UNIVERSIDADE EDUARDO MONDLANE

Acetil Cloretos, Extraco e Quantificao de DNA e Determinao de Matria CONDOEIRA, Orgnica

Silva

Ordem de Apresentao
1.

Acetil Cloretos Aplicao de PCR na Extraco e Quantificao de cido Desoxiribonuclico (DNA)

2.

3.

Determinao de Matria Orgnica no Solo pelo Mtodo de Walkley-Black

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Acetil Cloretos
Acetil cloreto um liquido incolor de cheiro acentuado e penetrante. Geralmente uma amostra pode conter PCl3, POCl3, SOCl3, Ac2O ou AcOH tendo assim variados p. eb.
H3 C C Cl O

Preparao: estes compostos podem ser obtidos de varias fontes e com uma ampla variedade de regentes.

Propriedades Qumicas
1.

Reaco com Reagentes Inorgnicos

v

H2O (Hidrlise) NH3 ou Compostos Semelhantes Halognios H2O2

33

cidos Inorgnicos Sais de cidos Inorgnicos

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2.

Reaco com Reagentes Orgnicos

v

Hidrocarbonetos (alicclicos e cclicos) Hidrocarbonetos Aromticos compostos R-OH (ou R-SH) ou seus derivados metlicos

Exemplos: Preparao: preparao de acetil cloreto a partir de AcOH

O

O H 3C C OH

PCl3

H3C

C Cl

H3PO3

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Propriedades Quimicas:
1.

Reaco com NH4OH(aq.) concentrado e frio formando acetamida (77%).

O H 3C C OH O

NH4OH(aq.)

H 3C

C NH 2

HCl

H2O

2.

Reaco com FeCl3 em CS2 formando pequenas quantidades de cido dihidroactico.

O H 3C C OH O O C CH 3

CS2 FeCl 3
H 3C O

OH

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3.

Reaco com ciclopentano em presena de AlCl3 formando cicloentil metil cetona (acetilciclopentno) .
O H 3C C OH O C

AlCl3

+
0C
H3C

H 2O

4.

Reaco com tolueno + AlCl3 forma 70% de metil p-toluil cetona

O H 3C C OH

AlCl3
CH 3

O C CH 3

HCl

H 3C

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APLICAO DE PCR NA EXTRACO E QUANTIFICAO DE CIDO DESOXIRIBONUCLICO (DNA)

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Introduo
Princpio do Mtodo: A tcnica de PCR (reaco de polimerase em cadeia) baseia-se no processo de replicao de DNA. Requisitos: DNA alvo, tampo salino contendo a polimerase, primers, os quatro desoxinucletidos (dNTPs) constituintes do DNA e o cofactor Mg2+. Esta mistura submetida a vrios ciclos que consistem em trs passos: 1) Desnaturao: (94-96C) de modo a separar as duas cadeias.
2)

Anelamento: (50-65C) Associao dos iniciadores por ligaes de hidrognio ao DNA alvo em cadeia simples.

3)

Extenso: (72C) amplificao dos primers pela sntese da cadeia complementar , catalisada pela DNA Taq polimerase
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Figura 1: Processo de replicao de DNA atravs da reaco de polimerase em cadeia (PCR)

Existem vrias tcnicas de deteco dentre elas a electroforese em gel de agarose (revelado com brometo de etdio) e electroforese em gel de poliacrilamida (revelado pela prata).
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Metodologia
1. Extraco de DNA 3. Amplificao (PCR)

2. Quantificao

4. Deteco por Electroforese em Gel de Agarose

10 10

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Resultados e Discusso
Analise qualitativa e quantitativa de DNA (Quantificao por espectrometria)

Tabela 1: Registo de concentraes e Absorvncia de ADN extrado da amostra

Amostras 1M"- Preto 2M"- Preto 1M"- Azul 2M"- Azul H2O

ng/l 33,98 39,96 46,33 62,59 0,46

A260 0,68 0,799 0,927 1,252 0,009

A280 0,958 1,14 1,316 1,696 0,013

A260/A280 0,71 0,7 0,7 0,74 0,72

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Padro

Figura 2: Visualizao de bandas de DNA em electroforese de gel de agarose

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Os resultados da quantificao indicam uma contaminao por protenas dos DNAs extrados, visto que a razo A260/A280 est abaixo de 1,44 - 1,90 que indicam amostras com alto grau de pureza.

Na electroforese em gel de agarose no se visualizou nenhuma banda que indicava existncia de DNA do tripanossoma na amostra entretanto, este resultado leva-nos a duas possveis anlise:

1)

Inibio pelo Chelex durante a extraco; Inexistncia do DNA de tripanossoma na amostra analisada.

2)

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Concluso
Nesta experincia foi-nos possvel aplicar as tcnicas bsicas de biologia molecular na extraco e quantificao de DNA, aplicar a reaco de polimerase em cadeia (PCR) na amplificao de uma quantidade mnima de um material gentico e com base na electroforese em gel de agarose fazer o seu diagnstico.

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DETERMINAO DA MATRIA ORGNICA NO SOLO

(Mtodo de Walkley Black)

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Introduo
Princpio do Mtodo de Walkley-Black: o carbono orgnico determinado por oxidao da matria orgnica pelo K2Cr2O7 em meio cido segundo a reaco:

A dosagem feita por meio da titulao do dicromato, remanescente da oxidao, com FeSO4.7H2O em meio cido, empregando-se como indicador difenilamina ou ferrona, conforme a reaco:

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Metodologia
Pesagem

H2SO4 Oxidao Indicador Ferrona Titulao

K2Cr2O7

[Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O]

Clculos

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Resultados e Discusso
Tabela 1: quantidade de matria orgnica em 0,500g da amostra e padro

Amosra 1 3 Padro Branco

Volume do titulante (mL) 11,58 17,18 12,58 20,10

BA 8,52 2,92 7,52 -----

Matria Orgnica (%) 2,89 0,98 2,54 ------

Tabela 2: quantidade de matria orgnica em 0,250g da amostra e padro

Amosra 2 4 5 Padro Branco

Volume do titulante (mL) 10,32 ----11,16 12,58 20,10

BA 9,78 ----8,94 7,52 -----

Matria Orgnica (%) 6,62 ----5,11 4,99 ------

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Concluso
1.

Com base no princpio de Walkley-Black foi-nos possvel determinar o teor de matria orgnica em diferentes amostras de solos;

2.

O mtodo apresenta limitaes na determinao de amostras com elevado teor de matria orgnica, como o caso da amostra 4, e recomenda-se nestes casos a determinao por outros mtodos.

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KHANIMAMBO!!!!
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