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African Journal of Microbiology Research Vol. 7(1), pp. 7-12, 1º de janeiro de


2013 Disponível online em http://www.academicjournals.org/
AJMR DOI: 10.5897/
AJMR12.042 ISSN 1996-0808 ©2013 Academic Journals

Trabalho de pesquisa completo

Efeitos do ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido lático,


NaCl, sorbato de potássio e extrato de Thymus vulgaris sobr
Staphylococcus aureus e Escherichia coli
Bayan M. Abu-Ghazaleh
Departamento de Biologia, Universidade Hachemita, Zarqa, Jordânia.
E-mail: bay.ghaz@yahoo.com. Fax: 962-6-5676213.

Aceito em 27 de novembro de 2012

Staphylococcus aureus e algumas cepas de Escherichia coli são frequentemente implicadas em doenças transmitidas
por alimentos. Este estudo examinou os efeitos de alguns compostos (ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido lático,
cloreto de sódio, sorbato de potássio e extrato de Thymus vulgaris ) no crescimento de S. aureus e E. coli.
O ácido lático (0,03% ou 0,1%) sozinho inibiu quase completamente o crescimento de S. aureus ou E. coli,
respectivamente. O ácido cítrico (0,03%) reduziu o crescimento e o ácido ascórbico (0,1%) inibiu quase completamente
o crescimento de S. aureus; as porcentagens de inibição após 24 h de incubação em caldo nutriente foram de 33 e
91%, respectivamente. O ácido cítrico (0,03%) e o ácido ascórbico (0,1%) não inibiram o crescimento de E. coli, mas
ocorreu um atraso antes que o aumento no número pudesse ser observado. NaCl (5%) reduziu significativamente o
crescimento de ambas as cepas; as porcentagens de inibição de S. aureus e E. coli após 24 h de incubação foram de
55 e 64%, respectivamente. O extrato de Thymus vulgaris (0,3%) sozinho ou o sorbato de potássio (0,09%) sozinho
reduziram o crescimento de ambas as cepas. Uma combinação de ácido cítrico (0,03%) e sorbato de potássio (0,05%)
ou ácido cítrico (0,03%) e NaCl (5%) inibiu quase completamente ou completamente, respectivamente, o crescimento
de S. aureus . Para E. coli, a combinação de ácido cítrico (0,03%) e sorbato de potássio (0,05%) inibiu completamente o
crescimento. Uma combinação de ácido cítrico (0,03%) e NaCl (3%) ou extrato de T. vulgaris (0,3%) e NaCl (3%) reduziu
muito o crescimento de cepas de E. coli e as porcentagens de inibição após 24 h de incubação foram de 65 e 70%,
respectivamente.

Palavras-chave: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, inibição, produtos químicos.

INTRODUÇÃO

Staphylococcus spp., especialmente S. aureus , é uma das (Berdgoll, 1989). A maioria dessas enterotoxinas é altamente
causas mais comuns de doenças relacionadas à alimentação em resistente ao calor. A enterotoxina A de S. aureus, por exemplo,
todo o mundo (Hennekinne et al., 2012). Por exemplo, no Canadá, permanece ativa em costeletas de frango empanadas pré-fritas a
10,5% dos alimentos submetidos à investigação de surtos entre 180°C por 55 segundos, assadas a 180°C por 13 minutos e
2007 e 2010 continham S. aureus (Crago et al., 2012). Os armazenadas a 4°C (Pepe et al., 2006).
sintomas da intoxicação alimentar estafilocócica aparecem em Muitas cepas de E. coli são hoje consideradas patógenos de
curto espaço de tempo (1-6 h) após a ingestão do alimento origem alimentar. Cepas pertencentes aos subgrupos
contaminado. Os sintomas incluem vômitos, diarreia e cólicas enteropatogênicos e enterotoxigênicos de E. coli produzem
abdominais; cerca de 10% das pessoas afetadas podem ser gastroenterite e diarreia leve ou grave quando alimentos ou água
hospitalizadas, mas a taxa de mortalidade é muito baixa ou nula contaminados são ingeridos (Ray, 2001). Além disso, E. coli
(Jay, 2000). A intoxicação alimentar estafilocócica resulta do shigatoxigênica , incluindo E. coli O157: H7, produz toxinas
consumo de uma ou mais enterotoxinas pré-formadas que são resistentes ao calor que não são inativadas por temperaturas de
produzidas em alimentos contaminados com Staphylococcus pasteurização (63°C por 30 min, 72°C por 15 s ou 89°C por 1 s)
(Dinges et al., 2000). A quantidade de enterotoxina necessária ( Rasooly e Do, 2010).
para causar intoxicação alimentar é muito baixa; foi relatado que Muitos tipos de alimentos (leite, laticínios, frango, carne) estão
20 ng a < 1 ug pode causar sintomas em humanos associados a doenças relacionadas a S. aureus ou E. coli . Foi
relatado que 3,1% (12/384) dos
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produtos alimentícios cozidos foram contaminados com S. caldo nutriente mais NaCl (3, 4 ou 5% p/v), caldo nutriente mais extrato bruto de T.
aureus na China; e cepas de S. aureus foram detectadas em vulgaris (0,3% v/v) ou caldo nutriente mais várias combinações desses compostos
foram inoculados com 0,5 ml de crescimento noturno cultura bacteriana. Para
11% (40/365) de carnes cruas e 16,3% (34/209) de leite cru
experimentos contendo sorbato de potássio (0,05% ou 0,09%), o pH do caldo nutriente
(Chao et al., 2007). Na Itália, Normanno et al. (2007) relataram foi ajustado para 5,9 (usando HCl ou NaOH) antes da adição dos compostos testados.
que 17% das amostras de produtos lácteos e 10% das amostras Em seguida, os compostos testados foram adicionados a frascos contendo 30 ml de
de produtos cárneos estavam contaminadas com S. aureus; e ~ caldo nutriente (pH 5,9) e tratados conforme descrito anteriormente. Após a inoculação,
60% dessas cepas produziram enterotoxinas. Em Portugal, as os frascos foram incubados estáticos a 30°C por 24 horas. Em intervalos adequados,
as amostras foram retiradas de cada frasco e o crescimento foi monitorado medindo a
contagens viáveis (log CFU/ml ou g) de Enterobacteriaceae
densidade óptica a 560 nm espectrofotometricamente (Spectronic, Cheshire, Reino
(incluindo E. coli, Klebsiella, Enterobacter sakazakii) variaram
Unido).
entre 5,9 e 7,0 no leite cru e entre 0,0 e 1,3 em queijos com 4
meses (Kongo et al., 2008). A prevalência de E. coli Durante a incubação, pelo menos cinco leituras foram obtidas de cada frasco.
shigatoxigênica (STEC) - amostras positivas em leite cru foi de
21% na França (Perelle et al., 2007), e ~ 7% de queijo de leite Todos os experimentos neste estudo foram realizados cinco vezes, e as leituras de
densidade óptica apresentadas são os valores médios. O teste t de Student foi utilizado
de ovelha cru duro abrigava E. coli shigatoxigênica na Espanha
para determinar as diferenças significativas (p< 0,05) entre os diferentes compostos
( Caro e Garcia-Armesto, 2007). Além disso, mais de 90% das
testados.
amostras de alimentos crus (carne, frango, marisco) continham
E. coli no Vietnã (Van et al., 2007).
RESULTADOS
A introdução dos organismos aos alimentos pode ocorrer em
seu ambiente original (fazendas) e/ou durante o abate e
Efeito do ácido cítrico, ácido láctico, ácido ascórbico e
processamento. Portanto, a aplicação de compostos para
cloreto de sódio
eliminar esses organismos antes do armazenamento pode
melhorar a qualidade dos alimentos e prolongar sua vida útil. Há
As leituras de OD560 de E. coli e S. aureus submetidas apenas
pouca informação sobre o efeito dos conservantes de alimentos
a ácido cítrico são mostradas nas Tabelas 1 e 3. A presença de
em S. aureus e E. coli. Portanto, este estudo foi realizado para
ácido cítrico (0,03%) no meio de crescimento não inibiu o
investigar os efeitos do sorbato de potássio, ácido lático, ácido
crescimento de E. coli , mas inibiu significativamente o
cítrico, ácido ascórbico, cloreto de sódio, extrato de Thymus
crescimento de S. aureus (p< 0,05). No entanto, ambas as cepas
vulgaris e combinações desses compostos nessas bactérias.
cresceram neste meio após um longo atraso (~ 3 h). A presença
de ácido ascórbico (0,1%) sozinho no meio de crescimento de
E. coli não causou inibição substancial do crescimento, mas
MATERIAIS E MÉTODOS houve um atraso de mais de 3 h antes que o crescimento
pudesse ser detectado (Tabela 1). No entanto, o ácido ascórbico
Cepas bacterianas (0,1%) inibiu quase completamente (p< 0,05) o crescimento de
S. aureus (a porcentagem de inibição após 24 h de incubação
Cepas clínicas de E. coli e S. aureus foram utilizadas neste estudo. As cepas foram foi de 91%) (Tabela 3).
obtidas de um laboratório central em 2010 e foram identificadas em nível de gênero e
A adição de ácido lático (0,1%) sozinho ao meio de crescimento
espécie usando os sistemas API-20E e API-Staph, respectivamente (Biomerieux, Marcy
I'Etoile, França). As cepas bacterianas foram mantidas em ágar nutriente inclinado a
de E. coli e ácido lático (0,03%) sozinho ao meio de crescimento
4°C. Para preparar o inóculo, caldo nutriente (20 ml) foi inoculado com cepas de E. coli de S. aureus inibiu quase completamente o crescimento das
ou S. aureus e incubado a 30°C por 24 h. cepas testadas (p<0,05) (Tabelas 1 e 3).
Apenas um ligeiro aumento na densidade óptica foi observado
após 24 h de incubação em caldo nutriente com ácido lático.
Mídia e produtos químicos As leituras de densidade óptica de E. coli e S. aureus
submetidas apenas a NaCl são apresentadas nas Tabelas 1 e 3.
Ácido lático, ácido cítrico, ácido ascórbico, cloreto de sódio e sorbato de potássio foram A presença de NaCl a 3% no meio de crescimento de E. coli
obtidos da Gainland Chemical Co. reduziu ligeiramente a taxa de crescimento (p< 0,05); a
(Hampshire, Reino Unido). Extrato bruto de T. vulgaris (extraído por hidrodestilação) foi percentagem de inibição após 24 h de incubação foi de 29%. A
obtido da Systema Co. Ltd. (Amman, Jordan). Soluções estoque de sorbato de potássio,
exposição de E. coli a 4% de NaCl causou maior inibição do
ácido cítrico e ácido ascórbico foram preparadas antes de cada uso e esterilizadas por
filtração através de filtros de membrana (0,45 um, Micron Separation Inc., Filadélfia,
crescimento, onde a porcentagem de inibição foi de 44%. NaCl
Pa., EUA). O caldo nutritivo foi obtido da Scharlau Chemie (Barcelona, Espanha). (5%) inibiu bastante (p< 0,05) o crescimento de E. coli ou S.
aureus; as porcentagens de inibição após 24 h de incubação
foram 63,5 e 55%, respectivamente (Tabelas 1 e 3).

Condições de crescimento
Interação entre os compostos testados
Frascos contendo 30 ml de caldo nutriente (pH 7,2), caldo nutriente mais ácido lático
(0,03 ou 0,1% p/v), caldo nutriente mais ácido cítrico (0,03% p/v), caldo nutriente mais A adição de NaCl (3%) e ácido cítrico (0,03%) juntos ao meio de
ácido ascórbico (0,05 ou 0,1% p/v), crescimento reduziu bastante (p<0,05) o crescimento
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Tabela 1. Inibição do crescimento de E. coli em caldo nutritivo por compostos simples ou combinados

Láctico Extrato ascórbico Crescimento (OD560) Redução


Ácido cítrico (%) NaCl (%)
ácido (%) de tomilho (%) ácido (%) após 2 h 3h 24h crescimento (%)a
0 0 0 0 0 0,04 0,1 0,63 -

0,03 0 0 0 0 0,02 0,68 0,03 -

0 3 0 0 0 0 0,027 0,45* 29
0 4 0 0 0 0 0 0,35* 44
5 0 0 0 0 0 0,23* 63,5
0 0,03 3 0 0 0 0 0 0,22* 65
0 0 0,1 0 0 0 0 0,01* 98
0 0 0 0,3 0 0 0 0,41* 35
0 3 0 0,3 0 0 0 0,19* 70
0 0 0 0 0,1 0 0,01 0,61 3

aRedução de crescimento (%) = 100 × Crescimento em caldo sem químico – crescimento em caldo com químico(s) / Crescimento em caldo sem químico.
*As médias são significativamente diferentes (p<0,05) do controle (composto(s) não foi adicionado ao meio de crescimento).

Tabela 2. Efeito do sorbato de potássio e outros compostos em E. coli .

Sorbato de Ácido Cítrico NaCl Extrato de tomilho Crescimento (OD560) após Redução no
potássio (%) (%) (%) (%) 2h 3h 24h crescimento (%)a
0 0 0 0 0,03 0,08 0,62 -

0,05 0 0 0 0,01 0,03 0,55* 11.3


0,09 0 0 0 0 0,01 0,51* 18
0,05 0,03 0 0 0 0* 100
0,05 0 3 0 0 0 0,01 0,26* 58,1
0,05 0 0 0,3 0 0 0,41* 34

aRedução no crescimento (%) = 100 × Crescimento em caldo sem produtos químicos - crescimento em caldo com produto químico(s) / Crescimento em caldo sem produtos

químicos.* As médias são significativamente diferentes (p<0,05) do controle (o(s) composto(s) não é(são) adicionado(s) para meio de crescimento).

taxa de E. coli, onde a porcentagem de inibição após 24 h de estirpe pode ser detectada (Tabelas 2 e 4).
incubação foi de 65% (Tabela 1). A exposição de S. aureus a A presença de sorbato de potássio (0,05%) e NaCl (3%)
NaCl (5%) e ácido cítrico (0,03%) juntos inibiu completamente o juntos no meio de crescimento causaram maior inibição de E.
crescimento. Não foi observado aumento da densidade óptica coli e a porcentagem de inibição após 24 h de incubação foi de
após 24 h de incubação em caldo nutriente contendo esses 58,1% (Tabela 2). A exposição de E. coli ou S. aureus ao sorbato
compostos (Tabela 3). A adição de NaCl (5%) e ácido ascórbico de potássio (0,05%) e extrato de tomilho (0,3%) juntos diminuiu
(0,05%) ao meio de crescimento de S. aureus causou redução significativamente a taxa de crescimento de E. coli (p<0,05),
significativa da taxa de crescimento (p< 0,05), e a porcentagem mas não afetou o crescimento de S. aureus (p> 0,05) (Tabelas
de inibição após 24h de incubação foi de 52% (Tabela 3 ). 2 e 4). A adição de sorbato de potássio (0,05%) e ácido cítrico
(0,03%) ao meio de crescimento inibiu completamente o
crescimento de E. coli e reduziu bastante o crescimento de S.
aureus (Tabelas 2 e 4).
Efeito do sorbato de potássio

A adição de sorbato de potássio (0,05%) sozinho ao meio de Efeito do extrato de Thymus vulgaris
crescimento de ambas as cepas inibiu apenas ligeiramente o
crescimento. No entanto, o sorbato de potássio a 0,09% reduziu A presença de extrato de tomilho (0,3%) sozinho no meio de
significativamente (p< 0,05) a taxa de crescimento de ambas as crescimento inibiu leve mas significativamente o crescimento
cepas e as porcentagens de inibição de E. coli e S. aureus após (p< 0,05) das cepas testadas; onde as porcentagens de inibição
24 h de incubação foram de 18 e 34%, respectivamente. Além após 24 h de incubação foram de 35 e 15% para E. coli e S.
disso, um atraso (~ 3 h) foi observado antes do aumento no número deaureus, respectivamente (Tabelas 1 e 3). Também,
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Tabela 3. Inibição do crescimento de S. aureus em caldo nutritivo por compostos simples ou combinados

Ácido Cítrico NaCl Ácido lático Extrato de tomilho Ácido ascórbico Crescimento (OD560) Redução
(%) (%) (%) (%) (%) após 2 h 3 h 24 h crescimento (%)a

0 0 0 0 0 0,006 0,05 0,33 -

0,03 0 0 0 0 0 0 0,22* 33
0 5 0 0 0 0 0 0,15* 55
0,03 5 0 0 0 0 0 0* 100
0 0 0,03 0 0 0 0,009* 97
0 0 0 0 0,3 0 0 0 0,28* 15
0 0 0 0 0,05 0 0 0,27* 18
0 0 0 0 0,1 0 0 0,03* 91
0 5 0 0 0,05 0 0 0,16* 52
0 0 0 0,3 0,05 0 0 0,19* 42

aRedução no crescimento (%) = 100 ×Crescimento em caldo sem químico – crescimento em caldo com químico(s) / Crescimento em caldo sem químico.
*As médias são significativamente diferentes (p<0,05) do controle (o(s) composto(s) não é(são) adicionado(s) ao meio de crescimento).

Tabela 4. Efeito do sorbato de potássio e outros compostos em S. aureus.

Sorbato de Ácido Cítrico Extrato de tomilho Crescimento (OD560) após Redução no crescimento
a
potássio (%) (%) (%) 2h 3h 24h (%)

0 0 0 0 0,32 -

0 0,05 0 0 0 0 0,29 9
0,09 0 0 0 0 0,21* 34
0,05 0,03 0 0 0,06* 81
0,05 0 0 0,3 0 0 0,31 3

aRedução no crescimento (%) = 100 ×Crescimento em caldo sem químico – crescimento em caldo com químico(s) / Crescimento em caldo sem químico. *As médias são
significativamente diferentes (p<0,05) do controle (o(s) composto(s) não é(são) adicionado(s) ao meio de crescimento).

ambas as estirpes cresceram neste meio após um longo intervalo (cerca mas inibiu quase completamente o S. aureus. Isso é consistente com os
de 3 h). A adição de extrato de tomilho (0,3%) e NaCl (3%) ao meio de resultados obtidos por outros investigadores.
crescimento reduziu bastante o crescimento de E. coli, e a porcentagem Richter et ai. (1988) relataram que a adição de ascorbato a culturas em
de inibição após 24 h de incubação foi de 70% (Tabela 1). Além disso, crescimento aeróbico de E. coli B causou apenas uma pequena pausa
a presença de extrato de tomilho (0,3%) e ácido ascórbico (0,05%) no crescimento e nenhuma alteração subsequente na taxa de
juntos no meio de crescimento de S. aureus causou maior inibição de crescimento. Tabak et ai. (2003) relataram que 10-20 mg/ml de ácido
seu crescimento (a porcentagem de inibição após 24 h de incubação foi ascórbico inibiu o crescimento de Helicobacter pylori em condições
de 42%) (Tabela 3). microaerófilas. Além disso, é possível que as cepas de E. coli testadas
tenham utilizado este composto. O ácido cítrico (0,03%) reduziu
significativamente o crescimento de S. aureus , mas não inibiu o
crescimento das cepas de E. coli testadas. É possível que cepas de E.
DISCUSSÃO coli tenham utilizado este composto. Outros estudos relataram que o
ácido cítrico (2%) foi mais eficaz contra bactérias gram-positivas (Bacillus
S. aureus e algumas cepas de E. coli estão entre as causas mais cereus e S. aureus) do que bactérias gram-negativas (Salmonella
comuns de doenças transmitidas por alimentos, onde produzem enteritidis e E. coli) (del Rio et al., 2007) . Além disso, o aumento da
enterotoxinas que são resistentes ao calor. concentração de ácido cítrico pode reduzir o crescimento de E. coli
Portanto, é importante controlar o crescimento dessas bactérias antes (Sagong et al., 2011).
do processamento ou armazenamento dos alimentos para prolongar
sua vida útil e evitar a produção de enterotoxinas. Neste estudo, foram O ácido lático (0,03% ou 0,1%) inibiu quase completamente o
investigados os efeitos do ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido lático, crescimento de cepas de S. aureus ou E. coli , respectivamente.
cloreto de sódio, sorbato de potássio, extrato de T. vulgaris e Resultados semelhantes foram obtidos por outros investigadores.
combinações desses compostos no crescimento de cepas de S. aureus Kolsarici e Candogan (1995) relataram que o número de bactérias
e E. coli . O ácido ascórbico (0,1%) não apresentou efeito inibitório sobre aeróbicas psicrotróficas totais, estafilococos e bactérias coliformes em
E. coli, frango diminuiu após
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tratamento com ácido lático e armazenamento a 4±1°C. Sagong Em conclusão, este estudo mostra que o ácido láctico ou o
et ai. (2011) observaram que a imersão de folhas de alface em cloreto de sódio sozinho inibiram quase completamente ou
ácido lático a 0,5% reduziu significativamente o crescimento de reduziram muito o crescimento das cepas de S. aureus e E. coli
E. coli O157:H7. Além disso, o ácido lático (0,03 e 0,1%) reduz testadas. O ácido cítrico ou o ácido ascórbico sozinhos reduziram
o pH do meio para 3,88 e 3,32, respectivamente; e S. aureus e muito o crescimento de S. aureus e aumentaram o tempo de
E. coli não são capazes de crescer neste pH. latência de E. coli. Várias combinações dos compostos testados
O extrato de tomilho (0,3%) reduziu a taxa de crescimento de reduziram muito o crescimento de ambas as cepas.
ambas as cepas e o efeito foi maior nas cepas de E. coli ; no Esses compostos podem ser utilizados como aditivos para
entanto, aumentar a concentração de extrato de tomilho pode preservação em indústrias alimentícias.
aumentar seu efeito em ambas as cepas. Isso é consistente
com os resultados obtidos por outros investigadores. Selim REFERÊNCIAS
(2011) relatou que a adição de óleo de tomilho em concentrações
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e Staphylococcus aureus em carne fresca. J. Food Prot. 67(2):310-315.
(Psidium guajava).
Vidro e outros. (2007) relataram que a adição de 0,05% de Normanno G, La Salandra G, Dambrosio A, Quaglia NC, Corrente M, Parisi A, Santagada
benzoato de sódio e 0,05% de sorbato de potássio juntos ou G, Firinu A, Crisetti E, Celano GV (2007).
Ocorrência, caracterização e resistência antimicrobiana de Staphylococcus aureus
0,05% de benzoato de sódio e 0,05% de propionato de sódio
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juntos à Bolonha Suína-Beef curada impediu o crescimento de
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produção e armazenamento. Pak. J. Biol. ciência 10:2694-2698.
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