Protein Disulfide Isomerase - Traduzido.pt

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AVALIAÇÕES Descoberta de drogas hoje-Volume 19, Número 3-Março 2014
As células cancerosas requerem um nível mais alto de PDI para lidar com o estresse significativo
do RE e o aumento global na síntese de proteínas para sustentar a rápida proliferação. O aumento da
síntese de proteínas leva a uma presença abundante de proteínas mal dobradas no RE
que precisam ser redobrados pela PDI. Como tal, as células cancerosas são mais vulneráveis
à inibição de PDI do que as células normais.
Avaliações-REVISÃO DA PALAVRA BÁSICA
Proteína dissulfeto isomerase: um alvo promissor

para a terapia do câncer
Shili Xu1, Saranya Sankar2e Nouri Neamati1
Shili Xué atualmente
pesquisador de pós-doutorado
no Departamento de Química
Medicinal da Faculdade de
1Departamento de Química Medicinal, Faculdade de Farmácia e Programa Translacional de Oncologia, Farmácia da Universidade de
Universidade de Michigan, North Campus Research Complex, 2800 Plymouth Road, Edifício 520, Ann Arbor, Michigan. Ele obteve seu
bacharelado em Ciências
MI 48109, EUA
Biológicas e Economia pela
2Departamento de Farmacologia e Ciências Farmacêuticas, Escola de Farmácia, Universidade de Pequim, China.
Universidade do Sul da Califórnia, 1985 Zonal Avenue, Los Angeles, CA 90089, EUA Concluiu seu doutorado sob a
supervisão de Nouri Neamati na University of Southern California.
O título de sua dissertação era 'Descoberta de novas moléculas
A proteína dissulfeto isomerase (PDI) tem um papel fundamental na manutenção da pequenas para terapia de câncer de ovário'. Ele trabalhou no
desenvolvimento pré-clínico de várias novas moléculas pequenas
homeostase celular mediando o dobramento oxidativo de proteínas. Catalisa a para o tratamento de câncer de ovário, colorretal, pulmão e
pâncreas. Os compostos representativos incluem PACMA31 e
formação, quebra e rearranjo de ligações dissulfeto no retículo endoplasmático e SC144 (um inibidor de gp130 de primeira classe). Ele também tem
um forte interesse no desenvolvimento de ensaios de atividade
tem atividade de proteína chaperona. Evidências crescentes sugerem que a PDI de alto rendimento robustos e eficientes para aplicações de
descoberta de medicamentos.
suporta a sobrevivência e progressão de vários tipos de câncer. Durante a última Saranya Sankarestá
década, foram desenvolvidos ensaios robustos de atividade de PDI e vários atualmente cursando seu
mestrado no Departamento
inibidores de PDI foram identificados, mas nenhum foi aprovado para uso clínico. de Farmacologia e Farmácia
Ciências, Escola de Farmácia,
Aqui, revisamos o conhecimento atual do papel da PDI no câncer e discutimos vários Universidade do Sul da Califórnia. Seu
trabalho está focado na descoberta de
ensaios para medir as atividades da PDI, destacando suas sensibilidades e utilidade novas classes de inibidores de PDI para o
tratamento de câncer no cérebro. Ela
para triagem de alto rendimento. Os inibidores de PDI relatados anteriormente recebeu seu diploma de bacharel em
Farmácia pela
requerem validação adicional para servir comogenuínoleads e otimização adicional Narsee Monjee Institute of Management Studies, Mumbai, Índia.
para gerar novos candidatos a medicamentos para estudos clínicos.

Nouri Neamatié Professor John
G. Searle de Química Medicinal
na Faculdade de Farmácia da
Universidade de Michigan e
membro do Programa de
Oncologia Translacional da UM.
PDI é uma oxidorredutase de ditiol-dissulfeto de 57 kDa e chaperona molecular. É uma das proteínas Obteve seu PhD em Ciências
Biomédicas pela University of
solúveis mais abundantes no retículo endoplasmático (RE), e representa até 0,8% do total de proteínas Texas Graduate School of
Biomedical Sciences
celulares.[1]. Foi descoberto como o primeiro catalisador de dobramento de proteínas em 1963 por dois
e MD do Anderson Cancer Center, Houston, Texas, em
grupos de pesquisa independentes liderados por Brunó Straub[2]e Christian B. Anfinsen[3], 1995. De 1995 a 2000, foi pós-doutorado e pesquisador do
National Institutes of Health (NIH). Em setembro de 2000,
respectivamente e, uma década depois, recebeu o nome de PDI[4]. Pelo menos 21 outros membros foram ele se juntou ao corpo docente da Escola de Farmácia da
posteriormente identificados, formando a família de proteínas PDI (Figura 1uma). Diferentes aspectos da Universidade do Sul da Califórnia, com uma nomeação
conjunta no Norris Comprehensive Cancer Center. Nouri
bioquímica dos membros da família PDI foram revisados anteriormente[5,6]. Neamati recebeu vários prêmios, incluindo o NIH
Technology Transfer, STOP CANCER, GlaxoSmithKline Drug
PDI tem um papel central como uma redutase, uma oxidase, uma isomerase e uma chaperona molecular no RE Discovery Award, vários prêmios do Departamento de
(a organela central para o dobramento de proteínas). Catalisa a oxidação (formação), redução (quebra) e Defesa dos EUA, LUNGevity Discovery Award da American
Lung Association e o Littlefield-AACR Award in Metastatic
isomerização (rearranjo) da ligação dissulfeto em seus substratos proteicos e peptídicos, mediando o dobramento Colon Pesquisa sobre câncer. Ele publicou mais de 200
manuscritos revisados por pares, 18 capítulos de livros e
oxidativo de proteínas. Além disso, o PDI se liga e estabiliza o complexo principal de histocompatibilidade (MHC)
mais de 30 patentes na área de design e descoberta de
classe I de carga de peptídeos (PLC) que medeia o dobramento de MHC de classe I e o carregamento de peptídeos medicamentos. Foi o editor-chefe fundador da
Farmacologia Molecular Atual,um Editor Associado deAlvos
[7]. Liga-se às subunidades NAD(P)H oxidase e regula a atividade da NAD(P)H oxidase nas células do músculo liso atuais de drogas anticâncere membro do Conselho
vascular[8]. PDI também é uma subunidade de prolil-4 hidroxilase Editorial de diversos periódicos, incluindoOpinião de
Especialista sobre Descoberta de Medicamentos, Opinião
de Especialista sobre Medicamentos em Investigação,
Hormônios e Câncer e aRevista de Química Medicinal.
Autor correspondente:Neamati, N. (neamati@umich.edu)
222www.drugdiscoverytoday.com 1359-6446/06/$ - veja a capa - 2013 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.http://dx.doi.org/10.1016/j.drudis.2013.10.017
Descoberta de drogas hoje-Volume 19, Número 3-Março 2014 AVALIAÇÕES
(uma) (c)
PDIA1(PDI, P4HB) CGHC CGHC
PDIA2(PDIp) CGHC CTHC
PDIA3(ERp57, GRP58) CGHC CGHC
PDIA4(ERp72) CGHC CGHC CTHC
PDIA5(PDIr) CSMC CGHC CPHC

PDIA6(ERp5, P5) CGHC CGHC
PDIA7(PDILT) SKQS SKKC
PDIA8(ERp27)
PDIA9(ERp29)
PDIA10(ERp44) CRFS
(d)N-terminal Cys: C-terminal Cys:
PDIA11(TMX1) CPAC
PDIA12(TMX2) SNDC
PDIA13(TMX3) CGHC
PDIA14(TMX4) CPSC
(TMX5) CRFS
PDIA15(ERp46) CGHC CGHC CGHC
PDIA16(ERp19, AGR1) CGAC

umaeuma′domínios:
PDIA17(ARG2, HAG-2) CPHS beb′domínios:

Transmembranar
domínios:
PDIA18(ARG3, HAG-3) CQYS
PDIA19(ERdj5) CSHC CPPC CHPC CGPC

(e)
PDIB1(CASQ1)
PDIB2(CASQ2)
(b)
CGHC CGHC KDELGenericName
uma b b′′ uma′′c
18 24 134 136 233 235 349 369 479 508

Descoberta de drogas hoje
FIGURA 1
Propriedades estruturais da proteína dissulfeto isomerase (PDI). (a) Membros de proteínas da família PDI. As sequências de aminoácidos dos sítios ativos são mostradas. (b)
Arquitetura de domínio do PDI. (c) Comparação de sequência doumaeuma0domínios. A comparação de sequência foi realizada usando STRETCHER (EMBOSS, Pasteur:http://
mobyle.pasteur.fr). O site ativo CGHC é destacado. (d) Acessibilidade das cisteínas N-terminal e C-terminal no sítio ativo PDI. As informações estruturais foramuma0domínio
de 4EKZ, e analisado usando Chimera 1.7 (UCSF). (e) Comparação de sequência dobeb0domínios.
(uma enzima essencial para a síntese de colágenos)[9]e proteína de algumas evidências sugerem que ele interage com a membrana celular por meio de
transferência de triglicerídeos microssomal (uma enzima central para a cargas eletrostáticas[22]. PDI funciona principalmente como uma redutase
montagem de lipoproteínas contendo apolipoproteína B)[10]. Até o [23]bem como uma isomerase[24]na superfície da célula. PDI de
momento, a geração de um camundongo knockout global PDI não foi superfície celular regula vários processos biológicos importantes,
relatada. No entanto, dado o papel essencial do PDI, camundongos incluindo coagulação[25], resposta a lesão[26], ativação plaquetária[27–
knockout podem não ser viáveis. A desregulação da expressão de PDI e/ 29]e formação de trombos[30–32], migração de células T[23], migração
ou atividade enzimática está associada a uma série de doenças humanas de células de glioma[33], fusão de gametas[34]e internalização de óxido
[11], como neurodegenerativas[12–15]e doenças cardiovasculares[16–19] nítrico do extracelularS-nitrosotióis[35]. É importante ressaltar que a PDI
. Além de sua localização primária no RE como uma oxidorredutase de superfície celular facilita a infecção viral[36], como exemplificado pelo
solúvel, a PDI também está presente no lado extracelular da membrana seu envolvimento em eventos fusogênicos do HIV-1. A PDI de superfície
plasmática.[20,21]. Embora o mecanismo pelo qual o PDI é secretado ou celular catalisa a redução de pelo menos duas ligações dissulfeto na
translocado para a superfície celular permaneça obscuro, gp120, uma glicoproteína do envelope do HIV-1, resultando em uma
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TABELA 1
Estruturas atualmente disponíveis de domínios isolados em PDI

ID do PDB Estrutura Domínio Método Resolução (Å) Data de deposição Referências
4EL1 aba0x (oxidado) Raio X 2,88 2012 [48]
4EKZ aba0x (reduzido) Raio X 2,51 2012 [48]

3 UEM bb0-xa0 Raio X 2,29 2011 [43]
2K18 bb0 RMN N / Duma 2008 [44]
3BJ5 b0-x Raio X 2.2 2007 [45]
1X5C uma0 RMN N/D 2005 N/D
2BJX b RMN N/D 1998 [46]
1MEK uma RMN N/D 1996 [47]
umaN/A: não aplicável.
alteração na gp120 que aumenta sua ligação aos co-receptores de [49]. Essas estruturas fornecem informações importantes sobre a relação
quimiocina (motivo CXC) receptor 4 (CXCR4) e receptor de quimiocina estrutura-atividade (SAR) de PDI e facilitam o projeto de inibidores de
CC tipo 5 (CCR5)[37–39]. Além do RE e da superfície celular, a PDI PDI.
também foi relatada em outras localizações subcelulares, incluindo oumaeuma0domínios compartilham 33,6% de identidade (Figura 1
citoplasma, mitocôndrias e núcleo.[40,41]. No entanto, essas c) e cada um contém um sítio ativo idêntico Cys-Gly-His-Cys (Figura 1
observações não são conclusivas e as funções biológicas da PDI b). As atividades de redutase, oxidase e isomerase de PDI dependem
nesses locais distintos permanecem obscuras. dos grupos tiol dessas cisteínas de sítio ativo[50,51]. oumaeuma0Os
O aumento do conhecimento sobre o envolvimento da PDI em várias domínios operam independentemente um do outro, porque a
doenças, o desenvolvimento de vários ensaios e a disponibilidade de ruptura das cisteínas do sítio ativo em qualquer domínio aboliu 50%
várias estruturas cristalinas levaram ao desenvolvimento de novos da atividade catalítica da PDI, e a ruptura das cisteínas em ambos os
potenciais inibidores de pequenas moléculas. Estudos recentes têm domínios aboliu completamente sua atividade oxidorredutase.[52].
implicado o PDI como um alvo de drogas novo e promissor para vários Em cada domínio tipo tiorredoxina, a cisteína do sítio ativo N-
tipos de câncer. Aqui, discutimos o conhecimento atual sobre a relação terminal está posicionada na superfície da proteína com seu grupo
entre PDI e câncer, os vários ensaios usados para a descoberta de tiol acessível para reações redox, enquanto a cisteína do sítio ativo C-
inibidores de PDI e inibidores de PDI atualmente disponíveis. terminal tem exposição limitada ao solvente.Figura 1d). A cisteína N-
terminal tem apKumana faixa de 4,5-5,6[53,54], enquanto o pKumada
Propriedades estruturais do PDI cisteína Cterminal foi calculado em 12,8[55]. No entanto, alguns
Codificado peloP4HBgene, PDI tem uma estrutura multidomínio[42]. O estudos sugerem que, durante as reações bioquímicas, ouma
PDI completo contém 508 aminoácidos, enquanto a forma madura não domínios sofrem mudanças conformacionais que fazem com que o p
possui o peptídeo sinal N-terminal de 17 aminoácidos. PDI tem quatro Kumada cisteína Cterminal para mudar de 12,8 para 6,1[55,56]. Na
domínios distintos,a, b, b0euma0, com uma extensão Cterminal etapa inicial de uma reação, a cisteína N-terminal forma uma ligação
altamente ácidace umb0-uma0vinculadorx (Figura 1b). Uma sequência de dissulfeto transitória com um resíduo de cisteína no substrato para
sinal ERretrieval clássica (KDEL) encontra-se no terminal C dec.A maioria formar um heterodímero. Isto é seguido pela 'via de escape' na qual
dos membros da família PDI compartilha o sítio ativo Cys-XX-Cys tipo a cisteína C-terminal ataca a cisteína N-terminal para liberar o
tiorredoxina (Trx) e a sequência de sinal de recuperação de ER. Embora a substrato[57].
estrutura do PDI humano completo ainda não tenha sido resolvida, obeb0domínios não contêm um site ativo e compartilham apenas 16,5% de
estruturas de domínios isolados estão disponíveis (tabela 1)[43–47]. identidade de sequência (Figura 1e). Embora todos os domínios PDI
Recentemente, Wanget ai.estruturas de alta resolução resolvidas de PDI contribuam para a ligação de proteínas mal dobradas, ob0O domínio constitui
humanoaba0x0nos estados reduzido e oxidado, mostrando que o o principal sítio de ligação ao substrato e apresenta alta afinidade e ampla
a, b, b0euma0Os domínios são organizados em forma de ferradura com dois sítios especificidade[58]. ob0O domínio é essencial e suficiente para a ligação de
ativos do CGHC voltados um para o outro[48]. Isso é consistente com a estrutura pequenos peptídeos por meio de interações hidrofóbicas[59], mas não para a
cristalina publicada anteriormente de PDI de levedura de comprimento total ligação de grandes peptídeos ou proteínas[58].
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(uma)
GSSG GSSG GSSG GSH
SH SH GSH S S
SG S SH
S S SH S S SH S– SH
S S S S S S
(b)
GSH
GSH GSH GSH

GSH GSH
GSH
SH
S– SH
SH SH
SG S SH GSSG S–
S S SH S S SH S S
SH SH SH SH
(c)
S1 S SH
S1
S2 S 1 S– SH SH4 S4 S1
S– SH
S3 S 4 SH2 S SH
S4
S3
S3 S2
S3 S2
(d)
Citoplasm
a
Proteínas desdobradas
Oxidação
Isom
eriza
ç ão
ato
GSS scorb UPR
G GSH DHAa
H2O2 H2O Oxidado
Ero PDI
Reduzido O2 1 inona
a K qu inona
PDI H2O s -2,3- Vitamin h idroqu
2 Prdx4 s Prdx4 SH ina K a K
Vitam o Vitamin
SH id
epóx
Retículo endo
plasmático
Golgi
Núcleo
Gene
expressão
ão
uç
r ad
T
FIGURA 2
Em vitroena Vivoreações bioquímicas envolvendo proteína dissulfeto isomerase (PDI). PDI catalisa (a) oxidação, (b) redução e (c) reações de isomerizaçãoem vitro.Na reação
de oxidação, o dissulfeto de glutationa (GSSG) representa os aceptores terminais de elétrons, e na reação de redução, a glutationa (GSH) representa os doadores terminais
de elétrons. Nenhum aceptor ou doador de elétrons extra é necessário para a reação de isomerização que é iniciada pela forma reduzida de PDI. As setas indicam as reações
nucleofílicas. (d) No retículo endoplasmático (RE), a PDI catalisa principalmente reações de oxidação e isomerização, mediando a formação de ligações dissulfeto e rearranjo
para o dobramento oxidativo de proteínas. Enquanto catalisa a formação de ligações dissulfeto em um substrato, as cisteínas do sítio ativo de PDI são reduzidas
O sítio de ligação do substrato emb0também é necessário para a (AL). Este efeito é independente da UPR, da perturbação da estrutura
atividade chaperone de PDI[60]e sua interação com ouma-subunidade de geral do RE ou da distribuição de outras proteínas residentes no RE.
prolil-4-hidroxilase[61]. [71]. Reticulon 1-C também foi relatado para induzir a redistribuição de
PDI em vesículas ER e para diminuir os níveis de PDI S-nitrosilado[72].
As reações de troca tiol-dissulfeto de PDI A regulação eficiente da atividade PDI é crucial para a maioria das funções
Está bem estabelecido que a PDI é capaz de atuar como oxidase, celulares. A formação de ligações dissulfeto ocorre em aproximadamente 30%
redutase e isomerase, dependendo do estado redox de suas cisteínas de de todas as proteínas e é essencial para suas bioatividades. Dado que a PDI
sítio ativo e das propriedades dos substratos. Em uma reação de serve como uma das enzimas mais abundantes e essenciais para o
oxidação, um substrato ditiol é oxidado a um dissulfeto em paralelo com dobramento oxidativo de proteínas, sua disfunção resulta em rápido acúmulo
a redução do dissulfeto de sítio ativo em PDI ao estado ditiol. de proteínas desdobradas e mal dobradas no lúmen do RE. Com cadeias
Subsequentemente, oxidantes como o dissulfeto de glutationa (GSSG) laterais de aminoácidos hidrofóbicas expostas à superfície, essas proteínas
atuam como aceptores terminais de elétrons para oxidar o ditiol de volta formam agregados insolúveis e desencadeiam o estresse UPR e ER [73,74].
ao estado dissulfeto e completar o ciclo catalítico.Figura 2uma). Em uma Subsequentemente, três proteínas transdutoras de sinal [protein kinase RNA-
reação de redução, um dissulfeto de substrato é reduzido ao estado ditiol like endoplasmic kinase (PERK), Inositolrequiring protein 1 (IRE1) e active
com a formação concomitante de um dissulfeto de sítio ativo em PDI. transcription factor 6 (ATF6)] que estão posicionadas na membrana do RE e
Para cumprir o ciclo catalítico, redutores, como glutationa (GSH), NADPH atuam como sensores de estresse do RE, são ativado para modular UPR. A
e ditiotreitol (DTT), servem como doadores de elétrons terminais para ativação do PERK leva imediatamente a uma atenuação translacional global
reduzir o dissulfeto em PDI de volta ao seu estado ditiol.Figura 2b). Em por meio da fosforilação direta do fator 2 semelhante a E74 (elF2), o iniciador
uma reação de isomerização, onde não são necessários reagentes redox regulador da tradução de mRNA, resultando em uma diminuição do influxo de
adicionais, o PDI catalisa uma mudança na posição da ligação dissulfeto proteínas para o lúmen do RE.[75]. eIF2 fosforiladoumatambém aumenta a
entre as cisteínas do substrato sem uma mudança no número de ligações tradução de ATF4, um fator de transcrição que regula os genes UPR[75]. A IRE1
dissulfeto no substrato ou no estado redox dos sítios ativos no PDI ( ativada, uma endonuclease específica de sítio, estabiliza o mRNA de XBP-1 pela
Figura 2c). remoção direta de um pequeno íntron, levando à regulação positiva dos níveis
Em células normais e sob condições fisiológicas, a atividade de PDI é de proteína de ligação de X-box 1 (XBP-1)[76]. ATF6, quando acionado pela
fortemente regulada. Quando PDI catalisa a formação de ligações UPR, transloca para o aparelho de Golgi e é clivado para produzir um
dissulfeto em proteínas nascentes para mediar o dobramento oxidativo fragmento ativo, ATF6 p50[77]. ATF6 p50, XBP-1 e ATF4 entram no núcleo,
de proteínas, os dissulfetos do sítio ativo em PDI são reduzidos e ligam-se aos promotores ERSE e ativam a expressão de proteínas envolvidas
subsequentemente reoxidados no ambiente oxidante do RE.Figura 2d). na regulação da UPR. Essas vias UPR definem o mecanismo pró-sobrevivência
Anteriormente, o GSSG era considerado um regulador importante na durante a fase inicial do estresse do RE para restaurar a homeostase do RE. A
oxidação dos sítios ativos de PDI. No entanto, este consenso foi desafiado falha em restaurar a homeostase do RE resulta no início da apoptose.
pela descoberta de uma ER flavor-oxidase, retículo endoplasmático
oxidorreductin 1 (Ero1), que preferencialmente interage e oxida PDI
[62,63], especialmente ouma0domínio[64]. Como parte dessa reação,
Ero1 usa oxigênio molecular como aceptor de elétrons e produz uma PDI como um potencial alvo de drogas para o tratamento do câncer
molécula de H2O2por ligação dissulfeto[65]. A oxidação das cisteínas do Embora a PDI tenha sido extensivamente estudada nas últimas décadas, seu
sítio ativo na PDI também é contribuída por outros mecanismos, como H2 papel na progressão do câncer não está bem estabelecido. No entanto, dados
O2, peroxirredoxina 4 (Prdx4), ácido docosahexaenóico (DHA) e vitamina publicados sugerem fortemente que a PDI está significativamente associada à
K, e foi recentemente revisto em profundidade[6,66]. progressão do câncer e é um potencial alvo de drogas para o tratamento do
câncer.
As modificações pós-traducionais nas cisteínas do sítio ativo regulam a
atividade da PDI. Por exemplo, estresse nitrosativo prolongado ou agudo A expressão de PDI é alta em uma variedade de tipos de câncer
induz S-glutationilação (P-SSG)[67–69] e S-nitrosilação (P-SNO)[12]das Os estudos de microarray de expressão gênica fornecem uma ferramenta
cisteínas do sítio ativo em PDI, enfraquecendo sua atividade e causando importante para avaliar os níveis de expressão de PDI em diferentes tipos de
uma resposta de proteína desdobrada (UPR) e estresse do RE. A câncer. Ao analisar conjuntos de dados de microarray publicados,
carbonilação de PDI (4-HNE-PDI) induzida por lipoproteínas de baixa comparamos a expressão de PDI em diferentes tipos de câncer com a de
densidade oxidadas (oxLDLs) ou 4-hidroxinonenal (4-HNE) também foi tecidos normais. Observamos que a expressão de PDI foi significativamente
relatada para interromper a atividade enzimática de PDI e, portanto, aumentada (P <10-5, mudança de dobra > 2) em cânceres de cérebro e SNC (
potencializar o estresse do RE e a apoptose[70]. Além disso, a distribuição Fig. 3a) [78–83], linfoma (Fig. 3b)[84–86], rim (Fig. 3c)[87–89], ovário (Fig. 3d)
intracelular de PDI pode ser regulada por outros eventos celulares. Por [90,91], próstata (Fig. 3e)[92,93], pulmão (Fig. 3f)
exemplo, baixos níveis de ruticulon-4A (Nogo-A), um inibidor do [94]e tumores de células germinativas masculinos (Fig. 3g)[95]. A regulação positiva
crescimento de neuritos específico para o sistema nervoso central (SNC), de PDI no câncer também foi confirmada por análises de proteoma. Os níveis de
causa uma distribuição difusa de PDI. Por outro lado, níveis mais altos proteína PDI estão aumentados em tecidos de pacientes com adenocarcinoma de
levam a uma distribuição pontuada de PDI protegendo contra a próstata em comparação com hiperplasia benigna da próstata (HBP) e estão
degeneração dos neurônios durante a esclerose lateral amiotrófica significativamente correlacionados com o escore de Gleason[96].
e eficientemente reoxidado por diferentes reguladores. Moléculas celulares envolvidas na reoxidação PDI incluem: retículo endoplasmático oxidorreductin 1 (Ero1), GSSG, H2O2,
peroxirredoxina 4 (Prdx4), ácido docosahexaenóico (DHA) e vitamina K. O comprometimento da atividade de PDI leva ao acúmulo de proteínas desdobradas e mal dobradas, causando
uma resposta proteica desdobrada e estresse do RE.
(uma) Rickman_Brain Gutmann_Brain TCGA_Brain Shai_Brain Sun_Brain Bredel_Brain
P=1,12 x 10-13 P=7,74 x 10-6 P=3,25 x 10-18 P=5,74 x 10-9 P=3,31 x 10-24 P=1,02 x 10-9
Mudança de dobra = 2,649 Mudança de dobra = 2,238 Mudança de dobra = 2,924 Mudança de dobra = 2,203 Mudança de dobra = 2,578 Mudança de dobra = 2,179
5,0 6,0 8,0 6,0 6,0 0,0
log2 centrado na mediana

intensidade de PDI
intensidade de PDI
intensidade de PDI
intensidade de PDI
intensidade de PDI
intensidade de PDI
4,0 5,5 - 0,5
6,0
4,0 4,0
3,0 5,0 - 1,0
4,0
2,0 4,5 - 1,5
2,0 2,0
2,0 - 2,0
1,0 4,0
0,0 3,5 0,0 0,0 0,0 - 2,5
a
a
m
m

ito o
al
al
)
)
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ro
ro
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As Pil
tr
lio
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lio
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ob N
te
G
é
at
at
(M
(M
(L
(b) Basso_Linfoma Compagno_Linfoma Piccaluga_Lmphoma
P= 8,64 x 10-13; 2,31 x 10-11; 2,32 x 10-10 P=2,97 x 10-11 Mudança P=1,89 x 10-6
Mudança de dobra = 2.188; 2.508; 3.324 de dobra = 2,004 Mudança de dobra = 2,572
7,0 6,5 7,0


6,0
intensidade de PDI
Normal 6,0
intensidade de PDI
intensidade de PDI
6,0
5,0 5,5 Normal
4,0 Normal
5,0 5,0
3,0
4,5
2,0 4,0
1,0 4,0
0,0 3,5 3,0
t
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Ce
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Li
Li
D
(c) Yusenko_Renal Beroukhim_Renal Jones_Renal (d) Bonome_Ovarian Welsh_Ovarian
P= 4,13 x 10-6; 4,70 x 10-8 P=2,98 x 10-8 P=1,90 x 10-7 P=4,93 x 10-12 Mudança P=1,27 x 10-5
Mudança de dobra = 2.229; 2.973 Mudança de dobra = 2,012 Mudança de dobra = 3,365
de dobra = 2,823 Mudança de dobra = 4,856
8,0 7,0 6,0 6,0 8,0

intensidade de PDI
intensidade de PDI
intensidade de PDI
intensidade de PDI
intensidade de PDI
6,0 6,0 4,0 6,0
4,0
Normal
4,0 5,0 2,0 2,0 4,0
2,0 4,0 0,0

0,0 2,0
0,0 3,0
- 2,0
- 2,0 0,0
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pi
r ci
lu
ca
(e
Su
Cé
(e) Welsh_Prostate Singh_Prostate (f) Beer_Lung (g) Korkola_Seminoma

P= 3,65 x 10-10; 1,03 x 10-12; 3,33 x 10-8; 2,30 x 10-8; 2,26 x 10-8
P=1,01 x 10-10 Mudança P=1,85 x 10-6 P=4,75 x 10-14 Mudança
Mudança de dobra = 3,375; 2.642; 2.148; 3.178; 2.800
de dobra = 2,195 Mudança de dobra = 3,108 de dobra = 2,167
8,0 10,0 6,0 8,0

intensidade de PDI
intensidade de PDI
intensidade de PDI
intensidade de PDI
7,0 6,0
5,0 5,0
6,0 4,0
0,0 4,0
5,0 2,0
4,0 - 5,0 3,0 0,0

a
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Ca
Ca
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FIGURA 3
A proteína dissulfeto isomerase (PDI) é altamente expressa em vários tipos de câncer em comparação com os respectivos tecidos normais. Os tipos de câncer analisados incluem (a)
cérebro [78–83], (b) linfoma[84–86], (c) rim[87–89], (d) ovário[90,91], (e) próstata[92,93], (f) pulmão[94]e (g) tumores de células germinativas masculinas[95]. Os conjuntos de dados foram
obtidos da OncomineMT(http://www.oncomine.com) com limites de filtragem comoP <10-5e mudança de dobra >2, e analisado usando Prism 5 (GraphPad Software, Inc). O teste t de
Student foi usado para análise estatística para comparar os níveis de expressão gênica entre tecidos normais e cancerosos. Caixa: 25–75%. Bigodes: Min e Max.
Estudos com 2-DE/dessorção a laser assistida por matriz/tempo de ionização [98], e no câncer gástrico primário e metastático induzido por
de voo (MALDI-TOF) mostraram que, em comparação com os respectivos metilnitronitrosoguanidina (MNNG) de um modelo de rato[99]. Outro
tecidos não neoplásicos adjacentes, a PDI é superexpressa em carcinomas estudo relatou que PDI foi uma das proteínas mais reguladas em fluidos
ductais infiltrantes de ambos os sexos femininos[97]e o peito masculino intersticiais de tumores de mama e, portanto, poderia servir como
um potencial marcador sorológico para detecção precoce do câncer de mama fator de crescimento transformante -b1 (TGF-b1) que ocorre frequentemente em
[100]. células cancerosas. TGF-b1 regula negativamente o mRNA para PDI em TGF-b1-
A regulação positiva da proteína PDI também se correlaciona com a células sensíveis, mas não em células que são insensíveis aos efeitos inibidores do
metástase e a invasão do câncer. Os níveis de proteína PDI são crescimento do TGF-b1[106]. Em segundo lugar, o PDI protege as células
significativamente maiores no tumor de mama metastático de linfonodo axilar cancerígenas da apoptose. No melanoma, a inibição da atividade de PDI usando
em comparação com o tumor de mama primário[101]. PDI também foi bacitracina aumentou a apoptose desencadeada por fenretinida ou velcade
fortemente expresso em células de glioma em migração em umem vitroensaio [107]. A PDI citosólica é um substrato da caspase-3 e -7 durante a apoptose
de migração e em células de glioma invasivas em ambos os xenoenxertos e na induzida por etoposídeo em células AML HL-60, e a superexpressão da PDI
frente invasiva de glioblastomas humanos[33]. Além disso, PDI serve como citosólica (sequência de retenção ER deletada) suprimiu a morte celular[108].
marcador tumoral para o diagnóstico de câncer colorretal[102]. Juntos, esses Células de carcinoma hepatocelular humano (HCC) expressam PDI de uma
dados sugerem que a superexpressão de PDI pode ser usada como um maneira induzível por hipóxia, e foi relatado que a bacitracina aumenta a
marcador de diagnóstico para tipos de câncer selecionados. Além disso, a PDI apoptose desencadeada pelo inibidor da hexoquinase II (3-bromopiruvato) em
foi relatada como um alvo de anticorpo durante a destruição do tumor células HCC através do aumento do estresse de ER e antiangiogênese[109]. Foi
imunomediada em pacientes com melanoma ou leucemia mielóide aguda recentemente demonstrado que o silenciamento de PDI em células de câncer
(LMA) refratária que receberam vacinação com células tumorais secretoras de de ovário humano resultou em citotoxicidade substancial
fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos autólogos (GM-CSF) [110]. Da mesma forma, carbamoil metil amidas de ácido propinóico
irradiadas[103]. (PACMA) 31, um novo inibidor irreversível de PDI, exibiu atividade
anticancerígena significativa em ambosem vitroena Vivomodelos de
A PDI está associada a resultados clínicos câncer de ovário[110].
A resistência à quimioterapia é uma grande preocupação no tratamento No entanto, os efeitos da PDI no suporte à sobrevivência e progressão
clínico do câncer. Está ficando claro que o PDI tem um papel na do tumor são dependentes do tipo de célula e câncer. Foi relatado que o
quimiorresistência em alguns cânceres. Por exemplo, em comparação com silenciamento de PDI induz citotoxicidade significativa em células
células HeLa sensíveis a aplidina, as células HeLa-R resistentes a aplidina cultivadas de MCF-7 (câncer de mama) e SH-SY5Y (neuroblastoma), mas
expressam níveis significativamente mais altos de proteína PDI e, por sua vez, não em células HeLa (câncer cervical), o que pode resultar dos diferentes
a inibição de PDI por células HeLa-R sensibilizadas por bacitracina à aplidina níveis de ativação de caspase nessas células[111]. Além disso, PDI
[104]. Esses dados sugerem que terapias combinadas usando inibidores de promove a invasão e metástase do câncer. A formação de ligação
PDI com agentes anticancerígenos tradicionais podem superar a dissulfeto mediada por PDI é importante para a atividade gelatinolítica e
quimiorresistência e até obter efeitos sinérgicos. Em apoio a esses dados secreção da matriz metalopeptidase 9 (MMP-9), uma importante matriz
experimentais, observou-se que a expressão de PDI mais baixa está extracelular que digere proteinase e facilita a metástase tumoral e a
significativamente associada a uma maior taxa de sobrevida global de angiogênese[112]. Bacitracina ou um mAb anti-PDI inibidoem vitro
pacientes com glioblastoma.Fig. 4a) e câncer de mama (Fig. 4b)[80,81,105]. migração e invasão de células de glioma humano[33], sugerindo que a
Portanto, os níveis de PDI em biópsias de câncer podem ser usados como um PDI de superfície celular também está envolvida na progressão do
marcador prognóstico, em particular, porque o PDI pode ser secretado no câncer. Também é importante notar que os níveis de proteína PDI
ambiente extracelular do tumor, os níveis séricos de PDI podem refletir a mudam de forma diferente em diferentes tipos de células e em resposta
expressão de PDI do tumor, facilitando a detecção clínica. a diferentes agentes farmacológicos que induzem a UPR. Por exemplo,
ambas as linhas celulares de sarcoma HT1080 e RD-ES aumentaram os
PDI suporta a sobrevivência e progressão do tumor níveis de PDI após o tratamento com tunicarmicina, mas apenas HT1080
Evidências crescentes de estudos funcionais indicaram que a PDI tem um aumentou os níveis de PDI após o tratamento com ritonavir[113].
papel importante no apoio à progressão do câncer. Primeiro, a PDI está Portanto, é importante e necessário entender o contexto molecular
associada à resistência aos efeitos inibidores do crescimento de específico do câncer para a aplicação da terapia direcionada PDI.
(uma) (b)
TCGA_Brain Shai_Brain vandeVijver_Breast
100 100
PDI baixo (N = 15) 100 PDI baixo (N = 148)
Sobrevivência Geral (%)
PDI baixo (N = 274) 80 PDI alto (N = 14)

80 PDI alto (N = 147)

PDI alto (N = 274)
60 60 80 P=0,0196
P=0,0017
40 40 **
60
*
P=0,0001 20
20
***
0 0 40
0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 0 5 10 15 20
Ano Ano Ano
FIGURA 4
A expressão da proteína dissulfeto isomerase (PDI) está associada à taxa de sobrevida global de pacientes com (a) glioblastoma[80,81]ou (b) câncer de mama[105]. Os conjuntos de dados
foram obtidos da OncomineMThttp://www.oncomine.com) e analisado usando Prism 5 (GraphPad Software, Inc). O método de análise de sobrevida de Kaplan-Meier foi utilizado para gerar
as curvas de sobrevida. *P <0,05; **P <0,01; ***P <0,0001.
Nossa hipótese é que o estresse do RE contribui para a citotoxicidade Ensaio fluorimétrico

induzida pelo silenciamento ou inibição de PDI. Uma característica do câncer é Em um ensaio fluorimétrico, PDI catalisa a redução de uma sonda
sua capacidade de manter o crescimento e a proliferação[114], exigindo um fluorescente [por exemplo, di-(o-aminobenzoil)-GSSG (diabz-GSSG) ou
suprimento suficiente de proteínas para a construção e funções celulares, dieosina-GSSG (Di-E-GSSG)] onde uma ligação dissulfeto liga duas
comunicação intercelular, destruição da matriz extracelular e estimulação da porções fluorescentes idênticas [(o-aminobenzoil)-GSSG (abz-GSH) ou
angiogênese. Em comparação com as células normais, as células cancerosas eosina-GSSG (E-GSH)] para manter a autoextinção de fluorescência (Fig. 5
precisam expressar proteínas de forma mais eficiente, ativando diferentes c). O destacamento das duas porções fluorescentes causa um aumento
funções transcricionais (por exemplo, c-Myc ou Jun) e translacionais (por substancial na intensidade de fluorescência[125.126]. O ensaio é sensível

exemplo, eIF2umaou eIF4E) máquinas[115.116]e, assim, regular os níveis de e pode medir a atividade da redutase em uma concentração de PDI tão
PDI para facilitar a produção de proteína em excesso. Portanto, as células baixa quanto 2,5 nM[125]. O ensaio fluorimétrico é adaptável para HTS,
cancerosas são mais sensíveis à inibição de PDI e UPR. Além disso, a inibição mas o custo é alto devido à necessidade de sintetizar sondas
da PDI também pode suprimir a invasão e a metástase do câncer nas quais a fluorescentes.
PDI da superfície celular está envolvida.
Ensaios de oxidação
Abordagens para medir atividades de PDI e triagem de Ensaio de oxidação de ribonuclease (RNase)
inibidores de PDI A RNase digere o RNA catalisando a hidrólise das ligações
Durante as últimas décadas, uma série de ensaios foi estabelecida para fosfodiéster. Neste ensaio, o PDI catalisa a renaturação oxidativa da
medir as atividades enzimáticas de PDI, bem como para triagem de RNase de sua forma reduzida inativa.Fig. 5d)[127.128]. A RNase
inibidores. Aqui, discutimos os ensaios de atividade de PDI atualmente oxidada ativa subsequentemente catalisa a hidrólise do monofosfato
disponíveis com base nas diferentes atividades de PDI (redutase, de citidina cíclico (cCMP) em CMP, levando a um aumento na
isomerase, oxidase e chaperona). Dado que muitos desses ensaios são absorbância em 296 nm. A taxa de hidrólise de cCMP indica a
amplamente utilizados para rastrear inibidores de PDI, é importante atividade oxidase de PDI. Embora conveniente, deve-se estar ciente
entender as vantagens e limitações de cada um quando usado para de que o produto (CMP) pode inibir competitivamente o PDI e alterar
identificar inibidores específicos. a velocidade da reação. Além disso, o cálculo da concentração de
RNase ativa depende daKmvalor para cCMP e oKeuvalor para CMP, e
Ensaios de redutase esses parâmetros podem variar dependendo do pH e da
Ensaio de turbidez da insulina concentração de sal da reação.
Como redutase, a PDI rompe as duas ligações dissulfeto entre as Versões alternativas deste ensaio utilizam outras enzimas e
cadeias A e B da insulina, causando agregação da cadeia B, substratos. Por exemplo, o PDI catalisa a oxidação da lisozima
enquanto a cadeia A permanece solúvel em solução.Fig. 5uma). A reduzida inativa à sua forma oxidada ativa que pode ser usada para
turbidez gerada pela cadeia B aumenta a absorbância da luz digerir uma suspensão doMicrococcus lysodeikticusparede celular
(540-650 nm) e, portanto, pode servir como uma leitura para medir a [118]. O inibidor de tripsina pancreática bovina (RBPTI) reduzido e
atividade da redutase do PDI. Doadores de elétrons comumente desnaturado também é usado como alternativa[129]. O PDI catalisa
usados para esta reação incluem GSH[117]e TDT[118.119]. Tal a oxidação do RBPTI à sua forma ativa que pode ser medida em
reação pode ser continuamente medida acoplando a formação de virtude de sua capacidade de inibir a tripsina. No entanto, essas
GSSG à oxidação de NADPH usando glutationa redutase [117.120]. O versões alternativas são menos usadas.
ensaio de turbidez da insulina pode ser convertido em um ensaio de Ensaio de oxidação de peptídeos
ponto final usando um reagente de parada (por exemplo, H2O2). Este ensaio utiliza um decapeptídeo NRCSQGSCWN compreendendo
Neste formato, o ensaio pode ser automatizado e usado para dois resíduos de cisteína separados por uma região de ligação, com
triagem de alto rendimento (HTS) de inibidores de PDI[121]. Este um resíduo fluorescente (triptofano) adjacente a uma cisteína e um
método relativamente simples, eficiente e econômico é comumente resíduo protonável (arginina) adjacente à outra cisteína (Fig. 5e)[53].
utilizado no campo. A sensibilidade deste ensaio está na faixa Esses dois grupos são reunidos quando o PDI catalisa a formação da
micromolar. É importante notar que este ensaio pode gerar falsos ligação dissulfeto entre as duas cisteínas, resultando na extinção da
negativos ao rastrear ou testar inibidores de PDI, porque compostos fluorescência. A espectroscopia de fluorescência permite a
que são facilmente reduzidos por DTT ou GSH podem perder sua determinação rápida e reprodutível de sua atividade oxidase.
atividade inibitória.
Ensaio de degradação de insulina Ensaios de isomerização
O ensaio de degradação de insulina é uma versão modificada do ensaio Ensaio de RNase embaralhado (sRNase)
de turbidez de insulina[122](Fig. 5b). Neste ensaio, o PDI catalisa a O ensaio sRNase foi o primeiro ensaio usado para medir a atividade de PDI
redução das ligações dissulfeto na insulina, resultando na precipitação de [130]. A sRNase é preparada submetendo a RNase a condições de
125Cadeias B marcadas com I. A intensidade de radiação solúvel em ácido desnaturação, de modo que esteja em um estado totalmente oxidado e inativo
restante no sobrenadante fornece uma estimativa da atividade da com ligações dissulfeto formadas aleatoriamente[120,131]. A adição de PDI
redutase de PDI[123.124]. No entanto, o ensaio pode subestimar a catalisa a troca de dissulfetos inter e intramoleculares na sRNase, resultando
atividade da redutase quando o sistema está contaminado por proteases no emparelhamento dissulfeto nativo e na recuperação da atividade
que podem adicionar fragmentos radioativos solúveis extras ao enzimática da RNase.Fig. 5f). A atividade de isomerase de PDI é medida
sobrenadante. As desvantagens adicionais do ensaio são as várias etapas avaliando a atividade de RNase usando RNA como substrato. Dado que o PDI é
envolvidas e o uso de materiais radioativos que limitam sua ampla uma isomerase essencial nas células, este ensaio sensível e relativamente fácil
aplicação como plataforma HTS. de realizar é útil para estudos mecanísticos.
(uma) (b)
Uma corrente
Radiação
intensidade em
GSH ou TDT sobrenadante

GSH ou TDT
OD600
cadeia B
cadeia B
(c) (d)
cCMP
diabz-GSSG abz-GSH
Hidrólise
GSSG
GSH ou TDT
CMP OD296
(e) Leve Leve Extinção Leve (f)

(ex: 280) de luz (ex: 280)
(em: 350)
Energia
transferir
Hidrólise
GSSG
(g) (h)
assistido por PDI Redobrar
redobrar rodanês
1S lodoacetamida
1S
2S 2S PDI
3S
Desnaturar
GSSG/GSH Auto
Desnaturado redobrar OD320
ESI-MS rodanês Agregado
2S 3S rodanês dobrável
(eu)
Leve
(em: 538 nm)
Redobrar Leve
(ex: 485 nm)
GFP desnaturado GFP redobrado
FIGURA 5
Ensaios de atividade de proteína dissulfeto isomerase (PDI). (a) Ensaio de turbidez da insulina. A PDI catalisa a redução das ligações dissulfeto entre as cadeias A e B da insulina, causando agregação da cadeia B. (b) Ensaio de degradação de insulina. A
PDI catalisa a redução das ligações dissulfeto entre a cadeia A da insulina e125Cadeia B marcada com I, resultando em uma diminuição na intensidade de radiação no sobrenadante. (c) Ensaio fluorimétrico. A PDI catalisa a redução da ligação dissulfeto
em dissulfeto de di-(o-aminobenzoil)-glutationa (diabz-GSSG), liberando duas moléculas de (o-aminobenzoil)-glutationa (abz-GSH) com aumento da atividade fluorescente. (d) Ensaio de oxidação de RNase. A PDI catalisa a oxidação da RNase reduzida à
sua forma ativa que hidrolisa o monofosfato de citidina cíclico (cCMP) em CMP, causando um aumento na absorbância em 296 nm. (e) Ensaio de oxidação peptídica. A PDI catalisa a formação de uma ligação dissulfeto intramolecular em
NRCSQGSCWN e, portanto, aproxima os resíduos de Trp e Arg, resultando na extinção da fluorescência de Trp por Arg. (f) Ensaio de RNase mexida (sRNAse). A PDI catalisa o redobramento da sRNase em sua forma ativa nativa que digere o RNA,
levando a uma mudança em A260/A280. (g) Ensaio de redobragem do inibidor de tripsina pancreática bovina (BPTI). O PDI catalisa a redobragem de BPTI de sua forma 2S não nativa para a forma 3S nativa. Tal mudança pode ser medida usando
espectrometria de massa de ionização por eletrospray (ESI-MS). (h) Ensaio de agregação de proteínas. O PDI medeia o redobramento do rodanês desnaturado, impedindo a agregação do rodanês dobrável. (i) Ensaio de proteína fluorescente verde
(GFP). PDI catalisa o dobramento de GFP desnaturado não fluorescente para sua forma nativa que recupera a atividade fluorescente. O PDI medeia o redobramento do rodanês desnaturado, impedindo a agregação do rodanês dobrável. (i) Ensaio de
proteína fluorescente verde (GFP). PDI catalisa o dobramento de GFP desnaturado não fluorescente para sua forma nativa que recupera a atividade fluorescente. O PDI medeia o redobramento do rodanês desnaturado, impedindo a agregação do
rodanês dobrável. (i) Ensaio de proteína fluorescente verde (GFP). PDI catalisa o dobramento de GFP desnaturado não fluorescente para sua forma nativa que recupera a atividade fluorescente.
Descoberta de drogas hoje-Volume 19, Número 3-Março 2014
MESA 2
Inibidores de PDI previamente relatados
Nome CI50 Referências Ensaio de atividade Seletividade Reversibilidade Membrana Em vitroAtividade de Na Vivo Referências
(micromolar) permeabilidade inibição de PDI Inibição de PDI

atividade
PACMA 31 10 [110] Insulina Seletivo para PDI sobre Irreversível Permeável Citotóxico em linhas celulares de Acumula em
turbidez outras proteínas como câncer de ovário (OVCAR-8, NCI/ tumor e
ensaio BSA e Grp78. ADR-RES, HEY e OVCAR-3) suprime o tumor
crescimento em um modelo de
xenoenxerto de camundongo de
cancro do ovário; não

toxicidade significativa
em direção ao normal
tecidos
16F16 63 [15] Fluorimétrico N/D Irreversível Permeável Inibe a apoptose no modelo de células Previne
ensaio PC12 de HD neurotoxicidade em
espinhoso médio
neurônios no estriado
região de fatias de cérebro
RB-11-ca 40 [142] Fluorimétrico N/D Irreversível Permeável Citotóxico em células HeLa N/D
ensaio com EC50= 23,9 micromolar
PAO 85 [110] Ensaio de turbidez da Baixa especificidade Irreversível Permeável Induz a liberação rápida de N/D [174]
insulina Reação com L-selectina de neutrófilos
proteínas contendo isolados, um processo
motivo cxxc[145.146] regulado negativamente pelo PDI
Inibe catalisado por PDI [37]
liberação redutiva de ácido
solúvel [125I] tiramina-SH da
superfície ligada [125I] tiramina-
SS-poli(D-lisina) (IC50= 10
micromolar) Eficaz antes ou
durante a infecção pelo HIV-1, [37]
mas não após a progressão da
infecção em P4, PM1, H9, 1G5 e
sem macrófagos
células monocíticas do sangue
periférico
DTNB 100 [124] Ensaio de degradação de Inespecífico Irreversível Impermeável Inibe a ativação da toxina N/D [147]
insulina da difteria
Previne as células H9 da infecção [147]
pelo HIV-1 (IC50= 0,3 mM) Célula
hospedeira de longa duração [175]
proteção nos estágios finais do
ciclo viral
Iodoacetamina 8 (pH 6) [150] Ensaio de turbidez da Inespecífico Irreversível Permeável N/D N/D
insulina
AVALIAÇÕES
NEM 8 [150] Ensaio de turbidez da Inespecífico Irreversível Permeável N/D N/D
insulina

MESA 2 (Contínuo )
AVALIAÇÕES
Nome CI50 Referências Ensaio de atividade Seletividade Reversibilidade Membrana Em vitroAtividade de Na Vivo Referências
(micromolar) permeabilidade inibição de PDI Inibição de PDI

atividade
Acroleína 10 (pH 6,3) [150] Ensaio de turbidez da Inespecífico Irreversível Permeável N/D N/D
insulina
Tiomuscimol 23 [15] Ensaio fluorimétrico Inespecífico Irreversível Permeável Previne o poliQ induzido N/D
apoptose no modelo de células PC12
de HD
Cistamina 66 [15] Ensaio fluorimétrico Inespecífico Irreversível Permeável Previne o poliQ induzido N/D
apoptose em um modelo de células PC12
de HD
Juniferdina 0,156 [118] Insulina Seletivo para PDI Reversível Permeável Inibe catalisado por PDI N/D
turbidométrico sobre ERp57 e ERp72 redução de HIV gp120 e
ensaio entrada viral
Citotóxico em células HeLa,
HepG2, HT1080 e K562
Quercetina- 6.1 [152] Insulina Seletivo para PDI sobre Reversível Pobre Inibe a agregação plaquetária e a Inibe o trombo
3-rutinosídeo turbidez ERp5, ERp57, ERp72, permeabilidade geração de fibrina mediada por formação
ensaio tioredoxina e células endoteliais
tioredoxina
redutase
Bacitracina 90 [153] Insulina Inespecífico[156] Irreversível Célula pobre Aumenta a apoptose junto com outras Cancela [107.182]
degradação permeabilidade drogas em células de melanoma neuroprotetor
ensaio [157] efeito de 4-HBA
Bacotracina A 590 [155] Reduz a migração e invasão de [33]

(análogo principal) células de glioma
Bacitracina B 1050 [155] Inibe a entrada de vírus [33.147,

176.177]
Bacitracina F 20 Inibe a agregação plaquetária [27,29]
Descoberta de drogas hoje-Volume 19, Número 3-Março 2014

Bacitracina H 40 Aumenta a agregação de Cu/Zn [178]
superóxido dismutase Inibe a
atividade de VKORC1 Aumenta a [179]
atividade de transcrição de NF-kB [180]
Inibe a atividade da NAD(P)H
oxidase [8]
Inibe a citotoxicidade da [124]

toxina da difteria
Inibe a liberação do receptor do [181]
hormônio estimulante da tireoide
Ribostamicina Inibição suficiente na [138] Proteína Inespecífico Reversível Permeável N/D N/D
razão molar de 100:1 de agregação
ribostamicina para PDI ensaio
(Kd = 3,19 10-4M)
Estrogênios: E1, > 30% de inibição a 1 [161] Insulina Inespecífico Reversível Permeável N/D N/D
E2, DES e E3 micromolar degradação
ensaio
No entanto, por envolver a retirada de alíquotas em intervalos Inibidores de pequenas moléculas de PDI
regulares, é inconveniente para HTS. Também é importante notar Embora a PDI tenha sido intensamente estudada nas últimas décadas,
que o substrato sRNase é uma mistura complexa de espécies com nenhum inibidor seletivo da PDI surgiu para uso clínico. Entre o número
dissulfetos intramoleculares e intermoleculares apresentando limitado de inibidores de PDI, a maioria não é nem potente nem seletivo,
variação de lote para lote. Além disso, a hidrólise do RNA pode ser e mostra significativa toxicidade fora do alvo. No entanto, o aumento do
catalisada por um intermediário em vez de um produto RNase nativo conhecimento sobre a estrutura e as funções das proteínas da PDI e seus
final da reação de isomerização, resultando em erro de cálculo da membros da família levará à descoberta de inibidores potentes e
atividade isomerase de PDI. seletivos. Descobertas recentes de inibidores sintéticos de PDI de

Ensaio de redobragem do inibidor de tripsina pancreática bovina pequenas moléculas, como carbamoil metil amida do ácido propinóico
(BPTI) (PACMA) 31 e 16F16, forneceram ferramentas necessárias para entender
BPTI é um polipeptídeo de cadeia simples que suprime a atividade melhor o papel da PDI na doença humana. Nesta seção, fornecemos uma
enzimática da tripsina. Em sua conformação nativa, a proteína se dobra revisão abrangente dos principais inibidores de PDI publicados até o
sobre si mesma e é mantida unida por três ligações dissulfeto (3S).[132]. momento. As propriedades dos inibidores de PDI estão listadas emmesa
Neste ensaio, o PDI catalisa um rearranjo dissulfeto em BPTI não nativo 2e estruturas químicas de compostos de chumbo selecionados são
para redobrar do estado nativo 2S para 3S (Fig. 5g)[59.133]. Em pontos de mostrados emFiguras 6,7. A maioria desses compostos são inibidores
tempo definidos, a reação é extinta pela adição de iodoacetamida que irreversíveis visando as cisteínas do sítio ativo de PDI. Também é
reage com grupos tiol livres e adiciona 57 Da à massa de proteína. A importante notar que todos os supostos inibidores de PDI requerem
espectrometria de massa de ionização por eletrospray (ESI-MS) é validação adicional para serem consideradosgenuínoe seletivo para este
subsequentemente usada para analisar a quantidade de BPTI redobrado alvo. Mais estudos irão lançar mais luz sobre a utilidade desses
(3S) e seus intermediários de dobramento (1S e 2S). Este ensaio é compostos para um maior desenvolvimento.
demorado porque o BPTI redobrado e seus intermediários de
dobramento precisam ser purificados para a análise ESI-MS. Além disso, Compostos sintéticos
quando este ensaio é usado para testar inibidores de PDI que interferem Carbamoilmetilamidas de ácido propinóico
na análise de MS, etapas adicionais são necessárias para remover os Os PACMAs são uma classe de novas moléculas pequenas com citotoxicidade
compostos após a reação[59]. Portanto, não é passível de HTS. Além significativa para uma ampla gama de células cancerígenas[140]. Um
disso, diferentes espécies de proteínas BPTI (1S, 2S e 3S) podem composto representativo, PACMA 31 (1)foi recentemente relatado como um
influenciar sua detecção por ESI-MS. Este ensaio é semiquantitativo[59]. inibidor irreversível de PDI com potência emem vitroena Vivomodelos de
câncer de ovário[110]. Seu grupo propinóico terminal reage covalentemente
Ensaios de proteína chaperona com os grupos tiol das cisteínas do sítio ativo em PDI. Essa interação também
Ensaio de agregação de proteínas altera a estrutura da proteína secundária da PDI. Uma correlação marcante
Rodanês compreende uma única cadeia polipeptídica dobrada em dois também foi observada entre a atividade inibitória de PDI e a citotoxicidade em
domínios de igual tamanho. O rodanês desnaturado com cloridrato de células de câncer de ovário entre os análogos de PACMA (S. Xu, S. Saranya e N.
guanidina (Gdn-HCl) tende a agregar-se durante o processo de Neamati, dados não publicados). Um análogo fluorescente, PACMA 57
autorreenrolamento na ausência de proteínas chaperonas. Com base (composto
nessa propriedade, o redobramento de rodanês desnaturado pode ser 2),sintetizado através da conjugação de uma molécula fluorescente BOD-IPY
usado para estudar a atividade de chaperona de PDI medindo a para composto1,mostrou propriedades semelhantes[110]. Serve como uma
absorbância em 320 nm (Fig. 5h)[59]. A ausência de ligações dissulfeto ferramenta útil para aprofundar o estudo daem vitroena Vivopropriedades dos
em rodanês o torna adequado para testar a atividade de chaperona de PACMAs e expandir o conhecimento das cascatas celulares associadas ao PDI.
PDI independente de sua atividade de isomerase[134]. Outras proteínas
também têm sido utilizadas como alternativas no ensaio de agregação de 16F16 (3)
proteínas, como a D-gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH, outra 16F16 (3)foi identificado em um HTS de 68.887 compostos para a capacidade
proteína que não contém ligações dissulfeto)[135]. Além disso, citrato de suprimir a apoptose em umem vitroModelo baseado em células PC12 da
sintase e luciferase têm sido usados no ensaio de agregação de doença de Huntington (HD)[15], em que a apoptose é induzida por
proteínas para estudar a atividade chaperona de DsbG, uma proteína poliglutamina (poliQ) e mediada por PDI. Usando 'click chemistry' e MS, as
dissulfeto isomerase presente no periplasma deEscherichia coli[136]. isoformas PDI PDIA1 e PDIA3 foram identificadas como alvos celulares do
Além da desnaturação química com cloridrato de guanidina (Gdn-HCl), a composto3.Dentro da faixa de 3 a 12 micromolares, o composto3mostrou um
desnaturação térmica também é utilizada para o ensaio de agregação de resgate dependente da dose de apoptose induzida por poliQ que se
proteínas. As proteínas de substrato usadas para desnaturação térmica correlacionou com a inibição de PDI, enquanto em concentrações >12
incluem álcool desidrogenase (ADH)[137]e citrato sintase[138]. micromolar, composto3mostraram citotoxicidade devido à inibição de PDI,
bem como potenciais efeitos fora do alvo. A análise SAR mostrou que a fração
Ensaio de proteína fluorescente verde (GFP) cloroacetil é crucial para sua atividade. Sua fração éster tolera pequenas
No ensaio de GFP, o redobramento de GFP desnaturado com ácido é modificações, como uma mudança de metil para etil, enquanto a incorporação
promovido por PDI, resultando em um aumento na intensidade de de marcadores de afinidade de biotina ou fluoresceína causa uma perda
fluorescência que pode ser monitorada em tempo real.Fig. 5eu)[139]. GFP completa de atividade. Composto 3pode se ligar a cisteínas do sítio ativo de
serve como um substrato modelo para estudar a atividade de chaperona de PDI de maneira semelhante a compostos1e2.É possível que compostos1–3
PDI porque não só falta ligações dissulfeto, mas também após desnaturação podem se ligar a outras proteínas, especialmente aquelas contendo cisteínas
ácida (pH 1,5) exibe uma baixa intensidade de fluorescência em comparação livres dentro de uma cavidade de ligação semelhante à PDI, mas podem não
com a estrutura ativa. afetar a
O
Cl H H
S N N N Cl
S O N
O O O
H H H
H N N O N N O
N CO 2Et O
N N N N Como
H
MeO O HN
MeO O O
NH
OMe
OMe R3
N N+
B-
F
F
PACMA 31 (1) PACMA 57 (2) 16F16 (3) RB-11-ca (4) PAO (5)
OH
O
Como CO2H O S O O
NÃO2 O O
EU N H2C
HO2C S NH2 H
S
NH2 Hg O
O2N Cl
aPAO (6) DTNB (7) pCMBS (8) Iodoacetamida (9) NEM (10) Acroleína (11)
OH
O HO HO
HO O OH
NH2 O
11
O OH
NH H 2N
10
9 HO
1 8
O O OH
S O 2
O O
S S 3 6
7
O
4 5 OH O H3C O
NH2 HO HO HO
HO
OH
Tiomuscimol (12) Cistamina (13) Juniferdina (14) Análogo de Juniferdina (15) Rutina (16)
FIGURA 6
Estruturas químicas de inibidores da proteína dissulfeto isomerase (PDI) a partir de compostos sintéticos.Abreviaturas:DTNB: 5,50-Ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico); NEM:N-
etilmaleimida; PACMA: carbamoilmetilamida do ácido propinóico; PAO: Óxido de fenilarsina; pCMBS:p-sulfonato de cloromercuribenzeno.
atividades dessas proteínas se os resíduos de cisteína não estiverem baixa especificidade para PDI porque também reagem com outras
relacionados à sua função. Além disso, o composto radiomarcado3e seus proteínas contendo o motivo CXXC. Por exemplo, composto6foi relatado
análogos foram recentemente relatados como novos agentes potenciais de para inibir a proteína tirosina fosfatase (PTPase)[145] e Rho GTPase[146].
tomografia por emissão de pósitrons (PET) para imagens de PDI em câncer Na verdade, é um inibidor específico de PTPase amplamente utilizado.
[141].
RB-11-ca (4) Reagentes de sulfidrila
Uma 1,3,5-triazina RB-11- trifuncionalizadacerca de (4)foi identificado Uma série de reagentes sulfidrila foram relatados para inibir a atividade
como um inibidor covalente de PDI usando click-chemistry[142]. catalítica de PDI. Eles reagem com os grupos tiol livres em PDI e, portanto,
Curiosamente, composto4mostrou uma especificidade relativa para o atuam como inibidores irreversíveis. Geralmente, eles exibem especificidades
resíduo Cys53 do sítio ativo noumadomínio. Estudos de SAR mostraram relativamente baixas para PDI.
que a fração hidrofóbica (R3) é essencial para a seletividade de ligação do 5,50-Ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico) [DTNB (7)],conhecido como
composto4,porque um análogo (RB-20-ca)com hidrofobicidade reduzida reagente de Ellman, é um bloqueador de sulfidrila impermeável à
em R3liga-se a uma proteína celular diferente (aproximadamente 28 kDa) membrana. Demonstrou-se que inibe a ativação da toxina da difteria, um
que não foi identificada no estudo. processo que envolve a clivagem da ligação dissulfeto mediada pela PDI
Compostos contendo arsênico da superfície celular [147.148]. A inibição da ativação da toxina da difteria
Óxido de fenilarsina (PAO,5)é conhecido por reticular grupos sulfidrila pelo composto7foi semelhante à inibição de PDI por bacitracina ou
vicinais[143]e formar laços de coordenação através de seu As13 anticorpos anti-PDI[124].p-Sulfonato de cloromercuribenzeno (pCMBS,
com os tióis vicinais do motivo CXXC de proteínas como PDI 8)é outro sulfidril impermeável à membrana relatado para bloquear
[144]. Seu derivado para-amino, aPAO (6),mostrou prevenir a entrada do os grupos tiol em PDI e prevenir a ativação da toxina da difteria
HIV-1 nas células[37]. No entanto, esta classe de inibidores de PDI tem [148.149].
HO NH2 HO
OH
NH2
O O O HO O O
H H
S N N O O O
H2N N N N
H H H H2N OH
N HO
O O HN NH2
NH2
O OH O NH
O Ribostamicina(18)
HN
O

O HN O OH
NH
H
H2N N
O H H
HO O
H H H H
N
O NH HO HO
Bacitracina A(17) E1(19) E2(20)
O
EU H2N OH EU HN OH Cl Cl
CH3 CH3
HO O O HO O O HO C OH HO C OH
CH3 CH3
EU EU EU EU Cl Cl
T3(21) NO3(22) BPA(23) Tetraclorobisfenol A(24)

FIGURA 7
Estruturas químicas de inibidores da proteína dissulfeto isomerase (PDI) de metabólitos vegetais, antibióticos, hormônios e xenoestrogênios.Abreviaturas:NO3:N forma
acetilada de T3; BPA: bisfenol A; E1: estrona; E2: 17b-estradiol; T3: 3,30,5-triiodo-L-tironina.
Alquiladores e aldeídos insaturados, incluindo iodoacetamida atividade. Juniferdina e composto15demonstraram ser inibidores
(9),N-etilmaleimida (NEM;10),acroleína (11),tiomuscimol específicos da atividade da redutase da PDI sem inibição significativa da
(12)e cistamina (13),foram relatados para inibir a atividade redutase de sua atividade da oxidase. Além disso, a juniferdina mostrou inibição
PDI no ensaio de turbidez de insulina em pHs fisiológicos baixos[15.150]. insignificante de outras redutases da família PDI, ERp57 e ERp72, que
As análises de SAR mostraram que a substituição do enxofre por oxigênio compartilham o mesmo sítio ativo, CGHC. Apenas a juniferdina
no composto12ou redução do dissulfeto intramolecular no composto13 apresentou citotoxicidade pronunciada. Considerando que o
aboliram completamente suas atividades inibitórias, confirmando que silenciamento de PDI usando pequeno (si)RNA de interferência, pequeno
atuam como inibidores irreversíveis. gancho de cabelo (sh)RNA ou inibidores de PDI (por exemplo, compostos
1, 2e3)resultou em citotoxicidade [15.110.111.151], é possível que o
Metabólitos vegetais composto15é celular impermeável, instável ou facilmente metabolizado.
Juniferdina (14)e seus análogos Quercetina-3-rutinosídeo (16)
Juniferdina é um sesquiterpenóide originalmente isolado da planta Férula A quercetina-3-rutinosídeo também é conhecida como rutina, um produto
juniperina.Este produto natural foi identificado como um sucesso em um HTS natural pertencente à família dos flavonóis. É um composto polifenólico
de turbidez de insulina de 10.000 compostos RIKEN Natural Product vegetal amplamente consumido em alimentos diários, como trigo sarraceno,
Depository (NPDepo) para inibidores de PDI como agentes anti-HIV-1 frutas vermelhas, chá e vegetais. Um HTS de turbidez de insulina de uma
[118]. Estudos de SAR mostraram que o anel sesquiterpeno é essencial biblioteca de 4900 compostos identificou a rutina como um inibidor principal
para a atividade da juniferdina, pois a substituição por um 1-octil aboliu de PDI[152]. A rutina não se liga covalentemente ao PDI, pois mostrou inibição
completamente sua atividade inibitória, enquanto outras estruturas do reversível do PDI em um ensaio fluorimétrico. oKdo valor da ligação da rutina
anel, como ciclooctil, ciclododecil ou (1R)-mentil, mantêm atividade ao PDI foi de 2,8 micromolar. A análise de SAR indicou que a fração de açúcar é
modesta. Modificações no anel sesquiterpênico também afetaram a essencial para a atividade do composto. A rutina atua como um inibidor
atividade da juniferdina. Enquanto os estereoisômeros 9,10- relativamente específico. Embora tenha inibido PDI em 60% a 30 micromolar,
monoepóxido 1:1 apresentaram inibição semelhante à juniferdina, o apenas inibição insignificante (<10%) foi observada para outras
2,3,9,10-diepóxido ou o 4,9,10-triidroxi não apresentaram inibição, e o oxidorredutases compartilhando o sítio ativo CGHC de PDI, incluindo ERp5,
2,3-monoepóxido e o estereoisomérico O derivado 4,9,10-trihidroxi ERp57, ERp72, tiorredoxina e tiorredoxina redutase. Embora a deleção
exibiu uma inibição 15 e 11 vezes menor, respectivamente. Composto15 genética de PDI seja tóxica para as células[15.110.111.151], a incubação de
carregando um 9,10-monoepóxido mostrou atividade semelhante à células endoteliais cultivadas com rutina a 100 micromolar por > 72 horas não
juniferdina, com um IC50valor de 0,167 micromolar. op-grupo mostrou toxicidade, sugerindo que tem baixa permeabilidade celular e pode
hidroxibenzoato também é importante para a atingir
PDI extracelular. De fato, a rutina foi testada em dois ensaios clínicos. O Outros antibióticos
protocolo NCT00003365 avaliando o efeito da rutina na prevenção do Com base na descoberta da ribostamicina como um inibidor de
câncer de cólon foi encerrado. Os resultados do protocolo NCT01254006 chaperona de PDI, um painel de outros antibióticos também foi rastreado
examinando o efeito da rutina em combinação com forscolina e por sua capacidade de inibir a atividade de chaperona de PDI[160]. Vários
vitaminas B1 e B2 ainda não foram divulgados. foram encontrados para ligar PDI em doses notavelmente altas, incluindo
vancomicina (Kd= 206 micromolar), sisomicina (Kd= 392 micromolar),
Antibióticos neomicina (Kd= 872 micromolar), gentamicina (Kd= 904 micromolar),
Bacitracina
canamicina (Kd= 1,05 mM) e estreptomicina (Kd= 1,25 mM). Todos eles
O antibiótico dodecapeptídeo cíclico bacitracina foi relatado em 1981 inibiram a atividade de chaperona de PDI. Em particular, a vancomicina e
como o primeiro inibidor de PDI[153]. Desde então, tem sido a sisomicina inibiram suficientemente a atividade da chaperona em uma
amplamente utilizado em estudos da bioquímica de PDI, bem como seu razão molar de 100:1 de antibiótico para PDI. Ainda não está claro se
papel em vários eventos celulares e serve como controle padrão em esses compostos se ligam e inibem a PDIna Vivoou se a inibição de PDI
testes de inibidores de PDI[118]. A bacitracina natural é produzida por contribui para suas ações antibióticas.
certas cepas deBacillus licheniformiseBacillus subtiliscomo uma mistura
de mais de 22 peptídeos estruturalmente relacionados[154]. Entre eles, a Hormônios
bacitracina A (17)é o principal análogo[59], e B, F e H também são de Estrogênios
abundância relativamente alta em misturas comerciais de bacitracina Em uma concentração de 1 micromolar, vários estrogênios
[155]. MALDI-TOF/TOF MS demonstrou que a bacitracina se liga ao PDI demonstraram inibir a atividade redutase de PDI em mais de 30%,
através da formação de ligações dissulfeto entre uma forma de tiol incluindo estrona (E1,19,56%), 17b-estradiol (E2,20,55%), dietilestilbestrol
aberta do anel tiazolina da bacitracina e Cys314/345 na ligação ao (DES, 45%) e estriol (E3, 38%). Além disso, E.1e E2também inibiu a atividade
substratob0domínio[155]. Outro estudo confirmou que a bacitracina não da isomerase[161]. Não foi observada inibição significativa da atividade
inibe a atividade da redutase do agente catalítico isoladouma domínio da chaperona[137]. Curiosamente, os segmentos de sequência de
[59]. A bacitracina não é específica para PDI, pois se liga e inibe outras aminoácidos na PDI têm alta similaridade com o domínio de ligação ao
proteínas com ou sem atividade de PDI. Por exemplo, a bacitracina (1 estrogênio no receptor de estrogênio (ER), mas não com os domínios
mM) inibiu completamente a atividade oxidase da fibronectina (FN) no esteróides dos receptores de progesterona e glicocorticóides ou com a
ensaio de oxidação da RNase, mas apenas 25% no PDI[156]. Um estudo tiorredoxina[161]. Foi ainda confirmado que o PDI tem um E2
recente examinou extensivamente a bacitracina em diferentes ensaios de local de ligação (Kd= 2,1 0,5 micromolar) que é distinto do peptídeo/
atividade de PDI[59], mostrando que a bacitracina não inibiu proteína e dos sítios de ligação da bacitracina[137]. Um estudo recente
significativamente a atividade de oxidase de PDI no ensaio de oxidação propôs um E2-modelo de ligação em que o E2ligado a uma bolsa
de peptídeos, ou a atividade de isomerase no ensaio de redobragem de hidrofóbica compreendendo principalmente ob0domínio e parcialmente
BPTI. No ensaio de agregação de proteínas, a bacitracina impediu o obatravés da formação de uma ligação de hidrogênio entre o grupo 3-
redobramento de rodanês da agregação de maneira independente de hidroxila de E2e seus 256 de PDI[162]. Além disso, E.2, 17uma-E2e DES
PDI sem um efeito significativo sobre sua atividade chaperona, enquanto também são inibidores potentes da ligação da somatostatina ao PDI[163]
inibiu a atividade chaperona de BiP, uma chaperona molecular residente .
no RE.[59]. No entanto, outro estudo mostrou que a bacitracina (15 Hormônios da tireóide
micromolar) inibiu a atividade chaperona de PDI sem ter um efeito 3,30,5-Triiodo-L-tironina também é conhecido como triiodotironina ou T3(
substancial na agregação de substrato na ausência de PDI no ensaio de 21).É um hormônio da tireoide que se liga ao receptor nuclear cerbA e
agregação de proteína[137]. No ensaio de turbidez da insulina, a tem papéis importantes em vários processos biológicos, como
bacitracina inibiu a atividade da redutase de PDI, bem comoE. coliDsbC crescimento celular, desenvolvimento e diferenciação, metabolismo
de maneira dose-dependente na faixa milimolaratravés dacompetição de energético e regulação da temperatura corporal e frequência cardíaca.
ligação do substrato[59]. Por isso, é necessário reavaliar ana Vivoefeitos [164]. Estudos usando um reagente de marcação de afinidadeN-bromoacetil-
da bacitracina e sua relação com PDI. Os efeitos fora do alvo da 3,30,5-[125I]triiodo-L-tironina (BrAc[125ISTO3) identificaram um
bacitracina devem ser considerados para seu uso futuro em estudos de polipeptídeo de 55 kDa como um T principal3proteína de ligação (T3
PDI. Embora amplamente utilizada em pesquisas sobre doenças BP) que foi confirmado como PDI[165–167]. No equilíbrio, T3liga PDI
associadas a PDI por décadas, a bacitracina não conseguiu entrar em em dois sites independentes[137.168]. Guthapfelet ai.mostrou que,
ensaios clínicos principalmente devido à sua baixa permeabilidade celular enquanto o primeiro sítio de ligação exibiu alta afinidade e pode ser
[157]e sua nefrotoxicidade[158]. saturado em T quase fisiológica3concentrações com umKdde 21 nM,
Ribostamicina (18) teve um B notavelmente baixomáximo(1,8 mmol T3/mol de monômero
Produzido porStreptomyces ribosidificus,A ribostamicina é um antibiótico PDI), implicando que T3a ligação é principalmente inespecífica; o
aminoglicosídeo que é eficaz contra cepas Gram-positivas e Gram- segundo sítio de ligação tinha baixa afinidade e era insaturado em
negativas. Utilizando uma cromatografia em coluna de afinidade de até 100 micromolar[168]. Mais tarde, Primet ai.relatou que os dois T3
proteínas em fígado bovino, a PDI foi identificada como o principal alvo sítios de ligação em PDI tiveram afinidade comparável, comKdvalores de
proteico de ligação de18[138]. A ribostamicina foi o primeiro inibidor 4,3 1,4 micromolar[137].
relatado da atividade chaperona de PDI, mas não tem efeito significativo PDI também se liga a uma ampla variedade de T3análogos, incluindo DT3,
sobre sua atividade isomerase, indicando que a ribostamicina não se liga 3,30,5-triiodotiropropionato, 3,30,5-triiodotiroacetato, 3,5-diiodo-L-
ao sítio ativo. A ribostamicina se liga não apenas ao PDI, mas também a tirosina, L-tironina e 3,5-diiodo-L-tironina. No entanto, estes
outras proteínas celulares, como o RNA ribossômico 16S, causando erros análogos não mostraram inibição significativa de PDI na mediação
de tradução[159]. do redobramento de RNase; nem tiveram qualquer efeito sobre
a atividade de acompanhante[137]. Por outro lado, Guthapfelet ai.mostrou foi documentado. A PDI é altamente expressa em tipos de câncer selecionados,
que T3inibiu a PDI na mediação do redobramento de RNase sob condições suporta o crescimento do tumor e está associada a resultados clínicos. Portanto, o
semelhantes, com uma constante de inibiçãoKeude 1,3 0,5 micromolar PDI é um potencial alvo de drogas para a terapia do câncer.
[168]. A capacidade de T3para inibir PDI (IC50= 3,49 micromolar) foi Atualmente, não há inibidores de PDI na clínica. As funções exatas da
ainda suportado por Hirolet ai.[163]. A relevância fisiológica da PDI em muitas doenças precisam de caracterização adicional antes que
inibição da atividade redox PDI não é clara porque T3está em os ensaios clínicos possam ser realizados. Além disso, tem havido falta de
concentração nanomolar nas células, mas tem uma altaKeupara PDI inibidores de PDI potentes e seletivos para o desenvolvimento clínico. A
[168]. NO3(22),umN-forma acetilada de T3, inibiu a clivagem redutiva bacitracina, o primeiro inibidor de PDI, não conseguiu entrar em ensaios

catalisada por PDI da célula ligada à superfície [125I] tiramina-SS- clínicos devido à sua toxicidade fora do alvo e fraca permeabilidade
poli(D-lisina) (IC50= 70 micromolar) e entrada do HIV-1 nas células celular. O desenvolvimento de ensaios robustos de atividade de PDI
hospedeiras[37]. levou às recentes descobertas de uma série de novos inibidores de PDI,
Xenoestrogênios como os inibidores irreversíveis PACMA 31, 16F16 e RB-11-ca,e os
Os xenoestrogênios são compostos químicos que imitam o estrogênio. inibidores reversíveis juniferdina e rutina. Esses novos inibidores de PDI
Bisfenol A [2,2-bis-(4-hidroxifenil)propano; BPA;23]é um monômero provaram ser potentes em modelos de doenças de câncer, HD, infecção
industrial sintético versátil para fabricação de plástico [169.170]. Como por HIV-1 e trombose, e são ferramentas úteis para explorar ainda mais a
um produto químico desregulador de hormônios, ele se liga fortemente biologia de PDI. Embora seja necessária uma avaliação adicional de sua
e ativa o receptor relacionado ao estrogêniog (ERRAR-g) (Kd= 5,5 nM) especificidade para PDI e seus efeitos fora do alvo, eles podem servir
[171]. O PDI foi identificado como outro alvo importante em uma como pistas para otimização adicional para selecionar candidatos viáveis
tela para proteínas de ligação ao BPA no cérebro de ratos[163]. O para estudos clínicos.
BPA liga-se tanto a ratos recombinantes (Kd= 22,6 6,6 micromolar) e A função de PDI é importante para a homeostase celular normal e, como
PDI humano (Kd= 17,51 3,93 micromolar). Embora o BPA tenha uma tal, pode haver preocupações no desenvolvimento de inibidores de PDI como
afinidade menor para o local de ligação do hormônio no PDI em estratégia terapêutica. Sob condições fisiológicas normais, a expressão de PDI
comparação com o E2(Kd= 2,1 0,5 micromolar[137]) e T3(Kd= 4,3 1,4 é fortemente regulada. No entanto, as células cancerosas requerem níveis
micromolar[137]), é um inibidor competitivo da ligação de PDI a E2e mais altos de PDI para lidar com o estresse significativo do RE e um aumento
T3. Um análogo, tetraclorobisfenol A (24),foi relatado como o mais global na síntese de proteínas para sustentar a rápida proliferação. O aumento
potente inibidor de T3ligação ao PDI com um IC50valor de 0,2 da síntese de proteínas leva a uma abundância de proteínas mal dobradas no
micromolar, 100 vezes menor que o BPA[172]. O local de ligação ao RE que precisam ser redobradas por PDI. Como tal, as células cancerosas são
BPA está localizado dentro doumaeb0domínios e ob0domínio mais vulneráveis à inibição de PDI do que as células normais. Além disso,
contribui para a sua inibição de PDI[173]. devido a essa maior demanda de energia, as células cancerosas produzem
altos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS), exacerbando o estresse do
Observações finais RE. Essa atividade diferencial de PDI entre células normais e cancerosas pode
Estrutura e arquitetura de domínio, reações redox bioquímicas, ser direcionada por drogas de pequenas moléculas. Na verdade, estudos
papéis fisiológicos e o envolvimento de PDI em várias doenças têm recentes usando PACMAs demonstraram claramente que os inibidores de PDI:
sido amplamente estudados durante as últimas décadas. A (i) induzem ROS; (ii) acumulam-se nos tecidos tumorais; (iii) mostrarna Vivo
desregulação da expressão do gene PDI, modificação pós- eficácia em xenoenxertos de camundongos; e (iv) não apresentam toxicidade
traducional ou atividade enzimática resulta em várias doenças no animal inteiro. Portanto, acreditamos que o PDI é um alvo importante para
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domínio de ligação ao substrato.FEBS J.278, 2034-2043 vitamina K1.J. Biol. Química282, 2626-2635
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AVALIAÇÕES Descoberta de drogas hoje-Volume 19, Número 3-Março 2014

Proteína dissulfeto isomerase: um alvo promissor

para gerar novos candidatos a medicamentos para estudos clínicos.

Autor correspondente:Neamati, N. (neamati@umich.edu)

PDIA1(PDI, P4HB) CGHC CGHC

PDIA2(PDIp) CGHC CTHC

PDIA3(ERp57, GRP58) CGHC CGHC

PDIA4(ERp72) CGHC CGHC CTHC

PDIA5(PDIr) CSMC CGHC CPHC

Avaliações-REVISÃO DA PALAVRA BÁSICA

PDIA7(PDILT) SKQS SKKC

PDIA15(ERp46) CGHC CGHC CGHC

PDIA16(ERp19, AGR1) CGAC

PDIA17(ARG2, HAG-2) CPHS beb′domínios:

PDIA19(ERdj5) CSHC CPPC CHPC CGPC

CGHC CGHC KDELGenericName

uma b b′′ uma′′c

18 24 134 136 233 235 349 369 479 508

Estruturas atualmente disponíveis de domínios isolados em PDI

4EL1 aba0x (oxidado) Raio X 2,88 2012 [48]

4EKZ aba0x (reduzido) Raio X 2,51 2012 [48]

3 UEM bb0-xa0 Raio X 2,29 2011 [43]

2K18 bb0 RMN N / Duma 2008 [44]

3BJ5 b0-x Raio X 2.2 2007 [45]

1X5C uma0 RMN N/D 2005 N/D

2BJX b RMN N/D 1998 [46]

1MEK uma RMN N/D 1996 [47]

umaN/A: não aplicável.

Avaliações-REVISÃO DA PALAVRA BÁSICA

Descoberta de drogas hoje

(uma) Rickman_Brain Gutmann_Brain TCGA_Brain Shai_Brain Sun_Brain Bredel_Brain

log2 centrado na mediana

log2 centrado na mediana

log2 centrado na mediana

log2 centrado na mediana

log2 centrado na mediana

0,0 3,5 0,0 0,0 0,0 - 2,5

Avaliações-REVISÃO DA PALAVRA BÁSICA

(b) Basso_Linfoma Compagno_Linfoma Piccaluga_Lmphoma

log2 centrado na mediana

log2 centrado na mediana

log2 centrado na mediana

log2 centrado na mediana

log2 centrado na mediana

log2 centrado na mediana

2,0 4,0 0,0

(e) Welsh_Prostate Singh_Prostate (f) Beer_Lung (g) Korkola_Seminoma

log2 centrado na mediana

log2 centrado na mediana

log2 centrado na mediana

4,0 - 5,0 3,0 0,0

Descoberta de drogas hoje

PDI baixo (N = 274) 80 PDI alto (N = 14)

80 PDI alto (N = 147)

Nossa hipótese é que o estresse do RE contribui para a citotoxicidade Ensaio fluorimétrico

Avaliações-REVISÃO DA PALAVRA BÁSICA

GSH ou TDT sobrenadante

(e) Leve Leve Extinção Leve (f)

Descoberta de drogas hoje

(micromolar) permeabilidade inibição de PDI Inibição de PDI

cancro do ovário; não

Avaliações-REVISÃO DA PALAVRA BÁSICA