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Dissertação
Pelotas
Rio Grande do Sul – Brasil
Novembro, 2007
Dados de catalogação na fonte:
Patrícia de Borba Pereira
Bibliotecária CRB10/1487
CDD 636.5
Banca Examinadora:
E agradeço com muito amor e muita gratidão à minha família, Pai, Mãe, Ana
e Ane. A minha paixão da vida, Beta, pelo amor, compreensão, apoio incansável e
auxílio indispensável durante este período.
À vocês,
MUITO OBRIGADO!
“O que realmente importa na vida não
são os objetivos a que nos propormos,
mas os caminhos que seguimos para
alcançá-los.”
Peter Bamm
vi
Resumo
Artigo 2.1
Figura 1 - Motilidade do sêmen de galos submetidos aos tratamentos com
diferentes níveis de lipossomas de LDL. .............................................. 26
Figura 2 - Regressão linear da motilidade do sêmen resfriado a 5˚C, por
tratamento, em função do tempo de acondicionamento a 5˚C. ............ 27
Figura 3 - Regressão linear para Integridade de membrana espermática, por
tratamento em função do tempo de acondicionamento a 5˚C. ........... 29
Figura 4 - Número de furos na membrana perivitelina interna do ovo (IPVL) de
galinha, penetrada por espermatozóide de galo.................................... 30
Figura 5 - Fotos tiradas em microscópio de campo escuro (aumento – 400X)
dos furos típicos realizados pelos espermatozóides incubados com a
membrana perivitelina interna do ovo (IPVL). Grupo controle (A) e
tratamento T6 (B), não diferem estatisticamente entre eles.................. 31
Artigo 2.2
Figura 1 - Médias e erro padrão para motilidade (E) e penetração espermática
(D) de sêmen de galos descongelados em três diferentes
temperaturas.......................................................................................... 44
2
Figura 2 - Médias e erro padrão para Penetração Espermática (furos/mm ) de
sêmen de galos, armazenados em palhetas ou em pellets, e
descongelados em três diferentes temperaturas. ............................... 44
Figura 3 - Médias e erro padrão para Motilidade (%) de sêmen de galos,
armazenados em palhetas ou em pellets, e descongelados em três
diferentes temperaturas. ..................................................................... 45
Figura 4 - Médias e erro padrão para Integridade de (E) e Penetração
Espermática (D) do sêmen congelado em pellets e palhetas. .............. 45
LISTA DE TABELAS
Artigo 2.1
1 Introdução Geral.......................................................................................... 12
2 Artigos
2.1 Efeito da lipoproteína de baixa densidade (LDL) no resfriamento do
sêmen de galo (Gallus gallus)....................................................................... 17
2.1.1 Introdução ............................................................................................ 20
2.1.2 Materiais e Métodos ............................................................................ 22
2.1.2.1 Animais ............................................................................................. 22
2.1.2.2 Extração do LDL / Preparo dos Lipossomas .................................... 22
2.1.2.3 Diluente ............................................................................................ 23
2.1.2.4 Coleta de Sêmen .............................................................................. 23
2.1.2.5 Avaliação dos ejaculados ................................................................ 24
2.1.2.6 Análise estatística ............................................................................ 25
2.1.3 Resultados .......................................................................................... 25
2.1.4 Discussão ........................................................................................... 30
2.1.5 Referências ........................................................................................ 32
2.2 Comparação entre forma de envase e temperatura de descongelamento
de sêmen de galos congelado com dimetilacetamida (DMA)........................... 35
2.2.1 Introdução ........................................................................................... 39
2.2.2 Materiais e Métodos ........................................................................... 40
2.2.2.1 Animais ............................................................................................ 40
2.2.2.2 Coleta de Sêmen e Diluição ............................................................. 40
2.2.2.3 Procedimentos de congelamento ..................................................... 41
2.2.2.4 Procedimentos de descongelamento ............................................... 41
2.2.2.5 Teste da qualidade do sêmen .......................................................... 42
2.2.2.6 Análise estatística ............................................................................ 43
2.2.3 Resultados .......................................................................................... 43
2.2.4 Discussão ........................................................................................... 46
2.2.5 Referências ......................................................................................... 47
xi
3 Conclusões................................................................................................... 50
4 Considerações finais.................................................................................. 51
Referências................................................................................................... 52
12
1 INTRODUÇÃO GERAL
2.1 ARTIGO
Van der Laan, G.M.1; Marten, C.P.2; Oliveira, E.B.2; Deschamps, J.C.1; Bongalhardo, D.C.3
1
Laboratório de Reprodução Animal, Centro de Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas, Brasil;
2
Graduandos da Faculdade de Medicina Veterinária – UFPEL;
3
Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas, Brasil.
RESUMO
ABSTRACT
Preservation of diluted poultry semen for more than 24 hours results in decreased
fertility. The present study aimed to obtain improvements in rooster semen
preservation by adding low density lipoproteins (LDL) to the cooling extender. The
methodology used was based on the evaluation of sperm motility (MOT), membrane
integrity (MI), and sperm penetration (SP) for a period of 5 days after adding LDL
liposomes to Beltsville Poultry Semen Extender (BPSE). After collection, semen was
pooled and split into 4 aliquots. Each aliquot was diluted with BPSE (1:1, vol:vol)
containing 0% (control), 6, 8, and 10% of LDL liposomes. Samples were refrigerated
at 5°C for 5 days, and semen quality was evaluated before cooling (hour 0) and after
24, 49, 72, and 96 hours of refrigeration. After 5 repetitions, it was observed that
MOT in T6 treatment did not differ (P>0.05) from the T0 (control), while T10 showed
the lowest values (45.2 ± 2.87), being significantly different from T0 and T6 (66.1 ±
2.35 and 63.6 ± 2.90, respectively). Regarding refrigeration time, a significant
decrease (P<0.05) in MOT and VIG after 24h was observed, while MI and SP
remained constant during the 96 hours of cooling. When analyzing treatment effect
within refrigeration time, it was observed that MI had higher values at T6 and T8
(81.4 ± 1.7 and 82.7 ± 1.3), but they were not statistically different from T0 and T10
(73.0 ± 2.5 and 70.5 ± 4.1, respectively). The present results allow to conclude that
adding 6% of LDL liposomes to the cooling diluent preserves the general sperm
quality, suggesting that improvements on fertility could be obtained if a limit in
lipoprotein supplementation is imposed.
1. Introdução
2. Materiais e Métodos
2.1 Animais
Um total de 15 galos de Linhagem Embrapa–051 (Empresa Brasileira de
Pesquisa Agropecuária) originada do cruzamento das raças Plymouth Rock White e
Rhode Island Red, foram usados neste estudo no Laboratório de Reprodução
Animal do Centro de Biotecnologia da UFPEL. Os animais foram alojados em
gaiolas individuais, alimentados com ração contendo 2850 Kcal de energia, 12,5 %
de proteína bruta, 3,34% de gordura, 3,54% de fibra, 0,67% de fósforo e 1% de
cálcio, tendo acesso ad libitum a esta ração e a água.
O sobrenadante foi então dializado por pelo menos 8 horas com água
destilada para eliminar o sulfato de amônia. Após a completa eliminação do sulfato
de amônia, a solução foi novamente centrifugada (7.840 RPM por 45 minutos) e
coletado o sobrenadante, rico em LDL.
2.3 Diluente
O diluente de resfriamento BPSE foi preparado com 5g de frutose, 0,34g de
cloreto de magnésio, 0,64g de citrato de potássio tribásico, 4,30g de acetato de
sódio, 8,67g de glutamato de sódio, 1,95g de TES, 0,65g de fosfato de potássio
monobásico e 12,70g de fosfato de potássio dibásico para 1 litro de água destilada,
com o pH ajustado para 6,5 e osmolaridade 353 mOsm/kg H2O (SEXTON, 1977).
Nos tratamentos foram adicionados ao diluente BPSE 0% (controle), 12, 16 e 20%
de lipossomas de LDL, resultando na solução final com 0, 6, 8 e 10 % após a adição
do sêmen na proporção (1:1, vol:vol).
3 Resultados
a, b
Letras diferentes, na mesma coluna, representam diferença P<0,05.
26
T0 80.2 ± 4.55 79.4 ± 5.37 70.2 ± 5.4 68.6 ± 4.0 66.6 ± 7.8
T6 81.8 ± 6.29 80.6 ± 3.41 81.4 ± 3.32 80.0 ± 4.13 83.2 ± 2.95
T8 87.0 ± 2.28 84.0 ± 2.91 81.0 ± 3.89 82.4 ± 2.0 79.4 ± 3.12
T10 82.4 ± 2.67 69.6 ± 9.24 65.6 ± 11.8 67.0 ± 9.13 68.0 ± 12.2
28
Tabela 3. Penetração espermática em IPVL (n˚ de furos por mm2) nos diferentes
tratamentos.
T0 31.8 ± 7.83 41.7 ± 26.3 82.0 ± 27.9 53.0 ± 37.7 26.1 ± 8.4
T6 110.4 ± 50. 13.8 ± 7.0 19.7 ± 3.6 11.3 ± 2.4 18.2 ± 4.7
T8 97.9 ± 36.6 15.9 ± 5.7 19.0 ± 4.1 15.2 ± 5.0 9.7 ± 1.6
T10 98.9 ± 69.8 9.0 ± 1.7 24.4 ± 5.7 14.5 ± 3.9 9.8 ± 4.1
4 Discussão
regressão linear da figura 2. Este resultado já era esperado pois quando o sêmen é
armazenado in vitro por mais de 24 horas, maiores são os problemas com fertilidade
(DONOGHUE; WISHART, 2000).
Nossos resultados não indicam uma influência significativa entre os
tratamentos com diferentes níveis de LDL sobre a Integridade de Membrana (IM). Na
figura 4 podemos observar o gráfico de regressão linear onde fica evidente que os
tratamentos T2 (6%) e T3 (8%) tiveram melhores médias de células íntegras
comparados aos outros grupos. Ainda, o Tratamento 2 (6%) foi o único apresentou
uma tendência em permanecer constante a porcentagem de células viáveis (íntegras)
ao longo das horas de resfriamento, enquanto que T1, T3 e T4 apresentaram uma
tendência decrescente entre 0 e 96 horas. Segundo Chalah e Brillard (1998), SYBR
14 + PI é o método mais adequado para verificar a Integridade de Membrana de
sêmen fresco e resfriado (>0˚C) de aves.
Através do teste de Penetração Espermática, se pode obter uma estimativa
da fertilidade individual ou de um grupo de aves, por meio da avaliação do número de
furos na membrana interna (IPVL) de ovos frescos (BRAMWELL et al.,1995). Este
tipo de teste serve para mostrar a função in vivo do sêmen, e ainda, a avaliação do
número de furos na membrana é uma análise simples (WISHART, 1995).
No teste de penetração espermática, não foram observadas diferenças
estatísticas entre os tratamentos. No gráfico da figura 5, podemos observar que
apesar de não diferirem entre eles, o grupo controle foi o melhor tratamento, seguido
pelo T2 e T3 com a média de furos/mm2 bem semelhantes, e por último o T4, com os
menores valores para PE. Assim como no teste de motilidade, observou-se o efeito
negativo em relação à proporção de Lipossomas de LDL ao diluente, sendo
inversamente proporcional o nível de LDL e o número de furos na membrana no teste
de PE.
Os resultados obtidos nestes estudos nos permitiram concluir que a adição
de lipossomas de LDL ao diluente de resfriamento de sêmen de galos mantém a
qualidade geral dos espermatozóides quando adicionado na proporção de 6%,
portanto, melhorias na fertilidade de sêmen de aves podem ser obtidas desde que
seja respeitado um limite de adição desta lipoproteína ao diluente.
32
5 Referências
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35
2.2 ARTIGO
Van der Laan, G.M.1; Miranda, R.C.2; Castro, T.F.2; Marten, C.P.2; Oliveira, E.B.2;
Deschamps, J.C.1; Bongalhardo, D.C.3
1
Laboratório de Reprodução Animal, Centro de Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas, Brasil;
2
Graduandos da Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Pelotas, Brasil ;
3
Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas, Brasil
RESUMO
para IM (20,3 ± 1,8 vs. 9,0 ± 1,0, P<0,05). Não houve interação entre forma de
envase e temperatura de descongelamento em nenhum dos parâmetros analisados.
Estes resultados indicam que a temperatura corporal é a mais apropriada para
descongelamento de sêmen criopreservado com DMA, e que o envase em palhetas
é uma alternativa ao invés do método de pellets.
ABSTRACT
Protecting rooster sperm with dimethylacetamide (DMA) is an alternative to the use
of glycerol. The best results obtained with DMA occur when sperm is fast-frozen in
pellets and fast-thawed at 60°C. However, straws are still the most suitable method
for storing semen, and subjecting sperm to temperatures higher than the
physiological body temperature could have deleterious effects on its function. The
present work aimed to evaluate quality of rooster semen frozen with DMA, packed in
straws and pellets, and thawed at 3 temperatures. After collection, semen was
pooled, split in two aliquots, and kept at 5°C for 10 min. One min after addition of
DMA, semen was packed into 0.25 ml straws, which were plunged into liquid
nitrogen; and pellets were formed by dropping 25 μl of semen directly into liquid
nitrogen. Straws were thawed with swirling motion into ice bath (5°C) or water bath
(40 and 60°C). Pellets were placed into tubes containing Lake’s diluent at 5, 40, or
60°C. After thawing, samples were maintained at room temperature for analyses.
Motility (MOT) was measured subjectively at microscope and the ability of sperm to
penetrate the egg was performed incubating sperm diluted at 1.25 x 109 sp/ml with
egg’s inner-perivitelline layer (IPVL) squares for 5 min at 40°C. IPVL was spread in
slides and the number of hydrolyses holes (HOLES) made by the sperm in 1 mm2
was counted. Analysis of variance showed that there was difference among thawing
temperatures; in MOT, 40 and 60°C was superior to 5°C (35,8 ± 5,8, 25,4 ± 7,1, and
15,0 ± 5,0% respectively, P<0,05) and in PE, 40 was higher than both 60 and 5°C
(14,2 ± 2,6, 6,3 ± 1,2, e 6,8 ± 1,1 holes/mm2, respectively, P<0,05). Sperm
penetration (PE) and Membrane Integrity (IM) were affected by packing method, with
straws being superior to pellets (11,9 ± 2,0 vs. 6,5 ± 0,9 holes/mm2, P<0,05) and
(20,3% ± 1,8 vs. 9,0% ± 1,0, P<0,05) respectively. There was no difference (P >
0.05) between packing methods in MOT or interaction between packing and
temperature in any parameter. These results indicate that body temperature is more
suitable for thawing DMA cryopreserved sperm, and that packing semen in straws
could be an alternative to the pellet storage method.
1 Introdução
irão interagir (MORTIMER et al., 1976; SEXTON, 1979; LAKE; RAVIE, 1984;
LATORRE et al., 1988).
O objetivo do presente estudo foi comparar a qualidade do sêmen congelado
de galos (Gallus gallus) utilizando a Dimetilacetamida (DMA) como crioprotetor,
envasado em palhetas ou em forma de pellets, e descongelados em três diferentes
temperaturas.
2 Materiais e Métodos
2.1 Animais
Um total de 15 galos de Linhagem Embrapa–051 (Empresa Brasileira de
Pesquisa Agropecuária – linhagem originada do cruzamento das raças Plymouth
Rock White e Rhode Island Red), foram usados neste estudo no Laboratório de
Reprodução Animal do Centro de Biotecnologia da UFPEL. Os animais foram
alojados em gaiolas individuais, alimentados com ração contendo de energia 2850
Kcal, 12,5 % de proteína bruta, 3,34% de gordura, 3,54% de fibra, 0,67% de fósforo
e 1% de cálcio, tendo acesso ad libitum a esta ração e a água.
• Palhetas
Para o descongelamento, as palhetas foram submetidas a três diferentes
tratamentos: Tratamento 1 (banho de gelo a 5˚C), tratamento 2 (banho-maria a
40˚C), e tratamento 3 (banho-maria a 60˚C). As palhetas foram mergulhadas e
manualmente agitadas por 30 segundos em cada tratamento. Após descongeladas,
as palhetas foram rapidamente abertas nas duas extremidades, e o sêmen
transferido para tubos Eppendorf® contendo o diluente Lake´s (1:1, vol:vol), e
posteriormente submetidos a avaliação.
• Pellets
Os pellets também foram submetidos aos mesmos três tratamentos. Para o
descongelamento, os pellets foram transferidos dos Cryotubos® para tubos
Eppendorf® contendo diluente de Lake´s (1:1, vol:vol) nas temperaturas de 5, 40 e
60˚C (tratamentos), e manualmente agitados dentro do banho de gelo ou no banho-
42
3 Resultados
Figura 1. Médias e erro padrão para motilidade (E) e penetração espermática (D) de
sêmen de galos descongelados em três diferentes temperaturas.
4 Discussão
das condições padrão, em que são usados o congelamento ultra-rápido com DMA
em pellets, e descongelamento ultra-rápido a 60˚C (TSELUTIN et al., 1999;
CHALLAH et al., 1999).
Na Holanda, o método tradicional de congelamento-descongelamento ultra-
rápido com DMA foi otimizado e combinado com o envase em Palhetas. Esta
adaptação é usada hoje como referência para o banco genético local de
reprodutores (WOELDERS; ZUILBERG; HIEMSTRA, 2006). Estas combinações de
técnicas adotadas neste país concordam com os resultados que obtivemos em
nossos experimentos.
Portanto, com os resultados obtidos neste estudo, concluímos que a
temperatura corporal (40˚C) é mais adequada para descongelar sêmen
criopreservado com DMA. Ainda, o envase em palhetas é mais eficiente em relação
ao pellet por razões sanitárias e segurança, e ainda, mais conveniente para a
identificação dos ejaculados, especialmente para a aplicação a campo desses
bancos genéticos.
5 Referências
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SEIGNEURIN, F.; BLESBOIS, E. Effects of the freezing rate on viability and fertility of
frozen-thawed fowl spermatozoa. Theriogenology, v.43, p.1351-1358, 1995.
3 CONCLUSÕES
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
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