Vigilância de Rotavirus e de outros Enteropatógenos em Crianças com Menos de 5 anos

no Distrito da Manhiça

Investigador Principal: Inácio Mandomando

Co-Investigadores Principais: Tacilta Nhampossa e Maria Manaca

Outros investigadores: Filomena Manjate, Sozinho Acácio, Delfino Vubil, Nilsa de Deus,
Marcelino Garrine, Pedro Alonso

Colaboradores:

Center for Disease Control and Prevention (CDC) Atlanta: Umesh Parashar e Jacqueline Tate

World Health Organization (WHO) Regional Office for Africa: Jason Mwenda

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Lista de Abreviaturas

AIDS- Acquired imune deficiency syndrome

BGS- Buffered glicerol saline

bp- pares de bases, do inglês base pair

CDC- Centers for Disease Control and Prevention

CIBS-CISM- Comité Institucional de Bioética para Saúde do Centro de Investigação em Saúde

de Manhiça

CISM- Centro de Investigação em Saúde de Manhiça

CNBS- Comité Nacional de Bioética para Saúde

DNA- Ácido desoxirribonucleico

EAEC- Escherichia coli Enteroagregativa

EHEC- Escherichia coli Enterohemorágica

EIEC- Escherichia coli Enteroinvasiva

ELISA- Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

EPEC- Escherichia coli Enteropatogénica

GEMS- Global Enteric Multicenter Study

HDM- Hospital Distrital da Manhiça

HIV- Virus de imunodeficiência Humana

IL8- interleucina 8

OMS- Organização Mundial da Saúde

OMS-AFRO- Organização Mundial da Saúde na região de África

OTUs- Operacional taxonomic units

PCR- Reacção em cadeia de polimerase, do inglês Polymerase chain reaction

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RNA- Ácido ribonucleico

RRV-TV- Rhesus-Human Reassortant RotavirusTetravalent Vaccine

RT-PCR- Reacção de transcrição reversa-reacção em cadeia da polimerase, do inglês Reverse

transcription- polymerase chain reaction

STEC- Escherichia coli produtora de shiga-toxina

ST-ETEC- Escherichia coli contendo toxina termo estável

SVD- Sistema de vigilância demográfica

TAC- Taq Man Array Card

UK- United Kingdom

USA- Estados Unidos de América, do inglês United States of America

VP- proteína viral, do inglês viral protein

XLD- Agar Xilose Lisina Desoxicolato

FDA- Food drug administration

TCBS- Tiossulfato-citrato-bilis-sacarose

TSI- Triplo ferro açúcar

S-S- Salmonella-Shigella agar

CIN- Cefsulodin Irgasan Novobiocin agar

MSD- Moderate-to-severe diarrhea

LSD- Less-severe-diarrhea

Resumo

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Rotavirus é a principal causa de diarreia severa em crianças com menos de 2 anos de idade.
Por outro lado, o interesse pelos dados sobre o peso de gastroenterites por rotavirus tem
crescido devido a recente disponibilidade de nova geração de vacinas seguras e eficazes
contra rotavirus, recomendadas pela organização mundial da saúde (OMS) para a sua
introdução nos programas alargados de vacinação a nível mundial. Em Moçambique, a vacina
contra rotavirus foi introduzida em Setembro de 2015; portanto ter dados antes e depois da
introdução da vacina é crucial para poder monitorar o impacto da vacina.
Dados de base sobre rotavirus estão disponíveis em poucos lugares no país: No distrito da
Manhiça através do estudo sobre diarreias conhecido por “Global Enteric Multicenter Study
(GEMS)” realizado entre Dezembro de 2007 a Novembro de 2012. Através do GEMS foi
possível documentar alto peso de rotavirus, particularmente em crianças com menos de 1 ano
de idade, sugerindo que a introdução da vacina contra rotavirus nas melhores condições
poderia reduzir em 35% do total de casos de diarreias moderadas-a-grave, neste grupo etário e
aproximadamente 20% das diarreias menos severa. Contudo dados preliminares dos genótipos
circulantes na Manhiça, sugerem uma grande diversidade de estirpes com as combinações do
genótipo G12 (que não está incluso nas vacinas disponíveis) sendo o mais prevalente. Para
além de rotavirus, Cryptosporidium spp, Shigella spp, Vibriocholerae e Escherichia coli
contendo a toxina termo-estável (ST-ETEC) foram também encontrados estando associados á
diarreia moderada-a-grave, bem como as diarreias menos graves (LSD, em sigla inglesa) em
grupos de idades específicos. Isto reforça a necessidade de medir de forma precisa a
contribuição específica de cada patógeno no peso das diarreias, para permitir estimar o
impacto de futuras intervenções de acordo com a severidade da doença. Portanto, é crucial
manter uma vigilância contínua sobre doenças diarreicas, particularmente aquelas associadas
a rotavirus e outros enteropatógenos (mencionados acima e possíveis novos) no distrito da
Manhiça, de modo a medir o impacto da vacina contra rotavirus, e, monitorar as tendências
epidemiológicas ao longo do tempo, incluindo possíveis mudanças ou surgimento de novos
genótipos de rotavirus e/ou reassortamente (combinação de estirpes derivados de animais com
as estirpes humanas). No presente estudo, pretendemos estabelecer uma vigilância contínua
para doenças diarreicas com enfoque aos patógenos frequentemente associados a diarreias
(rotavirus, Cryptosporidium spp, Shigella spp, V. Cholerae e E. coli), e avaliar o impacto da
vacina contra rotavirus introduzida em Moçambique em 2015.

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1. Introdução
Rotavirus constitui uma das principais causas de gastroenterites grave e desidratação em
crianças em todo mundo. São responsáveis por significante morbidade e mortalidade nos
países em desenvolvimento. Em 2008, das estimadas 453,000 mortes em crianças <5 anos de
idade a nível global, mais de metade (N=230,000) ocorreram em África 1.Cinco dos dez países
com elevados casos de mortalidade por rotavirus e 9 dos 10 países com mortalidade mais alta
estão em África1.
Recentemente rotavirus foi reportado entre as principais causas de diarreia moderada-a-grave
nos países em desenvolvimento (4 Africanos incluindo Moçambique e 3 Asiáticos) em crianças
com menos de 1 ano de idade 2. Nesse estudo, casos de diarreias atribuíveis a rotavirus foram
remarcáveis em crianças Moçambicanas, onde aproximadamente 35% do total dos casos de
diarreia moderada-a-grave2 e 20% de diarreia menos grave (LSD) (Acacio, Manuscrito em
preparação) poderiam ser atribuíveis a rotavirus nas crianças dos 0-11 meses de idade.
Por outro lado, o interesse pelos dados sobre o peso de gastroenterites por rotavirus tem
crescido devido a recente disponibilidade de nova geração de vacinas seguras e eficazes
contra rotavirus3,4. Portanto, a OMS da região Africana (OMS-AFRO) estabeleceu uma rede de
vigilância de rotavirus com o objectivo de apoiar os países a documentar o peso de rotavirus
em África5. Os dados recentemente publicados reforçam a existência de alto peso de rotavirus
e dão uma breve ideia sobre a diversidade genética de estirpes de rotavirus circulante em
África6,7,dados importantes para predizer o impacto da vacina contra rotavirus sobre as estirpes
circulantes na região. Além disso, em África foi demonstrado mudança recorrente de genótipos
de rotavirus circulantes (por exemplo em Kenya) incluindo o surgimento de G12 8. Baseado em
parte no alto peso da doença e custos associados, em Agosto de 1998, a vacina de rotavirus
com boa eficácia na fase pré-clínica foi licenciada nos Estados Unidos da América (USA)
(RRV-TV, Rotashield, Wyeth Lederle Vaccines, U.S.A.). Contudo, em Outubro de 1999, a
vacina foi retirada do mercado devido a intussuscepção, um bloqueio intestinal potencialmente
fatal identificado depois do licenciamento. A OMS recomenda duas novas vacinas – RotaTeq
(Merck) e Rotarix (Glaxo Smith Kline Biologicals, Rixensart, Belgium) – para todas crianças a
nível mundial. Ensaios clínicos pré-licenciamento de cada uma dessas vacinas mostraram boa
eficácia contra rotavirus grave e boa segurança em relação a intussuscepção, contudo,
monitorar os efeitos adversos destas no regime de uso no sistema de vacinação dos países é
crucial.
Em Moçambique, dados disponíveis sobre o peso de rotavirus do distrito da Manhiça reforçam
a existência de alto peso de rotavirus, particularmente em crianças com menos de 1 ano de

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idade, sugerindo que a introdução da vacina contra rotavirus em melhores condições poderia
prevenir aproximadamente 35% do total dos casos de MSD e 20% de LSD em crianças com
menos de 1 ano de idade2. Contudo, dados preliminares sobre os genótipos circulantes na
Manhiça mostraram grande diversidade genética com predominância do genótipo G12 (que
não está incluso nas actuais vacinas disponíveis). Por outro lado, patógenos como
Cryptosporidium spp, Shigella spp, V. Cholerae e E. coli foram encontrados como relevantes
em associação com MSD e LSD, em grupos de idades especifica 2. Dados de base são cruciais
para avaliar e monitorar o impacto da introdução da vacina contra rotavirus em Moçambique
(introduzida em Setembro de 2015). Mais ainda, uma sub-análise de amostras de fezes do
estudo GEMS de 4 países postulou possíveis novos patógenos que podem explicar os cerca de
50% de casos de diarreia moderada-a-grave que não foram atribuíveis a nenhum patógeno. A
razão disto é que algumas causas de diarreia podem requerer que haja interacção de duas
bactérias para causar doença e estes podem incluir Haemophilus e Streptococcus.  Dados
preliminares da análise da micróbiota intestinal de GEMS indicam que S. mitis e H. influenzae,
mas não S. mitis e H. Para influenzae causam destruição da camada única das células T84 e
induzem a libertação de IL8. H. Influenzae não é encontrado no intestino, mas sinais de algo
relacionado a Haemophilus pode estar lá. Para encontrar esta causa possível de diarreia
precisamos de colher Haemophilus de amostras de fezes (Lindsay, inpress Emer. Infect. Dis.).
Portanto é crucial manter uma vigilância contínua de doenças diarreicas, particularmente
causadas pelos patógenos mencionados acima (rotavirus, Cryptosporidium spp., Shigella spp.,
V. Cholearae e E. coli, bem como explorar os possíveis novos patógenos que causam diarreia)
na Manhiça e medir o impacto da vacina contra rotavirus, bem como monitorar tendências ao
longo do tempo e possíveis mudanças ou emergência/surgimento de novos genótipos de
rotavirus e/ou recombinação de estirpes maioritariamente derivados de animais com estirpes
humanas. Portanto, na vigilância ora estabelecida sobre doenças diarreicas na Manhiça,
pretendemos incluir a componente de avaliação do impacto da vacina contra rotavirus
introduzida em Moçambique em Setembro de 2015.

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2. Objectivos
2.1. Objectivo principal
 Estabelecer uma vigilância de diarreias (causadas por rotavirus e outros
enteropatógenos) em crianças com menos de 5 anos de idade no hospital distrital de
Manhiça

2.2. Objectivos específicos

 Monitorar a incidência de hospitalização e consultas externas associadas a
diarreias particularmente por rotavirus, Cryptosporidiums pp, Shigella spp, V.
Cholerae e E. coli em crianças menores de 5 anos de idade;
 Descrever a epidemiologia (distribuição de idade, sazonalidade, tendências temporais)
de diarreias associadas a rotavirus, Cryptosporidium spp, Shigella spp, V. Cholerae e E.
coli em crianças com menos de 5 anos de idade;
 Documentar a prevalência e tendência de estirpes de rotavirus, Cryptosporidium spp,
Shigella spp, V. cholerae e E. coli circulantes na população em estudo;
 Explorar possíveis novos patógenos tais como Haemophilus e Streptococcus mitis como
causa de diarreia;
 Realizar a caracterização molecular de estirpes circulantes de rotavirus,
Cryptosporidium spp, Shigella spp, V. Cholerae e E. coli;
 Avaliar o impacto da introdução da vacina contra rotavirus;
 Estimar a efectividade da vacina de rotavirus contra episódios de diarreias não
graves e genótipos específicos;
 Avaliar os factores de risco para infecção por rotavirus e outros enteropatógenos.

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3. Materiais e métodos
3.1. Área de estudo e população
O estudo será conduzido pelo CISM no hospital distrital da Manhiça (HDM), uma unidade de
referência para o distrito, uma zona rural localizada a 80Km a norte da província de Maputo, no
sul de Moçambique. O clima da área é subtropical com duas estações bem distintas: uma
estação chuvosa entre Novembro a Abril, e estação seca e fria durante o resto do ano. O
distrito tem uma população aproximada de 160,000 habitantes. A descrição geográfica e as
características sócio demográficas da comunidade em estudo foram descritas previamente 9. A
malária é maioritariamente devido a Plasmodium falciparum10 e a prevalência de HIV
11
determinada na base de estudos transversais na população adulta é alta (39.9%) . O CISM
tem conduzido de forma contínua um sistema de vigilância demográfica (SVD) nesta área
desde 1996 que até 2013 envolvia aproximadamente 92,000 habitantes12, e actualmente
178,000 habitantes. O CISM está adjacente ao HDM, e desde 1997 juntamente com o hospital
tem realizado o seguimento das consultas externas e internamentos durante 24h dos doentes
com menos de 15 anos de idade hospitalizados no HDM. Nesta área, as diarreias representam
aproximadamente 20% de todos internamentos em pediatria e constituem a quarta causa de
morte em crianças entre 12-59 meses de idade13.

3.2. Vigilância das doenças diarreicas

Dentro do sistema de vigilância bacteriana invasiva em curso, pretendemos incluir a
vigilância de doenças diarreicas a todos casos que são atendidos no Hospital Distrital da
Manhiça (HDM) e estender para o Centro de Saúde da Maragra (CSM) e o Hospital Rural
de Xinavane (HRX). Assumindo que o nosso maior interesse são os patógenos que mais
contribuíram no peso das diarreia (MSD e LSD), a destacar, rotavirus, Cryptosporidium e
outros 1, onde rotavirus foi encontrado em 32% das crianças (de forma global) com MSD
e 22% em crianças com LSD. A vigilância incluirá todos os casos de diarreias atendidos
nas consultas externas (LSD) e internados por diarreia severa (MSD). Todas crianças
menores de 59 meses com diarreia e atendidas no HDM, CSM e HRX serão convidadas e
recrutadas para o estudo. O recrutamento será em ambas consultas externas (se
produzem amostra) e internados que cumpram com os critérios de inclusão, o HIV não
será critério de exclusão. Um questionário padrão com dados de identificação, demográficos
e clínicos será administrado para todas crianças que os pais ou cuidadores primários aceitarem
e assinarem o consentimento informado e as amostras de fezes serão colhidas para
identificação de enteropatogenos.

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3.2.1. Definições
 Diarreia definida como três ou mais dejecções nas últimas 24horas
 Diarreia moderada-a-grave (MSD) definida como crianças com diarreias que se apresentam
a unidade sanitária com sinais de gravidade:
o Desidratação moderada a grave com
 Olhos encovados mais que o normal
 Prega cutânea diminuída
 Crianças que requerem rehidratação intravenosa
 Diarreia como um dos diagnósticos de internamento
 Diarreia com sangue
 Diarreias menos graves (LSD) – crianças com diarreias, sem nenhum dos pontos de
gravidade descritos acima.
 Caso suspeito de gastroenterites: uma criança <5 anos de idade, que é admitida no hospital
para tratamento de gastroenterites
 Caso confirmado de rotavirus: um caso suspeito com confirmação de rotavirus nas fezes
por técnicas de ELISA.
 Gastroenterites: Ocorrência aguda de pelo menos 3 dejecções aquosas ou liquidas em 24h
e/ou dois ou mais episódios de vómitos inexplicável por outras causas. Ocorrência aguda é
definida como sintomas com menos de 7 dias de início até a data da consulta. Os agentes
de medicina geral das unidades sanitárias farão diagnóstico de gastroenterites.
 Diarreia com sangue (disenteria): Episódio de diarreia com perda de fezes moles ou
líquidas contendo sangue visível.
 Desidratação:
o Desidratação grave: dois ou mais dos seguintes sinais:
 Letargia ou inconsciência
 Olhos encovados
 Prega cutânea reduzida
 Incapacidade de beber ou beber com dificuldades
o Alguma desidratação: dois ou mais dos seguintes sinais:
 Irritado, agitado
 Olhos encovados
 Prega cutânea reduzida.

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  Sedento
o Sem desidratação: sem sinais suficientes para classificar como alguma ou
desidratação grave.
 Caso elegível de diarreia – criança que tenha diarreia com menos de 7 dias de evolução
atendida na unidade sanitária que cumpra os critérios da diarreia moderada-a-grave ou
diarreia menos severa
 Controlo criança menor de 5 anos de idade recrutada na comunidade pareada por idade,
sexo, residência, livre de diarreia nos últimos 7 dias e recrutada dentro de 14 dias desde
apresentação do caso índice

3.2.2. Critérios de inclusão

 Criança entre 0-59 meses de idade

 Residente na área de vigilância demográfica do CISM

 Atendida numa das unidades sanitárias (postos sentinelas: Manhiça sede, Maragra e
Xinavane)
 Diarreia com menos de 7 dias de evolução

 Que cumpra com critérios de diarreia severa

o Olhos encovados mais que o normal
o Prega cutânea diminuída
o Crianças que requerem rehidratação intravenosa
o Diarreia como um dos diagnósticos de internamento
o Diarreia com sangue

 Diarreias menos severa como definido anteriormente

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3.2.3. Tamanho da amostra/amostragem
Como parte da vigilância contínua o tamanho de amostra será por conveniência e
baseado na experiência do GEMS, esperamos recrutar entre 100 e 500 casos por ano dos
0-59 meses de idade.
Para estimar a efectividade da vacina, foi calculado o tamanho de amostras para
alcançar um poder de 80% a um nível de significância de 5%, usando os seguintes
parâmetros e assunções

 Detectar um “odds ratio” de aproximadamente 0.6 ou efectividade de vacina de 40%

 O ratio do caso: controlo de 1:2

 Uma cobertura vacinal de 80% para uma série completa por controlos elegíveis por
grupos etários
Usando esses parâmetros e pressupostos, seriam necessários aproximadamente 242
casos positivos de rotavirus e 574 controlos comunitários para demonstrar a eficácia da
vacina de ≥40%. No entanto, dada a incerteza da introdução de vacina e de cobertura na
população e a eficácia da vacina no campo, examinámos uma vasta gama de cenários
(Tabela 1). Com base nestas estimativas, esperamos recrutar um número suficiente de
casos durante o período de tempo de avaliação para detectar a eficácia da vacina de pelo
menos 40% ou mais, se a cobertura vacinal for entre 30% e 90% (Tabela 1). O
recrutamento de casos vai continuar, independentemente dos números obtidos ao longo
do período de duração do projecto. O recrutamento dos casos de pacientes e controles
adicionais irá permitir análises adicionais, tais como cálculos de efectividade da vacina
específica do genótipo.

Tabela 1. Tamanho da amostra de casos* 1 para detectar uma determinada eficácia da

vacina por cobertura vacinal esperada de 2: 1 de correspondência.

3.2.5. Consentimento informado

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Um consentimento informado escrito será obtido dos pais ou cuidadores de todas as crianças
que entrarem para o estudo, tanto dos casos, assim como dos controlos, antes de colheita de
amostras. Só será administrado o consentimento depois de terem recebido suficiente
informação sobre o estudo e terem demonstrado que entenderam o estudo. O consentimento
informado será composto num simples formato fácil de entender usando língua local ou
português. Depois da sessão do consentimento, os pais ou cuidadores da criança terão
oportunidades de fazer perguntas sobre o estudo. Os formulários serão documentos através de

Eficacia Cobertura esperada da vacina

estimada da
vacina 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90%

80% 38 29 24 21 20 21 29

70% 57 45 38 34 34 38 58

60% 88 70 61 58 59 69 109

50% 143 116 103 99 105 126 205

40% 247 205 186 182 196 242 404

30% 483 407 375 375 412 518 882

3.2.4. Colheita de amostras

Crianças entre 0-59 meses de idade com diarreia menos grave e moderada-a-grave, serão
recrutadas para o estudo, depois do consentimento informado ser oferecido a mãe ou cuidador
primário da criança. Amostras de fezes serão colhidas em frascos estéreis apropriados e uma
porção de fezes será alicotada e colocada em solução salina tamponada (BGS) e cary-blair que
são meios de transporte e armazenadas a 4°C até o tempo de envio ao laboratório do CISM
para respectivo processamento. As alícotas de BGS e cary-blair serão processadas para o
isolamento de bactérias enquanto a amostra completa será armazenada a -80°Cpara futuras
caracterizações para determinação dos genótipos de rotavirus.

Para cada criança recrutada no hospital, um a três controlos serão recrutados na

comunidade pareados por idade (±2 meses para crianças de 4 meses e ±4 meses para
crianças maiores de 4 meses), sexo e residência, depois de um consentimento

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assinatura ou impressão digital para pacientes que não sabem assinar. O documento original
assinado ou com impressão digital será mantido no centro.

3.2.6.Colheita de dados clinico-epidemiológicos

Depois de obtido consentimento informado, um questionário será administrado aos pais ou

cuidadores primários para a informação dos pais e das suas crianças. O questionário incluirá a
seguinte informação:

informado ser oferecido a mãe ou cuidador primário da criança. Os controlos serão

seleccionados de forma aleatória a partir da base de dados do sistema de vigilância
demográfica do CISM dentro de 14 dias depois do recrutamento do caso índice. O
recrutamento e consentimentos serão administrados pelos trabalhadores devidamente
treinados para o efeito.

Para ambos casos e controlos, amostras de fezes serão colhidas em frascos apropriados e
imediatamente conservadas em colman com acumuladores frios até o momento de transporte
ao laboratório do CISM. No laboratório alicotas serão preparados e conservados em BGS e/ou
Cary Blair quando a amostra não for processada imediatamente, procedimento este aplicável
as amostras que não podem ser transportadas imediatamente ao laboratório.

Para propósito de rotavirus, para doentes internados, a amostra de fezes deve ser colhida
máximo entre 24-48 horas depois de internamento para evitar infecções nosocomiais.

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 Identificação: nome da criança para o inquérito da criança e nome do pai e/ou cuidador da
criança para o inquérito dirigido ao pai e/ou cuidador, endereço, e outros identificadores,
bem como o número do estudo da criança e iniciais. Este questionário será guardado em
lugar seguro e apenas pessoas autorizadas podem ter acesso aos dados.
 Dados clínico-epidemiológicos: perguntas sobre dados epidemiológicos serão feitas e
informação clínica da criança será colhida de forma detalhada incluindo recentes doenças,
sinais, sintomas e tratamento recebido bem como história de diarreia presente. O
entrevistador também vai avaliar os factores de risco de diarreia usando formulários
predefinidos, incluindo o historial e testagem de HIV entre outros testes.  
 Dados antropométricos: para avaliar a malnutrição, dados de altura, peso serão
sistematicamente colhidos se estes não foram disponíveis no questionário geral.
 Formulários de reporte do caso para investigação de rotavirus serão preenchidos para
crianças elegíveis.
 Além disso, perguntas relacionadas com diarreias actualmente colhidas nos formulários de
internamento dentro da vigilância de infecções bacterianas invasivas serão também usados
para o estudo
 A informação sobre estado de vacinação da criança será também colhida incluindo a
informação sócio-económica da família e de água e saneamento do meio.
 Para os controlos, dados sobre HIV serão colhidos e teste oferecido para os participantes
que aceitarem fazer o teste.
 Depois da entrevista, a enfermeira ou os trabalhadores de campo, vão pedir o cartão de
vacinação da criança para tirar uma cópia, que serve como prova da história de vacinação
da criança.

3.2.7.Manuseamento clínico dos casos e dos controlos

Resultados de todos os testes dos casos, principalmente os de bacteriologia serão enviados
aos clínicos para tratamento, para tentar beneficiar no máximo possível o doente, se algum
teste der positivo nos controlos, esses serão conduzidos ao hospital para o devido tratamento.
Resultados de rotavirus não serão informados porque estarão disponíveis duas semanas no
mínimo depois do recrutamento por causa do processo em “batch” das amostras.

3.2.8.Teste de HIV
O estudo GEMS demonstrou que a co-infecção HIV e diarreia é um tema crítico onde
aproximadamente 23% das crianças com diarreia moderada-a-grave estão infectados com HIV

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comparado com apenas 4% de prevalência de HIV no grupo controlo. Portanto, é crucial ter
amostra de sangue para o despiste de infecção por HIV de acordo com as recomendações do
sistema nacional de saúde para testagem de HIV com os dois testes (Determine e Unigold
apenas quando determine é positivo).

Portanto, todas crianças que cumprem critérios de inclusão serão convidados a fazer teste de
HIV se não conhecem o seu estado serológico. Crianças com o estado serológico conhecido
serão exigidas documentação para questões de comprovação.

Para crianças com estado serológico desconhecido ou negativo, os pais serão convidados ao
aconselhamento e testagem voluntária para HIV. Resultados do teste serão informados aos
pais e/ou cuidadores primários imediatamente e casos positivos serão manuseados de acordo
com as guias nacionais. As guias de testagem de HIV tem sido modificadas, para crianças com
menos de 9 meses de idade o diagnóstico de HIV será feito mediante a técnica de PCR que
será feita a partir de uma amostra de sangue colhida em papel de filtro usando a técnica
comercial da Abbott (PCR). O resultado da PCR de HIV será entregue dentro de um mês. Para
crianças superiores a 9 meses, a infecção por HIV será diagnosticada usando dois testes
serológicos de anticorpos rápidos (Determine e Unigold apenas quando Determine é positivo).
Criança que testar positiva para HIV será referida ao HDM para consultas de seguimento e
tratamento de acordo com as guias nacionais para tratamento de pessoas infectadas por HIV.

3.2.9. Métodos laboratoriais

Detecção de rotavirus
A presença de antígenos de rotavirus será determinada usando um kit comercial de ELISA
(Prospect, Oxoid, UK) ou outro kit disponível seguindo as introduções do fabricante.
Amostras positivas para rotavirus por ELISA serão usadas para amplificar o segmento VP4 e
VP7 do genoma como foi descrito anteriormente16,17. RNA do vírus será extraído seguindo
protocolos padrão18. O RNA extraído será ressuspendido em 40 µl de água livre de RNAase e
armazenado a -20°C para uso para PCR. Para tipificação do genótipo G, o comprimento total
de 1062 bp do segmento do gene 9 que codifica a glicoproteina VP9 do rotavirus humano do
grupo A será amplificado primeiro durante 30 ciclos usando iniciadores Beg 9 eEnd 9. Este será

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seguido por uma multiplex semi-nested PCR usando um cocktail de iniciadores específicos que
identifica os seguintes genótipos VP7: G1, aBT1 G1, aBT1; G2, aCT2; G3, aET3; G4, aDT4;G8,
aAT8; G9, aFT9 e um iniciador como RVG9 como descrito previamente18.
A tipificação do genótipo P será feita usando iniciadores Con 2 e Con 3 na primeira PCR de
transcriptase reversa (RT-PCR) num total de 30 ciclos para gerar 876 fragmentos do gene 4.
Con 3 será também usado para a segunda PCR com iniciadores específicos que identificam os
genótipos seguintes do VP4: P[8], IT-1; P[4], 2T-1; P[6], 3T-1; P[9], 4T-1 e P[10], 5T-1 (DNA
Agency) como foi anteriormente descrito16.
Os produtos da PCR serão visualizados por eletroforese em gel de agarose a 2% corados com
brometo de etidio e visualizados num transluminador de luz ultravioleta.

Detecção de outros enteropatógenos

Patógenos bacterianos (Shigella spp e E. coli) serão pesquisados usando a bacteriologia
convencional previamente descrita14. Amostras de fezes serão sub-cultivadas em meios sólidos
(Mac Conkey, Salmonella e Shigella e XLD agar bem como em meios de enriquecimentos
como caldo de enriquecimento F-Selenite – que será sub-cultivado em meios sólidos seguido
de incubação toda noite) para isolamento e identificação de bactérias de forma convencional.
Todos meios de culturas serão incubados por 18-24 horas a 37ºC. Além de mais, o sistemaTaq
Man Array Card (TAC), uma PCR em tempo real de 384-pocilhos de PCR simples capaz de
detectar 19 enteropatógenos incluindo vírus (adenovirus, astrovirus, norovirus GII, rotavirus, e
sapovirus), bactéria (Campylobacter jejuni/E. coli, Clostridium difficile, Salmonella,
Vibriocholerae, estirpes de Escherichia coli diarreagenicas incluindo E. coli entero aggregativa
[EAEC], E. coli enterotoxigénica [ETEC], E. coli enteropatogénica [EPEC], e E.coli produtora de
Shiga-toxigénica [STEC]), Shigella/ E. coli enteroinvasiva (EIEC), protozoários
(Cryptosporidium, Giardia lamblia e Entamoeba histolytica), e helmintos (Ascaris lumbricoides e
Trichuris trichiura) poderá ser usado como foi descrito previamente 15 brevemente. Amostras
fecais juntamente com os respectivos controlos extrínsecos serão examinados, extraído DNA e
RNA usando kit de extração (QiaAmp Stool DNA mini kit e Quick Gene RNA Tissue kit),
respectivamente, e misturados com Ag-Path-ID. Reagentes para o passo 1 de transcriptase
PCR (RT-PCR) serão colocados no cartão. Esta tecnologia poderá estar na fase de instalação
na Manhiça. Também estamos interessados em investigar possíveis novos patógenos que
possam explicar os 50% de casos de diarreia menos grave e moderada-a-grave sem causa

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aparente. Actualmente se sabe que todos patógenos para causar diarreia actuam de forma
independente. Parece que algumas causas de diarreia podem ser que haja necessidade de
interacção de duas bactérias. De modo a testar esta hipótese, iremos examinar a interacção
das unidades taxionómicas (OTUs) da microbiota de dados de 16S para examinar
Streptococcus e Haemophilus que foram encontradas em grande número de interacções que
apontam algumas taxas desconhecidas de Haemophilus e S. Mitis ou S. Oralis causando
diarreia. Vamos testar esta hipótese em células T84 para ver se tem um potencial patogénico.
Para podermos testar essas hipóteses precisamos de isolar Haemophilus de amostras de
fezes. Se alguma interacção for identificada em cultura celular, então iniciadores de PCR serão
desenhados para testar as taxas S e H e será usada uma PCR quantitativa para determinar a
frequência de patógenos combinados. Neste contexto iremos examinar também a presença de
Streptococcus e Haemophilus spp em amostras de fezes usando bacteriologia convencional
(Koneman’s, sixth Edition).

3.2.10.Gestão de dados
Toda informação será colhida em questionários padrão e digitados de forma dupla em
plataforma Open Clinica no CISM. Dados contendo informação das crianças serão tratados
como confidenciais e permanecerão no centro em condições de segurança. Apenas pessoal
autorizado terá acesso aos dados. Análises estatísticas serão realizadas usando o software
Stata.

4. Protecção dos participantes

Os procedimentos do estudo a serem aplicados não são invasivos e compreendem em grande

medida uma prática médica na área de estudo. A identificação de agentes causadores de
diarreias pode orientar estratégias de tratamento.

Para testagem de HIV, o processo de colheita de amostra de sangue pode durar menos de 1
minuto. Este pode causar pequeno desconforto para a criança. O mais importante, o
conhecimento do estado serológico da criança pode causar sofrimento psicológico, stress, e
estigma na comunidade. Reforçar a necessidade de aconselhamento e explicando o
comprometimento em termos de confidencialidade pode ajudar a minimizar o risco. Contudo,
para teste positivo, os participantes terão benefícios por ser oferecido tratamento ou visitas de
seguimento de acordo com a situação específica.

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Confidencialidade

Protecção dos participantes em termos de confidencialidade é de extrema importância. Os

conselheiros serão treinados sobre a confidencialidade seguindo a guias nacionais do
Ministério da Saúde de Moçambique em colaboração com o programa Global de AIDS,
Moçambique. Os conselheiros serão treinados para fazer testes rápidos. Apenas os
conselheiros, seus supervisores e médicos ou pessoal clínico saberão dos resultados (para o
manuseamento apropriado dos pacientes). Os resultados serão identificados com número de
identificação e mantidos em armários com protecção. Todos formulários e amostras colhidas
poderão ter resultados de HIV que serão identificados por códigos. Os resultados do laboratório
serão guardados em computador específico (Servolab). Apenas investigadores do estudo terão
acesso a informação pessoal que será armazenada num escritório fechado.

5. Aprovação ética

O protocolo do estudo, instrumentos de recolha de dados, e consentimento informado serão

submetidos aos comités de éticas (Comité Institucional de Bioética para Saúde do CISM –
CIBS-CISM e comité Nacional de Bioética para Saúde– CNBS) para revisão e devida
aprovação.

6. Disseminação dos resultados

As autoridades do Ministério da Saúde serão os primeiros a serem informados dos resultados

do estudo. Depois os resultados serão aprovados em conferências nacionais e internacionais,
seguidos de publicação de manuscritos em revistas internacionais indexadas.

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7. Cronograma

Período 2014-2019
Abr- Jul- Jan- Set- Jan- Set- Jan- Set- Jan- Oct-
Actividades
Jun/2014 Dez/2014 Ags/2015 Dez/2015 Ags/2016 Dez/2016 Ags/2017 Dez/2017 Set/2018 Set/2019
Revisão bibliográfica
Preparação do protocolo
Submissão ética
Recolha de dados e processamento laboratorial
Emenda do protocolo para inclusão de casos de
diarreia leve e controlos na comunidade
Emenda do protocolo para extênsão da
Vigilância para Maragra e Xinavane
Recrutamento de casos leves
Recrutamento de controlos
Análise de dados e escritura de artigos
Divulgação de resultados

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8. Referências

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Sanogo D, Onwuchekwa U, Manna B, Ramamurthy T, Kanungo S, Ochieng JB, Omore
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