Quim. Nova, Vol. 33, No.

3, 667-679, 2010 ANTIBITICOS: IMPORTNCIA TERAPUTICA E PERSPECTIVAS PARA A DESCOBERTA E DESENVOLVIMENTO DE NOVOS AGENTES Denise Oliveira Guimares, Luciano da Silva Momesso e Mnica Tallarico Pupo* Departamento de Cincias Farmacuticas, Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo, Av. do Caf, s/n, 14040-903 Ribeiro Preto SP, Brasil Recebido em 26/2/09; aceito em 21/8/09; publicado na web em 24/2/10

ANTIBIOTICS: THERAPEUTIC IMPORTANCE AND PERSPECTIVES FOR THE DISCOVERY AND DEVELOPMENT OF NEW AGENTS. There is a continuous need for antibiotics, mainly with new mechanisms of action, since infectious diseases represent the second major cause of death in the world and bacteria resistance levels are high. This review describes the contribution of microbial natural products for the development of the major antibiotic classes, the mechanisms of action of current antibiotics, some modern approaches involving genetic tools for the discovery and development of new antibiotics from microbial products and antibiotics in clinical trials. Keywords: microbial natural products; drug discovery; antibiotics.

INTRODUO Antibiticos so compostos naturais ou sintticos capazes de inibir o crescimento ou causar a morte de fungos ou bactrias. Podem ser classificados como bactericidas, quando causam a morte da bactria, ou bacteriostticos, quando promovem a inibio do crescimento microbiano.1 As bactrias so organismos unicelulares, identificados pela primeira vez por van Leeuwenhoek por volta dos anos 1670, aps a inveno do microscpio. Porm, somente no sculo XIX a possibilidade destes micro-organismos serem causadores de processos infecciosos comeou a ser aventada. Esta hiptese surgiu aps os elegantes experimentos de Louis Pasteur, que demonstrou que algumas linhagens de bactrias eram importantes para processos de fermentao e, tambm, que as bactrias eram de ampla distribuio pelo meio ambiente.2 Aps a segunda metade do sculo XIX, cientistas como Robert Koch identificaram micro-organismos responsveis por doenas como tuberculose, clera e febre tifoide. Nessa poca, as pesquisas eram conduzidas na busca de agentes qumicos que apresentassem atividade antibitica. O pesquisador Paul Ehrlich, conhecido como o pai da quimioterapia uso de substncias qumicas contra infeces foi responsvel pelos conceitos primrios de que uma substncia qumica poderia interferir com a proliferao de micro-organismos, em concentraes tolerveis pelo hospedeiro.2 Em 1910, Ehrlich desenvolveu o primeiro antibitico de origem sinttica, salvarsan (1), usado contra sfilis. Poucos progressos foram conseguidos nos 20 anos seguintes para o desenvolvimento de antibiticos, at a introduo da proflavina (2), em 1934, agente amplamente utilizado na Segunda Guerra Mundial, principalmente contra infeces de feridas profundas. Entretanto, este composto era muito txico para ser usado em infeces bacterianas sistmicas, o que evidenciava a necessidade de agentes mais eficazes.2 Em 1935, um marco na quimioterapia antibacteriana ocorreu com a descoberta de Gerhard Domagk de que o corante vermelho prontosil (3) apresentava atividade in vivo contra infeces causadas por espcies de Streptococcus. O prontosil (3) um pr-farmaco que originou uma nova classe de antibiticos sintticos, as sulfas ou sulfonamidas (22), que constituem a primeira classe de agentes efetivos contra infeces
*e-mail: mtpupo@fcfrp.usp.br

sistmicas introduzida no incio dos anos 1940.2 Entretanto, as sulfas apresentam espectro de ao limitado e so pouco usadas atualmente. Apesar destes avanos, o grande marco no tratamento das infeces bacterianas ocorreu com a descoberta da penicilina (4), por Alexander Fleming, em 1928.3 A atividade da penicilina era superior das sulfas e a demonstrao que fungos produziam substncias capazes de controlar a proliferao bacteriana motivou uma nova frente de pesquisas na busca de antibiticos: a prospeco em culturas de micro-organismos, especialmente fungos e actinobactrias. A penicilina G, ou benzilpenicilina (4), foi descrita em 1929 como agente antibitico, porm somente foi introduzida como agente teraputico nos anos 1940. Aps o processo de industrializao da penicilina, especialmente em consequncia da Segunda Guerra Mundial,4 foi observado um rpido crescimento na descoberta e desenvolvimento de novos antibiticos. Entre os anos 1940-1960 vrios antibiticos foram descobertos atravs de triagens de produtos naturais microbianos, sendo a maioria deles eficazes para o tratamento de bactrias Gram positivo: b-lactmicos (5, cefalosporina), aminoglicosdeos (9, estreptomicina), tetraciclinas (12, clortetraciclina), macroldeos (10, eritromicina), peptdeos (15, vancomicina) e outros (11 cloranfenicol, 16 rifamicina B, 14 clindamicina e polimixina B). Neste perodo apenas trs derivados sintticos foram introduzidos no mercado: isoniazida, trimetropim (23) e metronidazol.5 Entre os anos 1960-1980 foram introduzidos no mercado antibiticos semi-sintticos eficazes para o tratamento de patgenos Gram positivo e Gram negativo, anlogos aos antibiticos naturais j existentes. A maioria deles foi obtida a partir de prottipos naturais microbianos, como derivados b-lactmicos (anlogos de penicilina e cefalosporina, cido clavulnico, aztreonam), anlogos da tetraciclina, derivados aminoglicosdicos (gentamicina, tobramicina, amicacina).5 Entre os anos 1980-2000 as principais ferramentas utilizadas para a busca de novos antibiticos foram a genmica e as triagens de colees de compostos, em detrimento s triagens de produtos naturais microbianos. Porm, houve uma reduo dramtica na identificao de novos prottipos antibiticos, ao mesmo tempo em que ocorreu um aumento na incidncia de resistncia bacteriana. Este perodo marcado pela modificao do mercado de antibiticos pela introduo da classe das fluoroquinolonas sintticas (25, 26) na metade dos anos 1980, desenvolvidas a partir do cido nalidxico (24). Alguns antibiticos baseados em

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prottipos naturais, como imipenem (derivado b-lactmico) e anlogos da eritromicina (10, derivado macroldeo) tambm foram introduzidos neste perodo. A combinao de dois derivados semi-sintticos de produtos naturais microbianos, quinupristina (18) e dalfopristina (19), foi aprovada
H2N HO As As 1 salvarsan NH2 N H2N N OMe 23 trimetropim OMe OMe N N O COOH NH2 OH H2N H2N N 2 prolavina O F
6 8 3

para uso em infeces causadas por Enterococcus faecium resistente vancomicina em 1999 pelo FDA (Food and Drug Administration).6 A partir de 2000, poucos antibiticos foram introduzidos para a teraputica antimicrobiana. Em 2001, apenas um antibitico de origem
O S NH2 O O O N H O

N N NH2

NH2

H2N 22 sulfametoxazol

3 prontosil O

COOH

F N HN N

COOH O N F

O N O NH O

N 7 N HN

24 cido nalidxico

25 enoxacina

26 ciprofloxacina

27 linezolida

Figura 1. Antibiticos de origem sinttica

H N O O 4 penicilina G (Penicillium notatum) NH H2N H2N NH H HO N O CHO OH O HO HO HO O NHCH3 OH OH N H N R OH O OH O O O HO O O HN N H CO2H Cl H N O O N H H 2N O HO OH OH 15 vancomicina (Streptomyces orientalis) O NH2 Cl O O N H H N O O N H NH HO N O 20 daptomicina (Streptomyces roseosporum) O OH OH OH OH OH 21 dalbavancina (derivado semi-sinttico de PN produzido por Streptomyces) HO O NH O N H H N O N H Cl HO O O O O NH O O HN O N H HOOC O NH NH NH2 N H O H2 N H N O COOH H N O OH OH O O O O N H COOH H N O O OH O N H NHCH3 16 R=H rifamicina B (Streptomyces mediterranei) 17 R= C N N H NH rifampicina 18 quinupristina (derivado semi-sinttico de PN produzido por Streptomyces) N MeO O O OH O O O HO HN N OH O O O O O NH N S O O OO O S N O N H O H N N O OH O NH N O O N NH OH OH O O OH HO O O O OH HO O O OCH3 OH N(CH3)2 O2N HN Cl OH OH O Cl OH O OH OH O O N COOH H2 N S COOH O O 5 cefalosporina C (Cephalosporium acremonium) O COOH O N O N O COOH O O H N S O OH N OH H N N O COOH COOH 8 tienamicina (Streptomyces cattleya) OH N S OH NH2

6 cido clavulnico (Streptomyces clavuligerus) HOOC NH2

7 nocardicina A (Nocardia uniformis)

Cl

HO

N OH NH2 N R O

OH OH

10 eritromicina (Streptomyces erythreus)

11 cloranfenicol (Streptomyces venezuela)

12 clortetraciclina (Streptomyces aureofaciens)

9 estreptomicina (Streptomyces griseus) O OH HO O O

SCH3 OH 13 R=OH lincomicina (Streptomyces lincolnensis) 14 R=Cl clindamicina (derivado semi-sinttico)

H2 N HO

19 dalfopristina (derivado semi-sinttico de PN produzido por Streptomyces)

HOOC OH HN O HN HN O O COOH O

H N

H N O

H N

O OH

Figura 2. Frmacos representativos das principais classes de antibiticos de origem natural

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Antibiticos: importncia teraputica e perspectivas

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sinttica da classe das oxazolidinonas foi introduzido no mercado farmacutico, a linezolida (27).5 Os programas de descoberta de antibiticos de fontes naturais tm sido retomados em algumas indstrias farmacuticas, levando aprovao do lipodepsipeptdeo natural daptomicina (20) pelo FDA em 2003. O derivado semi-sinttico glicopeptdico dalbavancina (21) encontra-se em fase III de triagens clnicas pelo FDA.5,6 PRINCIPAIS CLASSES DE ANTIBITICOS EM USO CLNICO Os antibiticos de origem natural e seus derivados semi-sintticos compreendem a maioria dos antibiticos em uso clnico e podem ser classificados em b-lactmicos (penicilinas, cefalosporinas, carbapeninas, oxapeninas e monobactamas), tetraciclinas, aminoglicosdeos, macroldeos, peptdicos cclicos (glicopeptdeos, lipodepsipeptdeos), estreptograminas, entre outros (lincosamidas, cloranfenicol, rifamicinas etc). Os antibiticos de origem sinttica so classificados em sulfonamidas, fluoroquinolonas e oxazolidinonas.2,7,8 Os principais mecanismos de ao antibitica destes agentes teraputicos esto listados na Tabela 1. Antibiticos b-lactmicos Os antibiticos b-lactmicos corresponderam a 50% do total de vendas de antibiticos em 2004.9 So agentes antibacterianos que inibem irreversivelmente a enzima transpetidase, que catalisa a reao de transpeptidao entre as cadeias de peptideoglicana da parede celular bacteriana.1,10 A atividade desta enzima leva formao de ligaes cruzadas entre as cadeias peptdicas da estrutura peptideoglicana, que conferem parede celular uma estrutura rgida importante para a proteo da clula bacteriana contra as variaes osmticas do meio. Constituem a primeira classe de derivados de produtos naturais utilizados no tratamento teraputico de infeces bacterianas. Hoje, vrias dcadas aps a descoberta da penicilina, este grupo ainda contm os agentes mais comumente utilizados. Possuem amplo espectro de atividade antibacteriana, eficcia clnica e excelente perfil de segurana, uma vez que atuam na enzima transpeptidase, nica em bactrias. Todos os antibiticos b-lactmicos tm um elemento estrutural farmacofrico em comum, o anel azetidinona de quatro membros, Tabela 1. Principais mecanismos de ao antibitica1,2
Antibiticos b-lactmicos (penicilinas, cefalosporinas, carbapeninas, monobactamas) b-lactmicos (oxapeninas, sulfoxapeninas) Macroldeos, lincosamidas, estreptograminas (dalfopristina e quinupristina), cloranfenicol, oxazolidinonas (linezolida) Aminoglicosdeos, tetraciclinas Glicopeptdeos (vancomicina, teicoplanina) Alvo Enzima transpeptidase

ou anel b-lactmico. Na maioria dos antibiticos, o anel central b-lactmico fundido a outro anel de cinco (tiazolidnico) ou seis (dihidrotiaznico) membros, formando as penicilinas ou cefalosporinas, respectivamente.9,10 Em geral, o sistema bicclico fundamental para a atividade destes antibiticos, por mimetizar o resduo dipeptdico terminal D-Ala-D-Ala da cadeia de peptideoglicana, substrato da enzima transpeptidase (Figura 3). O sistema bicclico tensionado destes antibiticos contribui para o aumento da instabilidade qumica do anel b-lactmico, altamente suscetvel ao ataque de nuclefilos que promovem a hidrlise do grupo farmacofrico. No caso das penicilinas, o oxignio da cadeia lateral aclica participa como nuclefilo em reao intramolecular que promove a abertura do anel b-lactmico em meio cido, inativando o antibitico e inviabilizando sua administrao por via oral (Figura 4A). As modificaes estruturais possveis ficam restritas s cadeias laterais, que podem modular: a estabilidade em meio cido, fundamental para a atividade por via oral destes frmacos; a estabilidade frente s b-lactamases, enzimas bacterianas relacionadas resistncia, que hidrolisam o grupo farmacofrico destes antibiticos e, o espectro de ao frente a bactrias Gram negativo. Para aumentar a estabilidade em meio cido foram adicionados grupos retiradores de eltrons no carbono a ao carbono carbonlico da cadeia lateral em penicilinas semi-sintticas (ampicilina, amoxicilina, oxacilinas), que diminuem a nucleofilicidade do oxignio carbonlico (Tabela 2). O principal mecanismo de resistncia bacteriana aos antibiticos b-lactmicos atravs da produo de enzimas que apresentam grupos nucleoflicos (em geral, resduos de serina) capazes de promover a abertura do anel b-lactmico. Neste caso, a modificao molecular responsvel pelo aumento de resistncia s b-lactamases foi a introduo de grupamentos volumosos no carbono a ao carbono carbonlico da cadeia lateral em penicilinas semi-sintticas (meticilina, oxacilinas), que impedem o acesso dos antibiticos ao stio ativo da enzima b-lactamase por impedimento estrico.10 Devido natureza mais complexa da parede celular, as bactrias Gram negativo so mais resistentes ao de antibiticos, que no so capazes de cruzar efetivamente esta barreira lipdica. Para ter acesso clula bacteriana, os antibiticos devem cruzar a parede

Enzima b-lactamase Subunidade 50S ribossmica

Mecanismo de ao Inibio da formao de ligao cruzada entre cadeias de peptideoglicano, impedindo a formao correta da parede celular bacteriana. Inibio da enzima de resistncia bacteriana, que degrada antibiticos b-lactmicos. Inibio da sntese proteica bacteriana.

Subunidade 30S ribossmica Dipeptdeo terminal D-Ala-D-Ala do peptideoglicano Membrana plasmtica

Peptdeos no ribossomais (bacitracina, gramicidina C, polimixina B) Lipodepsipeptdeos (daptomicina)

Membrana plasmtica

Rifampicina Fluoroquinolonas Sulfonamidas

RNA polimerase dependente de DNA Enzima DNA girase Enzima di-hidropteroato sintetase

Inibio da sntese proteica bacteriana. Complexao com as cadeias peptdicas no ligadas e bloqueio da transpeptidao, impedindo a formao correta da parede celular bacteriana. Afetam permeabilidade da membrana bacteriana por facilitarem o movimento descontrolado de ons atravs da membrana. Afeta permeabilidade da membrana bacteriana e bloqueia sntese de cido pipoteicoico, componente da membrana externa de bactrias Gram positivo. Inibio da sntese de RNA. Bloqueio da replicao e reparo do DNA. Bloqueio da formao de cofatores do cido flico, importantes para sntese de cidos nucleicos.

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Figura 3. Mecanismo de reao da transpeptidase na formao de ligao cruzada entre cadeias peptdicas da parede celular bacteriana e inibio por antibiticos b-lactmicos

Tabela 2. Estrutura e propriedades das principais categorias de penicilinas em uso clnico1

Categoria Baixo espectro de ao, sensvel a b-lactamases

Nome Penicilina G (4) (benzilpenicilina) Penicilina V (28)

Propriedades Fraca estabilidade cida Boa estabilidade cida Fraca estabilidade cida Boa estabilidade cida

Baixo espectro de ao, resistente a b-lactamases

Meticilina (29)

Oxacilina (30) R = H ampicilina (31) R = OH amoxicilina (32)

Amplo espectro de ao, sensvel a b-lactamases

Boa estabilidade cida

celular atravs de canais proteicos de porina, embebidos na estrutura lipdica, que apresentam o interior com caractersticas hidroflicas. Assim, antibiticos com maior atividade frente a bactrias Gram negativo so aqueles que apresentam grupos ionizveis em suas estruturas qumicas. A Tabela 2 apresenta as principais modificaes estruturais encontradas em penicilinas. O maior nmero de antibiticos b-lactmicos em uso clnico pertence classe das cefalosporinas, que esto subdivididas em cefalosporinas de primeira, segunda, terceira e quarta geraes, em funo do espectro de ao mais ampliado frente a bactrias Gram negativo. O sistema bicclico das cefalosporinas menos tensionado em comparao ao das penicilinas, o que contribui para a maior estabilidade frente reao de abertura intramolecular do anel b-lactmico pela cadeia lateral.2,10 De fato, no so observados produtos de degradao cefalosporinas provenientes deste tipo de reao. A presena de grupos abandonadores ligados na posio 3 favorece a reao com a enzima transpeptidase (Figura 4B) contribuindo, portanto, para a ao antibitica. Por outro lado, a presena de steres em C-3 favorece a hidrlise por esterases plasmticas. A hidrlise por esterases leva formao do lcool, que um fraco grupo abandonador e, portanto, o produto reagir mais lentamente com a enzima transpeptidase. A introduo de grupos abandonadores diferentes do ster, como piridiA
H R O O N N H COOH S H+/ H2O

Amplo espectro Carbenicilina (33) de ao, antiPseudomonas, sensvel a Ticarcilina (34) b-lactamases

Fraca estabilidade cida Fraca estabilidade cida Uso injetvel, ativo frente a P. aeruginosa, atividade aumentada frente a Enterobacteriaceae

R N O O HN COOH S

B
R O O OH Enz Ser H N 7 N 3 COOH O O S R O O H N N O Ser

Espectro de ao estendido

Piperacilina (35)

COOH

Enzima

Figura 4. A- Instabilidade de penicilinas em meio cido. B- Mecanismo de ao das cefalosporinas

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Figura 5. Exemplos selecionados de cefalosporinas de 1 4 gerao

nium e carbamato, impede a hidrlise por esterases e favorece a reao com a enzima transpeptidase. Porm, estes grupos abandonadores tambm podem aumentar a hidrlise em meio cido, dificultando a administrao por via oral destes antibiticos. A presena de metila em C-3 favorece a absoro no trato gastrointestinal, mas diminui a velocidade de reao com a enzima transpeptidase. Modificaes em C-7 contribuem para o aumento de resistncia frente s b-lactamases. Tanto a introduo de um grupamento metoxlico com configurao a em C-7 quanto a presena de funo oximino na posio a ao carbono carbonlico da cadeia lateral conferem resistncia s enzimas b-lactamases. A presena de anel aminotiazlico na cadeia lateral em C-7 de cefalosporinas de terceira gerao aumenta a penetrao do antibitico atravs da membrana externa das bactrias Gram negativo. Estruturas zwitterinicas apresentam maior atividade em bactrias Gram negativo, devido ao maior carter hidroflico (Figura 5). As cefalosporinas de primeira gerao so consideradas frmacos de menor atividade que as penicilinas, porm apresentam boa atividade frente a bactrias Gram positivo. Tambm podem ser utilizadas para tratamento de infeces por S. aureus e por Streptococcus quando as penicilinas tm que ser evitadas. As cefalosporinas de segunda gerao so frmacos que, em geral, apresentam atividade variada frente a bactrias Gram positivo, porm atividade superior frente a bactrias Gram negativo. A terceira e a quarta gerao das cefalosporinas tambm so representadas por frmacos da classe das oximinocefalosporinas. Essa classe de frmacos representa um considervel incremento na potncia e no espectro de ao, particularmente frente a bactrias Gram negativo.2,10 Durante o perodo de maior procura por novos antibiticos, compreendido entre as dcadas de 1970 e 1980, muitos subgrupos de b-lactmicos foram relatados, tais como as monobactamas,9 representadas pelas nocardicinas (naturais) e pelo aztreonam (sinttico), e as clavamas ou oxapeninas, representadas pelo cido clavulnico (6), frmaco inativador de b-lactamases.1 Os inibidores de b-lactamases apresentam fraca ao antibitica, devido ausncia de cadeia lateral em C-6. Porm, reagem rapida e irreversivelmente com enzimas de resistncia bacteriana, com mecanismo anlogo ao da reao de penicilinas e cefalosporinas com a enzima transpeptidase. So geralmente usados em combinaes com penicilinas de amplo espectro de ao. As monobactamas so antibiticos b-lactmicos monocclicos e foram isoladas de fontes naturais. As nocardicinas (7) apresentam atividade moderada in vivo frente a um pequeno grupo de bactrias Gram negativo, incluindo Pseudomonas aeruginosa.2,10 O aztreonam um frmaco sinttico da classe das monobactamas com antividade antibitica e administrado via intravenosa. Apresenta atividade frente a micro-organismos Gram positivo e bactrias anaerbias.2,10 A tienamicina (8) foi o primeiro exemplo da classe das carbapeninas naturais e serviu de prottipo para o desenvolvimento de anlogos sintticos como imipenem, meropenem e ertapenem. As carbapeninas

atuam de maneira anloga s penicilinas e cefalosporinas, com elevada potncia e extraordinrio espectro de atividade frente a bactrias Gram positivo e Gram negativo, alm de boa resistncia a b-lactamases.2 Aminoglicosdeos Os aminoglicosdeos so agentes que possuem um grupo amino bsico e uma unidade de acar. A estreptomicina (9), principal representante da classe, foi isolada em 1944 de Streptomyces griseus, um micro-organismo de solo. Os aminoglicosdeos apresentam atividade melhorada em pH levemente alcalino, em torno de 7,4, onde esto positivamente carregados, facilitando a penetrao em bactrias Gram negativo.2 Os antibiticos aminoglicosdicos apresentam efeito bactericida por ligarem-se especificamente subunidade 30S dos ribossomos bacterianos, impedindo o movimento do ribossomo ao longo do mRNA e, consequentemente, interrompendo a sntese de protenas.2,11 O uso contnuo de antibiticos aminoglicosdeos deve ser cuidadosamente controlado, devido aos efeitos ototxicos e nefrotxicos. Esses agentes so efetivos contra bactrias Gram negativo aerbicas, como P. aeruginosa, e apresentam efeito sinrgico com b-lactmicos.1 Devido polaridade, os aminoglicosdeos devem ser administrados por via injetvel. Eles tambm so incapazes de atravessar a barreira hemato-enceflica eficientemente e, portanto, no podem ser usados para o tratamento de meningites, a menos que sejam injetados diretamente no sistema nervoso central.2,11 Macroldeos Os macroldeos representaram cerca de 18% do total de vendas de antibiticos em 2004.9 Os macroldeos naturais caracterizam-se pela presena de lactonas macrocclicas de origem policetdica de 14 ou 16 membros, ligadas a um acar e um amino-acar.1 Derivados semi-sintticos podem apresentar anel macrocclico de 15 membros (azitromicina). A eritromicina (10), isolada pela primeira vez em 1952 de Streptomyces erythreus, um dos mais seguros antibiticos em uso clnico.2 Os macroldeos so agentes bacteriostticos, que atuam pela ligao com o RNA ribossomal 23S da subunidade 50S, interferindo na elongao da cadeia peptdica durante a translao e bloqueando a biossntese de protenas bacterianas.9,12 So usados em infeces respiratrias como pneumonia, exacerbao bacteriana aguda de bronquite crnica, sinusite aguda, otites mdias, tonsilites e faringites. Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae e Moraxella catarrhalis so os patgenos predominantes envolvidos nestas doenas.9 A eritromicina age frente maioria dos patgenos respiratrios, considerada segura e amplamente prescrita a crianas. Entretanto, seu limitado espectro de ao e sua limitada estabilidade em meio

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cido resultam em uma fraca biodisponibilidade e uma variedade de outros efeitos colaterais, tais como influncia na motilidade gastrointestinal, aes pr-arrtmicas e inibio do metabolismo de frmacos. Porm, durante dcadas, esforos tm sido realizados para se obter novos derivados da eritromicina, tanto de origem natural quanto sinttica, com perfis mais favorveis. Antibiticos macroldeos de segunda gerao, como roxitromicina, claritromicina e azitromicina, foram gradualmente substituindo a eritromicina, superando seu espectro de atividade, melhorando a atividade e os perfis fsico-qumico e farmacocintico, alm de atenuar os efeitos colaterais.9 Cloranfenicol O cloranfenicol (11) foi isolado a primeira vez do microorganismo Streptomyces venezuela. Atualmente o cloranfenicol sintetizado e somente o ismero R,R ativo.2,9 O cloranfenicol liga-se subunidade 30S do ribossomo e parece inibir o movimento dos ribossomos ao longo do mRNA, provavelmente pela inibio da peptidil transferase, responsvel pela extenso da cadeia peptdica. Uma vez que o cloranfenicol se liga mesma regio que os macroldeos e as lincosamidas, eles no podem ser administrados em associao. Os grupamentos nitro e ambos grupamentos lcool esto envolvidos nas interaes. O grupo dicloroacetamida tambm importante, porm pode ser substitudo por outros grupos eletronegativos.2,9 Tetraciclinas As tetraciclinas so antibiticos policetdicos bacteriostticos de amplo espectro e bastante eficazes frente a diversas bactrias aerbicas e anaerbicas Gram positivo e Gram negativo. 2,13 A clortetraciclina (12) foi o primeiro derivado a ser descoberto. As tetraciclinas inibem a sntese de protenas atravs da ligao com a subunidade 30S dos ribossomos, impedindo a ligao do aminoaciltRNA. Como resultado, a adio de novos aminocidos para o aumento da cadeia proteica bloqueada. A liberao de protenas tambm inibida.2,9 A seletividade frente aos ribossomos bacterianos em relao aos ribossomos de eucariotos deve-se a diferenas estruturais nos ribossomos e tambm concentrao seletiva do antibitico nas clulas bacterianas.1 Devido ao aumento de resistncia bacteriana s tetraciclinas, o seu uso como primeira escolha na terapia antibitica tem diminudo. Entretanto, o desenvolvimento recente de um derivado semi-sinttico desta classe, a tigeciclina (77), que inibe a bomba de efluxo, indica o interesse contnuo nesta classe de antibiticos.1 Devido presena de formas de equilbrio ceto-enlico, as tetraciclinas apresentam a capacidade de quelar metais, especialmente clcio. Portanto, seu uso no recomendado em crianas e mulheres grvidas, uma vez que estes antibiticos podem se acumular em dentes e ossos em formao.2 Lincosamidas As lincosamidas tm propriedades antibacterianas similares aos macroldeos e agem pelo mesmo mecanismo de ao. A lincomicina (13) e seu derivado semi-sinttico clindamicina (14) foram introduzidos na prtica clnica como antibiticos de uso oral em 1960 e 1969, respectivamente. A lincomicina foi isolada do micro-organismo de solo Streptomyces lincolnensis. A clindamicina um antibitico amplamente utilizado, que possui melhor atividade e maior absoro por via oral. A clindamicina o frmaco de escolha para o tratamento de infeces perifricas causadas por Bacillus fragilis ou outras bactrias anaerbicas penicilina resistentes. Este frmaco tambm topicamente utilizado para o tratamento de acne.2,9,14

Glicopeptdeos Os antibiticos glicopeptdicos, vancomicina (15) e teicoplanina tm se tornado os frmacos de primeira linha no tratamento de infeces por bactrias Gram positivo com resistncia a diversos antibiticos.15 A vancomicina (15), o primeiro antibitico glicopeptdico introduzido na prtica clnica em 1959, foi isolada de amostras de solo de Streptomyces orientalis (reclassificado como Amycolatopsis orientalis). A elucidao da estrutura desse antibitico demorou vrios anos, at ser completa e inequivocadamente proposta na dcada de 1980.9 A vancomicina apresenta uma conformao rgida importante para a atividade. Os glicopeptdeos inibem a biossntese da parede celular bacteriana pela complexao com o resduo dipeptdico terminal D-Ala-D-Ala das cadeias peptdicas que constituem a parede celular. Esta complexao impede que o substrato esteja disponvel para a ao da transpeptidase inibindo, portanto, a reao de transpeptidao.1,15 O desenvolvimento de resistncia bacteriana a estes antibiticos mais lento, apesar de algumas linhagens de Staphylococcus aureus hospitalares j apresentarem resistncia desde 1966.2 Eles so restritos para o tratamento de infeces causadas por bactrias Gram positivo por serem incapazes de penetrar nas membranas de bactrias Gram negativo.9,15 A vancomicina (15) em geral o antibitico de ltima escolha frente a patgenos Gram positivo resistentes, em particular contra espcies de Enterococcus. Lipodepsipeptdeos A daptomicina (20) um lipodepsipeptdeo isolado de Streptomyces roseosporus e aprovado em 2003 para tratamento de infeces causadas por bactrias Gram positivo. Seu mecanismo de ao envolve desorganizao de mltiplas funes da membrana celular bacteriana.2,9,12 provvel que todos os antibiticos lipopeptdicos apresentem alguma penetrao na membrana devido s cadeias alqulicas, o que promove sua desorganizao.1 Rifamicinas A rifampicina (17) um frmaco semi-sinttico derivado da rifamicina B (16), produto natural hbrido de policetdeos e peptdeos no ribossomais. A rifamicina B (16) foi isolada de Streptomyces mediterranei, reclassificado como Nocardia mediterranei.1 A rifampicina um inibidor da RNA polimerase, utilizada clinicamente como parte da combinao de frmacos para o tratamento da tuberculose. o nico frmaco em uso clnico que bloqueia a transcrio bacteriana.1,12 Estreptograminas A pritinamicina uma mistura de substncias macrolactonas obtidas de Streptomyces pristinaespiralis, que podem ser utilizadas oralmente no tratamento de infeces por bactrias Gram positivo. Dois derivados semi-sintticos desta classe, quinupristina e dalfopristina, tm sido utilizados por via intravenosa em combinao.2 A quinupristina (18) derivada da pristinamicina I, uma peptideolactona cclica no ribossonal, enquanto a dalfopristina (19) deriva da pristinamicina IIA, um hbrido policetdico/peptdico contendo um anel macrolactnico.1,16 Esses agentes atuam de maneira sinergstica para bloquear a translao do polipeptdeo, pela ligao na subunidade 50S dos ribossomos bacterianos, na regio 23S do rRNA, sobrepondo parcialmente o stio de ligao dos macroldeos.1,14 Aparentemente, a ligao da dalfopristina (19) aumenta a afinidade da ligao para a quinupristina (18), explicando o efeito sinrgico. A quinupristina (18) inibe a elongao da cadeia peptdica, enquanto a dalfopristina (19) interfere na transferncia da cadeia peptdica de um tRNA para outro.2

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Antibiticos: importncia teraputica e perspectivas

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Antibiticos sintticos Sulfonamidas e trimetoprim As sulfonamidas, tambm conhecidas como sulfas, foram testadas pela primeira vez nos anos 1930 como frmacos antibacterianos. Um exemplo de sulfa ainda utilizada na teraputica o sulfametoxazol (22), em associao com o trimetoprim (23), para o tratamento de pacientes com infeces no trato urinrio e tambm para pacientes portadores do vrus HIV que apresentam infeces por Pneumocystis carinii. Cada um desses frmacos bloqueia uma etapa no metabolismo do cido flico.12 O sulfametoxazol bloqueia a enzima di-hidropteroato sintetase, presente apenas nas bactrias, enquanto o trimetoprim inibe a di-hidrofolato redutase. Ambas as enzimas atuam na via de biossntese do N5,N10-metileno-tetra-hidrofolato, importante cofator que fornece uma unidade de carbono na biossntese de bases pirimidnicas constituintes dos cidos nucleicos. A atuao destes frmacos sinrgica no bloqueio de dois diferentes passos na via bioqumica de formao deste cofator essencial.1 As sulfonamidas so, portanto, agentes bacteriostticos que atuam como antimetablitos do cido paminobenzoico, substrato para a di-hidropteroato sintetase bacteriana, impedindo a formao do di-hidropteroato e, consequentemente, do N5,N10-metileno-tetra-hidrofolato.2 Quinolonas e fluoroquinolonas As quinolonas e fluoroquinolonas so frmacos bactericidas muito utilizados no tratamento de infeces do trato urinrio e tambm no tratamento de infeces causadas por micro-organismos resistentes aos agentes antibacterianos mais usuais.2 Esta classe representou 19% das vendas de antibiticos em 2004.9 O cido nalidxico (24), sintetizado em 1962, foi o prottipo desta classe de antibiticos. ativo frente a bactrias Gram negativo e utilizado no tratamento de infeces do trato urinrio, porm, os micro-organismos podem adquirir rpida resistncia a esse antibitico. Vrios outros anlogos tm sido sintetizados, com propriedades similares ao cido nalidxico.2 A enoxacina (25), desenvolvida em 1980, um frmaco que apresenta elevado espectro de atividade frente a bactrias Gram positivo e Gram negativo. tambm ativo frente Pseudomonas aeruginosa, bactria altamente resistente a antibiticos. O desenvolvimento da enoxacina (25) foi baseado na descoberta de que um tomo de flor na posio 6 aumenta a atividade, bem como facilita a entrada na clula bacteriana. Um anel piperaznico bsico na posio 7 levou ao aumento na absoro por via oral, distribuio tecidual e estabilidade metablica. Foi observado tambm um aumento no nvel e espectro de atividade, particularmente frente a bactrias Gram negativo como Pseudomonas aeruginosa. Muitos desses benefcios so devidos ao substituinte bsico ligado posio 7 formar um zwitterion com o cido carboxlico da posio 3.2 A introduo de um substituinte cicloproplico na posio 1 incrementou o amplo espectro de ao, enquanto a substituio do nitrognio da posio 8 por um carbono reduziu as reaes adversas e aumentou a atividade frente a S. aureus. Estas modificaes originaram a ciprofloxacina (26), o antibitico mais ativo da classe das fluoroquinolonas frente a bactrias Gram negativo. Esse frmaco amplamente utilizado em infeces do trato urinrio, respiratrio e gastrointestinal, alm de infeces de pele, ossos e articulaes.2 As fluoroquinolonas agem inibindo a topoisomerase IV de bactrias Gram positivo e apresentam seletividade 1000 vezes maior para enzimas bacterianas em relao s enzimas correspondentes em clulas humanas. Em bactrias Gram negativo, o alvo das fluoroquinolonas a topoisomerase II, tambm conhecida por DNA-girase, que apresenta as mesmas funes da topoisomerase IV.2,17 As DNA-topoisomerases mudam o nmero de ligaes no DNA superenrolado atravs de quebras transitrias no DNA, que se torna topologicamente relaxado devido quebra temporria

em uma fita (tipo I) ou em ambas as fitas ao mesmo tempo (tipo II).1,17 Topoisomerases so essenciais para a viabilidade celular em clulas procariticas e eucariticas. As quinolonas apresentam boa seletividade para clulas bacterianas. Oxazolidinonas A linezolida (27) um agente bacteriosttico da classe das oxazolidinonas que apresenta um amplo espectro de ao e atividade frente a bactrias resistentes a outros antibiticos que inibem a sntese de protenas.18 A linezolida (27) liga-se subunidade 50S ribossomal, impedindo sua unio com a subunidade 30S para formao do ribossomo 70S, essencial para o incio da sntese proteica. Desta forma, a translao no pode ser iniciada. Os outros antibiticos que inibem a sntese proteica atuam no prprio processo de translao.2,18 A linezolida (27) foi lanada em 2000 e apresenta boa atividade frente bactrias Gram positivo. Esse frmaco pode ser administrado por via oral, porm, apresenta um alto nvel de efeitos colaterais.2,18 RESISTNCIA BACTERIANA A resistncia pode ser considerada um fenmeno ecolgico que ocorre como resposta da bactria frente ao amplo uso de antibiticos e sua presena no meio ambiente.19 As bactrias multiplicam-se rapidamente, sofrem mutao e so promscuas, podendo trocar material gentico entre linhagens de mesma espcie ou de espcies diferentes. So consideradas micro-organismos de alta capacidade de adaptao a diversos fatores, como a exposio a agentes qumicos potentes.5,19 Antes do sculo XXI a resistncia bacteriana ocorria predominantemente em ambientes hospitalares. Atualmente, a resistncia bacteriana est associada a diversos ambientes e pode atingir indivduos saudveis.19 Uma alternativa que pode ser adotada na tentativa de contornar o problema da resistncia bacteriana o uso de terapias associadas.5 Porm, o uso extensivo e muitas vezes inapropriado dos antibiticos, ms condies de higiene, fluxo contnuo de viajantes, o aumento de pacientes imunocomprometidos e a demora no diagnstico das infeces bacterianas tm favorecido o aumento da resistncia.9 Um dos mais recentes exemplos de resistncia a antibiticos a causada por patgenos intracelulares, que constituem um reservatrio para infeces recorrentes. Isso ocorre quando os patgenos atacam clulas como os macrfagos e ficam em um estgio de dormncia, protegidos dos efeitos dos antibiticos administrados. Atualmente, os antibiticos ampicilina e meropenem so capazes de combater mais eficiente e rapidamente bactrias intracelulares do que as extracelulares.20 difcil predizer qual micro-organismo vai ser influenciado por um determinado antibitico, pois nem sempre ocorre a resistncia com o patgeno que est sendo focado no tratamento. Um exemplo foi a observao de resistncia de enterococci frente vancomicina utilizada, inicialmente, para o tratamento do patgeno Staphylococcus aureus resistente meticilina.21 O conhecimento dos mecanismos bioqumicos e genticos envolvidos na resistncia bacteriana de grande importncia para se entender como a bactria pode desenvolver a resistncia. Apesar destes mecanismos variarem de patgeno para patgeno, a resistncia causada por alguns fatores bsicos: inativao do antibitico diretamente na molcula bioativa por alteraes qumicas, geralmente promovidas por enzimas bacterianas;22 modificao do alvo que leva perda de sensibilidade ao antibitico;23 mudanas na bomba de efluxo e permeabilidade externa da membrana que promovem a reduo da concentrao do antibitico sem sua modificao qumica;16 transmisso do alvo algumas bactrias se tornam insensveis a alguns antibiticos porque so capazes de transmitir a inativao de uma

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determinada enzima, ou seja, os antibiticos com mecanismos de ao que envolvem inibio enzimtica tornam-se inativos por no terem o alvo para atuar.25 Algumas estratgias podem ser adotadas para evitar o desenvolvimento de resistncia bacteriana: preveno de infeces bacterianas com o uso de vacinas, uso racional de antibiticos, controle e preveno da disseminao de micro-organismos resistentes, descoberta e desenvolvimento de novos antibiticos.26 Alm disso, a caracterizao dos genes responsveis pela resistncia, assim como sua localizao e diversidade so de grande importncia para o entendimento dos fatores envolvidos na resistncia.26 Atualmente, h apenas cerca de trs compostos antibiticos com novos mecanismos de ao em estudos pr-clnicos Fase I, sendo que estes compostos so de amplo espectro para micro-organismos Gram positivo ou para infeces do trato respiratrio. O cenrio para bactrias Gram negativo ainda mais alarmante, pois no h nenhum composto com novo mecanismo de ao em ensaios pr-clnicos.27 Aspectos econmicos so tambm preocupantes. As indstrias farmacuticas desejam receber o retorno financeiro investido ao longo do processo de desenvolvimento aps terem um antibitico lanado no mercado. Entretanto, o aumento do uso de agentes antibiticos gera tambm o rpido aumento da resistncia bacteriana, o que contribui para diminuir o tempo da patente. O investimento na busca de agentes antibiticos fica mais complicado, pois a descoberta de um antibitico pode levar cerca de 7-10 anos e o desenvolvimento de resistncia pode levar 7-8 anos.5 Os antibiticos mais recentes lanados no mercado e em estudos clnicos esto ilustrados na Figura 7 e pode-se destacar a significativa e contnua contribuio de produtos naturais microbianos nesta classe teraputica. A tigeciclina (77), pertecente classe das tetraciclinas, foi recentemente lanada no mercado pela indstria Wyeth.12 Os derivados glicopeptdicos dalbavancina (21), telavancina (79) e oritavancina (82) ainda esto sendo submetidos a estudos clnicos. A telavancina (79) e oritavancina (82) atuam na terminao D-alaD-ala, precursores do peptdeoglicano da parede celular bacteriana. O antibitico b-lactmico ceftobiprol (80) est em estudos clnicos fase III.12 Dois novos macroldeos, telitromicina (78), lanada no mercado, e cetromicina (81), em estudos clnicos Fase III, so antibiticos que atuam no domnio V da regio 23S do rRNA.12 O iclaprim (83) est em Fase III de estudos clnicos e atua na inibio da di-hidrofolato redutase.12 PERSPECTIVAS PARA A DESCOBERTA E DESENVOLVIMENTO DE NOVOS ANTIBITICOS Diversas razes justificam a necessidade urgente por novos agentes antibiticos: doenas infecciosas so a segunda maior causa de mortalidade do mundo; altas taxas de resistncia microbiana, especialmente em ambientes hospitalares; o decrscimo constante observado no nmero total de novos agentes antimicrobianos aprovados pelo FDA;28 a necessidade de agentes que atuem por mecanismos de ao diferentes aos frmacos em uso.27,29 Novas fontes de produtos naturais Antibiticos naturais geralmente apresentam estruturas qumicas complexas importantes para as interaes especficas e reconhecimento por alvos macromoleculares em bactrias patognicas.30 Neste contexto, nos ltimos 10 anos os pesquisadores tm voltado ateno para fontes naturais ainda pouco exploradas, pois organismos obtidos de novos ecossistemas esto frequentemente associados nova diversidade qumica.31 Uma ampla diversidade de organismos tem sido explorada nos mais diversos habitats, especialmente em locais

de condies ambientais extremas (ambientes que possuem alteraes drsticas de temperatura, pH, umidade e/ou luminosidade). O crescente interesse por micro-organismos marinhos, especialmente actinobactrias, tem levado descoberta de substncias com atividade antitumoral e antibitica.32 Algumas destas substncias esto ilustradas na Figura 6. O antibitico policclico abissomicina C (45) foi isolado de uma actinobactria marinha do gnero Verrucosispora e atua inibindo a sntese do cido p-aminobenzoico.33 As marinomicinas A-D (46-49), macroldeos incomuns formados por lactonas dimricas do cido hidroxibenzoico conjugadas com cadeias policetdicas, foram isoladas da actinobactria marinha Marinispora e apresentaram atividade antibitica frente a Staphylococcus aureus resitente meticilina e Enterococcus faecium resistente vancomicina.34 Bactrias de solo ainda continuam sendo promissoras na busca de antibiticos. A platensimicina (52), isolada de Streptomyces platensi, apresentou atividade antibacteriana de amplo espectro contra Gram positivo e encontra-se em fase de estudos pr-clnicos.35,36 Outro grupo de micro-organismos que tem sido explorado so as bactrias gliding, caracterizadas como um grupo diverso de microorganismos que possuem alta capacidade de adaptao a diferentes condies ambientais, como florestas tropicais, costa marinha, guas sujas, areias de desertos e nos tratos gastrointestinais de seres humanos e animais. Essas bactrias tm sido consideradas importantes na ecologia microbiana e compostos antibacterianos isolados destas bactrias apresentaram diferentes mecanismos de ao antibitica, como inibio da sntese proteica, inibio de RNA polimerase e interferncia na sntese da parede celular.37 Micro-organismos endofticos, organismos no patognicos que vivem no interior de vegetais, tm sido considerados outra fonte promissora na busca de substncias bioativas. 31,38 Recentemente, novas substncias antimicrobianas tm sido isoladas de fungos endofticos.7,39 Os peptdeos munumbicinas A-D, isolados de Streptomyces associado Kennedia nigriscans, apresentaram atividade frente a diferentes bactrias resistentes meticilina.40 Guanacastepenos A e I (50, 51) foram isolados do fungo endoftico CR115. O guanacastepeno A (50) apresentou atividade frente a cepas resistentes de Staphylococcus aureus e Enterococcus faecalis e o guanacastepeno I (51) apresentou atividade antimicrobiana frente a S. aureus.41 As plantas tambm podem contribuir na descoberta de novos antibiticos, pois possvel que produtos naturais antimicrobianos possam ser biossintetizados para prevenir e/ou combater o ataque de micro-organismos patognicos s plantas. Gibbons42 cita vrios exemplos de metablitos isolados de plantas frente a Staphylococcus sp. Produtos naturais vegetais tambm tm sido apontados como inibidores de bombas de efluxo, conhecidas como bombas de resistncia a mltiplos frmacos, um novo alvo na busca de antibiticos.42 Fontes naturais pouco exploradas com interaes ecolgicas que podem resultar na descoberta de compostos quimicamente diversos e biologicamente ativos tm sido consideradas promissoras na busca de novos antibiticos como, por exemplo, estudos de bactrias simbiontes com insetos.43 Estudos qumicos das bactrias endosimbiontes LU 2184 e LU 7314 isoladas de tecidos da pulga Ceratophyllus sp. e do intestino da larva da liblula Ceoenagrion sp., respectivamente, permitiram o isolamento de dois compostos antibacterianos: bacitracina (LU 2184) e amicoumacina B (LU 7314).43 Peptdeos antimicrobianos foram isolados do contedo estomacal de pingins rei (Aptenodytes patagonicus)44 e da hemolinfa de formigas bfalo oriundas da Austrlia (Myrmecia gulosa).45 Plectasina, um peptdeo com 40 resduos de amoninocidos foi isolado de um ascomiceto saproftico, Pseudoplectania nigrella, e possui atividade frente a bactrias Gram positivo.46 Trs tetrapeptdeos constitudos de aminocidos incomuns foram isolados de Streptomyces sp.47 A partir do fungo Phoma sp. foram obtidas trs substncias antibiticas: cidos fomalnicos A-C (53-55).48

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Antibiticos: importncia teraputica e perspectivas

HO OH

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O O O

O HO O O OH OH OH OH OH OH O O OH OH HO 46 Marinomicina A R HO

O O OH

OH

OH

HO O O HO HO

HO HO O OH O OH H OH C H

45 Abissomicina C O H O O O OH

OH

HO O OH O OH

OH O O O OH HO2C OH

OH N H

OH O O H O C

OH

47 R = H Marinomicina B 48 R = CH3 Marinomicina D H

HO

OH 49 Marinomicina C

52 Platensimicina 50 Guanacastepeno A 51 Guanacastepeno I 53 cido fomalnico A HO O

H OH 54 cido fomalnico B O C

H O

55 cido fomalnico C NH O HN NH 56 Turbomicina A N H N H COOH O OH OH O COOH O 60 Medermicina O OH OH O O O H N(CH3)2 HO OH O O H H H OH OH O O HO O OH O O COOH OH O H O O N(CH3)2 OH O O H

OH

OH

57 Turbomicina B

59 Actinorodina

61 Diidrogranaticina

H2N

H N O 58 Palmitoilputrescina NH2 OH OH HO OH OH OH OH OH OH OH OH O O O OH CH3 OH OH O O 64 ECO-02310 OH H NH H H

62 Mederorrodina

OH

OH

O O

OH OH O

COOH

63 Diidrogranatirodina

Figura 6. Substncias com atividade antimicrobiana obtidas a partir de micro-organismos pouco explorados e atravs da utilizao de ferramentas genmicas

A contribuio da genmica na descoberta de antibiticos naturais Vrias abordagens relacionando a qumica dos produtos naturais e tcnicas de biologia molecular tm sido desenvolvidas visando a obteno de molculas naturais, que possam ser usadas como prottipos para o desenvolvimento de novos antibiticos.49 Os micro-organismos cultivveis so reconhecidos como uma excelente fonte para a descoberta de novas molculas bioativas, sendo responsveis por cerca de 10% de todos os produtos naturais bioativos conhecidos.50 Porm, apenas cerca de 1% dos micro-organismos existentes so cultivveis atravs de tcnicas microbiolgicas normalmente usadas em laboratrios.50 Atualmente, abordagens como a metagenmica, a biossntese combinatria e a explorao genmica tm possibilitado o cultivo de um grande nmero de micro-organismos no cultivveis, a diversificao de colees de compostos atravs da obteno de produtos naturais no-naturais e o acesso a clusters de genes biossintticos silenciosos, respectivamente, gerando uma promissora expectativa quanto descoberta de novos compostos bioativos.49 Os genomas de toda a microbiota encontrada na natureza so denominados em conjunto de metagenoma.51 Tcnicas de isolamento do metagenoma do solo permitem que o DNA de toda comunidade microbiana seja diretamente extrado do ambiente, eDNA (do ingls environmental DNA). Atravs da expresso heterloga do eDNA em hospedeiros facilmente cultivveis, como Escherichia coli, os respectivos produtos naturais codificados pelo metagenoma de micro-organismos no cultivveis podem ser produzidos, isolados, identificados e avaliados biologicamente.51 Como a produo de antibiticos geralmente est relacionada a vias complexas de biossntese inseridas em extensas regies do DNA, a clonagem dessas vias uma atividade bastante complexa.29 O emprego desse tipo de tcnica pode gerar uma boa expectativa na descoberta de novos antibiticos, porm uma das limitaes desse mtodo que o hospedeiro pode no expressar o fragmento de DNA incorporado.29 A descoberta das turbomicinas A-B (56, 57)52 e da palmitoilputrescina (58)53 utilizando tcnicas metagenmicas ilustra o potencial desta abordagem na busca de novos antibiticos. Mais recentemente, a abordagem

metagenmica foi aplicada na busca de genes especficos relacionados a enzimas envolvidas em acoplamento oxidativo na biossntese de antibiticos glicopeptticos, resultando no isolamento de dois novos clusters de genes.54 Aps estudos de reconstituio in vitro e expresso heterloga destes clusters de genes, sete novos anlogos aglicnicos sulfatados da teicoplanina foram isolados e identificados, com atividade antibitica semelhante vancomicina e teicoplanina frente a Staphylococcus aureus.54 A biossntese combinatria envolve a engenharia gentica das vias biossintticas naturais para a produo de novos compostos usando a maquinaria biossinttica existente em cada organismo, especialmente para obteno de antibiticos derivados policetdeos e peptdeos no ribossomais.55 Esta possibilidade foi primeiramente demonstrada por Hopwood et al.,56 que clonou os genes biossintticos do antibitico actinorodina (59) de Streptomyces coelicolor nos micro-organismos produtores de medermicina (60) e di-hidrogranaticina (61), respectivamente. O actinomiceto Streptomyces sp. AM-7161 modificado geneticamente produziu, alm de medermicina (60), grandes quantidades de uma nova substncia mederorrodina (62), a qual contm um grupo hidroxila adicional caracterstico da actinorodina. Streptomyces violaceoruber T 22, modificado para produzir di-hidrogranaticina (61), produziu uma nova substncia, di-hidrogranatirodina (63), preservando as configuraes dos precursores nos estereocentros da nova molcula. Este trabalho representa a primeira utilizao do conceito de biossntese combinatorial de produtos naturais e abriu uma nova perspectiva para a diversificao estrutural de produtos naturais de interesse.51 Um exemplo mais recente de sucesso para a biossntese combinatorial foi a manipulao gentica das vias biossintticas de Streptomyces roseosporus, produtor da daptomicina (20), que originou uma plataforma robusta com mais de 60 novos antibiticos lipopetdicos, os quais seriam dificilmente obtidos por sntese qumica.57 A engenharia metablica, caracterizada pela combinao de delees de genes e expresses de genes externos atravs de vetores de expresso replicativos, tambm tem sido usada com sucesso para gerar variaes estruturais de antibiticos aminocumarnicos.58 Outro aspecto da genmica que tem sido adotado para a busca de substncias antibiticas a identificao de clusters de genes associados com a biossntese de antibiticos, denominada de ex-

676
OH OH OH O HO O O NH O N O O N H N O H 2N OH HN OH HN O O N H HO OH HO O H2N NH 67 ECO-0501 (pr-clnica) Amycolatopsis orientallis75 N H N O H2N O H N O HO OCH3 HO OH HO O HN HN O NH HO O O 71 AC98-6446 (Pr-clnica) Manopeptimicina de Streptomyces hygroscopicus79 NH HN HN H O N OH HN H HN HO OH O OH NH NH OH O OH O O O O O OH H2N 69 Muraimicina (pr-clnica) Streptomyces sp.77 N H O CO2H O OH OH N NH2 O O O N N O OH CO2H O NH O O O H N

Guimares et al.
OH OH O HN HN O HN O HN O 66 GE23077 (pr-clnica) Actinomadura sp.74 O NH2 O O N F HO HO O OH O O OH OH OH OH 68 Ramoplanina (Fase II) Actinoplanes sp.76 N O S OH S N S N H N O O 72 GE81112 (pr-clnica) Streptomyces sp.80 O N H OH H N O HO O O OH H N N O S NH Cl HO NH N S HN O O O HO O O N S O NH O N O O O O HO O O O OH O OH N HO N N O H N O NH2 O H O HN O H N O N H O OH OH H N O N H OH H2N OH H N O O O N H O H N O O N H O O O N H NH OH Cl O O NH N H O O

Quim. Nova

H N

H N O

H N

NH2

HO 65 Arilomicina (pr-clnica) Streptomyces sp.73

H2N OH OH H N O O N H O

H N O

HO

O O

NH

H N O

HO2C

H N O HN

H N HN N H

O N H

N NH OH O

O OH

HO 70 LBM415 (Fase I) Actinonina de Streptomyces sp.78 HN

HO 74 Retapamulina (Fase III) Pleuromutilina de Pleurotus mutiliz82 OH

OH O OH H NH

O H H3CO O O O OH

OH Cl OH Cl

73 Nocatiacins (pr-clnica) Nocatiacina I de Nocardia sp.81

HO N OH NH2 OH O OH OH O O O HO O HO H H HO HO O O Cl O O HO O NH2 H NH O O O N H O NH2 OH OH 82 Oritavancina Targanta Therapeutics28 OH H N O H N H O Cl N H H2N N H N P O N O Me2N OH OH OH O N O O N H O OMe O H O H N HO H N H HO O H HN O N H COOH O HO O O O O HO H

75 Tacumicina B (Fase II) Dactylosporangium aurantiacum83

NH2 O N H O N H H N O H N NH O O

O H H H N O O O O H N

OH

N N O N H H H N

OH NH O O

H N

O O O N H O NH2

Cl

77 Tigeciclina Tygacil - Wyeth Pharmaceuticals84 OH O O NMe2 O HO O N

HN H N O NH2 N H

Cl H H N H O

OH H N O H N H

H N

76 Friulimicina B N OH H N N H2N O O O 80 Ceftobiprol Johnson & Johnson12 OH N S

N H H

O H N

78 Telitromicina Sanofi-Aventis12

HO

OH

N O

NH

O O O O

79 Telavancina TD-6424 - Theravance28

OH NH2

81 Cetromicina Advanced Life Sciences12

O HH HN N H O O H H N H O

OH

MeO OMe

HO

83 Iclaprim Arpida12

Figura 7. Antibiticos recentes introduzidos no mercado farmacutico e em estudos clnicos

plorao genmica (genome mining), que possibilita a identificao de genes que no so expressos em condies usuais de cultivo.59,60 Esta abordagem associa a informao gentica primria funo das respectivas enzimas biossintticas, possibilitando a identificao de novos produtos naturais. O isolamento e identificao do composto coeloquelina a partir de Streptomyces coelicolor demonstra uma efetiva contribuio desta tcnica para a descoberta de agentes antimicrobianos.61 O potente agente antifngico ECO-02301 (64) tambm foi identificado atravs da explorao genmica em Streptomyces aizunensis.59 Novos mecanismos de ao antibitica Entre os 10 antibiticos aprovados desde 1998, somente a oxazolidinona linezolida (27) e o lipodepsipeptdeo daptomicina (20) apresentaram novos mecanismos de ao.62 H poucos relatos de compostos antimicrobianos que desempenham diferentes mecanismos

de ao como nova estratgia para o combate a doenas infecciosas. O composto friulimicina B (76) um dos poucos exemplos. Esta substncia encontra-se em Fase I de estudos pr-clnicos, iniciada na Sua em junho de 2007. Apesar da friulimicina B apresentar similaridade qumica com a daptomicina, ela o primeiro membro da nova classe de antibiticos lipopeptdicos bactericidas que parece interferir na inibio da formao do lipdeo I, um precursor na sntese de peptideoglicanos da parede celular.28 Apesar dos nucleosdeos simples possurem mecanismos de ao j descritos, agindo especialmente como inibidores da sntese de cidos nucleicos, os derivados acil- e glicosil-nucleosdicos possuem mecanismos de ao mais diferenciados e complexos. Por exemplo, a puromicina e nucleocidina podem agir como inibidores da sntese de cidos nucleicos ou protenas ou sntese de glicanos, enquanto as nicomicinas inibem a sntese de quitina da parede celular fngica.63 Frmacos com novos mecanismos de ao devero apresentar vantagens no combate a micro-organismos resistentes e emergncia

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Antibiticos: importncia teraputica e perspectivas

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de novos patgenos. Butler e Buss64 ilustram alguns compostos com potencial para novas classes de antibiticos, destacando-se arilomicina, manopeptimicina, muraimicina, caprazamicina e nocatiacina, alm de outros compostos em fase de estudos clnicos.64 Novas estratgias tm sido desenvolvidas na tentativa de otimizar processos de elucidao de mecanismos de ao de candidatos a frmacos antibiticos, como ensaios baseados em microarray e biomarcadores . Essa tcnica consiste em trs etapas fundamentais: construo de uma base de dados com as respostas transcricionais de uma bactria frente a diferentes compostos antibiticos; padronizao das concentraes e tempo de exposio dos antibiticos no ensaio com mecanismos de ao ainda desconhecidos e a determinao de genes transcritos envolvidos em novos mecanismos de ao. A anlise dos dados realizada comparando-se respostas de diferentes antibiticos com mecanismos de ao conhecidos com compostos de mecanismos de ao desconhecidos. Os resultados so obtidos atravs das respostas antibiticas baseadas em dados microarray dos mecanismos de ao de antibiticos conhecidos em funo das respostas transcricionais de uma bactria (deve ter sequenciamento gentico previamente caracterizado) por biomarcadores frente ao composto do qual se deseja determinar o mecanismo de ao.65 Novos ensaios antibacterianos Os ensaios celulares caracterizam-se pela deteco dos efeitos que um composto apresenta frente ao crescimento celular. Esta triagem baseada na anlise do fentipo pode ser informativa acerca de interaes entre os compostos e o sistema celular submetido no ensaio, porm no possvel obter nenhuma informao acerca do mecanismo de ao pelo qual as substncias atuam, j que a resposta fenotpica observada pode estar relacionada a uma grande variedade de alvos responsveis pelos efeitos biolgicos observados.66 Alm disso, uma desvantagem desta abordagem que a presena de compostos citotxicos em extratos brutos pode mascarar o potencial de outros compostos.67 Atualmente, ensaios high-throughput screening (HTS) tm sido amplamente empregados para a descoberta e desenvolvimento de novos frmacos. Esses ensaios so realizados por equipamentos automatizados, comumente conhecidos como robotizados, que permitem triagens in vitro e in vivo de grandes colees de compostos. Os ensaios HTS permitem uma rpida anlise na identificao de compostos bioativos com aplicaes qumicas e biolgicas.68 Alguns alvos possuem alta probabilidade de sucesso na busca de compostos antibacterianos: transglicosilase, que tem importante funo na formao de substratos lipoglicopeptdicos para formao da parede celular tem sido alvo para ensaios HTS; a sntese proteica bacteriana tem sido explorada a nvel ribossomal utilizando tcnicas de cristalografia de raios-X a fim de se verificar em qual regio do RNA ribossomal o antibitico se liga; em bactrias Gram positivo a busca de inibidores de enzimas sortases, relacionadas formao da parede de peptideoglicano, podem ser alvos para agentes bactericidas e/ou bacteriostticos; enzimas que participam da via de biossntese do isopreno, descritas no metabolismo de vrias bactrias patognicas, tm sido consideradas alvos interessantes, pois so enzimas diferentes das encontradas em seres humanos.30 Alvos envolvendo mltiplas enzimas so priorizados devido a uma maior probabilidade de se encontrar molculas capazes de se ligarem a uma ou mais unidades, alm de serem alvos mais difceis de favorecerem a resistncia.27 Alvos envolvendo a virulncia, que pode ser promovida por intermdio de molculas sinalizadoras em processos quorum sensing, tambm tm sido explorados a fim de se detectar fatores responsveis pela patogenicidade. Nas bactrias, as clulas monitoram sua densidade populacional por meio de sinais qumicos, os quais tm sua produo favorecida em funo do

crescimento celular bacteriano. Aps um limiar de concentrao de densidade populacional as molculas quorum sensing podem induzir diferentes comportamentos para a comunidade bacteriana como bioluminescncia, produo de antibiticos, formao de biofilme, virulncia, esporulao e capacidade de adaptao.67,69 Recentemente, informaes sobre estrutura molecular de alta resoluo de ribossomos tm contribudo para o desenvolvimento de novos antibiticos que atuam a nvel ribossomal, pois permitem observar quais caractersticas conectivas a nvel atmico dos ribossomos e seus ligantes so importantes.70 Em muitas bactrias, a expresso de um determinado nmero de genes crucial para o metabolismo regulada por estruturas do mRNA conhecidas como riboswitches. Em algumas bactrias patognicas, essas regies regulam a expresso gentica essencial para a sobrevivncia ou virulncia do micro-organismo. Portanto, pode-se predizer que metablitos que interajam nas regies riboswitches podem causar efeitos letais para as bactrias, j que o composto mimtico no pode desempenhar funes semelhantes ao ligante natural. Pesquisas tm sido conduzidas utilizando essas regies como alvos para compostos antibacterianos.71 Porm, tanto os ensaios bioqumicos quanto os ensaios celulares apresentam desvantagens por desconsiderarem a presena do hospedeiro infectado. importante considerar que i) algumas doenas afetam um organismo como um todo, e a maioria dos organismos no pode ser reconstituda in vitro; ii) clulas e organismos esto fisiologicamente correlacionados e esta interface pode ser crtica para o desenvolvimento de algumas doenas, o que no pode ser reconstitudo in vitro; iii) o progresso de uma doena tambm no pode ser construdo in vitro. Com isso, vrios hits promissores apresentam falhas quando submetidos a ensaios de toxicidade e eficcia in vivo. Isso ocorre porque tanto os patgenos quanto as substncias submetidas a esses tipos de ensaios se comportam diferentemente quando observadas in vitro e no hospedeiro. Uma alternativa a utilizao de mamferos, como ratos e cobaias, infectados com micro-organismos patognicos. Porm, esses ensaios tm um alto custo e aspectos ticos envolvidos.72 Organismos invertebrados com gentica bem caracterizada, como Drosophylla, Caenorhabditis elegans e Arabidopsis thaliana tm sido utilizados como hospedeiros de micro-organismos patognicos caracterizando novos modelos biolgicos na busca de agentes antimicrobianos.72 Caenorhabditis elegans e Danio rerio (zebrafish) tm sido utilizados em ensaios antibacterianos, contribuindo para um ensaio in vivo mais informativo, onde podem ser descobertos compostos com atividade in vivo, incluindo pr-frmacos; compostos que atuam sobre a virulncia do micro-organismo utilizado no ensaio ou compostos que aumentam a resposta imune do hospedeiro. Alm disso, podem ser detectados possveis efeitos txicos dos compostos, o ensaio pode ser realizado em HTS e a infeco pode ser monitorada em tempo real.72 Vale mencionar que muitos prottipos no so adequados ao futuro desenvolvimento de frmacos devido a problemas relacionados farmacocintica. Com estas caractersticas, ensaios baseados em modelos de infeco in vivo podem levar identificao de novas substncias ativas com maior quantidade de informaes agregadas, o que pode agilizar o processo de desenvolvimento de eventuais antibiticos a partir dos prottipos descobertos.72 CONCLUSES As novas estratgias da pesquisa em produtos naturais microbianos, envolvendo a busca de substncias em micro-organismos pouco explorados e a utilizao de ferramentas genmicas para o acesso a novos produtos naturais, aliadas aos novos ensaios biolgi-

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Guimares et al.

Quim. Nova

cos adotados nas triagens, podem acelerar o processo de descoberta de novos antibiticos, extremamente importantes num cenrio de rpido desenvolvimento de resistncia pelas bactrias aos agentes teraputicos disponveis. A ampla biodiversidade existente no mundo combinada s diversas tcnicas citadas neste trabalho indica que novos compostos antibiticos podem ser descobertos atravs da pesquisa com microorganismos ou outras fontes naturais. AGRADECIMENTOS Ao apoio financeiro da FAPESP (Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo), CAPES (Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior) e CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico) pelo apoio financeiro s pesquisas na forma de auxlios e bolsas de pesquisa. REFERNCIAS
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