Instituto Nacional de Câncer - Ministério da Saúde

Coordenação de Pesquisa
Divisão de Medicina Experimental

PERFIL DE EXPRESSÃO DE ISOFORMAS DA OSTEOPONTINA EM

TUMORES DE OVÁRIO E SUA CORRELAÇÃO COM DADOS CLÍNICO-
PATOLÓGICOS

Vanessa Ferreira Franco

Orientadora: Etel Rodrigues Pereira Gimba

Dissertação do Programa de
Pós-graduação Stricto-sensu
em Oncologia do INCa

Rio de Janeiro – RJ
2009
F825p Franco, Vanessa Ferreira

Perfil de expressão de isoformas da osteopontina em tumores de

ovário e sua correlação com dados clínico-patológicos / Vanessa
Ferreira Franco. - Rio de Janeiro: INCA, 2009.

71.

Dissertação (Mestrado) - Instituto Nacional de Câncer.

Programa de Pós-graduação Stricto Sensu em Oncologia do Instituto
Nacional de Câncer (INCA-RJ), 2009. Orientador: Etel Rodrigues
Pereira Gimba.
1. Neoplasias Ovarianas. 2. Osteopontina. 3. Isoformas de
proteínas. 4. Perfilação da Expressão Gênica. I. Gimba, Etel
Rodrigues Pereira. II. Título.
CDD 616.99465027
 Agradecimentos

A Dra. Etel Gimba, minha orientadora, pelos ensinamentos, paciência e

tempo dispendidos.

A todo o grupo atual e aqueles que já se despediram, por terem me

ensinado todos os ensaios da bancada. Agradeço por terem me acolhido com
tanto carinho. Obrigada à Tatiana Martins Tilli, Lívia Matos, Luciana Bueno
Ferreira, Douglas Faget, Aline da Rocha Matos, Fabrício Ribeiro de Azevedo
da Silva, Fernanda Lourenço Jorge e Bianca Faria Pereira Dias. Aos colegas
dos outros grupos da Medicina Experimental, pelos auxílios constantes,
especialmente à Kátia Kandian e Juliane Menezes.

À doutoranda Cíntia Oliveira e Vera Motta Buy da Farmacologia, à

enfermeira Roberta Lima e ao auxiliar administrativo Fabrício da Silva Oliveira
do Serviço de Pesquisa Clínica, por terem tornado possível a inclusão das
pacientes nesse estudo.

Ao Laboratório de Patologia Clínica do HCII na pessoa da bióloga Vera

Lúcia da Cunha Alves, e a todos os auxiliares de enfermagem desse setor que
com tamanho profissionalismo e disponibilidade nos auxiliaram nesse projeto.

A todos os colegas do Serviço de Anatomia Patológica especialmente ao

Dr. Fábio Carvalho Moreira e a todos os colegas da Ginecologia Oncológica do
HCII por viabilizarem a coleta dos materiais.

À Direção do HCII na pessoa do Dr. Reinaldo Rondinelli e Dr. Celso

Rotstein e a chefia do Serviço de Ginecologia, Dr. Luiz Figueiredo Mathias e
Dr. Olímpio Ferreira Neto por tornarem esse sonho possível.

A Epidemiologista Dra. Ilce Ferreira da Silva, as gerentes de dados

Isabele Avila Small e Daniela Maria de Paula Ramalho e ao Professor Eduardo
Campos pelos auxílios com a análise dos dados.
Dedicatória

Aos meus pais, Divina e Alceu por

ensinarem o que de mais singelo um berço
pode ter, honestidade e retidão. Ao meu
marido Octávio Werther pela alegria
contagiante, entusiasmo e pelo lindo coração.
Índice

Resumo ..............................................................................................................I

Abstract .............................................................................................................II

Lista de abreviaturas ………………………………………………………...........III

Lista de tabelas ……………………………………………………………….........IV

Lista de figuras ….…………………………………………………………….........V

1. Introdução…………………………………………………………………….........1
1.1. Epidemiologia do câncer de ovário ...................................................1

2. Tumores do ovário e origem celular desses tumores...............................2

2.1. Patologia............................................................................................4
2.2. Graduação do carcinoma do ovário...................................................9
2.3. Estadiamento...................................................................................10
2.4. Diagnóstico.......................................................................................11

3. Genes expressos diferencialmente no tumor de ovário .........................13

4. Osteopontina................................................................................................14
4.1. O Gene.............................................................................................14
4.2. O RNA..............................................................................................15
4.3. A proteína.........................................................................................16
4.4. Papel funcional da OPN...................................................................17
4.5. Expressão da OPN nos diversos tumores ......................................19
4.6. OPN e expressão de isoformas variantes em tumores................... 21
4.6.1. Isoformas de “splicing” alternativo como biomarcadores
tumorais........................................................................................21
4.6.2. OPN e suas isoformas de “splicing”...................................22
5. Objetivos......................................................................................................25
5.1. Objetivo Principal.............................................................................25
5.2. Objetivos Específicos.......................................................................25

6. Material e métodos......................................................................................25
6.1. Critérios de inclusão.........................................................................25
6.2. Critérios de exclusão........................................................................25
6.3. Descrição das amostras...................................................................26
6.4. Dados clinico-patológicos.................................................................26
6.5. Coleta do tecido...............................................................................27
6.6. Extração do RNA total......................................................................27
6.7. Síntese de cDNA..............................................................................27
6.8. RT-PCR............................................................................................28
6.9. PCR em tempo real..........................................................................28
6.10. Cálculo do nível de expressão das OPNs......................................30
6.11. Análises estatísticas.......................................................................30

7. Resultados....................................................................................................31
7.1. Caracterização dos parâmetros clínicos e patológicos dos grupos de
pacientes analisados...............................................................................31
7.2. Caracterização do perfil de expressão das isoformas de
OPN........................................................................................................33
7.3. Freqüência de expressão das diversas isoformas da OPN nos
diversos tecidos ovarianos......................................................................35
7.4. Análise do nível de expressão de múltiplas isoformas da
osteopontina em diferentes tecidos ovarianos........................................36
7.5. Relação entre a expressão das diferentes isoformas de OPN em
uma mesma amostra tecidual.................................................................38
7.6. Correlação do nível de expressão das isoformas de OPN com
diferentes parâmetros clínico-patológicos de pacientes com tumores
ovarianos.................................................................................................39
7.7. Relação entre o nível de expressão das OPNs e os valores do CA-
125 e achados cirúrgicos........................................................................42
8. Discussão.....................................................................................................46

9. Referências Bibliográficas..........................................................................53

10. Anexo
Tabela 1: Relação entre o nível de expressão relativo médio das OPNs
e os diversos dados clínicos- patológicos...............................................69

11. Apêndices
Apêndice 1: artigo submetido para publicação em novembro 2009
................................................................................................................70

Apêndice 2: termo de consentimento livre e esclarecido......................71

 I

Resumo
O carcinoma do ovário é um tumor agressivo e diagnosticado no
estadiamento avançado da doença. O desenvolvimento de novos marcadores
moleculares que auxiliem no diagnóstico desta neoplasia é de grande
importância. A osteopontina (OPN) é uma proteína superexpressa em diversos
tumores, com presentes evidências de que a expressão de suas isoformas de
“splicing” parecem ser câncer e tecido específicas. O objetivo desse estudo é
caracterizar o perfil de expressão das diferentes isoformas da osteopontina no
tecido ovariano tumoral do tipo carcinoma, “borderline” e benigno e no tecido
ovariano normal, assim como correlacionar o perfil de expressão dessas
isoformas com os dados clínico-patológicos. A expressão destas isoformas foi
realizada através de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) utilizando RNA
total destas diferentes amostras teciduais e oligonucleotídeos iniciadores
específicos para cada uma das isoformas (OPNa, OPNb e OPNc). No presente
estudo, as isoformas OPNa e OPNb mostraram-se expressas nos quatro grupos
teciduais analisados. Por outro lado, a OPNc apresentou expressão
exclusivamente em amostras de carcinoma do ovário e nos tumores “borderline”
do ovário. O nível de expressão da OPNa e OPNc não foi significativamente
diferente entre os grupos de amostras analisados. Entretanto, o nível de
expressão da OPNb foi maior no carcinoma do ovário do que no tumor
“borderline” do ovário. Especificamente no tecido ovariano normal, o nível de
expressão da OPNa foi maior do que o da OPNc. Não observamos correlação
entre o nível de expressão das diversas isoformas da osteopontina e os
parâmetros clínicos e patológicos analisados. Concluímos que o tecido ovariano,
seja ele tumoral ou não, apresenta “splicing” alternativo da OPN. Dentre estas
isoformas, as isoformas OPNa e OPNb apresentam expressão em todas as
amostras de tecido ovariano. Por outro lado, a OPNc é aquela que apresenta
expressão tumor específica. Assim sendo, o presente estudo, em associação
com a avaliação do papel funcional de cada um destas isoformas em modelos in
vitro e in vivo, abre possibilidade de uma melhor compreensão do papel de cada
uma destas isoformas na tumorigênese e progressão do carcinoma de ovário.
 II

Abstract

The ovarian carcinoma is an aggressive tumor and is diagnosed at an

advanced stage of disease. The recognition of a molecular marker to help in its
diagnosis is very important. The osteopontin (OPN) is a protein involved with
several tumors, and some alternatively spliced isoforms seems to be tissue and
cancer specific. The aim of this study is to characterize the expression profile of
osteopontin splice variants (OPNa, OPNb and OPNc) in tumor and in normal
ovarian tissues samples and to correlate this pattern to different clinical
pathologic data. In this study we analysed tissue samples from ovarian invasive ,
borderline and benign tumors and those normal ovaries tissues. The OPN
isoforms expression was analyzed by real-time RT-PCR using total RNA from
these ovarian tissues and splice variant-specific primers . OPNa and OPNb
isoforms were detected in all ovarian tissues analysed. In contrast, OPNc was
detected only in ovarian carcinoma samples and in borderline tumors. The
expression level of OPNa and OPNc were not significantly among the groups of
ovarian tissues analyzed in this study. However, the levels of expression of
OPNb were higher in ovarian carcinoma group as compared to ovarian
borderline tumor. Specifically in normal ovarian tissues, OPNa expression levels
were higher as compared to OPNc. There were no correlation between the
expression levels of several osteopontin isoforms and different clinical pathologic
analysed data. In conclusion, we observed herein that tumoral and non tumoral
ovarian tissues analysed present OPN alternative splicing isoforms. Among
these isoforms, the OPNa and OPNb isoforms were expressed in all samples of
ovarian tissues. Notably, OPNc presents tumor specific expression. In conjuction,
these OPN splicing isoform expression profiling, in association to in vitro and in
vivo functional studies, open the possibility for a better understanding of the roles
of these isoforms in ovarian tumorigenesis and progression.
 III

Lista de abreviaturas
APST tumor seroso proliferativo atípico
CA-125 antígeno do câncer 125
CCBT Tumor “borderline” de células claras
CCC carcinoma de células claras
CCT carcinoma de células transicionais
cDNA ácido desoxirribonucléico complementar
CE carcinoma endometrióide
CEO carcinoma epitelial do ovário
CI-BG carcinoma intraepitelial de baixo grau
CM carcinoma mucinoso
CO Câncer de Ovário
CS-BG carcinoma seroso de baixo grau
CS-AG carcinoma seroso de alto grau
EBT tumor endometrióide “borderline”
FIGO Federação Internacional de Ginecologia e Obstetricia
HNF-1β Fator Nuclear do Hepatócito
LOH perda da heterozigosidade
MBT tumor mucinoso “borderline”
MEC matrix extra-celular
MMPs metaloproteinases da matrix
NERM nível de expressão relativo médio
PMP pseudomixoma peritonei
SBT tumor seroso “borderline”
SIM Sistema de Informação Sobre Mortalidade
TGF fator de crescimento transformador
TIMPs inibidores teciduais de metaloproteinases
TMO tumor epitelial misto do ovário
uPA ativador de plasminogêneo tipo urokinase
USTV ultrassonografia transvaginal
WT1 tumor Wilms 1
 IV

Lista de tabelas

Tabela 1: Dados epidemiológicos sobre a incidência e mortalidade do CO.........2

Tabela 2: Alterações genéticas e lesões precursoras dos tumores do ovário do

tipo I e tipo II..........................................................................................................7

Tabela 3: Resumo dos aspectos clínico-patológico dos tumores tipo I e II:

carcinoma seroso de baixo e alto grau, respectivamente.....................................8

Tabela 4: Estadiamento do CO segundo a FIGO...............................................10

Tabela 5: Grupos das pacientes estudadas segundo o tipo do tecido ovariano

analisado.............................................................................................................26

Tabela 6: Seqüência dos oligonucleotídeos senso e antisense para cada

gene.....................................................................................................................29

Tabela 7: Resumo das características clinco-patológicas das pacientes incluídas

no estudo (número absoluto e percentagens dentro de cada grupo)..................32

Tabela 8: Freqüência de expressão das diversas isoformas nos diversos tecidos

.............................................................................................................................35

Tabela 9: Nível médio de expressão relativo médio das diversas isoformas da

osteopontina nos tecidos estudados....................................................................37
 V

Lista de figuras

Figura 1: As hipóteses Celômica e Mülleriana para a origem dos carcinomas

epiteliais do ovário, tuba e primário do peritôneo..................................................3

Figura 2: Representação esquemática da progressão tumoral do carcinoma

seroso de baixo grau.............................................................................................5

Figura 3: Família SIBLINGs de proteínas...........................................................15

Figura 4: Diferentes isoformas da osteopontina resultantes de splicing

alternativo............................................................................................................15

Figura 5: As proteínas da família SIBLINGs medeiam a interação matrix-célula e

a sinalização celular.............................................................................................18

Figura 6: Curva de desnaturação dos produtos de amplificação das isoformas

de OPN com oligoncucleotídeos isoforma específicos a partir de amostras
teciduais de CO...................................................................................................34

Figura 7: Analise do perfil eletroforético de migração de produtos de

amplificação por qRT-PCR das 3 isoformas de OPN em gel de agarose 2%.....34

Figura 8: Freqüência de expressão das isoformas da osteopontina nos diversos

tecidos do ovário..................................................................................................36

Figura 9: Nível de expressão relativo das isoformas da osteopontina nos

diversos tecidos do ovário...................................................................................37

Figura 10: Relação entre o nível de expressão relativo das isoformas de OPNa,
OPNb e OPNc em uma mesma amostra de diferentes tipos teciduais de
ovário...................................................................................................................39
 VI

Figura 11: Relação entre o nível de expressão relativo das isoformas da OPNa,
OPNb e OPNc nos tecidos de CO e “borderline” e o estadiamento
tumoral.................................................................................................................40

Figura 12: Relação entre o nível de expressão relativo das isoformas de OPNa,
OPNb e OPNc entre tumores do Tipo I e Tipo II.................................................41

Figura 13: Relação entre o nível de expressão das isoformas da osteopontina e

o grau histológico nos CO....................................................................................42

Figura 14: Relação entre o nível de expressão das isoformas da osteopontina e

o nível sérico do CA-125 nos carcinomas e nos tumores “borderline”
agrupados............................................................................................................43

Figura 15: Relação entre o nível de expressão das 3 isoformas da OPN no CO e

a presença ou não de ascite ...............................................................................44

Figura 16: Relação entre o nível de expressão das 3 isoformas da OPN no CO e

o tamanho do maior tumor ovariano ressecado..................................................45
 1

1. Introdução

1.1. Epidemiologia do Câncer de Ovário

O Câncer de ovário (CO) é um tumor raro, todavia é a neoplasia malígna

ginecológica com maior letalidade, levando mais ao óbito que o câncer de
endométrio e colo uterino juntos (Ozols, 2005). Nos Estados Unidos da
América, em relação ao câncer de mama, o CO tem 1/10 de sua incidência,
mas é três vezes mais letal. (Jemal et al., 2008). Na Inglaterra e no País de
Gales, dentre os carcinomas ginecológicos, o CO é o mais comum (Cooper et
al., 2008).
No Brasil, no município de São Paulo, a incidência do CO assumiu a 8a
posição após o câncer de mama, de pele, do colo do útero, cólon, tireóide,
estômago e pulmão (Mirra et al., 2007). Os registros brasileiros acerca dos
índices de mortalidade são colhidos pelo Sistema de Informação Sobre
Mortalidade (SIM). A taxa de mortalidade foi estável nos anos de 1998 a 2000
(Retirado de MS, INCa 2001, 2002 e 2003) (Tabela 1).
O CO é raro na pré-menopausa, com menos de 10% dos casos abaixo
de 45 anos, sendo que 50 a 60% das pacientes têm mais que 60 anos
(Barnholtz-Sloan et al., 2003). Sua incidência aumenta lentamente com a idade
até os 75 a 79 anos antes de uma leve diminuição nas mulheres ≥ 80 anos
(Goodman et al., 2009). Os fatores de risco associados com o CO são
compartilhados com o câncer de mama e uterino, sendo que a menarca tardia,
a alta paridade, a menopausa precoce e o longo tempo de uso de
contraceptivos conferem um baixo risco para o CO, provavelmente por reduzir
o número de ciclos ovulatórios (Ristow et al., 2006).
 2

Tabela 1: Dados epidemiológicos sobre a incidência e mortalidade do CO.

País Incidência % Óbito % Ano Referência ou fonte
(número de casos) (número de casos)
EUA 3% (21.650) 6% (15.520) 2008 Jemal et al., 2008
Inglaterra e 5% (6000)* 6% (4.000) 1990-2000 Cooper et al., 2008
País de Gales
São Paulo, 3.2% (4.473)** 4.5% (1.712) 1997-2003 Mirra et al., 2007
Brasil
SIM, Brasil - 1.67% (1.947) 2000 Retirado de MS, INCa 2003
SIM: Sistema de Informação Sobre Mortalidade; *: taxas de incidência anual; **: taxas de incidência
no período.

2. Tumores do ovário e origem celular desses tumores

A classificação histológica para os tumores do ovário da Organização

Mundial de Saúde (OMS) é baseada na célula que dá origem a esse tumor. A
maioria dos tumores ovarianos são epiteliais (85-90%). Porém, tumores raros
como os tumores de células germinativas (3-5%) e os tumores de origem
mesênquimal (estroma e cordão sexual, 5-10%) também são encontrados
(Pascalicchio et al., 2000).
A exata origem dos tumores do ovário ainda não é conhecida, havendo
uma série de hipóteses que tentam explicá-la. A teoria da ovulação incessante
propõe que o processo de ovulação envolve microtraumas repetitivos no
epitélio ovariano, que poderia desencadear mutagênese e carcinogênese
(Fathalla, 1971).
Zajicak (1978) sugere que a invaginação do epitélio celômico no córtex
do ovário origina cistos, os quais são conhecidos como cistos de inclusão e
podem ser fonte de neoplasia. Cramer & Welch (1983), propuseram que a
estimulação do estroma ovariano com altas doses de gonadotrofinas sobre os
cistos de inclusão induz ao câncer.
Outra hipótese sugere que o epitélio celômico dos cistos de inclusão
sofreria uma diferenciação metaplásica para epitélio Mülleriano. Esses novos
cistos passariam a se chamar cistos metaplásicos, os quais são chamados
cistoadenomas serosos (se recobertos por uma camada de células que lembra
as da tuba de falópio), endometriomas (se recobertos por uma camada de
células que lembra as glândulas endometriais) ou cistadenomas mucinosos (se
 3

recobertos por uma camada de células que lembra as células da endocérvice)

(Dubeau, 1999).
Mais recentemente, Dubeau (2008) defendeu a hipótese que o tumor
epitelial do ovário é derivado dos ductos Müllerianos e do sistema Mülleriano
secundário (Figura 1). Estas são estruturas microscópicas recobertas por
epitélio Mülleriano, que devem ser remanescentes dos ovidutos (tuba de
falópio). Os componentes do Sistema Mülleriano secundário podem
desenvolver grandes cistos extra-ovarianos (cistoadenomas paraovariano e
paratubário), que são morfologicamente idênticos aos cistoadenomas do
ovário. Também dão origem a tumores malígnos, que são classificados como
carcinoma primário do peritôneo, caso não tenha disseminação para os
ovários. As características clínicas semelhantes do CO, do carcinoma da
trompa e primário do peritôneo, sugerem que se trata de uma entidade
nosológica única, onde aspectos da diferenciação Mülleriana estão presentes.

Figura 1: As hipóteses Celômica e Mülleriana para a origem dos carcinomas epiteliais do

ovário, tuba e primário do peritôneo (modificado de Dubeau, 2008). Na Hipótese Mülleriana, a
transformação maligna celular ocorre diretamente no epitélio Mülleriano. Na Hipótese
Celômica, é necessário que o epitélio celômico passe por um processo de metaplasia, que
então sofre transformação maligna.
 4

2.1. Patologia

Os tumores epiteliais do ovário são dos tipos histológicos serosos,

mucinosos, endometrióides, células claras, células transicionais (tumor de
Brenner) e células epiteliais mistas e são classificados em benignos,
“borderline” e invasores (Kaku et al, 2003). Todavia, o diagnóstico
histopatológio dos tumores do ovário é complexo, havendo divergências inter e
intraobservadores (Leitão et al., 2004).
Os tumores benignos são caracterizados por ausência de atipia
citológica significante e de proliferação epitelial. Os cistoadenomas serosos têm
aspecto de cisto uni ou multiloculado e são revestidos por um epitélio
semelhante ao da tuba. Quando os elementos epiteliais e/ou estromais
lembram a estrutura do endométrio, caracterizam os cistoadenomas
endometrióides. Os cistoadenomas mucinosos usualmente são preenchidos
por um fluido mucinoso. Quando esse tumor for predominantemente sólido e
fibroso é denominado de fibroadenoma (Seidman et al., 2004). Os tumores de
Brenner benignos são lesões sólidas e mais de 50% são menores do que dois
centímetros (Kaku et al, 2003).
Os tumores “borderline” foram descritos pela primeira vez por Taylor
em 1929, incorporados na FIGO em 1971 e pela OMS em 1973 (Serov et al.,
1973). Eles se caracterizam pela presença de proliferação epitelial, atipia
nuclear de moderada à intensa e figuras de mitose de forma esparsa. Este
aspecto histológico deve ocupar pelo menos 10% do tumor (Seidman et al,
2004). A microinvasão estromal pode ocorrer, sendo que Bell & Scully (1990)
propuseram que o limite máximo de invasão do estroma é de 3mm.
Posteriormente, foi proposto que a dimensão linear máxima seria de 5mm ou
uma área de extensão máxima de 10 mm2 (Scully 1999; Sehdev et al., 2003).
O tumor seroso do tipo “borderline” (SBT) do ovário tem dois
fenótipos diferentes, o tumor seroso proliferativo atípico (APST) que tem
comportamento benigno e o carcinoma seroso micropapilar não invasivo ou
carcinoma intraepitelial de baixo grau (CI-BG), o qual é caracterizado por
um padrão micropapilar (Seidman et al., 2004). O SBT apresenta implantes
peritoneais em aproximadamente 20-30% dos casos (Scully, 1999). Esses
implantes podem ser invasores ou não invasores, os quais podem ser do tipo
 5

epitelial ou desmoplásico. O envolvimento linfonodal ocorre em 21 a 25 % dos

casos e não parece haver impacto na sobrevida. O SBT com padrão
micropapilar está associado com estádios avançados (II e III) e implantes
invasivos (Bell et al., 2004). O APST pode progredir para o CI-BG, o qual é um
precursor imediato do carcinoma seroso de baixo grau (CS-BG) (Ho et al.,
2004) (Figura 2).

Figura 2: Representação esquemática da progressão tumoral do carcinoma seroso de

baixo grau. Mutações ocorrem em uma pequena proporção dos cistoadenomas, o que deve
contribuir para o desenvolvimento do SBT. Alguns tumores serosos “borderline” progridem
posteriormente para o carcinoma intra-epitelial de baixo grau e então para o carcinoma seroso
de baixo grau. APST: tumor seroso proliferativo atípico; SBT: tumor seroso “borderline”
(Modificado de Ho et al., 2004).

Os tumores mucinosos “borderline” (MBT) são classificados no tipo

gastrointestinal e no tipo endocervical, também conhecido como seromucinoso
ou mucinoso “borderline” Mülleriano. O tipo gastrointestinal é o mais freqüente
e caracteriza-se por um epitélio mucinoso do tipo gastrointestinal atípico. O tipo
seromucinoso é caracterizado por uma proliferação epitelial complexa,
revestido por células que contem mucina do tipo endocervical. Esse tumor é
mais freqüentemente bilateral e assim como o SBT pode demonstrar
arquitetura micropapilar, microinvasão e envolvimento linfonodal. O MBT tem
um comportamento benígno e a existência no estadiamento avançado é
questionável (Shappell et al., 2002; Ronnett et al., 2004).
Os Tumores “borderline” de células claras (CCBT) são
extremamente raros e difíceis de diagnosticar. Lembram o adenofibroma de
células claras, porém com atipia epitelial e/ou proliferação epitelial além
 6

daquela vista no adenofibroma. Todavia, esse componente fibromatoso pode

estar ausente (Suzuki et al., 2006). Os tumores de Brenner “borderline” são
revestidos por uma camada de células transicionais que lembram as
neoplasias do trato urinário. Assim como o CCBT, as formas in situ e
microinvasivas não foram claramente definidas e não há casos de implantes
peritoneais e de óbito relatados (Seidman & Kurman, 2003).
O tumor endometrióide “borderline” (EBT) é um tumor raro e assim
como os tumores “borderline” dos tipos mucinosos gastrointestinais, células
claras e Brenner têm boa evolução. Ainda não foi relatado óbito relacionado ao
EBT. O EBT também pode ser caracterizado como carcinoma intra-epitelial e
EBT com microinvasão (Seidman et al., 2004).
O carcinoma do ovário é caracterizado pela evidência de invasão
estromal, que excede aquela descrita para as lesões microinvasoras. São
tumores predominantemente sólidos e a presença de necrose e hemorragia
são comuns. Existem dois tipos de invasão do estroma, a invasão estromal
destrutiva e a com padrão glandular confluente (Chen et al, 2005).
Kurman et al., (2008) propôs um modelo de carcinogênese, onde o
tumor de ovário é dividido em dois grupos chamados do tipo I e tipo II. Os
tumores de ovário do tipo I representam 25% dos tumores malígnos.
Apresentam crescimento lento e geralmente estão confinados aos ovários.
Esses tumores desenvolvem-se a partir de lesões precursoras como os
cistoadenomas, e os tumores “borderline”. Incluem o CS-BG, o carcinoma
mucinoso (CM), o carcinoma endometrióide (CE), o tumor de Brenner
malígno e o carcinoma de células claras (CCC) e são tumores
geneticamente estáveis (Tabela 3) (Gemignani et al., 2003; Singer et al., 2003;
Ho et al., 2004).
Os tumores do tipo II são neoplasias de crescimento rápido e
altamente agressivos, para as quais não foram descritas lesões precursoras e
raramente estão confinados aos ovários. Incluem o carcinoma seroso de alto
grau (CS-AG), o tumor mesodérmico misto malígno (carcinosarcoma) e os
carcinomas indiferenciados. Esse grupo tem um alto nível de instabilidade
genética e são caracterizados por mutação no gene p53 (Tabela 2).
 7

Tabela 2: Alterações genéticas e lesões precursoras dos tumores do ovário do

tipo I e tipo II (Modificado de Shih e Kurman, 2004)
Tumor do ovário Lesões precursoras Alterações genéticas
CS-BG Cistoadenoma seroso Mutação BRAF e KRAS (~67%)
Adenofibroma
Tumor seroso proliferativo
atípico
Carcinoma intraepitelial
Carcinoma Cistoadenoma mucinoso Mutação KRAS (>60%)
mucinoso Tumor mucinoso proliferativo
atípico
Carcinoma intraepitelial
Carcinoma Endometriose LOH ou mutação PTEN (20%)
endometrioide Adenofibroma endometrioide Mutação β-catenina (16-54%)
Tumor endometrioide Mutação KRAS (4-5%)
proliferativo atípico Instabilidade de Microsatelite (13-
Carcinoma intraepitelial 50%)
CCC Endometriose Mutação KRAS (5-16%)
Adenofibroma de células claras Instabilidade de microsatelite
Tumor de células claras (~13%)
proliferativo atípico Mutação TGF-β RII (66%)
Carcinoma intraepitelial
Tumor de Brenner Tumor de Brenner Não identificado
Maligno Tumor de Brenner proliferativo
atípico
CS-AG Não identificado Mutação no p53 (50-80%)
Amplificação e superexpressão do
HER2/neu (10-20%) e do AKT2 (12-
18%)
Inativação do p16 (10-17%)
Carcinoma Não identificado Não identificado
Indiferenciado
Carcinosarcoma Não identificado Mutação no p53 (>90%)
CS-BG: carcinoma seroso de baixo grau; CCC: carcinoma de células claras; CS-AG: carcinoma
seroso de alto grau; LOH: perda da heterozigosidade; TGF: fator de crescimento
transformador. Os tumores de ovário do tipo I apresentam crescimento lento e geralmente
estão confinados aos ovários. Esses tumores desenvolvem-se a partir de lesões precursoras
como os cistoadenomas, e os tumores “borderline”. Os tumores do tipo II são neoplasias de
crescimento rápido e altamente agressivos, para as quais não foram descritas lesões
precursoras e raramente estão confinados aos ovários.
 8

Os carcinomas serosos do ovário são os carcinomas ovarianos mais

freqüentes, representam 80-85% de todos os carcinomas do ovário (Soslow,
2008). Podem ser de baixo ou alto grau. A Tabela 3 faz um resumo dos
aspectos clinico-patológico dessas lesões.

Tabela 3: Resumo dos aspectos clínico-patológico dos tumores tipo I e

II: carcinoma seroso de baixo e alto grau, respectivamente (Modificado de Shih
e Kurman, 2004).
Freqüência Aspecto Histológico Comportamento clínico Resposta
QT
CS-BG 25% dos CS Arquitetura micropapilar Indolente Pobre
Baixo grau nuclear Progressão lenta
Baixo índice mitótico Sobrevida 5anos ~55%
CS-AG 75% dos CS Ninhos sólidos e massas Agressivo Boa
Alto grau nuclear Progressão rápida Recorrência
Alto índice mitótico Sobrevida 5anos ~30% freqüente
CS-BG: carcinoma seroso de baixo grau; CS-AG: carcinoma seroso de alto grau

O CE é o segundo subtipo mais comum de CO, representa 10% desses

tumores. São massas sólido-císticas preenchidas por um fluido de cor
achocolatada e 43% desses tumores são diagnosticados no E I (Seidman &
Kurman, 2003).
O CCC foi definido em 1973 pela OMS como células com citoplasma
claro abundante com crescimento em um padrão com aspecto sólido-tubular,
glandular assim como em células “hobnail” (Serov et al., 1973). É diagnosticado
principalmente no E I e II e se associa a endometriose em 37.5% a 70% dos
casos (Goff et al., 1996; Ogawa et al., 2000; Sugiyama et al, 2000). Como os
CM e os CE, os CCC tendem a ser grandes (15cm), unilateral, sólidos e muitas
vezes contem um cisto predominante.
Os CM representam menos do que 3% de todos os CO, 50-66% são
diagnosticados no E I e são bem diferenciados. Embora a identificação de
mucina intra-citoplasmática seja mandatória, em muitos tumores mucinosos há
falta da mucina apical em grande parte do tumor (Soslow, 2008).
O carcinoma de células transicionais (TCC) do ovário foi definido pela
primeira vez por Austin e Norris em 1987 sendo a morfologia de um carcinoma
 9

com aspecto urotelial. O componente benigno ou proliferativo do tumor de

Brenner deve ser identificado. A incidência desse tumor é de 1-2% e tem uma
melhor resposta a quimioterapia que outros tipos de CO. Há pouco ou nenhum
estudo sobre os eventos moleculares nesse tumor (McCluggage, 2008).
O tumor epitelial misto do ovário é caracteriza-se por pelo menos dois
elementos histológicos distintos presentes e o componente minoritário constitui
pelo menos 10% do tumor (Soslow, 2008). O carcinoma indiferenciado é um
diagnóstico de exclusão, constitui um grupo muito heterogêneo e a ausência de
aspectos de diferenciação é considerada suficiente para fazer esse
diagnóstico. Esse tumor tem o pior prognóstico de todos os carcinomas
epiteliais (Kaku et al, 2003). Os carcinosarcomas representam < 1% de todas
as neoplasias malignas do ovário e constituem carcinomas de alto grau com
elementos sarcomatosos metaplásicos (McCluggage, 2008).

2.2. Graduação do carcinoma do ovário

Segundo a FIGO, o grau tumoral depende da taxa de estruturas

glandulares e papilares nas áreas sólidas do tumor, sendo classificado em 3
graus. O grau 1 representa tumores com <5% de componentes sólidos, o grau
2 que tem entre 5 e 50% de componentes sólidos e o grau 3 mais de 50%. A
classificação do grau tumoral pela OMS é baseada na impressão do patologista
quanto ao aspecto arquitetural e citológico do tumor. Embora essa classificação
não seja definida de uma maneira quantitativa, também contém três graus.
Malpica (2008) esclareceu que carcinoma seroso é graduado de acordo com a
atipia celular e o índice mitótico em baixo e alto grau. Assim, os tumores com
atipia nuclear de leve a moderada são considerados de baixo grau e aqueles
com atipia nuclear severa são de alto grau. O carcinoma endometrióide é
graduado de acordo com a FIGO. O carcinoma mucinoso não é graduado, mas
subdividido em não invasivo (intra-epitelial) ou invasivo (tipo confluente ou tipo
infiltrativo). O carcinoma de células transicionais é graduado de acordo com os
carcinomas uroteliais. O CCC e o carcinoma indiferenciado por definição, são
de alto grau.
 10

2.3. Estadiamento

O estadiamento do tumor do ovário, quando indicado, é essencialmente

cirúrgico. A cirurgia é realizada através de incisão vertical, com inventário
minucioso da cavidade. Deve-se proceder ao lavado peritoneal, a anexectomia
com remoção intacta do tumor e congelação do mesmo. O estadiamento é feito
através da omentectomia infra-cólica, das biópsias múltiplas (cúpula
diafragmática e goteira parieto-cólica direita e esquerda, fundo de saco anterior
e posterior) da linfadenectomia pélvica e para-aórtica. A histerectomia total
abdominal do tipo I e a anexectomia contralateral são realizadas na
dependência do resultado da congelação e do desejo de gestar dessa
paciente. O estadiamento é o proposto pela Federação Internacional de
Ginecologia e Obstetricia (FIGO) em 1971, o qual está descrito na Tabela 4.

Tabela 4: Estadiamento do CO segundo a FIGO

FIGO: Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia

 11

Aproximadamente 70% das mulheres com carcinoma do ovário têm

doença avançada no momento do diagnóstico (Jemal et al., 2008). Trinta e um
por cento dos E I e II estadiados corretamente são III ou IV.
O E IV para os tumores “borderline” são mais do que raros. Para alguns
autores, o termo estadiamento para o tumor “borderline” não deveria ser
aplicado, uma vez que sugere malignidade. Com exceção dos tumores com
implantes peritoneais, aproximadamente todo tumor “borderline” tem um
comportamento benígno (citado por Seidman et al., 2004).
O estadiamento indica o prognóstico do tumor, já que há uma relação do
mesmo com a sobrevida. No carcinoma confinado aos ovários, a sobrevida em
5 anos varia de 91-93% nas diversas raças, já na doença avançada, a
sobrevida é de 23-30% (Jemal et al., 2008). Segundo Palmer et al (2008), o
estadiamento da FIGO é um preditor da sobrevida livre de doença para o CO.
No tumor “borderline” o estadiamento avançado representa um fator preditivo
independente para recorrência (Ren et al., 2008).

2.4. Diagnóstico

O diagnóstico do tumor de ovário é cirúrgico-patológico, porém a

apresentação clínica e os exames de rastreamento norteiam a sua suspeição.
A idade média das pacientes no momento do diagnóstico é de 43 anos no CS-
BG e de 61 anos para o CS-AG. A maioria das pacientes são assintomáticas
ou apresentam sintomas inespecíficos, até que a doença progrida para os
estádios avançados. Aproximadamente 75-80% dos casos têm tumor
disseminado além dos ovários no momento do diagnóstico. Nesta situação,
sintomas como o aumento do volume e dor abdominal podem estar presente. A
caquexia é resultado da obstrução intestinal e de alterações metabólicas
devido à doença avançada (Gadducci et al., 2001).
A tríade de massa ovariana, ascite e derrame pleural caracterizam a
Síndrome de Meigs, onde classicamente a massa ovariana é benigna do tipo
fibroma ou fibrotecoma. O Tumor de Brenner malígno e o tumor de células da
granulosa podem raramente apresentar-se dessa forma. Outros tumores
benígnos ou malígnos associados com a tríade são chamados de Síndrome
pseudo-Meigs (Fujii et al., 2006 e Lanitis et al., 2009). A apresentação clínica
 12

inicial pode raramente se dar como metástase em linfonodos supraclaviculares

(Keepanasseril et al., 2008) e em 3.5% dos casos com metástase umbilical
conhecida como nódulo de Sister Mary Joseph’s (Kolwijck et al., 2007).
No rastreamento do CO, até o presente momento não há um teste que
seja considerado eficiente para a sua detecção precoce. A falta de uma
estratégia de rastreamento para os estádios iniciais da FIGO, faz com que
apenas 20% dos cânceres de ovário sejam diagnosticados no EC I quando as
taxas de cura aproximam-se dos 90%. Nos estadios mais avançados, a taxa de
sobrevida varia de 20-25%, dependendo do estadiamento, do grau histológico
do tumor e da doença residual após a cirurgia. Embora 80-90% dessas
pacientes respondam à quimioterapia, menos do que 10-15% dos casos
permanecem em remissão (Mutch D., 2002).
O CA-125 é o único marcador tumoral bem definido e com papel no
monitoramento do carcinoma de ovário, sendo o teste sorológico mais utilizado
na atualidade. É uma glicoproteína com peso molecular de 200-KDa, descrita
pela primeira vez em 1983, sendo reconhecida pelo anticorpo monoclonal
OC125 e quantificado por radioimunoensaio. É expresso em 80% dos
carcinomas epiteliais do ovário (CEO) e sua especificidade é baixa, já que é
encontrada em tumores benígnos, malígnos de ovários e outras neoplasias.
Sua maior aplicabilidade é no seguimento de pacientes tratadas, para avaliar a
resposta ao tratamento assim como detecção precoce da recidiva.
A diminuição no seu nível sérico está relacionada com resposta a terapia
e o aumento, com progressão do tumor. Apesar dessa correlação, muitos
pacientes com CA-125 menor do que 35 U/ml e sem evidência clínica de
doença após completar a quimioterapia, apresentam doença residual
microscópica (Wong et al., 2000).
O valor de corte do CA-125 recomendado por Bast el al (1983) é igual a
35 U/ml, resultando em uma sensibilidade de 50-60% para doença inicial e a
especificidade se aproxima a 99% na mulher da pós-menopausa. A
especificidade é menor na pré-menopausa e na doença ginecológica benígna.
O CA-125 também está aumentado nas mulheres com doença hepática,
falência renal, pancreatite, patologias estas que alteram a excreção do
antígeno ou que irritam a serosa do peritônio e da pleura (Mills et.al., 2001).
 13

Zhang et al (2007), utilizando a associação de quatro biomarcadores

(CA-125, CA 72-4, CA 15-3 e fator estimulante de colônia de macrófago M-
CSF), obtiveram uma maior,sensibilidade para o diagnóstico do CEO quando
comparado com o CA-125 isolado. Embora essa combinação de marcadores
auxilie o diagnóstico, não atinge o valor preditivo positivo de 10% (E99.7%,
S75%) proposto por Bast et al (1998).
Um painel de biomarcadores foi descrito por Visintin et al (2008)
utilizando seis proteínas, entre elas a leptina, prolactina, o fator inibidor de
macrófagos, a osteopontina, o CA-125 e o fator de crescimento “insulina-like”
(IGFII). Este ensaio multiplex atingiu uma sensibilidade de 95.3% e uma
especificidade de 99.4%.
A efetividade da USTV em diferenciar tumores malígnos dos benígnos é
influenciada pelo acesso ao exame ultrasonográfico de qualidade (equipamento
e experiência do profissional) e pela condição da paciente (Zhang et al., 2007).
O diagnóstico precoce e o seguimento de pacientes portadoras de tumor
de ovário, ainda nos dias atuais, representam um desafio. A descoberta de
novos marcadores moleculares que sejam específicos para o ovário pode
representar uma grande evolução no diagnóstico e acompanhamento dessas
pacientes.

3. Genes expressos diferencialmente no tumor de ovário

Os genes diferencialmente expressos entre o tecido tumoral e o normal

do ovário, assim como em outras neoplasias, constituem a principal fonte de
identiticação de novos biomarcadores séricos ou teciduais. A identificação
destes genes foi enormemente estendida desde o término do seqüenciamento
do genoma humano, na chamada era pós-genômica. Através das atuais
abordagens em grande escala, como o genoma, transcriptoma, proteoma,
metaboloma e epigenoma, espera-se que estes avanços sejam traduzidos em
testes diagnósticos mais sensíveis e que a terapêutica seja menos tóxica. A
tecnologia de microarranjos de DNA, RNA e de tecidos, combinados com a
tecnologia do “differential display” e com ferramentas de bioinfomática,
constituem importantes estratégias para estudos em grande escala de
mudanças na expressão gênica nestas neoplasias (Kim et al., 2009). Em
 14

relação ao CO, a expressão destes genes tem se mostrado correlacionada com

a agressividade do tumor, adicionando às informações patológicas e dados
clínicos disponíveis, com o potencial de melhorar o prognóstico do CO (Gilks et
al., 2005).
O’Neill et al (2005) demonstraram que no CS-AG, a expressão de certas
proteínas como a p53, o MIB1, o proto-oncogene BCL2, o HER-2/neu e o
receptor de tirosina cinase C-KIT é significantemente maior do que no CS-BG.
Köbel et al (2008) analisaram a expressão de 21 proteínas no CO e
revelaram que a expressão de biomarcadores como o WT1 e Ki-67
apresentavam-se estáveis nos diferentes estádios dentro de um mesmo
subtipo de tumor. Dessa forma, os subtipos histológicos devem ser
considerados como doenças distintas nos estudos de biomarcadores.
Dentre uma série de genes diferencialmente expressos no carcinoma de
ovário, inclui-se a osteopontina (OPN). Kim et al (2002) foram os primeiros a
descrever que a OPN parece ser um candidato a biomarcador no diagnóstico
do CEO. Mor et al (2005) demonstraram que um painel com quatro
biomarcadores, dentre eles a osteopontina, proporciona uma melhoria no
diagnóstico do CEO quando comparado com os marcadores utilizados
atualmente na clínica.

4. Osteopontina

4.1. O Gene

O gene da osteopontina humana (OPNh) estende-se por 8 kb, estando

mapeado no braço longo do cromossomo 4, próximo aos genes da
sialoproteina óssea (BSP), da “dentin matrix protein 1 (DMP1)”, da dentin a
sialofosfoproteína (DSPP) e da fosfoglicoproteína da matrix (Figura 3). Estes
cinco genes constituem a família SIBLINGs (do inglês, “small integrin-binding
ligand N-linked glycoproteins”) (Bellahcène et al 2008).
 15

Figura 3: Família SIBLINGs de proteínas: o segundo éxon contém o códon de iniciação da

tradução. Os éxons 3 e 5 contêm a seqüência para a fosforilação da serina (PO4). O éxon 4 é
rico em prolina. O tripeptídeo RGD (Arg-Gly-Asp) é encontrado dentro do último ou dos dois
éxons maiores. As cadeias de glicosaminoglicans (GAG) de cor laranja indicam cadeias de
condroitin ou dermatan sulfato e a de cor verde indica a cadeia de Keratan sulfato. O sítio de
clivagem de proteínas da família SIBLINGs está representado pela tesoura. SPP1,
osteopontina; IBSP, sialoproteina óssea; DMP1, dentina proteína 1 da matriz; DSPP, dentina
sialofosfoproteína; MEPE, fosfoglicoproteína da matrix extracelular (Modificado de Bellahcène
et al., 2008).

4.2. O RNA
.
O gene da OPN humana (OPNh) apresenta “splicing” alternativo,
gerando três isoformas distintas da OPN (Figura 4). A OPNa representa a
forma completa do mRNA, a OPNb é aquela onde há deleção do éxon 5 e na
isoforma da OPNc há deleção do éxon 4 (He et al, 2006).

Figura 4: Diferentes isoformas da osteopontina resultantes de “splicing” alternativo (Modificado

de He et al, 2006). O éxon 1 não é demonstrado neste diagrama, por não ser codificante. A
OPNa é a isoforma completa da OPN, na OPNc e OPNb estão ausentes, respectivamente os
éxon 4 e 5.
 16

4.3. A proteína

A OPN é uma glicofosfoproteína não colagenosa da matrix extracelular

(ECM), a qual tem um papel crítico no crescimento celular, adesão, migração, e
metástase. É uma proteína secretada, solúvel, rica em aspartato e resíduos de
ácido siálico, sendo expressa em uma variedade de tipos celulares. Esta
proteína está amplamente distribuída nos fluidos humanos como plasma, urina,
leite e bile (Nagatomo et al., 2004).
Senger (1979) descreveu a OPN como um marcador de transformação
de células epiteliais, tendo sido isolada pela primeira vez de uma matrix óssea
calcificada por Franzen (1985). É também conhecida como sialoproteína óssea
I, fosfoproteína secretada I (Spp1), 2ar, uropontin e early T-lymphocyte
activation-1 (Eta-1).
A OPN humana contém aproximadamente 314 aminoácidos, sendo que
o peso molecular das suas isoformas varia entre 41 e 75 kDa. Esta proteína é
altamente modificada em nível pós-traducional, existindo em múltiplas formas
como a glicosilada e a fosforilada. A OPN contém diversos domínios funcionais,
apresentando seqüências que são conservadas entre as espécies, quais sejam
as regiões NH2 e COOH terminais, o local de clivagem da trombina (RSK) e a
seqüência GRGDS (glicina-arginina-glicina–aspartato-serina) (citado por
Denhardt et al., 2001).
A GRGDS é uma seqüência localizada no fragmento amino-terminal da
OPN humana, traduzida a partir do éxon 6, e contém uma seqüência RGD
modificada, capaz de ligar aos diferentes receptores de integrina da superfície
celular (αvβ3, αvβ1, αvβ5, α5β1, α8β1). A trombina cliva a OPN e produz dois
fragmentos, expondo o domínio de ligação da integrina e do CD44 (Rodrigues
et al., 2007).
O fragmento carboxi-terminal da OPN se liga à variante 6 e 3 do CD44
(CD44v6 e CD44v3), através de uma ponte de heparina, promovendo a
invasão e tumorigênese (Teramoto et al., 2005). A OPN também é um
substrato para as metaloproteinases (MMP-3 e MMP-7), as quais também
promovem a clivagem da OPN e o aumento da sua atividade como molécula de
adesão e como estímulo migratório em uma variedade de tipos celulares.
(Agnihotri et al.,2001).
 17

4.4. Papel funcional da OPN

A OPN tem uma variedade de funções celulares fisiológicas, além de

estar envolvida com diversas fases do desenvolvimento do câncer e
progressão tumoral. Apresenta importantes papéis na adesão celular,
proliferação, invasão, degradação da matrix extracelular, na resposta imune
(inflamação e evasão do complemento), angiogênese e metástase (Bellahcène
et al., 2008).
No tecido ósseo, a OPN aumenta atividade do osteoclasto como
conseqüência da interação entre a OPN e as integrinas da superfície celular do
osteoclasto. A OPN está envolvida na remodelação óssea, demonstra múltiplas
interações com o Ca++, inibe e quebra o crescimento de cristais de oxalato de
cálcio e tem papel no processo de formação de massa óssea (Choi et al., 2008;
Denhhardt & Noda, 1998).
A OPN também apresenta função na sobrevida celular e progressão
tumoral através das vias de sinalização intra-celulares (Figura 5). A via de Akt
cinase serina/treonina regula a progressão do ciclo celular e medeia a
sobrevida e migração celulares. A OPN ativa o NFκB, o qual promove a
sobrevida das células T ativadas, através da fosforilação da cinase IKKβ
(conhecida como inibidor da cinase β do NFκB) e da inibição da transcrição do
fator Foxo3a (Hur et al., 2007). A proliferação das células cancerosas é
induzida pela OPN através da ativação do EGFR (receptor do fator de
crescimento epidermal), o qual através da cinase SRC forma um complexo com
a integrina. Esse complexo ativa a cinase ativadora de mitogeno (MAPK), a
qual resulta na ativação de vias de sinalização associadas com a progressão
tumoral (Sodek et al., 2000).
 18

Figura 5: As proteínas da família SIBLINGs medeiam a interação matrix-célula e a sinalização celular.

Essas glicoproteínas podem promover interações dependentes e independentes de RGD. A OPN também
pode interagir com receptores da família do CD44. Alguns desses complexos são capazes de mediar as
seguintes funções: (a) sobrevida celular através da phospholipase C-γ (PLCγ), da proteína cinase C
(PKC), da phophatidylinositol 3-Kinase (P13K), ativação da via de Akt que leva a sinais de anti-apoptose
nas células tumorais. A fosforilação de Akt induzida pela OPN pode ser bloqueada pelo supressor de
tumor PTEN (phosphatase and tensin homologue); (b) motilidade através da ativação da via canônica de
integrina αvβ3 onde tanto o a cinase indutora de fator nuclear (NIK), como o MEKK1 (proteína cinase
cinase cinase 1), JNK1 (MAPK8) promove a migração celular através da ativação da expressão dos genes
dependente de AP1 (c) ponte com a metaloproteinases (MMP) da matrix, permitindo a digestão da matrix
extracelular local, a remodelação tecidual e migração celular através da matrix extracelular; (d) ponte e
ativação do CFH, através da promoção da degradação de C3 converte o complexo C3bBb. A ativação do
CFH pelo SIBLING impede a formação do complexo de ataque da membrana (MAC) e a lise
subseqüente de células cancerosas logo, favorece o escape da defesa imunológica (Modificado de
Bellahcène et al., 2008).

A OPN apresenta também papel em diferentes momentos da formação

de metástases. No tumor primário, as células cancerosas secretam altos níveis
de OPN, que favorecem a sua proliferação. Para que ocorra invasão, é
necessária a alta motilidade das células cancerosas e o aumento da expressão
das proteases que degradam a matrix extra-celular (MEC) (Bellahcène et al.,
2008). A degradação da MEC ocorre através de duas vias de controle de
proteólise, o ativador de plasminogêneo tipo urokinase (uPA) e via MMP. A
OPN induz a secreção de uPA por ativar a via de sinalização SRC-EGFR-ERK
(Das et al., 2004). A interação da uPA com o seu receptor facilita a conversão
do plasminogêneo em plasmina, a qual regula a invasão celular através da
degradação de proteínas como fibronectina, colágeno tipo IV, laminina
promovendo a migração e progressão tumoral (Besser et al., 1995; Dano et al.,
1985; Schmalfeldt et al., 2001).
 19

A OPN age como um fator pró-angiogênico, sendo o receptor de

integrina essencial para a angiogênese tumoral. A integrina αvβ3 medeia a
migração de células endoteliais durante a formação dos vasos e é
extensamente expressa nos vasos sanguíneos em amostras de tumor humano,
mas não é expressa nos tecidos humanos normais (Weber et al., 2000).
As células tumorais atingem a corrente sanguínea, onde são
transportadas. Essas células superexpressam a OPN, a qual se liga nos
receptores da membrana célula (αvβ3 e CD44) e seqüestram o fator de
complemento H (CFH). Esse complexo inibe a formação do MAC (Complexo de
ataque à membrana celular) e logo, inibe a lise celular mediada pelo sistema
complemento. Desta forma, as células transformadas podem escapar à lise
celular mediada pelo sistema complemento, favorecendo a sua sobrevida.
(Fedarko et al., 2000; Jain et al.,2002).

4.5. Expressão da OPN nos diversos tumores

Níveis plasmáticos alterados da OPN estão relacionados com vários

tipos de neoplasias e positivamente correlacionados com a progressão,
invasão e metástase tumoral (Nakae et al., 2006). A super expressão da OPN
foi detectada em células tumorais da mama, endométrio, colo uterino,
carcinoma de células claras renais, bexiga, próstata, cólon, gástrico, esôfago,
pâncreas, pulmão, câncer de cabeça e pescoço e no câncer hepatocelular
(Mirza et al., 2008; Hiagashiyama et al., 2007; Briese et al., 2006; Hashiguchi et
al., 2006; He et al., 2006; Vordermark et al., 2006; Donati et al., 2005; Agrawal
et al., 2002; Thalmann et al., 1999; Ue et al., 1998; Casson et al., 1997). O
nível sérico da OPN está substancialmente elevado nos pacientes com
carcinoma metastático (Coppola et al., 2004).
Dentre os tumores ginecológicos, a expressão da OPN foi descrita no
tumor do endométrio e do colo uterino. No tumor do endométrio, Brown et al
(1994) detectaram o transcrito da OPN nas células tumorais do
adenocarcinoma bem como nos macrófagos. Briese et al (2006) encontraram
que a OPN é expressa em 80% das amostras de endométrio normal e que sua
localização é citoplasmática. Neste estudo, nas hiperplasias endometriais e nos
carcinomas a expressão foi de 64.7% e 67.4% respectivamente.
 20

No carcinoma cervical, a marcação por imuno-histoquímica para a OPN

foi observada em 67% dos casos, todavia ela mostrou-se ausente no tecido
cervical saudável. Além do mais, uma alta imunoreatividade para OPN está
relacionada com pior sobrevida global e menor sobrevida livre de doença
caracterizando-se como um biomarcador útil no diagnóstico e prognóstico do
carcinoma cervical (Cho et al., 2008). Sakaguchi et al (2007) demonstraram
que o nível protéico da OPN é maior na doença metastática linfonodal do que
no tumor cervical primário e que o prognóstico desses pacientes é pior.
Para o CEO (carcinoma epitelial do ovário) o nível de OPN no soro pré-
operatório pode ser útil em predizer essa neoplasia e no pós-operatório para
detectar recorrência. Além disto, níveis elevados de OPN na urina podem ser
úteis para o rastreamento não invasivo no diagnóstico precoce (Ye et al., 2006;
Nakae et al., 2006; Brakora et al., 2004; Kim et al., 2002).
Tiniakos et al (1998) desenvolveram o primeiro estudo de expressão de
OPN na neoplasia ovariana. A expressão da OPN mostrou-se fraca ou ausente
em 93% dos pacientes com adenocarcinoma e em suas metástase e presente
em 80% dos tumores “borderline” e em 50% dos seus implantes. Nesse estudo,
o tipo histológico, o grau hitológico e o estadiamento não se correlacionaram
com o nível de expressão da OPN.
Kim et al (2002) foram os primeiros a descrever que a OPN parece ser
um candidato a biomarcador no diagnóstico do CEO. Estes autores mostraram
que o nível médio de OPN no soro é maior em pacientes com CEO quando
comparado com pessoas sadias (p<0.001). Porém, no tecido esse aumento
não foi significante.
Brakora et al (2004), diferente de Kim et al (2002), observaram níveis
sorológicos da OPN mais baixos nos pacientes do que nos controles
saudáveis. Como nesse estudo o soro foi coletado após a cirurgia de
citoredução primária e naquele a coleta foi antes do tratamento, eles sugerem
que a OPN deve ser produzida pelo ovário normal ou pelo omento. Houve
correlação da OPN com a presença de ascite, doença volumosa e com a
resposta ao tratamento quimioterápico. No entanto, não houve relação entre o
nível da OPN e o tipo e grau histológico do tumor.
Comparando o CS-BG com o CS-AG, o nível de expressão a OPN
através da imunohistoquimica, não foi diferente entre eles. Neste estudo, a
 21

maioria das células tumorais apresentou positividade maior do que 50% e essa
marcação foi citoplasmática (O’Neill et al., 2005).
A expressão da OPN parece ter relação com o estadiamento da doença.
Pacientes com CEO no EC IV apresentaram nível plasmático elevado ao
comparar E I e II. O nível plasmático da OPN foi maior nas pacientes com
ascite. Quando o volume de ascite foi comparado com o CA-125, a correlação
não foi significante (Nakae et al., 2006).
Ye et al (2006) demonstraram que o fragmento COOH terminal da OPN
pode ser analisado na urina. O grupo encontrou que o valor médio da
concentração da OPN é maior no CEO do que nos indivíduos normais ou nos
portadores de outros carcinomas. Interessantemente, este estudo mostrou que
o CM e o SBT tiveram níveis mais altos do que os outros subtipos e houve um
aumento significante da OPN em relação ao estadiamento mais avançado.
No seguimento do CEO, há uma tendência para queda do nível de OPN
sérica após o tratamento cirúrgico e quimioterápico. No entanto, a queda do
CA-125 é mais consistente. Embora o nível de expressão de OPN sérica seja
inferior ao CA-125 em predizer resposta à terapia, a OPN aumenta
precocemente em 90% dos pacientes que desenvolvem recidivas.(Schorge et
al., 2004).

4.6 OPN e expressão de isoformas variantes em tumores

4.6.1. Isoformas de “splicing” alternativo como biomarcadores

tumorais

O genoma humano contém de 20.000 a 25.000 genes, todavia esse

número de genes não é capaz de ser reponsável por todas as proteínas
reveladas nas análises proteômicas. O “splicing” alternativo foi
responsabilizado por essa diversidade proteômica. Ele constitui um evento
molecular fisiológico no qual um único transcrito primário (pré-RNA) é
processado pela maquinaria do splicing e pode gerar RNAs maduros mútiplos e
distintos, levando a expressão de isoformas de proteínas com estrutura e
propriedades funcionais diferentes (Ghigna et al., 2008).
 22

Muitos genes relacionados ao câncer são regulados pelo “splicing”

alternativo. Eles originam proteínas envolvidas no controle do ciclo celular,
proliferação, diferenciação, via de sinalização, morte celular, angiogênese,
invasão, motilidade e metástase. Uma forma de “splicing” especifica
identificada somente no câncer, mas não nas células saudáveis poderia ser um
candidato a biomarcador (Pajares et al., 2007).
A identificação de genes e suas variantes de “splicing” envolvidos nos
tumores do ovário podem permitir a caracterização de novos potenciais
candidatos a biomarcadores para essa neoplasia e podem representar um
avanço na abordagem das pacientes.

4.6.2. OPN e suas isoformas de “splicing”

Saitoh et al (1995) descreveram um estudo envolvendo células de

glioma, o qual foi o primeiro a demonstrar que as células cancerosas
expressam múltiplas variantes de “splicing” da OPN. Posteriormente, He et al
(2006) encontraram que as linhagens malígnas de câncer de mama expressam
os três RNAm distintos da OPN. Este estudo mostrou que a OPNc é
seletivamente expressa em linhagem celular de tumor de mama invasivo
(MDA-MB-435 e MDA-MB-231), mas não em não invasivo (MCF-7). Nas
analises de RT-PCR de tecidos de mama humanos, a variante de “splicing”
OPNc é um marcador altamente específico para as células transformadas, o
qual não é expresso nos tecidos adjacentes e nem nos tecidos normais.
Posteriormente, Mirza et al (2008), avaliaram a OPNc como biomarcador
seletivo para o câncer de mama. O RNAm da OPNc encontra-se expresso em
80% dos carcinomas de mama, em 36% dos tecidos normais adjacentes e não
foi detectado em tecidos normais do órgão. O RNAm da OPNa mostrou-se
expresso em vários níveis em todos os carcinomas de mama e em todos os
tecidos adjacentes ao tumor, assim como em 95.45% tecidos normais
analisados. A OPNb foi detectada em baixos níveis em 90% dos carcinomas de
mama, em 72.7% dos tecidos adjacentes ao tumor e e em 27.2% dos tecidos
de mama não tumorais. Este estudo mostrou que o nível de OPNc no tumor é
significativamente maior que nas amostras normais. O nível de OPNa não se
mostrou diferente entre os três grupos. Estes autores também demostraram
 23

que a expressão de OPNb é baixa e a proteína é instável, devido à degradação

pelo proteosoma. Em relação ao grau tumoral, a marcação da OPNc mostrou-
se maior nas lesões de alto grau histológico do que naquelas de baixo grau e
se caracterizou como o melhor preditor isolado do carcinoma de alto grau.
Analisando a expressão de diferentes isoformas da OPN no peritoneo
normal, no mesotelioma e em linhagens celulares de mesotelioma, Ivanov et al
(2009) demonstraram que a OPNa é a isoforma que apresenta a maior
expressão no tecido tumoral. Esta isoforma, juntamente com a OPNb,
apresentaram uma expressão 9 e 16 vezes maior em um paciente após a sua
recidiva. Nos ensaios de proliferação celular, a super-expressão da OPNa
promoveu a migração celular. Nos ensaios de invasão da matrigel, a OPNa e b
estimularam a invasão enquanto a OPNc demonstrou efeito supressor não
significante na linhagem celular HP-1 e não teve efeito na linhagem celular
H2595.
Sullivan et al (2009) demonstraram que o estímulo com nicotina nas
linhagens celulares HS766T e BxPC-3 de adenocarcinoma de pâncreas,
promove um aumento do nível de expressão da OPNc. Neste estudo, nas
amostras teciduais de adenocarcinoma ductal pancreático que expressam altos
níveis da OPN total, a OPNc mostrou-se expressa em 100% dos fumantes e
não fumantes. Todavia, nas amostras teciduais da neoplasia mucinosa
intrapapilar do pâncreas, a OPNc está presente em 50% dos fumantes e não
foi detectada nos não fumantes. Além disso, os níveis séricos da OPN em
pacientes não fumantes, foi maior naqueles com lesão de adenocarcinoma
ductal pâncreático do que nos indivíduos com lesão pré-maligna (neoplasia
mucinosa intrapapilar do pâncreas).
Blasberg et al (2009) utilizaram capilar endotelial bovino cuja cultura foi
no meio condicionado de linhagens celulares de carcinoma pulmonar não
pequenas células, as quais foram transfectadas com isoformas individuais da
OPN e plaqueadas em matrigel. Neste estudo, a superexpressão da OPNa
resultou em formação de maior quantidade de túbulos quando comparados
com o vetor vazio, associado a uma duplicação da expressão relativa do
VEGF. Entretanto, a superexpressão da OPNc resultou em uma diminuição
significativa na formação dos túbulos, e da expressão do VEGF. Já a
superexpressão da OPNb, promoveu a formação dos túbulos endoteliais em
 24

menor extensão do que aquele da OPNa, notávelmente sem associação com

a secreção ou expressão de VEGF.
No CO a expressão das diferentes isoformas de “splicing” da OPN no
tecido ovariano ainda não foi caracterizada. Nosso grupo caracterizou o papel
funcional das variantes de isoformas de “splicing” da OPN na tumorigênese e
na progressão tumoral no CO utilizando como modelo a linhagem tumoral de
ovário OvCar-3 (Tilli et al., submetido, apêndice 1). Os clones de OvCar-3 que
super expressam a OPNc apresentam um aumento na proliferação e migração
celular, crescimento independente de ancoragem e formação de tumores em
camundongos atímicos em comparação com as células que super-expressam a
OPNa, OPNb, vetor vazio e OvCar-3 não transfectada.
 25

5. Objetivos

5.1. Objetivo Principal:

O objetivo desse estudo é caracterizar o perfil de expressão das

diferentes isoformas da osteopontina no tecido ovariano tumoral do tipo
carcinoma, “borderline” e benigno e no tecido ovariano normal do ovário de
pacientes submetidas à cirurgia no Serviço de Ginecologia Oncológica do
Instituto Nacional de Câncer do Rio de Janeiro, Brasil.

5.2. Objetivos Específicos:

Correlacionar o perfil de expressão das diferentes isoformas da

osteopontina com os dados clínicos e patológicos das pacientes incluídas no
estudo.

6. Material e métodos

6.1. Critérios de Inclusão

Neste estudo prospectivo, foram incluídas 40 voluntárias das quais,

foram coletados os tecidos ovarianos. As pacientes internaram no serviço de
Ginecologia Oncológica do INCa, no período de maio de 2006 a janeiro de
2008, para serem submetidas a laparotomia devido a massa pélvica a
esclarecer ou portadoras de outros tumores ginecológicos não ovarianos, como
tumor primário do endométrio ou colo uterino em pré-operatório de
histerectomia e anexectomia.

6.2. Critérios de Exclusão

Foram excluídas as pacientes hemotransfundidas, as portadoras de

doenças autoimunes ou de um segundo tumor primário e as submetidas à
quimioterapia ou radioterapia prévia.
 26

6.3. Descrição das amostras

As amostras foram divididas em quatro grupos (Tabela 5). O primeiro

grupo é representado por 15 pacientes portadoras de carcinoma epitelial do
ovário das quais foram estudados 15 tecidos ovarianos (11 do tipo histológico
seroso, 2 tumores mistos do tipo seroso e células claras, 1 endometrióide e em
1 caso o tipo histológico não foi definido). O Grupo 2 é constituído por seis
pacientes portadoras de tumor “borderline” do ovário, das quais foram
analisados 6 tecidos ovarianos sendo três tumores serosos e 3 mucinosos. O
terceiro grupo é representado por 8 pacientes diagnosticadas com tumor
benígno do ovário, dentre eles 2 cistoadenomas serosos, 1 cistoadenoma
mucinoso, 1 cistoadenofibroma seroso, 1 tumor estromal do tipo tecoma e três
tumores germinativos do tipo teratoma maduro. O último grupo (grupo 4) é
composto por 11 voluntárias das quais foram coletados 11 tecidos ovarianos
normais provenientes de pacientes que apresentavam tumor primário do colo
uterino (1 caso), tumor primário do endométrio (9 casos) e 1 caso com cisto
folicular. Esse pequeno tamanho amostral está relacionado à raridade desta
patologia, à necessidade da divisão das amostras em diferentes grupos e da
dificuldade na realização dos ensaios em curto período de tempo.

Tabela 5: Grupos das pacientes estudadas segundo o tipo do tecido

ovariano analisado.
Número de pacientes Porcentagem (%) Tecido ovariano
e amostras estudado
Grupo 1 15 37.5 CO
Grupo 2 6 15 Tumor “borderline”
Grupo 3 8 20 Tumor benigno
Grupo 4 11 27.5 Normal
Total 40 100

6.4. Dados clinico-patológicos

Os dados clínico-patológicos foram colhidos através de prontuários das

pacientes, a partir dos quais foram registrados a idade, tipo e grau histológico
 27

do tumor, estadiamento cirúrgico conforme descrito pela FIGO (Federação

Internacional de Ginecologia e Obstetrícia), o tipo de cirurgia realizada, a
presença ou não de ascite, o tamanho do maior tumor ovariano ressecado e o
nível sérico do CA-125.

6.5. Coleta do tecido

O tecido ovariano tumoral foi obtido de pacientes submetidas à

laparotomia devido à massa pélvica em que no intra-operatório foi
diagnosticado como lesão ovariana benigna ou maligna. O tecido foi coletado
no momento da cirurgia, macrodissecado e armazenado em RNA later
(Ambion). O tecido ovariano normal foi coletado de pacientes submetidas à
cirurgia devido a outros tumores ginecológicos não ovarianos, onde os laudos
histopatológico desses ovários revelaram se tratar de tecido normal. O tecido
ovariano normal foi coletado e armazenado nas mesmas condições do tecido
ovariano tumoral. Todas as pacientes assinaram o termo de consentimento
livre e esclarecido e o projeto foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa
sob o número 019/06.

6.6. Extração de RNA total

O tecido ovariano foi homogenizado com o homogenizador de tecidos

Omni TH (Omni International). A extração do RNA foi realizada utilizando o
RNeasy Mini Kit (Qiagen) seguindo o protocolo conforme as recomendações do
fabricante. O RNA foi dosado em espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 V3.2
(nanodrop Technologies, Inc-USA) a 260 nm.

6.7. Síntese de cDNA

A síntese do cDNA foi feita a partir de 3 µg de cada amostra do RNA

total, as quais foram transcritas reversamente para cDNA segundo protocolo do
kit “Superscript II First-Strand Synthesis System for RT-PCR” (Invitrogen)
conforme o protocolo descrito pelo fabricante em um volume final de 20 µl.
Após a síntese do cDNA, o mesmo era dosado no espectrofotômetro NanoDrop
 28

ND 1000. O cDNA foi então utilizado em uma concentração de 123 ng/µl para a
realização do qRT-PCR.

6.8. RT-PCR

Para testar a qualidade do cDNA sintetizado, avaliamos a expressão do

gene constitutivo GAPDH através de amplificação pela reação em cadeia da
polimerase (PCR). Este gene foi amplificado utilizando-se as seguintes
condições: utilizando-se tampão 10x (Amersham), 0.5U de Taq polimerase, 200
µM final de dNTPs, 0,5 µM do oligonucleotídeos senso e antisenso e 2 µl de
cDNA para um volume final de 25 µL. Os olignucleotideos utilizados foram o
GAPDH senso e antisenso (Tabela 6). As condições de ciclagem foram: 10
ciclos de 95°C por 30 segundos (desnaturação), 55° C por 1 minuto
(anelamento) e 72°C por 45 segundos (extensão). A cada ciclo, a temperatura
de anelamento é diminuída em 0.5°C, seguido de 30 ciclos de 95°C por 30
segundos (desnaturação), 50°C por 1 minuto (anelamento) e 72°C por 45
segundos (extensão). O tamanho do produto amplificado com estes
oligonucleotídeos era de 418pb.

6.9. PCR em tempo real

A análise da expressão das isoformas da osteopontina (OPNa, OPNb e

OPNc) foi realizada através de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR)
através do sistema SYBR Green (SYBRTM Green PCR Master Mix, Applied
Biosystems). A reação contém 10 µL de SYBR Green, 0.2 µM do primer
forward e reverse (específico para cada isoforma da OPN, OPNa, OPNb,
OPNc ou GAPDH), 1 µl de cDNA e 4 µl de água bidestilada para completar
volume final de 20 µl (Tabela 6). A normalização do experimento foi feita
através da concentração de cDNA de uma amostra que expressa as três
isoformas da OPN e que foi incluída em todas as placas como calibrador
interno. Todas as amostras foram testadas em duplicada.
As condições de ciclagem foram: incubação inicial a 50°C por 2 minutos,
seguidos de uma incubação a 94°C por 5 minutos, uma incubação a 94°C por
 29

30 segundos e uma incubação a 55°C por 30 segundos. A temperatura então

decrescia em 0,5°C por ciclo (“touchdown”). Extensão a 72°C por 1 minuto e
meio. Essa ciclagem inicial era repetida por nove vezes. As amostras eram
submetidas a uma nova ciclagem a 94°C por 30 segundos 30 vezes, 50°C por
30 segundos e uma parada a 72°C por 1 minuto e meio para a leitura da
fluorescência. A extensão final era a 72° por 15 minutos. Após o término da
etapa de amplificação, as amostras amplificadas eram submetidas a uma curva
de desnaturação para verificar se o produto amplificado correspondia ao
produto específico de interesse. Essa curva consistia de um aumento de
temperatura a partir de 60°C até 90°C, com leituras da fluorescência efetuadas
a cada 0,2°C. A curva de desnaturação produz um único pico para reações de
amplificação específicas. O termociclador utilizado foi o CFD-3240 Chromo 4
Detector (MJ Research) e o software de análise dos dados gerados foi o
Opticon Monitor versão 2.03. A amplificação do produto final da reação de qRT-
PCR era confirmada para todas as amostras através de corrida em eletroforese
em gel de agarose 2%.

Tabela 6: Seqüência dos oligonucleotídeos senso e antisense para cada gene.

Gene Oligonucleotídeos Sequência 5’- 3’

OPNa OPNa F 5’-ATC TCC TAG CCC CAC AGA AT- 3’

OPNa OPNa R 5’-CAT CAG ACT GGT GAG AAT CAT C- 3’

OPNb OPNb F 5’-CTC CTA GCC CCA CAG ACC CT- 3’

OPNb OPNb R 5’-TAT CAC CTC GGC CAT CAT ATG- 3’

OPNc OPNc F 5’-CTG AGG AAA AGC AGA ATG- 3’

OPNc OPNc R 5’-AAT GGA GTC CTG GCT GT- 3’

GAPDH GAPDH 1F 5’-TGA CCC CTT CAT TGA CCT CA- 3’

GAPDH GAPDH 1R 5’-AGT CCT TCC ACG ATA CCA AA- 3’

F: forward, R: reverse
 30

6.10. Cálculo do Nível de Expressão das OPNs

As amostras que apresentaram picos únicos na curva de dissociação e

na corrida em gel de agarose foram então selecionadas para o cálculo do nível
de expressão. Para cada reação de amplificação da isoforma da OPN e do
GAPDH foi anotado o Ct (cycle-Threshold), o qual corresponde ao ciclo de
amplificação onde a amostra cruza a linha de base (threshold). A média do Ct
foi calculada a partir de dois experimentos independentes efeitos em duplicata.
A partir destes valores, foi então calculado o Δ Ct que representa o valor médio
da ampificação da OPNa, OPNb ou OPNc diminuído pelo valor médio da
amplificação do GAPDH para uma determinada amostra. Foi então escolhido
uma amostra que expressava as três isoformas da OPN, sendo esta usada
como normalizador para os demais cálculos (amostra 119 tumor direito). Para o
cálculo do ΔΔCt, o valor do Δ Ct de cada uma das isoformas da amostra de
interesse foi diminuído dos valores do Δ Ct das isoformas correspondentes da
amostra normalizadora. O nível de expressão de cada isoforma foi então obtido
através da fórmula 2-ΔΔCt.

6.11. Análises estatísticas

Foi efetuada análise descritiva (uni e bivariada) utilizando o teste t-

student para compraração das médias das variáveis contínuas. O grau de
significância de 5% foi considerado para o teste.
 31

7. Resultados

7.1. Caracterização dos parâmetros clínicos e patológicos dos

grupos de pacientes analisados

Um resumo das características clinico-patológicas das pacientes incluídas

neste estudo estão apresentadas na Tabela 7. A idade média das pacientes com
CO foi de 60.93 anos e daquelas com tumor “borderline” foi de 46.33 anos. No
grupo das pacientes portadoras de CO, 73.3% eram da cor branca e as pardas e
negras representavam 13.3% cada . Dentre as pacientes com tumor “borderline”,
66.7% eram da cor branca e as pardas e negras representavam 16.7% cada.
Com relação ao “status” menopausal, 80% das pacientes com CO estão na pós-
menopausa e 66.7% das pacientes com tumor “borderline” eram pré-
menopausadas. Dentre as seis pacientes nulíparas, 83.33% são portadoras de
tumor “borderline” do ovário ou CO. O valor médio do CA-125 foi de 40.96 U/ml,
74.71 U/ml e 1036.17 U/ml nas portadoras de tumor benigno, “borderline” e CO,
respectivamente. Todas as portadoras de CO apresentaram esse marcador
acima dos valores considerados normais (≥ 35 U/ml). Todavia, o valor do CA-
125 foi normal (< 35 U/ml) em 66.7%, 87.5% e 83.3% das pacientes com tumor
“borderline”, com tumor benigno do ovário e com ovário normal,
respectivamente. Em relação ao estadiamento no CO, 60% das pacientes
tinham E III ou IV. Nestas pacientes, o subtipo histológico seroso e o grau
histológico 3 foram encontrados em 73.3% dos casos. A distribuição em relação
ao estadiamento para o tumor “borderline” foi de 50% das pacientes no E I e as
demais no E III. Em relação ao tipo histológico, 50% apresentavam tumores do
tipo seroso e as demais do tipo mucinoso. No per-operatório, foi verificado a
presença de ascite em 66.6% dos casos de CO e em 25% das pacientes com
tumores benígnos do ovário. Todavia, nenhuma daquelas com tumores
“borderline” ou com ovários normais apresentaram ascite.
 32

Tabela 7: Resumo das características clinco-patológicas das pacientes incluídas

no estudo (número absoluto e percentagens dentro de cada grupo).
Carcinoma do Tumor Tumor Tecido ovariano
ovário “borderline” benigno normal
(n=15) (n=6) (n=8) (n=11)
Idade (anos) 43-78 28-80 26 –63 41–81
Média 60.93 46.33 48.13 62.45
Mediana 61 39.5 48 63
Status menopausal
Pré-menopausa 3 (20%) 4 (66.66%) 3 (37.5%) 2 (18.19%)
Pós-menopausa 12 (80%) 2 (33.34%) 5 (62.5%) 9 (81.81%)
Número de gestações
Nulípara 3 (20%) 2 (33.34%) 0 (0%) 1 (9.09%)
1-4 7 (46.66%) 4 (66.66%) 6 (75%) 7 (63.63%)
5-8 5 (33.33%) 0 (0%) 2 (25%) 2 (18.19%)
9 – 12 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (9.09%)
CA-125 (U/ml) 38.6- 3243.79 9.3- 222 5.28- 211 6.25-216
Média 1036.17 U/ml 74.71 U/ml 40.96 U/ml 47.59 U/ml
*
Estadiamento NA
Ia 2 (13.33%) 3 (50%) 0 (0%)
Ib 0 (0%) 0 (0%) 5 (45.45%)
Ic 3 (20%) 0 (0%) 2 (18.19%)
IIa 1 (6.66%) 0 (0%) 0 (0%)
IIb 0 (0%) 0 (0%) 1 (9.09%)
IIIa 0 (0%) 1 (16.66%) 0 (0%)
IIIc 8 (53.33%) 2 (33.33%) 2 (18.19%)
IV 1 (6.66%) 0 (0%) 0 (0%)
Tipo Histológico
Seroso 11 (73.33%) 3 (50%) 3 (37.5%) 2 (18.19%)
Mucinoso 0 (0%) 3 (50%) 1 (12.5%) 0 (0%)
Endometrióide 1 (6.66%) 0 (0%) 0 (0%) 6 (54.54%)
Misto 2 (13.33%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (9.09%)
Estromal (tecoma) NA NA 1 (12.5%) NA
Germinativo (TM) NA NA 3 (37.5%) NA
ND 1 (6.66%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (9.09%)
NA 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (9.09%)
 33

Grau Histológico
1 0 (0%) 1 (9.09%)
2 3 (20%) 5 (45.45%)
3 11 (73.33%) 4 (36.36%)
ND 1 (6.66%) 0 (0%)
NA 0 (0%) 6 (100%) 8 (100%) 1 (9.09%)
Cirurgia realizada
HTA do tipo I 8 (53.33%) 4 (66.66%) 6 (75%) 9 (81.81%)
HTA do tipo II 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 2 (18.19%)
SOB 13 (86.66%) 4 (66.66%) 6 (75%) 11 (100%)
SOU 2 (13.33%) 2 (33.33%) 2 (25%) 0 (0%)
Linfadenectomia pélvica 8 (53.33%) 4 (66.66%) 1 (12.5%) 8 (72.72%)
Linfadenectomia PA 4 (26.66%) 2 (33.33%) 0 (0%) 2 (18.19%)
Omentectomia/Biópsias 12 (80%) 6 (100%) 1 (12.5%) 1 (9.09%)
Apendicectomia 1 (6.66%) 2 (33.33%) 0 (0%) 0 (0%)
Outros 3 (20%) 1 (16.66%) 0 (0%) 0 (0%)
Presença de ascite 10 (66.7%) 0 (0%) 2 (25%) 0 (0%)
Tamanho do maior 3- 22 cm 7- 27 cm 5 - 21 cm NA
tumor ovariano média: média: média:
ressecado 12.13 cm 18.67 cm 13.14 cm
HTA: histerectomia total abdominal; SOB: salpingooforectomia bilateral; SOU:
salpingooforectomia unilateral; PA: para-aórtica; n: número; LNF: linfonodos; p: pacientes; NA:
não se aplica; ND: não definido. *: O estadiamento no grupo do tecido ovariano normal é
referente ao estadiamento do tumor primário da paciente.

7.2. Caracterização do perfil de expressão das isoformas de

OPN

Como primeiro passo para caracterização do perfil de expressão das

isoformas de OPN em amostras de tecidos ovarianos, avaliamos o perfil de
amplificação das três isoformas de osteopontina utilizando pares de
oligonucleotideos isoforma específicos e cDNA de amostras teciduais de CO
(Tabela 6). As reações de amplificação foram padronizadas pelo sistema de
PCR em tempo real (qRT-PCR). Primeiramente analisamos o perfil das curvas
de desnaturação dos produtos amplificados, visando verificar se haveriam
produtos únicos de amplificação (Figura 6). Verificamos pela curva de
 34

desnaturação, que haviam produtos únicos de amplificação, demonstrando

assim a especificidade de amplificação das diferentes isoformas de OPN a partir
dos oligonucleotídeos específicos para cada isoforma.
Estes produtos de amplificação também foram analisados em géis de
agarose, através dos quais confirmamos a amplificação de produtos específicos
e de tamanhos esperados para cada uma das isoformas (Figura 7). Em função
desta informação, poderíamos utilizar o PCR em tempo real para avaliar de
forma específica o nível de amplificação das diferentes isoformas de OPN em
amostras de tecidos ovarianos.

Figura 6: Curva de desnaturação dos produtos de amplificação das isoformas de OPN com
oligoncucleotídeos isoforma específicos a partir de amostras teciduais de CO. Azul: isoforma da
OPNc; verde: OPNa; vermelho: OPNb.

PM 1 2 3 4

Figura 7: Analise do perfil eletroforético de migração de produtos de amplificação por qRT-PCR

das 3 isoformas de OPN em gel de agarose 2%. São demonstrados os produtos de amplificação
das três isoformas da OPN (-a, -b, -c) utilizando pares de oligonucleotideos isoforma específicos
e também o produto de amplificação do gene GAPDH, utilizado como gene constitutivo
normalizador nestes ensaios. Os produtos de amplificação apresentam pesos moleculares 216pb
(OPNa), 282pb (OPNb), 149pb (OPNc) e 418pb (GAPDH). Padrão de peso molecular de 100pb.
PM: padrão de peso molecular, 1: OPNa, 2: OPNb, 3: OPNc, 4: GAPDH.
 35

7.3. Freqüência de expressão das diversas isoformas da OPN nos

diversos tecidos ovarianos

Visando caraterizar a freqüência de expressão das diferentes isoformas

de OPN nos diferentes grupos de amostras teciduais de ovário, realizamos
ensaios de qRT-PCR com oligonucleotídeos específicos para cada uma das
isoformas. Observamos que as isoformas a e b encontram-se expressas no CO,
nos tumores “borderline”, nos tumores benignos e nos tecidos ovarianos
normais. No entanto, a isoforma da OPNc apenas encontra-se expressa nos CO
e nos tumores “borderline”, apresentando ausência de expressão nos tumores
benignos e tecidos ovarianos normais (Figura 8).
Observamos que 8 de 15 amostras de CO (53.33%), 3 de 6 amostras de
tumores borderline (50%), 4 de 8 amostras de tumores benignos (50%) e 5 de
11 amostras de tecidos ovarianos normais (45.45%) apresentam positividade de
expressão para a OPNa. Além disso, nenhuma amostra tecidual apresentou
expressão isolada desta isoforma. Ao avaliaramos as freqüências de amostras
que expressam a isoforma OPNb, observamos que 12 de 15 (80%), 5 de 6
(83.3%), 4 de 8 (50%) e 6 de 11 (54.54%) apresentaram expressão desta
isoforma nestas mesmas amostras teciduais , respectivamente. A isoforma de
OPNc, cuja expressão somente foi identificada em amostras de tumores de CO
e “borderline”, encontra-se expressa, respectivamente em 3 de 15 (20%) e 3 de
6 (50%) destas amostras teciduais (Tabela 8 e Figura 8).

Tabela 8: Freqüência de expressão das diversas isoformas nos diversos tecidos

ovarianos.
Tecido OPNa OPNb OPNc
Carcinoma (n=15) 8 (53.33%) 12 (80%) 3 (20%)
Borderline (n=6) 3 (50%) 5 (83.3%) 3 (50%)
Benigno (n=8) 4 (50%) 4 (50%) 0
Normal (n=11) 5 (45.45%) 6 (54.54%) 0
Total: 40 20 (50%) 27 (67.5%) 6 (15%)
n: tamanho amostral de cada grupo tecidual estudado, %: percentagem da freqüência de
expressão de cada isoforma da osteopontina dentro de cada grupo tecidual.
 36

Negativo 7/15 3/15 12/15 3/6 1/6 3/6 4/8 4/8 8/8 6/11 5/11 11/11
(46.66% 20% 80%) (50% 16.66% 50%) (50% 50% 100%) (54.54% 45.45% 100%)

90
80
70
FREQUÊNCIA%

60
OPNa
50
OPNb
40
OPNc
30
20
10
0
Carcinoma "Borderline" Benigno Normal
TECIDOS

Figura 8: Freqüência de expressão das isoformas da osteopontina nos diversos tecidos do

ovário. O RNA foi analisado por qRT-PCR a partir de amostras teciduais conservadas em RNA
Later. O número total de amostras e o número de amostras com nível de expressão não
detectado de osteopontina estão indicados na parte superior do gráfico. As freqüências de
expressão das isoformas da osteopontina estão representadas em % no eixo da ordenada.
OPNa (barras azuis), OPNb (barras roxas), OPNc (barras amarelas).

7.4. Análise do nível de expressão de múltiplas isoformas da

osteopontina em diferentes tecidos ovarianos

A partir destes dados, fomos avaliar nas amostras teciduais do ovário que
expressaram a OPN, o nível de expressão de suas isoformas (Figura 9). O nível
de expressão relativo médio (NERM) das isoformas da OPNa, OPNb e OPNc
nos diversos tecidos estudados representam as médias do nível de expressão
relativo dessas isoformas, em cada grupo tecidual analisado (Tabela 9). Ao
avaliarmos o NERM da OPNb observamos que ele é maior no tecido do CO do
que no tecido “borderline” do ovário (p=0.0437). Todavia, para o NERM das
isoformas da OPNa e da OPNc nos quatro grupos teciduais estudados, não
observamos diferenças significantes entre eles (Figura 9).
 37

Tabela 9: Nível de expressão relativo médio das diversas isoformas da

osteopontina nos tecidos estudados.
Tecido ovariano OPNa OPNb OPNc
*
CO 1.12 1.14 3.38
Tumor “borderline” 0.57 0.42 98.46
Tumor benigno 15.19 9.94 0
Tecido normal 0.17 0.50 0
O nível de expressão relativo médio (NERM) representa as médias do nível de expressão
relativo de cada isoforma da OPN, nas amostras que expressaram a OPN, em cada grupo de
tecido ovariano estudado. O nível de expressão relativo das diferentes isoformas nos tecidos
estudados foi obtido utilizando a amostra do tumor “borderline” como referência (nomeado como
119 tumor direito). Logo, o valor do Δ Ct da OPNa, OPNb e OPNc desta amostra foram utilizados
para o cálculo do nível de expressão relativo das isoformas de todas as amostras desse estudo. *
O NERM da OPNb é significativamente maior no CO em relação ao NERM da OPNb no tecido
“borderline” do ovário (p=0.0437). A OPNc não foi expressa no tecido tumoral benigno e no
tecido normal do ovário.

Figura 9: Nível de expressão relativo das isoformas da osteopontina nos diversos tecidos do
ovário. O nível de expressão relativo das diferentes isoformas nos tecidos estudados foi obtido
utilizando uma amostra do tumor “borderline” como referência (nomeado como 119 tumor
direito). Logo, o valor do Δ Ct da OPNa, OPNb e OPNc desta amostra foram utilizados para o
cálculo do nível de expressão relativo das isoformas de todas as amostras desse estudo. Os
símbolos circulares de cor preta, triângulo de cor cinza, quadrado de cor marrom e o losângulo
de cor verde representam o nível de expressão de cada amostra tecidual do CO, tumor
“borderline”, tumor benigno e tecido ovariano normal, respectivamente. No eixo da ordenada
estão representados os níveis de expressão relativo das isoformas da OPNa, OPNb e OPNc
dentro de cada grupo tecidual. * O NERM da OPNb é significativamente maior no CO em relação
ao NERM da OPNb no tecido “borderline” do ovário (p=0.0437). Não foi observada expressão
detectável de OPNc no tecido tumoral benigno e no tecido normal do ovário.
 38

Em resumo, estes dados demonstram que as isoformas OPNa e OPNb

são expressas nos tecidos tumorais de CO, “borderline” e benignos, assim como
nos tecidos ovarianos normais. Em relação à OPNc, não foi detectada
expressão desta isoforma em nenhuma das amostras de tecidos tumorais
benignos e nos tecidos ovarianos normais analisados neste estudo, apenas em
amostras de tecidos tumorais de CO e “borderline”. Nossos dados mostram
também que a freqüência de expressão da OPNc foi maior nas amostras de
tumores “borderline” do ovário do que nos tecidos de CO. Contudo, apesar desta
diferença em relação à freqüência de amostras que expressam a OPNc, não
observamos diferenças significativas entre o nível de expressão dessa isoforma,
assim como da OPNa entre os diversos grupos analisados (p>0.05). Por outro
lado, a isoforma de “splicing” da OPNb apresenta um nível de expressão maior
no CO do que no tumor “borderline” (p= 0.0437).

7.5. Relação entre a expressão das diferentes isoformas de OPN em

uma mesma amostra tecidual

Com base nos dados acima apresentados, nos perguntamos se o nível de

expressão de cada uma das isoformas apresenta relação com o nível de
expressão das demais isoformas em uma mesma amostra tecidual ovariana
(Figura 10). Observamos que nas amostras de tecidos normais do ovário, o
NERM da OPNa é maior do que o NERM da OPNc (p=0.0432), contudo o NERM
da OPNb não mostrou ser diferente das demais isoformas. Além disso, nas
amostras teciduais de CO, tumores “borderline” e tumores benignos do ovário, o
nível de expressão de uma determinada isoforma de OPN, não tem relação com
as demais isoformas.
 39

a b

c d
**

Figura 10: Relação entre o nível de expressão relativo das isoformas de OPNa, OPNb e OPNc
em uma mesma amostra de diferentes tipos teciduais de ovário. a. amostras de CO. 3 destas
amostras não expressaram nenhuma das isoformas de OPNs, 4 delas expressaram somente a
OPNb; b. amostras de tumor “borderline” do ovário. 1 destas amostras não expressou nenhuma
das isoformas; c. amostras de tumor benigno do ovário. 4 amostras não expressaram nenhuma
das isoformas da OPN; d. amostras de tecido ovariano normal. Dentre elas, 5 não amplificaram
nenhuma das isoformas, uma expressou somente a OPNb; Quadrados de cor rosa: nível de
expressão relativo da isoforma da OPNa na amostra analisada; triângulos de cor roxa: nível de
expressão relativo da OPNb na amostra analisada; triângulos de cor azul: nível de expressão
relativo da isoforma da OPNc na amostra analisada; linhas de cor rosa: conecta o nível de
expressão relativo da isoforma da OPNa ao da OPNb em uma mesma amostra tecidual; linha de
cor roxa: conecta o nível de expressão relativo da isoforma da OPNb ao da OPNc em uma
mesma amostra tecidual. *: amostra 119 TD (tumor direito), utilizada como referência para o
cálculo de nível de expressão relativo. Logo, o valor do Δ Ct da OPNa, OPNb e OPNc desta
amostra foram utilizados para o cálculo do nível de expressão das isoformas de todas as
amostras desse estudo. **: Significância estatística do NERM entre a OPNa e OPNc nas
amostras teciduais de ovários normais (p=0.0432).

7.6. Correlação do nível de expressão das isoformas de OPN com

diferentes parâmetros clínico-patológicos de pacientes com tumores
ovarianos

Fomos então investigar as correlações entre a expressão das diferentes

isoformas da OPN com os diversos parâmetros clínico-patológicos de pacientes
 40

com tumores ovarianos. Os parâmetros avaliados foram o estadiamento do

tumor, o tipo de tumor segundo a classificação proposta por Kurman et al (2008),
o grau histológico tumoral, o nível sérico do CA125 e a presença de ascite na
cirurgia.
Nas amostras teciduais de CO, na série de pacientes analisadas, os
NERM das três isoformas de OPN não apresentaram diferenças
estatísticamente significantes entre o estadiamento avançado (III e IV) daqueles
estadiamentos mais iniciais (I e II). Para os tumores “borderline”, esta análise foi
realizada entre o EI e o E III já que nenhum paciente foi estadiado como II ou IV.
Para esses tumores, também não observamos diferenças significativas entre o
NERM das OPNs nesses estadiamentos (Figura 11 e Tabela 1 do anexo).

a b

Figura 11: Relação entre o nível de expressão relativo das isoformas da OPNa, OPNb e OPNc
nos tecidos de CO e “borderline” e o estadiamento tumoral. Os símbolos circulares de cor preta,
o triângulo de cor cinza e o quadrado de cor marrom representam o nível de expressão da
OPNa, OPNb e OPNc de cada amostra tecidual, respectivamente. a: amostras teciduais de CO.
Em seis destas amostras, os pacientes têm estadiamento I e II e em nove casos o estádio é III e
IV. b: amostras teciduais de tumor “borderline” do ovário. Em três destas amostras, os pacientes
têm estadiamento I e em três casos o estádio é III. E: estadiamento. A amostra 119 TD (tumor
direito) foi referência para o cálculo do nível de expressão relativo. Logo, o valor do Δ Ct da
OPNa, OPNb e OPNc desta amostra foram utilizados para o cálculo do nível de expressão das
isoformas de todas as amostras desse estudo.

Uma vez que atualmente propõe-se que os carcinomas ovarianos sejam

classificados em tipo I (aqueles que apresentam crescimento lento, geralmente
confinado aos ovários e que se desenvolvem a partir de lesões precursoras) e
Tipo II (aqueles que apresentam crescimento rápido, raramente confinado aos
 41

ovários e para as quais não foram descritas lesões precursoras) (Kurman et al.,
2008), fomos investigar a relação entre o NERM destas isoformas e os dois tipos
de tumores, nesta série de amostras. Observamos que os grupos de tumores do
tipo I e tipo II analisados neste estudo não apresentam NERM distintos (Figura
12 e Tabela 1 do anexo).

Figura 12: Relação entre o nível de expressão relativo das isoformas de OPNa, OPNb e OPNc
entre tumores do Tipo I e Tipo II. Os símbolos circulares de cor preta representam o nível de
expressão relativo das isoformas nos tumores do tipo I. Os símbolos do tipo triângulo de cor
cinza representam o nível de expressão relativo das isoformas nos tumores do tipo II. Quatro
amostras não foram classificadas (2 tumores mistos G3, 1 tumor G3 com tipo histológico não
definido e 1 tumor seroso com grau histológico não definido). A amostra 119 TD (tumor direito)
foi utilizada como normalizador. Logo, o valor do Δ Ct da OPNa, OPNb e OPNc desta amostra
foram utilizados para o cálculo do nível de expressão das isoformas de todas as amostras desse
estudo.

Em relação ao grau histológico, o nível de expressão da OPNa, OPNb e

OPNc não mostraram-se significativamente diferentes entre os CO
moderadamente diferenciados (G2), daqueles pouco diferenciados (G3) (p>
0,05) (Figura 13 e Tabela 1 do anexo).
 42

Figura 13: Relação entre o nível de expressão das isoformas da osteopontina e o grau
histológico nos CO. Os símbolos circulares, triângulos e quadrados representam o nível de
expressão relativo da OPNa, OPNb e OPNc, respectivamente. G2: tumores moderadamente
diferenciados (n=3), G3: tumores pouco diferenciados (n=11), em 1 caso o grau histológico não
foi definido. A amostra 119 TD (tumor direito) foi utilizada como normalizador. Logo, o valor do Δ
Ct da OPNa, OPNb e OPNc desta amostra foram utilizados para o cálculo do nível de expressão
das isoformas de todas as amostras desse estudo.

7.7. Relação entre o nível de expressão das OPNs e os valores do

CA-125 e achados cirúrgicos

Os dados até então apresentados sugerem que o NERM das três

isoformas de OPN não apresenta correlação com a progressão tumoral, com o
tipo e o grau histológico do tumor. Perguntamos-nos então se o NERM da OPN
estaria relacionado com os níveis circulantes do CA125, o marcador tumoral
usado atualmente como rotina na abordagem clínica. Para fazer esta análise,
comparamos o NERM das isoformas de OPN no CO e no tumor “borderline”
agrupados, com os níveis séricos do CA-125 dos pacientes portadores destes
tumores, tendo como nível de corte para este marcador o valor de 35 U/ml.
Nesta análise, não observamos diferenças significativas entre o nível de
expressão da OPNa, OPNb e OPNc e os níveis séricos de CA-125 (p>0.05)
(Figura 14).
 43

Figura 14: Relação entre o nível de expressão das isoformas da osteopontina e o nível sérico do
CA-125 nos carcinomas e nos tumores “borderline” agrupados. Os símbolos circulares de cor
preta, tipo triângulo de cor cinza e tipo quadrado de cor marrom representam o nível de
expressão relativo da OPNa, OPNb e OPNc, respectivamente. Dezenove amostras
apresentaram o nível sérico do CA-125 maior do que 35 U/ml e em duas amostras, ele foi menor
do que 35 U/ml. A amostra 119 TD (tumor direito) foi utilizada como normalizador. Logo, o valor
do Δ Ct da OPNa, OPNb e OPNc desta amostra foram utilizados para o cálculo do nível de
expressão das isoformas de todas as amostras desse estudo.

Analisamos então a relação entre o NERM das diversas isoformas da

OPN e a presença ou não de ascite encontrado no ato operatório. Para isso,
analisamos todas as pacientes com CO. Observamos que o NERM das
diferentes isoformas da OPN não se relaciona de maneira estatisticamente
significante com a presença ou não de ascite (p>0,05) (Figura 15).
 44

Figura 15: Relação entre o nível de expressão das 3 isoformas da OPN no CO e a presença ou
não de ascite. Verde: ausência de ascite, vermelho: presença de ascite. A amostra 119 TD
(tumor direito) foi utilizada como normalizador. Logo, o valor do Δ Ct da OPNa, OPNb e OPNc
desta amostra foram utilizados para o cálculo do nível de expressão das isoformas de todas as
amostras desse estudo.

Averiguamos então a relação entre o NERM das diversas isoformas da

OPN e o tamanho do maior tumor ovariano ressecado, o qual foi mensurado e
descrito na macroscopia do laudo histopatológico . Para isso, analisamos todas
as pacientes com CO e as amostras foram agrupadas em pacientes nas quais o
volume do maior tumor ovariano foi > 10 cm ou ≤ 10 cm na sua maior extensão.
Observamos que o NERM das diferentes isoformas da OPN não se relaciona de
maneira estatisticamente significante com o volume do tumor do ovário
ressecado (p>0,05) (Figura 16).
 45

Figura 16: Relação entre o nível de expressão das 3 isoformas da OPN no CO e o tamanho do
maior tumor ovariano ressecado. Verde: tumor ressecado > 10cm, vermelho: tumor ressecado ≤
10 cm. A amostra 119 TD (tumor direito) foi utilizada como normalizador. Logo, o valor do Δ Ct
da OPNa, OPNb e OPNc desta amostra foram utilizados para o cálculo do nível de expressão
das isoformas de todas as amostras desse estudo.

Em resumo, não foram observadas evidências estatísticas de que haja

diferença entre os níveis médios de expressão de osteopontina a, b e c entre os
dados clinico-patológicos analisados.
 46

8. Discussão

O CO é um tumor raro, contudo em função das limitações dos

marcadores atualmente disponíveis para o seu diagnóstico, 2/3 dos diagnósticos
de CO são feitos no estadiamento avançado da doença. Além disso, 75%
desses tumores caracterizam-se por uma alta agressividade e letalidade o que
leva a necessidade de desenvolvimento de novas terapias para este tumor tão
agressivo. O fato de que uma grande série de alterações genéticas está
associada com a progressão desta neoplasia, descrever os mecanismos
moleculares relacionados à progressão deste carcinoma podem auxiliar no
desenvolvimento de novos biomarcadores (Kurman & Shih, 2008). Dentre estas
modificações genéticas, inclui-se o “splicing” alternativo, o qual tem sido
demonstrado como um importante mecanismo molecular relacionado à
tumorigênese e progressão tumoral. Além disso, recentes estudos têm
demonstrado que a expressão de isoformas de “splicing” parecem ser câncer e
tecido específicos (Ghigna et al., 2008).
Apesar de uma série de dados a respeito do papel da proteína OPN estar
disponível na literatura e mostrar a importância desta proteína na progressão do
tumor de ovário, nenhum trabalho até o presente momento caracterizou o perfil
de expressão de isoformas de “splicing” desta proteína no tumor do ovário
(Grisaru et al., 2007; Brakora et al., 2004; Kim et al., 2002). Desta forma, este
trabalho constitui a primeira descrição do perfil de expressão destas isoformas
no tecido ovariano. No presente estudo, avaliamos o perfil de expressão de
mRNA de três isoformas da osteopontina (OPNa, OPNb e OPNc) em amostras
de tecido ovariano normal, de tumores benignos, “borderline” e carcinoma de
ovário. Além disso, correlacionamos o perfil de expressão destas isoformas com
os dados clínicos e patológicos das pacientes incluídas no estudo.
Observamos que as isoformas OPNa e a OPNb mostraram-se expressas
no tumor do ovário do tipo carcinoma, “borderline” e benigno, bem como no
tecido ovariano normal. A OPNa mostrou-se expressa em aproximadamente
50% das amostras analisadas e não houve diferença significante do seu nível de
 47

expressão entre os diversos grupos teciduais. Por outro lado, a OPNb mostrou-
se expressa em até 83.3% dos casos e o seu nível de expressão apresenta-se
mais elevado no CO do que no tecido tumoral “borderline”. Entretanto, não
detectamos expressão da OPNc no tecido ovariano normal, tampouco no tecido
ovariano tumoral benigno. Logo, nesta série de amostras analisadas, a OPNc
apenas mostrou-se expressa no CO e no tecido tumoral do tipo “borderline”.
Nestas amostras, a freqüência de expressão da OPNc foi de 20% e 50%,
respectivamente, não havendo diferença significativa no nível de expressão
desta isoforma entre estes dois grupos de amostras teciduais analisados. Estes
dados demonstram que a expressão da OPNc é específica para células tumorais
malignas. Nossos achados confirmam os estudos prévios no tecido mamário,
onde a OPNc mostrou-se expressa no carcinoma de mama e no tecido mamário
adjacente ao tumor e ausente no tecido mamário normal. Neste referido estudo,
as isoformas OPNa e OPNb mostraram-se expressas nas três amostras de
tecido mamário estudadas. Contudo, a freqüência de expressão dessas
isoformas no tecido mamário, variou de 80 a 100%, exceto para o tecido normal
adjacente, o qual expressou OPNc em apenas 36% das amostras estudadas.
Além disso, assim como no tecido ovariano, conforme observado no presente
trabalho, na mama o nível de expressão da OPNa foi semelhante entre os
diversos grupos. Porém, a OPNb e OPNc apresentaram níveis de expressão
maiores no carcinoma do que no tecido mamário normal (Mirza et al., 2008).
Baseando-nos na observação de que a OPNc apresenta uma expressão tumor-
específica, nosso grupo de pesquisa recentemente investigou o papel funcional
destas diferentes isoformas na tumorigênese e progressão do tumor de ovário
(dissertação de mestrado de Tatiana Tilli, concluída em fevereiro de 2009),
utilizando como modelo a linhagem tumoral de ovário OvCar-3. Nosso dados
mostraram que os clones de OvCar-3 que super expressam a OPNc apresentam
um aumento na proliferação e migração celulares, no crescimento celular
independente de ancoragem e na formação de tumores em camundongos
atímicos, em comparação com as células que super-expressam a OPNa, OPNb,
vetor vazio e OvCar-3 não transfectada. De maneira semelhante ao observado
 48

nesse trabalho, linhagens celulares de câncer de mama (MCF-7) transfectadas

com OPNc formaram colônias de maior tamanho quando comparadas com
aquelas transfectadas com as demais isoformas, apesar de não aumentar o
potencial proliferativo destas células (He et al., 2006). Em contraste, no
mesotelioma peritoneal maligno, a OPNa e OPNb mostraram-se super-
expressas no tumor em relação ao tecido normal em 74.19% dos tecidos
avaliados e promoveram a proliferação, migração e invasão celular. Entretanto,
a OPNc não apresentou-se super-expressa neste tecido, bem como não
demonstrou efeitos pró-tumorigênicos no mesotelioma (Ivanov et al., 2009). Da
mesma forma, em linhagens celulares de câncer de pulmão, a super-expressão
da OPNa estimula a secreção do VEGF, o qual promove o aumento da migração
celular e da invasividade. Entretanto, a super-expressão da OPNc diminui
significativamente a secreção do VEGF (Blasberg et al., 2009). Em
adenocarcinomas pancreáticos, a OPNc mostrou-se expressa em 87% das
amostras sendo que, 73% eram fumantes. No entanto, nas lesões precursoras
do pâncreas, não houve expressão dessa isoforma nos fumantes (Sullivan et al.,
2009). Desta forma, podemos observar que diferentes tecidos comportam-se de
maneira distinta em relação ao papel funcional das isoformas de “splicing” da
osteopontina.
Especificamente nas amostras de tecido ovariano normal, o nível de
expressão da OPNa é maior que o da OPNc. Além disso, a OPNa é expressa
em todos os grupos teciduais com uma freqüência e nível de expressão
semelhante entre eles. Em conjunto estes dados nos sugerem que a isoforma
completa da osteopontina (OPNa), não se relaciona com o fenótipo tumoral no
tecido ovariano. Observamos também que nos tecidos ovarianos analisados não
houve expressão isolada da OPNa. Logo, podemos especular que nas amostras
que expressam osteopontina, sempre ocorre “splicing” alternativo deste gene.
Nessa série de amostras analisadas, em um mesmo tecido ovariano, o
nível de expressão da OPNb, não difere dos níveis de expressão das demais
isoformas. Além da expressão desta isoforma no tecido ovariano normal, a
OPNb também está expressa no CO do tipo I e do tipo II, nos tumores
 49

“borderline” bem como nos tumores benignos do ovário. Estes dados sugerem
que esta isoforma possa estar envolvida na carcinogênese dos carcinomas
ovarianos em cuja origem as lesões precursoras do ovário estão presentes ou
ausentes. Além disso, nessa série de amostras, o nível de expressão da OPNb é
maior no CO do que no tumor “borderline” logo, sua aplicação no auxilio do
diagnóstico diferencial dessas neoplasias, deve ser melhor explorado. Todavia,
a via através da qual essa isoforma está envolvida nos processos de
tumorigênese requer esclarecimentos, uma vez que no carcinoma pulmonar, a
sua super-expressão aumenta a extensão dos túbulos endoteliais sem
alterações associadas ao VEGF (Blasberg et al., 2009).
De acordo com os dados observados no presente trabalho, a OPNc é um
marcador de malignidade ovariana melhor do que a OPNb, já que sua expressão
está ausente no tecido ovariano normal e no tumoral benigno. Além disso, a
freqüência de expressão da OPNc é maior no tecido “borderline” do que no CO.
Nesta série, a maioria dos casos de CO é do tipo II os quais, não tem relação
com lesões precursoras. Logo, estes dados nos sugere que a OPNc pode se
tratar de uma isoforma de “splicing” mais envolvida com as lesões precursoras
do ovário do tipo “borderline” do que com o carcinoma invasor de alto grau.
Dados semelhantes foram demonstrados através de imunohistoquímica por
Tiniakos el al (1998), cujos dados mostraram que 80% dos tumores “borderline”
apresentaram forte marcação para OPN, em contraste com o CO, onde 93% de
amostras deste tipo tecidual apresentaram marcação fraca ou ausente para
OPN.
Demonstramos no presente trabalho que amostras teciduais de CO e de
tumores “borderline” ovarianos expressam as três isoformas da osteopontina. Da
mesma forma, Mirza et al. (2008) demonstraram que a linhagem celular
metastática do câncer de mama (MDA-MB-435), também expressam as três
isoformas da osteopontina. Apesar de termos observado expressão específica
da OPNc nos tumores malignos e naqueles com baixo potencial de malignidade,
deve-se ressaltar que uma vez que observamos que esta isoforma não é
expressa em todas essas amostras, sua utilização como marcador no
 50

diagnóstico ficaria limitada. Neste caso, seria necessária a utilização de

múltiplos biomarcadores para aumentar a sua sensibilidade na detecção de
carcinomas e tumores “borderline” do ovário. Associados com os dados
previamente publicados a respeito do papel funcional das isoformas da OPN em
diferentes modelos tumorais, nossos dados sugerem que a deleção do exon 4
resulta em um transcrito (OPNc) que no tecido ovariano, assim como no tecido
mamário e pancreático, se relaciona com o fenótipo tumoral. Isto justifica
estudos futuros sobre o papel destes 27 aminoácidos (exon 4) traduzido em
domínio distal do fragmento amino-terminal, e para o qual até o presente
momento não foi descrito seu papel específico na atividade e função desta
proteína.
Embora os resultados de nosso grupo de pesquisa referentes aos estudos
funcionais in vitro (Tilli et al., submetido, 2009) sugiram que a super-expressão
da OPNc esteja relacionada com a progressão tumoral, ao analisarmos a
expressão desta isoforma em tumores ovarianos, não observou-se correlações
com diferentes parâmetros relacionados a progressão. Assim como já verificado
por Tiniakos et al (1998) e Brakora et al (2004), não encontramos diferença
estatisticamente significante entre o nível de expressão da OPN e alguns
parâmetros como o tipo e grau histológico e o estadiamento tumoral. Todavia,
esses autores diferentemente dos resultados aqui apresentados, encontraram
uma correlação significante com a presença de ascite. Isto pode ser devido ao
pequeno tamanho amostral utilizado no presente estudo ou ainda que a OPNc
esteja primariamente envolvida nas etapas inicias da progressão tumoral.
O único caso de carcinoma endometrióide do ovário dessa série
analisada não expressou nenhuma das três isoformas. Da mesma forma, Brown
et al (1994) examinou uma amostra de carcinoma ovariano endometrióide e uma
amostra de carcinoma indiferenciado do ovário e a expressão da OPN mostrou-
se ausente nestes casos, embora nesta publicação o foco tenha sido apenas a
osteopontina completa (OPNa). Outros autores observaram que o nível sérico da
OPN não apresentou diferença entre pacientes portadores de diversos tipos
 51

histológicos do carcinoma do ovário (seroso, mucinoso, células claras e

endometrióide) (Kim et al., 2002).
Nessa série de amostras, analisamos amostras de CO do tipo I e tipo II e
comparamos o nível de expressão das diversas isoformas da OPN entre estes
dois grupos de amostras, observando não haver diferenças significativas entre
estes dois grupos. No entanto, vale ressaltar que o pequeno número amostral
restringe essas análises. Acrescido ao pequeno tamanho amostral, os tecidos
analisados não foram microdissecados o que possibilita que naqueles tumores
onde co-existem lesões precursoras e invasoras, a área examinada através do
qRT-PCR não necessariamente corresponda à classificação histológica tumoral.
Os estudo funcionais destas diferentes isoformas da OPN foram
realizados com a linhagem celular de tumor OvCar-3. De modo a melhor
compreender o papel destas isoformas, especialmente da OPNc nos tumores do
tipo “borderline”, estudos adicionais deveriam ser realizados em linhagens
celulares derivadas deste tipo tumoral, visando uma melhor definição do
comportamento biológico desses tumores. Além disto, analises com a OvCar-3
co-transfectadas com as diversas isoformas da OPN devem elucidar com maior
fidelidade o papel funcional das isoformas in vivo já que as isoformas da OPNa e
OPNc não foram encontradas isoladamente em nenhum tecido ovariano
humano.
Em conclusão, os dados do presente trabalho demonstram que o tecido
ovariano, seja ele tumoral ou não, apresenta “splicing” alternativo da OPN. O
perfil de expressão destas isoformas mostra que as isoformas OPNa e OPNb
apresentam-se expressas em tecidos ovarianos normais e tumorais do tipo
benigno, “borderline” e carcinoma. A expressão da isoforma completa da OPN
(OPNa) no tecido ovariano, não parece se relacionar com a tumorigênese do
ovário. Todavia, o nível de expressão da OPNb é maior no CO do que nos
tumores “borderline” do ovário. Por outro lado, a OPNc somente mostrou-se
expressa em amostras de tumores “borderline” e do tipo carcinoma,
demonstrando sua expressão tumor específica. Além disso, a OPNc pode ser
um biomarcador interessante para auxiliar na distinção amostras ovarianas de
 52

tumores benignos e malignos. Os dados funcionais previamente descritos pelo

nosso grupo em relação ao papel da OPNc no CO, sugerem ser a OPNc um
biomarcador importante na tumorigênese e progressão do carcinoma de ovário.
Entretanto, nesta série de amostras de tecido ovariano analisadas não
encontramos correlação entre as diversas isoformas da osteopontina e os dados
clínico-patológicos avaliados.
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10. Anexo

Tabela 1: Relação entre o nível de expressão relativo médio das

OPNs e os diversos dados clínicos- patológicos.
OPNa (p-valor) OPNb (p-valor) OPNc (p-valor)
CO (E I/II x III/ IV) 0.318 0.554 0.590
Tumor “borderline” (E I x III) 0.364 0.766 0.432
CO tipo I x CO tipo II 0.587 0.530 0.399
Grau histológico (G2 x G3) 0.786 0.475 0.331
CO e “borderline” CA-125 0.257 0.155 0.570
<35 x CO e “borderline”
com CA-125 >35
Presença ou ausência de DR 0.425 0.811 0.449
DR ≤ 1 cm ou >1cm 0.211 0.741 0.226
Presença ou ausência de 0.323 0.489 0.749
ascite no CO
Tamanho do maior tumor 0.259 0.873 0.476
ovariano ressecado no CO
CO: carcinoma do ovário, E: estadiamento, DR: doença residual
 70

11. Apêndice 1

CANCER RESEARCH CAN-09-4356 -- Receipt of New Manuscript

De:
lauren.barnett@aacr.org
Enviada:terça-feira, 1 de dezembro de 2009 16:17:48
Para: egimba@inca.gov.br
Cc: etelgimba@hotmail.com
Dear Dr. Gimba,

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CAN-09-4356

MANUSCRIPT TITLE
The Splicing Isoform Osteopontin-c Contributes to Ovarian Cancer Progression

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Thank you for submitting your work to CANCER RESEARCH.

Sincerely,
CANCER RESEARCH
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Apêndice 2: Termo de consentimento livre e esclarecido