Identificação de lipopeptídeos

por Espectrometria de Massas

Dra. Adriana Spirotto Stein Mesquita

Abril de 2021
 01 Definição e aplicação

LIPOPEPTÍDEOS 02 Produção e purificação

03 Interpretação de espectros MS/MS

2
 O que é LIPOPEPTÍDEO?

 Os lipopeptídeos constituem uma classe distinta de H

N
O
OH

metabólitos secundários microbianos.

O
HO O
NH O
NH

O
O
NH
H2N

Peptídeo HO
NH
O

hidrofílico Surfactina
N

O NH
NH O

O
Iturina O
NH2
NH2
O
O
OH
NH
HO O O OH
O H
O
NH2
O O H
N

O O NH NH
HO NH OH O
HO
NH
NH O
H
O
HO NH NH NH2
O CH3 O NH NH NH
O O O
O
O NH HN O O
O NH
NH NH NH2 NH2
NH
NH NH
NH2
NH N
O H O

O O H2N
O NH
NH O

Cadeia ácido graxo

N
OH O
O O

O
NH O
hidrofóbico O
O
HO

H
N
O OH
HO
Cl
NH CH3 NH
NH
NH O O
O O O O
CH3
NH2 HN

O NH

HO
Fengicina NH NH
O
O

HO
HN OH
NH O
NH NH
O
H2N O
H2N
NH2
 ANTIBIÓTICOS

ANTIVIRAIS
ANTIFÚNGICOS E ANTICÂNCER

ANTI-INFLAMATÓRIOS SURFACTANTES

LIPOPEPTÍDEOS

Esquema. Importância dos lipopeptídeos.

KIM et al, 1998; BARROS, 2008

 Bacillus sp

Pseudomonas sp
Paenibacillus sp

Actinomicetos Serratia sp
Esquema. Lipopeptídeos não-ribossômicos produzidos por NRPSs.
 Purificação dos lipopeptídeos

Extração
Precipitação solvente
ácida Membrana ultrafiltração
Cromatografia em SPE

Cultura de
células
RP-HPLC
O

Sobrenadante O
HO

H O OH
HO
N Cl
NH
NH
O O

HN

O NH

O
NH NH O

HO
HN OH
NH O
NH NH
O
H2N O
H2N
NH2
Estudo dos lipopeptídeos por Espectrometria de Massas
1- Preparo da amostra
2- Análise utilizando MALDI-TOF-MSn ou ESI-MSn

MS

tandem MS

Amostra LPs
 Vantagens do tandem MS/MS

• Especificidade mais alta do que no espectro de massa normal

• As modificações de peptídeos também podem ser identificadas

• Melhor sinal para ruído (sem ruído químico)

 Análise usando Q-ToF

Lipopeptídeos entram
no espectrômetro
 Análise usando Q-ToF

Massa dos LPs são scaneadas e m/z 1022.6

é selecionada para MS/MS
 Análise usando Q-ToF

Lipopeptídeo de m/z é 1022.6 é

fragmentado
 Análise usando Q-ToF

Fragmentos do Lipopeptídeo (m/z 1022.6)

são analisados
 Notação de Biemann para íons fragmentos de lipopeptídeos
Série C-teminal

y(n-m)
x(n-m)
z(n-m)
Rm O
n: número total de resíduos no peptídeo
m: número de resíduos correspondentes
NH aos íons a, b ou c.
NH
O Rm + 1
am cm
bm

Série N-teminal 48

Roepstorff–Fohlmann–Biemann , 1984.
ESTRATÉGIAS PARA IDENTIFICAR
ESPECTROS DE MASSAS DE LPs
• Intuição química

• Experiência prática

• Levantamento bibliográfico do que sabe sobre a amostra

• A composição de elemento é conhecida?

• A fórmula molecular é exata?

• Que grupos funcionais estão presentes?

• Que tipo de reação química o composto foi isolado?

ESI-MS/MS do lipopeptídeo de m/z 1022, 6
Amostra Surfactina A2
CARACTERIZAÇÃO DOS LIPOPEPTÍDEOS POR ESI-MS/MS

Leu
2 +H
OH
O

1
b2
Glu O
y6
O b3
N
H y5
O N H H 3
H N Leu
H
H
H H
O
R1 b4

y6
H HN
y4
O
H

b2
O
H
Val 4
O
H
H H N b5
N
H
H
N
y3
O
O
Leu7 O
b7 y2 Asp
5
b6 OH
6
Leu
b3
y2

y4

M + H -H2O
Surfactina A (C14) m/z 1022.6755
y3

b5

b7
b4

b6
y5

Figura. Espectro de LC-ESI-MS/MS e proposta de fragmentação

da amostra Surfactina A2.
CARACTERIZAÇÃO DOS LIPOPEPTÍDEOS POR ESI-MS/MS
356 469 582 681 796
C 13 H 25
909 1022
O O O O O O O
C NH HC C NH CH C NH CH C NH CH C NH HC C NH CH C NH CH C.

O CH2 H2C CH2 HC CH3 CH2 H2C H2C

CH2 HC CH3 HC CH3 CH3 C O HC CH3 HC CH3
C O CH3 CH3 CH3 CH3
OH
OH
113 (Leu) 113 (Leu) 99 (Val) 115 (Asp) 113 (Leu) 113 (Leu)

b2+ H2O
129 (Glu)

y6
b3
y2

y4

M + H -H2O
y3

b5

b7
b4

b6
y5

Figura. Espectro de LC-ESI-MS/MS e proposta de fragmentação

da amostra Surfactina A2.
 356 469 582 681 796
C 13 H 25
909
O O O O O O
C NH HC

CH2
C NH CH

H2C
C NH CH

CH2
C NH CH C

CH3
NH HC

CH2
C NH CH CH
-LEU
O HC H2C
CH2 HC CH3 HC CH3 CH3 C O HC CH3
C O CH3 CH3 CH3
OH
OH
113 (Leu) 113 (Leu) 99 (Val) 115 (Asp) 113 (Leu)

b2+ H2O
129 (Glu)

y6
b3
y2

y4

M + H -H2O
y3

b5

b7
b4

b6
y5

Figura. Espectro de LC-ESI-MS/MS e proposta de fragmentação

da amostra Surfactina A2.
 356 469 582 681 796
C 13 H 25 O O O O O

C NH HC C NH CH C NH CH C NH CH C NH HC CH

O CH2 H2C CH2 HC CH3 CH2 -LEU-LEU

CH2 HC CH3 HC CH3 CH3 C O
C O CH3 CH3
OH
OH
113 (Leu) 113 (Leu) 99 (Val) 115 (Asp)

b2+ H2O
129 (Glu)

y6
b3
y2

y4

M + H -H2O
y3

b5

b7
b4

b6
y5

Figura. Espectro de LC-ESI-MS/MS e proposta de fragmentação

da amostra Surfactina A2.
 356 469 582 681
C 13 H 25 O O O O
NH NH NH NH
-LEU-LEU-ASP
C HC C CH C CH C CH CH

O CH2 H2C CH2 HC CH3

CH2 HC CH3 HC CH3 CH3

C O CH3 CH3

OH
113 (Leu) 113 (Leu) 99 (Val)

b2+ H2O
129 (Glu)

y6
b3
y2

y4

M + H -H2O
y3

b5

b7
b4

b6
y5

Figura. Espectro de LC-ESI-MS/MS e proposta de fragmentação

da amostra Surfactina A2.
 356 469 582
C 13 H 25 O O O

C NH HC C NH CH C NH CH CH

O CH2 H2C CH2

-LEU-LEU-ASP-VAL
CH2 HC CH3 HC CH3

C O CH3 CH3

OH
113 (Leu) 113 (Leu)

b2+ H2O
129 (Glu)

y6
b3
y2

y4

M + H -H2O
y3

b5

b7
b4

b6
y5

Figura. Espectro de LC-ESI-MS/MS e proposta de fragmentação

da amostra Surfactina A2.
 356 469
C 13 H 25 O O

C NH HC C NH CH CH

O CH2 H2C
-LEU-LEU-ASP-VAL- LEU
CH2 HC CH3

C O CH3

OH
113 (Leu)

b2+ H2O
129 (Glu)

y6
b3
y2

y4

M + H -H2O
y3

b5

b7
b4

b6
y5

Figura. Espectro de LC-ESI-MS/MS e proposta de fragmentação

da amostra Surfactina A2.
 356
C 13 H 25 O

C NH HC CH

O CH2 -LEU-LEU-ASP-VAL- LEU-LEU

CH2

C O

OH

b2+ H2O
129 (Glu)

y6
b3
y2

y4

M + H -H2O
y3

b5

b7
b4

b6
y5

Figura. Espectro de LC-ESI-MS/MS e proposta de fragmentação

da amostra Surfactina A2.
 OH FA Leu

OH FA Glu Leu Leu Val Asp Leu Leu

b2(356) b3(469) b4(582) b5(681 b6(796) b7(909)

b2+ H2O

y6
b3
y2

y4

M + H -H2O
y3

b5

b7
b4

b6
y5

Figura. Espectro de LC-ESI-MS/MS e proposta de fragmentação

da amostra Surfactina A2.
 707.49 594.48 481.39 382.55
C 14 H 28 O O O O O 267*
O O
C NH HC C NH CH C NH CH C NH CH C NH HC C NH CH C NH CH COH 2 Na

O CH2 H2C CH2 HC CH3 CH2 H2C H2 C

CH2 HC CH3 HC CH3 CH3 C O HC CH3 HC CH3
C O CH3 CH3 CH3 CH3
OH
OH
113 (Leu) 113 (Leu) 99 (Val) 115 (Asp) 267 (Leu+Leu+H2O+ Na)

b2+ H2O
129 (Glu)

y6
b3
y2

y4

M + H -H2O
y3

b5

b7
b4

b6
y5

Figura. Espectro de LC-ESI-MS/MS e proposta de fragmentação

da amostra Surfactina A2.
 685 572 459 360
O O O O 245 O O
-FA- Glu- NH CH C NH CH C NH CH C NH HC C NH CH C NH CH COH 2
+

H2C CH2 HC CH3 CH2 H2C H2C

HC CH3 HC CH3 CH3 C O HC CH3 HC CH3
CH3 CH3 CH3 CH3
OH

113 (Leu) 113 (Leu) 99 (Val) 115 (Asp) (Leu+Leu+H2O)

y6
b3
y2

y4

M + H -H2O
y3

b5

b7
b4

b6
y5

Figura. Espectro de LC-ESI-MS/MS e proposta de fragmentação da amostra Surfactina A2.

 572 459 360 245
O O O O O
-FA- Glu-Leu- NH CH C NH CH C NH HC C NH CH C NH CH COH 2
+

CH2 HC CH3 CH2 H2 C H2C

HC CH3 CH3 C O HC CH3 HC CH3
CH3 CH3 CH3
OH

113 (Leu) 99 (Val) 115 (Asp) (Leu+Leu+H2O)

y6
b3
y2

y4

M + H -H2O
y3

b5

b7
b4

b6
y5

Figura. Espectro de LC-ESI-MS/MS e proposta de fragmentação da amostra Surfactina A2.

 459 360 245
O O O O
-FA- Glu-Leu-Leu- NH CH C NH HC C NH CH C NH CH COH 2
+

HC CH3 CH2 H2C H2C

CH3 C O HC CH3 HC CH3
CH3 CH3
OH

99 (Val) 115 (Asp) (Leu+Leu+H2O)

y6
b3
y2

y4

M + H -H2O
y3

b5

b7
b4

b6
y5

Figura. Espectro de LC-ESI-MS/MS e proposta de fragmentação da amostra Surfactina A2.

 360 245
O O O
-FA- Glu-Leu-Leu-Val- NH HC C NH CH C NH CH COH 2
+

CH2 H2 C H2 C

C O HC CH3 HC CH3
CH3 CH3
OH

115 (Asp) (Leu+Leu+H2O)

y6
b3
y2

y4

M + H -H2O
y3

b5

b7
b4

b6
y5

Figura. Espectro de LC-ESI-MS/MS e proposta de fragmentação da amostra Surfactina A2.

 245 O O
-FA- Glu-Leu-Leu-Val-Asp- NH CH C NH CH COH 2
+

H2 C H2 C

HC CH3 HC CH3
CH3 CH3

(Leu+Leu+H2O)

y6
b3
y2

y4

M + H -H2O
y3

b5

b7
b4

b6
y5

Figura. Espectro de LC-ESI-MS/MS e proposta de fragmentação da amostra Surfactina A2.

 OH FA Leu

y6(685) y5(572) y4(356) y3(356) y2(356)

OH FA Glu Leu Leu Val Asp Leu Leu
b2(356) b3(469) b4(582) b5(681 b6(796) b7(909)

y6
b3
y2

y4

M + H -H2O
y3

b5

b7
b4

b6
y5

Figura. Espectro de LC-ESI-MS/MS e proposta de fragmentação da amostra Surfactina A2.

Tabela. Íons detectados por fragmentação (LC-ESI-MS/MS) dos homólogos da surfactina a partir dos íons
percusores de m/z 1008, 1022, 1036 e 1050.
([M + H]+) (m/z)
Produtos da 1ª série (alifática) *Fragmentos 1008 1022 1036 1050
C13 C14 C15 C16
Surfactina A2
([M + H - H2O]+) 990 1004 1018 1032
([M + H - Leu]+) b7 895 909 923 937
([M + H - Leu-Leu]+) b6 782 796 810 824
([M + H - Leu-Leu-Asp]+) b5 667 681 695 709
([M + H - Leu-Leu-Asp-Val]+) b4 568 582 596 610
([M + H - Leu-Leu-Asp-Val-Leu]+) b3 455 469 483 497
([M + H - Leu-Leu-Asp-Val-Leu- b2 342 356 370 384
Leu]+)
Produtos da 2 ª série (peptídica)
[M + H - βOH FA-Glu]+ y6 685 685 685 685
[M + H - βOH FA-Glu-Leu]+ y5 572 572 572 572
[M + H - βOH FA-Glu-Leu-Leu]+ y4 459 459 459 459
[M + H - βOH FA-Glu-Leu-Leu-Val]+ y3 360 360 360 360
[M + H - βOH FA-Glu-Leu-Leu-Val- y2 245 245 245 245
Asp]+
βOH FA = cadeia β-hidroxi ácido
graxo
*Fragmentos: b = N-terminal; y = C-terminal
 CARACTERIZAÇÃO DOS LIPOPEPTÍDEOS POR ESI-MS/MS
+H
Amostra Iturina A1 y5
b3 (CH2)11
b4
Ser7 NH2
O NH CH2 O
HO H y4 Asn1
C O
y6 NH
H

b5
NH H b5
b2 O O
O y3

b2
NH

b3
H2N C H
Asn6 H Try 2
NH
y7
OH
O b6
O
H NH
b1 H
y2
N
H
O C NH2
NH
Pro5 O b7 O
Ans3

M + H -H2O
y1
y3
CO
Gln4
NH2

b7
y2

b6
b4

y5 Iturina A (C14) m/z 1043.5545

y4

y7
y6

Figura. Espectro de fragmentação do íon ([M+H]+) em m/z 1043,5545, obtido por LC-ESI-MS/MS da amostra Iturina A1 e respectiva proposta de
fragmentação para a isoforma iturina A (C14).
 Amostra Iturina A1

Prol Asn Ser AA Asn Tyr Asn - Gln-

b1(98) b2(212) b3(299) b4(524) b5(638) b6(801) b7(915)

b2

b5
b3

M + H -H2O
y3
y2

b7
b6
b4

y5
y4

y7
y6
b1
y1

Figura. Espectro de fragmentação do íon ([M+H]+) em m/z 1043,5545, obtido por LC-ESI-MS/MS da amostra Iturina A1 e respectiva proposta de
fragmentação para a isoforma iturina A (C14).
 Amostra Iturina A1
y7(946) y6(832) y5(745) y4(520) y3(406) y2(243) y1(129)

- Prol- Asn Ser AA Asn Tyr Asn Gln

b2

b5
b3

M + H -H2O
y3

b7
y2

b6
b4

y5
y4

y7
y6
b1
y1

Figura. Espectro de fragmentação do íon ([M+H]+) em m/z 1043,5545, obtido por LC-ESI-MS/MS da amostra Iturina A1 e respectiva proposta de
fragmentação para a isoforma iturina A (C14).
 y7(946) y6(832) y5(745) y4(520) y3(406) y2(243) y1(129)

Prol Asn Ser AA Asn Tyr Asn Gln

b1(98) b2(212) b3(299) b4(524) b5(638) b6(801) b7(915)

b2

b5
m/z 1043,5545

b3
Iturina A (C14)

M + H -H2O
y3

b7
y2

b6
b4

y5
y4

y7
y6
b1
y1

Figura. Espectro de fragmentação do íon ([M+H]+) em m/z 1043,5545, obtido por LC-ESI-MS/MS da amostra Iturina A1 e respectiva proposta de
fragmentação para a isoforma iturina A (C14).
 CARACTERIZAÇÃO DOS LIPOPEPTÍDEOS POR ESI-MS/MS
O OH
Glu 5 C
H2C
CH2 O
Thr 4 HO O C Ala 6
N C
C H H N
H3C CH H CH3
C C
H H O
N C
1080 H
1209 966 O C N
OH
H H
H
O Pro 7
C CH2 C N C C N C C N CH
O O H C C O
H H H
O H
HO NH2
255 N H
FA Glu 1 Orn 2 Tyr 3 O
HC CH2
C CH2 NH2
H C
O C

- (Ala)
C

- (Glu)
- (Thr)
H

- (Tyr)
- (FA+Glu +Orn+Tyr)

- (Ile)
HC N N O O
C C Gln 8
H3C CH2 H H
O CH2
H3C
Ile 10
OH

- (Orn)

- (FA)
- (Glu)
Tyr 9

FA

Glu

Orn

1463.8022
Prol Gln Tyr Ile Tyr Thr Glu Ala

98* 226 389 502 1162 1263 1392

m/z 1463,8022
Fengicina A (C16)

Figura. Espectro de fragmentação LC-ESI-MS/MS do íon ([M+H]+) em m/z 1463,8022 da amostra Fengicina AB1 e proposta de fragmentação para
a isoforma fengicina A (C16).
 1108 994

1 2 3 4 5 6
CH3-(CH2)12-CH-CH2-CO Glu Orn Tyr Thr Glu Val

- (Glu)
- (Orn)

- (FA)
O

- (Val)
10 9 8 7
Ile Tyr Gln Prol

m/z 1491,8498

1491.8498
Fengicina B (C16)

Figura. Espectro de fragmentação LC-ESI-MS/MS do íon ([M+H]+) em m/z 1491,8498 da amostra Fengicina AB1 e proposta de fragmentação para a
isoforma fengicina B (C ).
 R O R O HO
H OH
N O
O O NH O
O NH
H2N O
NH O
O

NH
NH
O NH NH2 O 7 6 10

O (7) (8) (9)

R= (13) R= C13
HO O
NH NH
N NH

O
NH O 8 8 9
O NH NH NH
O (10) (11) (12)
O O O
H2N O NH2 HO
O
Iturina A Surfactina A
10 9 8

R= (1) (2) (3)

HO R
HO O O
12 10 10 O O
O HO HO
(4) (5) (6) O OH
HO NH
O HO
H3C NH HO R O CH3
NH O
CH3
O O NH HN O
NH O
NH
N O NH NH
NH NH2

NH NH
O O
O
O
NH O N
NH2
O
O

O O
H2N O NH NH O
(14) R= C13 CH3
N NH
O NH
H (15) R= C14
HO O CH3 O O O
CH3 (16) R= C13
NH2
CH3 (17) R= C12
HO
Fengicina A Fengicina B
Figura. Lipopeptídeos isolados de B. amyloliquefaciens PpC1 2.2b (LP164)
 OBRIGADA!

Contato: spirottostein@yahoo.com.br