SAGE-Hindawi Access to Research

Enzyme Research
Volume 2011, Article ID 720194, 5 pages
doi:10.4061/2011/720194

Artigo de Pesquisa
Atividade de lipase entre bactérias isoladas de solos da Amazônia

Andre´ Luis Willerding,1 Luiz Antonio de Oliveira,2 Francisco Wesen

Moreira,2 Mariana Gomes Germano,3 and Aloısio´ Freitas Chagas Jr.4
1
Biochemistry and Molecular Biology Coordination, Amazon Biotechnology Center (CBA), Avnue Gov. Danilo Areosa,
690 Distrito Industrial, 69075351 Manaus, AM, Brazil
2
Soil Microbiology Laboratory, National Research Institute of Amazonia (INPA), Caixa Postal 478, 69011-970 Manaus, AM, Brazil
3
Soils and Plant Tissue Laboratory, Brazilian Agricultural Research Corporation (EMBRAPA-SOY), Rod. Carlos Joao˜
Strass, Distrito de Warta, 86001-970 Londrina, PR, Brazil
4
Department of Agronomy, Federal University of Tocantins (UFTO), Rua Badeijos,´ Lote 07, Chacara´ 69/72, Zona
Rural, 77402-970 Gurupi, TO, Brazil

Correspondence should be addressed to Andre´ Luis Willerding, andre.cba@suframa.gov.br

and Luiz Antonio de Oliveira, luizoli@inpa.gov.br

Received 14 April 2011; Revised 27 July 2011; Accepted 27 July 2011

Academic Editor: Alane Beatriz Vermelho

Copyright © 2011 Andre´ Luis Willerding et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution
License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly
cited.

O objetivo deste estudo foi selecionar bactérias produtoras de lipase coletadas em diferentes municípios da região amazônica. Das 440
cepas de bactérias, 181 foram selecionadas para o ensaio de lipase em testes qualitativos em placas de Petri, sendo 75 (41%) de lipase
positivas. O índice enzimático foi determinado durante quinze dias em diferentes temperaturas (30◦, 35◦, 40◦ e 45◦C). A maior atividade
de lipase foi observada em 72 horas a 30 ° C. Doze estirpes bacterianas apresentaram índice igual ou superior ao padrão utilizado como
referência, demonstrando o potencial de recursos microbianos. Após o bioensaio em placas de Petri, as cepas de bactérias selecionadas
foram analisadas em testes quantitativos em palmitato de p-nitrofenil (p-NPP). Um grupo de linhagens foi selecionado para outras fases
de estudo com o uso em substratos oleaginosos da flora amazônica, visando a aplicação em processos como a biotransformação de óleo.

1. Introdução comparado com os outros triacilgliceróis examinados; além

A lipase (triacilglicerol acil-hidrolase E.C. 3.1.1.3) tem uma
aplicação industrial extensa por hidrólise de ligações éster acílico
de acilgliceróis na interface entre óleo e água, atuando também nas
reações de esterificação e transesterificação [1–3]. As lipases são
produzidas por muitos microrganismos. A maioria das lipases úteis
comercialmente são de origem microbiana. A crescente tendência
de seu mercado mostra a importância de buscar novos recursos
microbianos para produzir essas enzimas [4, 5]. Microrganismos
produtores de lipase foram encontrados em diferentes habitats,
como resíduos industriais, fábricas de processamento de óleo
vegetal, laticínios, solo contaminado com óleo, oleaginosas e
alimentos em decomposição [6]. A lipase de diferentes
microrganismos apresenta características químicas diferentes, que
podem ser úteis para indústrias. Foi encontrada uma atividade
lipase específica de P. fluorescens S1K W1 em um meio que
continha azeite emulsionado como fonte de carbono. A enzima
mostrou uma alta atividade lipolítica em relação ao tricapróico (C6)
e tricaprilina (C8)
disso, hidrolisou preferencialmente as ligações éster em 1 e 3 da
trioleína [7] A temperatura e a atividade do pH também podem
ser diferentes entre as lipases [8].
As condições ambientais da Amazônia favorecem altas
atividades metabólicas e o crescimento de vários
microrganismos. Essa diversidade microbiana pode ser útil para
encontrar novos bons recursos enzimáticos. O objetivo deste
estudo foi avaliar a produção de lipase a partir da coleta de
microrganismos do solo do Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia (INPA), visando a aplicação em processos como a
bio-transformação de petróleo.
2. Materiais e Método
2.1 Organismos, Manutenção e Condição da Cultura. As cepas
bacterianas foram obtidas na Coleta de Microrganismos do
Solo, do Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia (INPA).
Os microrganismos foram isolados de solos e raízes do
ambiente agrícola e florestal como bactérias solubilizadoras de
2 Pesquisa de enzimas

fosfato em meio fosfatase específico [9] em uma pesquisa que TABELA 1: Quantidade de bactérias lipolíticas para cada grupo analisado.
procurava que essa capacidade bacteriana fosse aplicada em Origin (city, No. of Activated Lipase
solos da Amazônia com pouco fósforo disponível. As culturas state) Group strains strains positive %
de estoque foram iniciadas em meio básico contendo glicose (1) Acre (several
(1,0%), extrato de levedura (0,2%), KH2PO4 (0,5%), MgSO4 A 4 1 1 100%
towns)
(0,2%), CaCl2 (0,1%) e ágar (1,8%), pH 6,5 e incubado a 30 ° (2) Barreirinha
C. Para este estudo, 440 cepas de bactérias solubilizantes de B 19 8 5 63%
(AM)
fosfato foram testadas quanto à atividade de lipase. As estirpes (3) Rondoniaˆ
que cresceram até 72 horas foram selecionadas para o ensaio de D 11 2 0 0%
(several towns)
lipase. (4) Rio Preto da
E 196 79 39 49%
Eva (AM)
2.2 Produção de lipase. A produção da enzima ocorreu em meio (5) Manaus
M 22 4 2 50%
indutor (pH 8,0), contendo azeite (2,0% v / v), Tween 80 (1,0% (Brasileirinho)
v / v) e rodamina B (0,001% p / v), o que facilita a detecção do (6) Projeto RECA
R 61 36 17 47%
atividade enzimática, visualizada por um halo próximo às (RO)
colônias [10–12]. Além disso, cada placa de Petri foi submetida (7) Urucu (AM) U 86 42 10 24%
à marca de irradiação UV (UV-A, 350 ηm) modelo BIO-RAD (8) Amazonas
Z 41 9 1 11%
UV Lamp 1660500. A atividade enzimática foi medida pelo (several towns)
índice de atividade da lipase (IAF), uma taxa entre o diâmetro Total 440 181 75 41%
do halo próximo à colônia e o diâmetro da colônia durante 15
dias [7, 13, 14], com cinco repetições. A atividade foi medida 1.7
em quatro temperaturas (30◦, 35◦, 40◦ e 45◦C).
1.6
2.3 Ensaio quantitativo de lipase. A análise quantitativa foi 1.5
realizada com cepas bacterianas que cresceram em meio básico
LAI

até 72 horas e incubadas a 160 rpm por 48 h a 30 ° C em frascos
agitados. Após 72 horas, uma alíquota (1000 μL) foi transferida
para 49 mL do meio líquido indutor. Após 72 horas, uma
alíquota (2000 μL) foi centrifugada a 12000 g por 20 min a 4◦C.
O sobrenadante foi usado como extrato bruto enzimático. A
atividade foi determinada pela hidrólise do p-
nitrofenilpalmitato (p-NPP) por espectrofotômetro modelo UV
Mini 1240 Shimadzu a 410 μm [15]. Uma alíquota (50 μL) do
extrato bruto de cada cepa selecionada foi adicionada em 950
μL de solução de p-NPP contendo 0,189 g do substrato em 200
mL de tampão acetato de sódio (pH 8; 50 mM) adicionado com
2,1% de Triton X -100 [16]. O efeito das temperaturas foi
estudado (de 25 a 55 ° C). A atividade da lipase foi determinada
pela taxa de produção de p-nitrofenol (p-NP). Uma unidade de
atividade enzimática foi definida como a quantidade de lipase
necessária para liberar um µmol de p-NP · min-1.
3. Resultados e discussão
Das 440 cepas testadas no meio básico, 181 foram escolhidas
para testar a atividade da lipase, pois apresentavam bom
desenvolvimento preliminar nesse meio (até 72 horas). Destas,
75 cepas (41%) apresentaram atividades enzimáticas (Tabela
1).
A capacidade dos microrganismos de produzir enzima é
influenciada por condições ambientais como temperatura, pH e
presença de indutores ou repressores. Muitos experimentos
relatados na literatura mostraram diferentes tempos para
análise, variando de 1 hora a 120 horas no ensaio qualitativo de
lipase [6, 7, 13, 14]. A maioria das bactérias testadas neste
estudo iniciou a síntese de lipase em 24 horas, mas foi possível
observar o aumento da atividade quantitativa de lipase até 72
horas, quando ocorreu um declínio subsequente (Figura 1).
1.4
1.3
1.2
1.1
1
24 48 72 144 216 288 360
Time (h)
FIGURA 1: Evolução do índice de atividade da lipase (IAF) em
placas de Petri a 30 ° C (média das 75 cepas).
Esses dados corroboram com a literatura, indicando esse tempo
para a seleção de bactérias.
O IAF analisado em cada temperatura às 72 horas diminuiu
com o aumento da temperatura (Figura 2). Algumas bactérias
tiveram um comportamento diferente, mas prevaleceram as
médias mais altas a 30 ° C. A essa temperatura, o IAF aumentou
linearmente com o tempo, enquanto, em temperaturas mais
altas, ocorreu um declínio dos valores do IAF durante o período
da avaliação, sendo 48 horas as melhores a 35◦C e 45◦C e 24
horas a 45◦ C (Figura 3).
Em uma visão geral, as bactérias apresentaram mais
atividade de lipase em temperaturas mais baixas, talvez porque
seus metabolismos aceleram quando a temperatura aumenta,
resultando em depleções das atividades enzimáticas mais
rapidamente. A 40 ° C, a produção de lipase apresenta baixa
variação, enquanto, a 45 ° C, o maior IAF ocorreu em 24 horas,
com forte declínio depois disso.
Esse resultado é semelhante ao observado por Dong et al.
[17] com Pseudomonas, que apresentaram ótima atividade de
lipase para Pseudomonas a 30 ° C por 72 horas na faixa de pH
7–9. No entanto, com Burkholderia sp., A atividade de lipase
foi analisada em uma faixa de temperatura de 25 a 65 ° C, e a
maior atividade de lipase foi obtida quando a reação foi
conduzida a 55 ° C [18].
Enzyme Research 3

35
1.8
1.56 30
30
1.6
1.32 25
1.4 21
20

Strains
1.2
1
15
1 0.88 12
LAI

10 9
0.8
5 3
0.6
0
0.4 1–1.39 1.4–1.69 1.6–1.79 1.8–1.99 >2
0.2 Weak Medium Good Very good Excellent

0 Classification
30◦C 35◦C 40◦C 45◦C
a ab b c FIGURA 4: Classificação do índice de atividade da lipase (IAF) para
75 cepas após 72 h a 30 ° C em placas de Petri (olivicultura).

Temperature/Tukey P < 0.05 ocorrendo entre 55◦C e 65◦C, mas obtiveram bons resultados a
FIGURA 2: Índice de atividade da lipase (IAF) em diferentes 29◦C. Snellman et al. [27], estudando uma lipase extracelular de
temperaturas (média das 75 cepas). Acinetobacter em p-NPP, observaram um pico de atividade a 55
° C, com a enzima permanecendo ativando até 70 ° C. A
temperatura ótima de reação apresentada neste trabalho é mais
1.8 alta que a relatada para muitas lipases bacterianas em ensaios
1.6 de condições semelhantes. Sharma et al. [6], estudando a
1.4 influência ambiental na produção de lipase, observaram que
1.2 Lactobacillus plantarum teve um comportamento diferenciado
de acordo com a mudança de temperatura, onde a atividade da
1
lipase foi analisada de 22◦C para 45◦C, com pico a 30◦C.
LAI

0.8 Sant'Anna Jr. et al. [22] testaram a produtividade da enzima a

0.6 25 ° C, 30 ° C e 35 ° C, com os melhores resultados a 30 ° C.
0.4 Stamford et al. [23] apresentaram um processo de triagem de
bactérias lipolíticas in vitro a 28◦C. George et al. [24]
0.2
apresentaram os melhores resultados a 37 ° C. Sharma et al. [6]
0
descrevem vários trabalhos que apresentam as melhores
72 h
24 h

48 h
72 h

48 h

48 h

48 h
72 h
2
4
h

2
4
h

2
4
h
72

temperaturas para a enzima variando de 30 ° C a 60 ° C.

h

Após a definição do tempo e temperatura ideais, aplicou-

30◦C 35◦C 40◦C 45◦C se uma classificação para o índice de qualificação, que revelou
Time/temperature
diferentes níveis de atividade enzimática e considera como
FIGURA 3: Índice de atividade da lipase (IAF) até 72 horas em referência a cepa Bacillus subtilis ATCC 6633 [23], que possui
diferentes temperaturas (média das 75 cepas). um índice enzimático lipase de 1,80 (Figura 4). Assim, doze
bactérias apresentaram um índice maior ou semelhante ao
ATCC 6633. Nove bactérias foram classificadas como “muito
Liu et al. [18] observaram que a resposta da lipase diminuiu
boas” e três como “excelentes”, o que demonstra o potencial da
quando a temperatura aumentou, permanecendo 96, 92, 90 e
microbiota estudada. No entanto, todas as bactérias com índice
78% de sua atividade original após ser incubada a 25, 37, 42,5
enzimático 1,60 e IAF alto foram selecionadas para testes
e 55◦C, respectivamente. Isso sugere que a Burkholderia era
quantitativos, totalizando 24 cepas de bactérias. Essa triagem
bastante estável durante a faixa de temperatura examinada. As
levou em consideração que as bactérias que apresentaram
lipases testadas neste trabalho parecem seguir o mesmo
classificação média nos testes em meio sólido podem apresentar
comportamento.
melhores resultados em p-NPP.
Quando se deseja a aplicação de microrganismos para
O comportamento de 24 bactérias no bioensaio com
processos industriais, os mecanismos de seleção tornam-se
diferentes temperaturas e pHs foi semelhante à média obtida
importantes [4]. Portanto, os parâmetros analisados são
com as 75 estirpes de bactérias (Figura 5); houve também uma
decisivos na triagem. A maior média do IAF ocorreu a 30 ° C
atividade mais alta a 30 ° C e pH 8,0. Esta informação é
às 72 horas. Os resultados corroboram com outros relatados,
importante para estudos cinéticos das lipases, quando eles
onde a melhor produção de lipase ocorreu a 30 ° C [3, 6, 19,
devem ser testados em grandes escalas de fermentação. Os
20]. A atividade de lipase de Bacillus megaterium foi analisada
respectivos índices enzimáticos para as 24 bactérias
por Lima et al. [21] nas temperaturas de 30 a 85◦C, com o pico
selecionadas com IAF> 1,60 estão na Tabela 2.
4 Enzyme Research

2 1.8 1800
1.8
1.51 1600
1.6
1400
1.4 1.3
1.2 1200

−1
0.92 0.96
LAI

p-NP/ µ ·mol m
L
1
1000
0.8
0.6 800
0.4
600
0.2
0 400
30◦ pH 6.5 30◦ pH 8 30◦ pH 9 35◦ pH 8 45◦ pH 8
c a ab bc c 200

0
25 30 37 45 55
Treatments/Tukey P < 0.05
Temperature (◦C)
FIGURA 5: Classificação do índice de atividade da lipase (IAF) para
25 cepas em diferentes tratamentos em placas de Petri U-067 R-024 E-039
(olivicultura). U-068 E-089 Z-034
U-078 E-012 R-016
TABELA 2: Índice de atividade da lipase de cepas selecionadas em E-100 U-053 E-099
meio de cultura da azeitona. E-066 E-111 R-048
E-005 R-006 E-139
Origin Bacteria strains Average SD Tukey (P < 0.05) U-015 E-024 U-027
(1) INPA P-146 E-089 2.41 0.05 a
FIGURA 6: Efeito da temperatura na atividade da lipase do extrato
(2) INPA P-784 U-053 2.20 0.32 ab
bruto no p-nitrofenilpalmitato (comportamento das 24 cepas).
(3) INPA P-697 U-015 2.15 0.29 abc
(4) INPA P-632 R-024 1.98 0.21 abcd
(5) INPA P-616 R-016 1.95 0.16 abcd cadeia de carbono longa, como p-nitrofenilaurato (C12) ou p-
(6) INPA P-613 R-048 1.97 0.26 abcd nitrofenilpal-mitato (C16) [6, 7, 17].
A atividade da lipase da solução de extratos brutos de cada
(7) INPA P-691 U-027 1.93 0.20 abcd
cepa selecionada foi analisada sob p-NPP em diferentes
(8) INPA P-124 E-170 1.89 0.18 bcd
temperaturas (Figura 6). A melhor atividade de lipase no extrato
(9) INPA P-112 E-005 1.81 0.13 bcd
bruto foi a 45 ° C para as cepas U-067, U-068 e U-078.
(10) INPA P-108 E-100 1.81 0.15 bcd
Para todas as bactérias, o pico de atividade ocorreu a 37 °
(11) INPA P-493 E-139 1.80 0.25 bcd C. Essas três bactérias sempre foram superiores ao restante em
(12) INPA P-799 U-068 1.80 0.28 bcd todas as condições de teste. Isso sugere a maior quantidade de
(13) INPA P-348 Z-034 1.77 0.12 bcd lipase dessas bactérias no substrato p-NPP. Quando os picos da
(14) INPA P-478 E-066 1.71 0.19 bcd atividade enzimática são comparados, a diferença entre as
(15) INPA P-423 E-039 1.72 0.35 bcd bactérias pendentes e outras bactérias, a 37 ° C, é o dobro. A 45
(16) INPA P-803 U-078 1.69 0.19 cd ° C, os resultados se tornam 4 vezes maiores. As cepas de
(17) INPA P-798 U-067 1.68 0.12 cd bactérias com os melhores resultados nesta fase do trabalho não
(18) INPA P-093 E-024 1.68 0.27 cd foram as que obtiveram os melhores resultados nos testes
(19) INPA P-082 E-111 1.66 0.25 cd qualitativos, onde a análise ocorreu em meio de ágar com azeite
(20) INPA P-117 E-012 1.63 0.12 d de oliva. As diferenças físicas nessas condições podem
(21) INPA P-540 E-087 1.62 0.09 d influenciar a liberação da lipase. Mesmo entre as cepas de
(22) INPA P-106 E-099 1.62 0.22 d bactérias podem ser encontradas enzimas isoformas que são
(23) INPA P-392 E-053 1.61 0.17 d diferenciadas pelo peso molecular, por exemplo, e isso pode
(24) INPA P-593 R-006 1.60 0.12 d
resultar em variação da migração no ágar, mas na cultura do
caldo essas dificuldades não ocorrem [27]. Embora ambos os
substratos possuam longas cadeias de carbono, ácido oleico
(C18), o principal componente do azeite e a p-NPP (C16) não
3.1 Atividade de lipase. As lipases apresentam diferentes
são a mesma coisa. Assim, percebe-se que, para algumas
diferenças para o substrato [24–26]. A atividade varia de acordo
bactérias, a lipase apresentou alta afinidade com o óleo para
com o comprimento da cadeia dos ácidos graxos. Assim,
outras, a afinidade foi melhor com o p-NPP. Embora estejam
algumas bactérias podem apresentar uma afinidade com o p-
em diferentes condições de ensaio, os resultados apresentaram
nitrofenilacetato (cadeias pequenas C2) ou o p-
o potencial das cepas estudadas e indicam o grupo de 24 cepas
nitrofenicaprilato (cadeias médias C8). Outras isoformas de
de bactérias que foram selecionadas para outras fases de estudo
lipase apresentam uma melhor afinidade para ésteres com
Enzyme Research
utilizando substratos oleaginosos da flora amazônica, visando
a aplicação em processos como biotransformação de óleo.
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