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Jornal Oficial da Unio Europeia REGULAMENTO (UE) N.o 278/2012 DA COMISSO de 28 de maro de 2012

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que altera o Regulamento (CE) n. 152/2009 no que respeita determinao dos teores de dioxinas e de bifenilos policlorados
(Texto relevante para efeitos do EEE) A COMISSO EUROPEIA,

Tendo em conta o Tratado sobre o Funcionamento da Unio Europeia, Tendo em conta o Regulamento (CE) n.o 882/2004 do Parla mento Europeu e do Conselho, de 29 de abril de 2004, relativo aos controlos oficiais realizados para assegurar a verificao do cumprimento da legislao relativa aos alimentos para animais e aos gneros alimentcios e das normas relativas sade e ao bem-estar dos animais (1), nomeadamente o artigo 11.o, n.o 4, Considerando o seguinte:
(1)

tes mximos inferior a 5 %, bem como requisitos rigo rosos para os mtodos de anlise de confirmao. Alm disso, os mtodos de confirmao permitem a determi nao de teores tambm na gama baixa dos nveis de contaminao de base. Este aspeto importante para acompanhar as tendncias temporais, a avaliao da ex posio e para reavaliar os limites mximos e os limiares de interveno.
(4)

A Diretiva 2002/32/CE do Parlamento Europeu e do Conselho, de 7 de maio de 2002, relativa s substncias indesejveis nos alimentos para animais (2) estabelece li mites mximos para a presena de dioxinas, furanos e bifenilos policlorados (PCB) em alimentos para animais, bem como limiares de interveno que induzem os Es tados-Membros a proceder a anlises a fim de identificar a origem dessas substncias. O Regulamento (CE) n.o 152/2009 da Comisso, de 27 de janeiro de 2009, que estabelece os mtodos de amostragem e anlise para o controlo oficial dos alimen tos para animais (3) inclui mtodos para a determinao dos teores de dibenzo-p-dioxinas policloradas (PCDD), dibenzofuranos policlorados (PCDF) e de bifenilos poli clorados (PCB) sob a forma de dioxina em alimentos para animais. Pode utilizar-se um mtodo de anlise de pr-seleo com validao amplamente aceitvel e com rendimento elevado para identificar as amostras com teores significa tivos de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina (de preferncia, selecionando amostras que excedam os limia res de interveno e garantam a seleo de amostras que excedam os limites mximos). Os teores de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina nestas amostras tm de ser determinados por um mtodo de anlise de confirmao. Por conseguinte, conveniente estabelecer requisitos ade quados para o mtodo de pr-seleo que garanta que a taxa de falsos resultados conformes relativamente a limi

A alterao dos limites mximos de dioxinas e de PCB sob a forma de dioxina e o estabelecimento de PCB no semelhantes a dioxinas na Diretiva 2002/32/CE, bem como a necessidade de atualizar os critrios dos mtodos de pr-seleo obrigam a modificar as regras aplicveis determinao de dioxinas e PCB nos alimentos para ani mais, tal como previsto no anexo V, parte B, do Regu lamento (CE) n.o 152/2009. Por questes de clareza e inteligibilidade, convm substituir a parte B do anexo V. da maior importncia que os resultados analticos se jam comunicados e interpretados de maneira uniforme, a fim de assegurar uma abordagem harmonizada de execu o em toda a Unio. O anexo V do Regulamento (CE) n.o 152/2009 deve, portanto, ser alterado em conformidade. As medidas previstas no presente regulamento esto em conformidade com o parecer do Comit Permanente da Cadeia Alimentar e da Sade Animal e nem o Parlamento Europeu nem o Conselho se lhes opuseram, Artigo 1.o

(5)

(2)

(6) (7)

(3)

ADOTOU O PRESENTE REGULAMENTO:

No anexo V do Regulamento (CE) n.o 152/2009, a parte B alterada em conformidade com o anexo do presente regulamen to. Artigo 2.o O presente regulamento entra em vigor no vigsimo dia se guinte ao da sua publicao no Jornal Oficial da Unio Europeia. aplicvel a partir da data de entrada em vigor.

O presente regulamento obrigatrio em todos os seus elementos e diretamente aplicvel em todos os Estados-Membros. Feito em Bruxelas, em 28 de maro de 2012. Pela Comisso O Presidente
Jos Manuel BARROSO

(1) JO L 165 de 30.4.2004, p. 1. (2) JO L 140 de 30.5.2002, p. 10. (3) JO L 54 de 26.2.2009, p. 1.

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ANEXO No anexo V do Regulamento (CE) n.o 152/2009, a parte B, DETERMINAO DOS NVEIS DE DIOXINAS (PCDD/PCDF) E DE PCB SOB A FORMA DE DIOXINA PARA EFEITOS DE CONTROLO OFICIAL, passa a ter a seguinte redao: B. DETERMINAO DOS TEORES DE DIOXINAS (PCDD/PCDF) E DE PCB CAPTULO I Mtodos de amostragem e interpretao de resultados analticos 1. Objecto e mbito de aplicao As amostras destinadas ao controlo oficial dos teores de dibenzo-p-dioxinas policloradas (PCDD), dibenzofuranos policlorados (PCDF), bifenilos policlorados (PCB) sob a forma de dioxina (*) e de PCB no semelhantes a dioxinas nos alimentos para animais devem ser colhidas em conformidade com os mtodos descritos no anexo I. Devem aplicar-se as exigncias quantitativas respeitantes ao controlo de substncias ou produtos repartidos uniforme mente nos alimentos, tal como se prev no ponto 5.A do anexo I. As amostras globais assim obtidas so consideradas representativas dos lotes ou sublotes dos quais foram colhidas. A observncia dos limites mximos estabelecidos na Diretiva 2002/32/CE deve ser estabelecida em funo dos teores determinados nas amostras de laboratrio.

___________
(*) Quadro dos FET (fatores de equivalncia txica) para dioxinas, furanos e PCB sob a forma de dioxina: FET-OMS para avaliao dos riscos para o ser humano com base nas concluses da reunio de peritos do Programa Internacional de Segurana Qumica (IPCS) da OMS realizada em Genebra, em junho de 2005 [Martin van den Berg et al., The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds (Reavaliao de 2005 pela OMS dos fatores de equivalncia txica [FET] em humanos e mamferos respeitantes s dioxinas e aos compostos sob a forma de dioxina). Toxicological Sciences (Cincias toxicolgicas) 93(2), p. 223-241 (2006)].
Congnere Valor do FET Congnere Valor do FET

Dibenzo-p-dioxinas (PCDD) dibenzo-p-furanos (PCDF) 2,3,7,8-TCDD 1,2,3,7,8-PeCDD 1,2,3,4,7,8-HxCDD 1,2,3,6,7,8-HxCDD 1,2,3,7,8,9-HxCDD 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD OCDD 2,3,7,8-TCDF 1,2,3,7,8-PeCDF 2,3,4,7,8-PeCDF 1,2,3,4,7,8-HxCDF 1,2,3,6,7,8-HxCDF 1,2,3,7,8,9-HxCDF 2,3,4,6,7,8-HxCDF 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF OCDF

e 1 1 0,1 0,1 0,1 0,01 0,0003

PCB sob a forma de dioxina: PCB no-orto + PCB mono-orto PCB no-orto PCB 77 PCB 81 PCB 126 PCB 169 PCB mono-orto 0,1 0,03 0,3 0,1 0,1 0,1 0,1 0,01 0,01 0,0003 PCB 105 PCB 114 PCB 118 PCB 123 PCB 156 PCB 157 PCB 167 PCB 189 0,00003 0,00003 0,00003 0,00003 0,00003 0,00003 0,00003 0,00003 0,0001 0,0003 0,1 0,03

Abreviaturas utilizadas: T = tetra; Pe = penta; Hx = hexa; Hp = hepta; O = octo; CDD = clorodibenzodioxina; CDF = clorodibenzofurano; CB = clorobifenilo.

Para efeitos da presente parte do anexo V, so aplicveis as definies estabelecidas no anexo I da Deciso 2002/657/CE da Comisso, de 14 de agosto de 2002, que d execuo ao disposto na Diretiva 96/23/CE do Conselho relativamente ao desempenho de mtodos analticos e interpretao de resultados (**).

___________
(**) JO L 221 de 17.8.2002, p. 8.

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2. 2.1.

Conformidade do lote ou do sublote com a especificao No que se refere a PCB no semelhantes a dioxinas O lote est conforme com a especificao se o resultado analtico no for superior ao limite mximo de PCB no semelhantes a dioxinas estabelecido na Diretiva 2002/32/CE, tomando em considerao a incerteza da medio. O lote no est conforme com a especificao se o resultado analtico superior (***), confirmado por anlise em duplicado (****), for superior ao limite mximo estabelecido na Diretiva 2002/32/CE, tomando em considerao a incerteza da medio. A incerteza da medio deve ser tida em considerao de acordo com uma das seguintes abordagens: calculando a incerteza expandida, utilizando um fator de expanso de 2, que permite obter um nvel de confiana de cerca de 95 %. Um lote ou sublote no est conforme se o valor medido menos U for superior ao limite mximo, estabelecendo o limite de deciso (CC) em conformidade com o ponto 3.1.2.5 do anexo I da Deciso 2002/657/CE. Um lote ou sublote no est conforme se o valor medido for igual ou superior ao CC. Estas regras de interpretao so aplicveis ao resultado analtico obtido na amostra para controlo oficial. No caso de anlises para efeitos de direito de recurso ou de procedimentos de arbitragem, so aplicveis as normas nacionais.

___________
(***) O conceito de limite superior preconiza que o contributo de cada congnere no quantificado seja igual ao limite de quantificao. O conceito de limite inferior preconiza que o contributo de cada congnere no quantificado seja igual a zero. O conceito de limite mdio preconiza que o contributo de cada congnere no quantificado seja igual a metade do limite de quantificao. (****) A anlise em duplicado necessria para se excluir a possibilidade de contaminao cruzada interna ou de uma troca acidental de amostras. A primeira anlise, que tem em conta a incerteza da medio, utilizada para verificar a conformidade. No caso de a anlise ser realizada no contexto de um incidente de contaminao, a confirmao atravs de uma anlise em duplicado poder ser omitida, se as amostras selecionadas para anlise estiverem associadas, atravs da rastreabilidade, a esse incidente de contaminao. 2.2. No que se refere a PCDD/F e a PCB sob a forma de dioxina O lote est conforme com as especificaes se o resultado analtico de uma nica anlise, realizada por um mtodo de pr-seleo com uma taxa de falsos resultados conformes inferior a 5 %, indicar que o teor no excede o respetivo limite mximo de PCDD/F nem da soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina fixado na Diretiva 2002/32/CE, realizada por um mtodo de confirmao, no excede o respetivo limite mximo de PCDD/F nem da soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina fixado na Diretiva 2002/32/CE, tendo em conta a incerteza da medio. Em relao aos ensaios de pr-seleo, deve ser estabelecido um valor-limite para decidir da conformidade da amostra com os respetivos teores requeridos fixados quer para PCDD/F, quer para a soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina. O lote no est conforme com a especificao se o resultado analtico superior (*****), obtido por um mtodo de confirmao e confirmado por anlise em duplicado, for superior ao limite mximo estabelecido na Diretiva 2002/32/CE, tomando em considerao a incerteza da medio (******). A incerteza da medio deve ser tida em considerao de acordo com uma das seguintes abordagens: calculando a incerteza expandida, utilizando um fator de expanso de 2, que permite obter um nvel de confiana de cerca de 95 %. Um lote ou sublote no est conforme se o valor medido menos U for superior ao limite mximo. No caso de uma determinao em separado dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina, a soma da incerteza expandida estimada dos resultados analticos separados dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina deve ser utilizada para a soma dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina, estabelecendo o limite de deciso (CC) em conformidade com o ponto 3.1.2.5 do anexo I da Deciso 2002/657/CE. Um lote ou sublote no est conforme se o valor medido for igual ou superior ao CC.

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Estas regras de interpretao so aplicveis ao resultado analtico obtido na amostra para controlo oficial. No caso de anlises para efeitos de direito de recurso ou de procedimentos de arbitragem, so aplicveis as normas nacionais.

___________
(*****) O conceito de limite superior exige que se utilize o limite de quantificao para calcular o contributo de cada congnere no quantificado para os equivalentes txicos (TEQ). O conceito de limite inferior exige que se utilize zero para calcular o contributo de cada congnere no quantificado para os TEQ. O conceito de limite mdio exige que se utilize metade do limite de quantificao para calcular o contributo de cada congnere no quantificado para os TEQ. (******) A anlise em duplicado necessria para se excluir a possibilidade de contaminao cruzada interna ou de uma troca acidental de amostras. A primeira anlise, que tem em conta a incerteza da medio, utilizada para verificar a conformidade. No caso de a anlise ser realizada no contexto de um incidente de contaminao, a confirmao atravs de uma anlise em duplicado poder ser omitida, se as amostras selecionadas para anlise estiverem associadas, atravs da rastreabilidade, a esse incidente de contami nao 3. Resultados superiores aos limiares de interveno estabelecidos no anexo II da Diretiva 2002/32/CE Os limiares de interveno servem de instrumento para a seleo de amostras nos casos em que necessrio identificar uma fonte de contaminao e adotar medidas com vista sua reduo ou eliminao. Os mtodos de pr-seleo devem estabelecer valores-limite adequados para a seleo dessas amostras. Os esforos necessrios para identificar a fonte e reduzir ou eliminar a contaminao devem ser envidados apenas se a superao dos limiares de interveno for confirmada por uma anlise em duplicado mediante um mtodo de confirmao e tendo em conta a incerteza da medio (*******).

___________
(*******) Explicao e requisitos aplicveis anlise em duplicado para o controlo de limiares de interveno idnticos aos da nota (*****) para limites mximos.

CAPTULO II Preparao das amostras e requisitos respeitantes aos mtodos de anlise utilizados no controlo oficial dos teores de dioxinas (PCDD/PCDF) e de PCB sob a forma de dioxina em alimentos para animais 1. mbito de aplicao Os requisitos expostos no presente anexo devem ser aplicados quando se analisarem alimentos para animais para efeitos de controlo oficial dos teores de dibenzo-p-dioxinas policloradas, dibenzofuranos policlorados (PCDD/F) e dos bifenilos policlorados (PCB) sob a forma de dioxina substitudos nas posies 2,3,7 e 8 e para outros fins regulamentares. A monitorizao da presena de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina nos alimentos para animais pode ser realizada com dois objetivos diferentes: a) Seleo das amostras com teores de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina que excedam os limites mximos, ou os limiares de interveno. Esta abordagem pode envolver um mtodo de pr-seleo que permita uma boa relao custo-eficcia, aumentando assim a oportunidade de descobrir novos incidentes com elevada exposio e riscos para a sade dos consumidores. Os mtodos de pr-seleo podem incluir mtodos bioanalticos e mtodos CG/EM. A sua aplicao dever ter como objetivo evitar falsos resultados conformes. necessrio que a concentrao de PCDD/F e a soma de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina nas amostras com teores significativos seja determinada/confirmada por um mtodo de confirmao; b) Determinao dos teores de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina nas amostras de alimentos para animais na gama baixa dos nveis de contaminao de base. Tal importante para acompanhar as tendncias temporais e a avaliao da exposio da populao, bem como para criar uma base de dados para uma eventual reavaliao dos nveis de ao e dos limites mximos. Este objetivo conseguido atravs de mtodos de confirmao, que permitam identificar os PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina e quantific-los inequi vocamente ao teor requerido. Estes mtodos podem utilizar-se para a confirmao de resultados obtidos por mtodos de pr-seleo e para a determinao de nveis de contaminao de base baixos na monitorizao dos alimentos para animais. So tambm importantes para estabelecer padres de congneres com vista a identificar a fonte de uma eventual contaminao. Atualmente, tais mtodos utilizam a cromatografia gasosa de elevada resoluo/espetrometria de massa de elevada resoluo (HRGC/HRMS). 2. Classificao dos mtodos pelo seu grau de quantificao (********)

___________
(********) Adaptada para PCDD/F e compostos sob a forma de dioxina a partir das Guidelines for the validation of screening methods for residues of veterinary medicines (Orientaes para a validao de mtodos de pr-seleo de resduos de medicamentos veterinrios), laboratrios de referncia da UE (LRUE) para resduos de medicamentos veterinrios e contaminantes em gneros alimentcios de origem animal em Fougres, Berlim e Bilthoven, 20/1/2010, http://ec.europa.eu/food/food/chemicalsafety/residues/lab_ analysis_en.htm.

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2.1.

Os mtodos qualitativos do uma resposta de tipo sim/no quanto presena dos analitos em causa, sem indicao quantificada da concentrao do analito requerido. Os mtodos qualitativos podem ter o potencial para fornecer resultados semiquantitativos, mas so utilizados apenas para comunicar uma deciso de tipo sim/no como indicao de teores acima ou abaixo de certas gamas, por exemplo, limite de deteo, limite de quantificao ou valores-limite. Para o controlo dos limites mximos e dos limiares de interveno referentes aos PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina nos alimentos para animais, podem aplicar-se mtodos de pr-seleo baseados na comparao entre o resultado analtico e um valor-limite e que proporcionam uma deciso de tipo sim/no para indicar a eventual superao do teor requerido.

2.2.

Mtodos semiquantitativos so mtodos que do uma indicao aproximada da concentrao do analito suposto, embora o resultado numrico no preencha os requisitos para mtodos quantitativos. Podem utilizar-se para obter informaes sobre a gama de concentraes do analito, a fim de ajudar o analista a decidir da gama de calibrao para o teste de confirmao a realizar posteriormente e para efeitos de controlo de qualidade. Consideram-se mtodos semiquantitativos, por exemplo, os seguintes mtodos: a) Mtodos que tm por base princpios biolgicos, como ensaios com clulas, ensaios com recetores ou imunoensaios, a seguir designados por mtodos bioanalticos, que so capazes de detetar os analitos reque ridos, que incluem uma curva de calibrao, que do uma resposta sim/no para indicar a eventual superao do nvel requerido e que permitem notificar o resultado como equivalentes bioanalticos (BEQ), constituindo uma indicao do valor TEQ na amostra; b) testes fsico-qumicos [por exemplo, cromatografia gasosa-espetrometria de massa/espetrometria de massa (GC-MS/MS) ou cromatografia gasosa/espetrometria de massa de baixa resoluo (GC/LRMS)], em que as caractersticas de preciso do mtodo de medio no cumprem os requisitos aplicveis de testes quantita tivos.

2.3.

Os mtodos quantitativos cumprem os mesmos requisitos de exatido, gama dinmica e preciso que os mtodos de confirmao. Quando for necessrio quantificar, validar-se-o mtodos quantitativos como mtodos de confirmao. Contexto Para o clculo de concentraes de equivalentes de toxicidade (TEQ), as concentraes de cada substncia numa determinada amostra so multiplicadas pelos respetivos fatores de equivalncia txica (FET), definidos pela Organizao Mundial de Sade e enumerados no apndice do presente anexo, sendo subsequentemente somadas para darem a concentrao total de compostos sob a forma de dioxina expressos em equivalentes de toxicidade (TEQ). Para efeitos da presente parte B do anexo V, o limite especfico aceite de quantificao de um congnere individual a concentrao de um analito no extrato de uma amostra que produza uma resposta instrumental a dois ies diferentes, a qual ser controlada com um rcio sinal/rudo (S/R) de 3:1 para o sinal menos intenso e o cumprimento de critrios de identificao descritos, por exemplo, na norma prEN 16215 (Alimentao animal determinao de dioxinas e de PCB sob a forma de dioxina por CG/HRMS e de PCB indicadores por CG/HRMS) e/ou no mtodo EPA 1613, reviso B. Os mtodos bioanalticos de pr-seleo no daro resultados ao nvel do congnere, mas apenas uma indica o (*********) do valor TEQ, expresso em equivalentes bioanalticos (BEQ) no sentido de reconhecer o facto de que nem todos os compostos presentes num extrato de amostra que produz uma resposta no teste podem cumprir todos os requisitos do princpio TEQ. Os mtodos de pr-seleo e de confirmao apenas podem ser aplicados para o controlo de uma determinada matriz se os mtodos forem suficientemente sensveis para detetar fiavelmente teores ao teor requerido (limiar de interveno ou limite mximo).

3.

___________
(*********) Os mtodos bioanalticos no so especficos para os congneres includos no sistema dos FET. Podem estar presentes no extrato de amostra outros compostos estruturalmente relacionados ativos como AhR (recetor aril-hidro-carboneto) que contribuem para a resposta global. Por conseguinte, os resultados bioanalticos no podem ser uma estimativa, mas sim uma indicao do valor TEQ na amostra.

4. 4.1. 4.2.

Requisitos de garantia da qualidade Devem ser tomadas medidas para evitar a contaminao cruzada em cada etapa do procedimento de amostragem e de anlise. As amostras devem ser conservadas e transportadas em recipientes de vidro, alumnio, polipropileno ou polie tileno, adequados para o armazenamento sem qualquer influncia nos teores de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina das amostras. Devem ser removidos do recipiente da amostra os vestgios de poeiras de papel.

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4.3. 4.4.

O armazenamento e o transporte das amostras devem ser realizados de modo a manter a integridade da amostra de alimentos para animais. Desde que relevante, cada amostra de laboratrio deve ser finamente triturada e cuidadosamente misturada, mediante um processo que tenha demonstrado alcanar uma homogeneizao completa (por exemplo, triturao que permita passar por um crivo de 1 mm). As amostras devem ser exsicadas antes da triturao, caso o teor em humidade seja demasiado elevado. Deve proceder-se ao controlo de reagentes, de material de vidro e de equipamento relativamente a uma eventual influncia nos resultados baseados em TEQ ou em BEQ. Deve ser efetuada uma anlise em branco atravs da realizao de todo o procedimento analtico, omitindo apenas a amostra. Relativamente aos mtodos bioanalticos, devem testar-se todo o material de vidro e os solventes utilizados na anlise para verificar se esto isentos de compostos que interfiram com a deteo de compostos-alvo na gama de trabalho. O material de vidro deve ser enxaguado com solventes ou aquecido a temperaturas adequadas para remover da sua superfcie vestgios de PCDD/F, de compostos sob a forma de dioxina e de compostos interfe rentes. A quantidade da amostra utilizada para a extrao deve ser suficiente para cumprir os requisitos relativos a uma gama de trabalho suficientemente baixa, incluindo as concentraes requeridas. Os procedimentos especficos para preparao de amostras utilizados para os produtos em causa devem seguir orientaes aceites internacionalmente. Requisitos aplicveis aos laboratrios Em conformidade com o disposto no Regulamento (CE) n.o 882/2004, os laboratrios devem ser acreditados por um organismo reconhecido que opere em conformidade com o Guia ISO 58, a fim de assegurar que aplicam a garantia de qualidade analtica. Os laboratrios devem ser acreditados em conformidade com a norma EN ISO/IEC 17025. A competncia de um laboratrio deve ser comprovada pelo xito da sua participao contnua em estudos interlaboratoriais para a determinao de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina nas matrizes relevantes de alimentos para animais e nas gamas de concentraes. Os laboratrios que aplicam mtodos de pr-seleo para o controlo de rotina de amostras devem estabelecer uma estreita cooperao com os laboratrios que aplicam o mtodo de confirmao, tanto para o controlo da qualidade como para a confirmao do resultado analtico de amostras suspeitas. Requisitos bsicos a cumprir pelo procedimento analtico para determinao de dioxinas (PCDD/F) e de PCB sob a forma de dioxina Gama de trabalho baixa e limites de quantificao No que diz respeito aos PCDD/F, as quantidades detetveis devem ser da gama dos femtogramas superiores (10 15 g) devido extrema toxicidade de alguns destes compostos. Para a maioria dos congneres de PCB, o limite de quantificao na gama dos nanogramas (10 9 g) j suficiente. Quanto medio dos congneres de PCB sob a forma de dioxina mais txicos (designadamente, os congneres no-orto substitudos), o limite inferior da gama de trabalho deve atingir os teores baixos dos picogramas (10 12 g). Para todos os restantes congneres de PCB, suficiente o limite de quantificao na gama dos nanogramas (10 9 g).

4.5. 4.6. 4.7.

4.8. 4.9. 5. 5.1.

5.2.

5.3.

6. 6.1.

6.2. 6.2.1.

Seletividade (especificidade) elevada necessrio estabelecer uma distino entre PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina e inmeros compostos co-extrados e eventualmente interferentes, presentes em concentraes que podem atingir vrias ordens de grandeza superiores s dos analitos requeridos. Nos mtodos de GC/MS, necessria uma diferenciao entre vrios congneres, nomeadamente entre congneres txicos (por exemplo, os dezassete PCDD/F substitudos nas posies 2,3,7 e 8 e os doze PCB sob a forma de dioxina) e outros congneres. Os mtodos bioanalticos devem ser capazes de detetar os compostos-alvo como a soma de PCDD/F e/ou de PCB sob a forma de dioxina. A limpeza (clean-up) das amostras destina-se a remover compostos conducentes a falsos resultados no conformes ou compostos que possam diminuir a resposta, provocando falsos resultados confor mes. Exatido elevada (rigor e preciso, recuperao aparente do bioensaio) No que diz respeito aos mtodos GC/MS, a determinao deve fornecer uma estimativa vlida da verdadeira concentrao numa amostra. necessria uma elevada exatido para se evitar a rejeio do resultado da anlise de uma amostra devido reduzida fiabilidade do valor TEQ determinado. A exatido expressa em termos de rigor (diferena entre o valor mdio medido para um analito num material certificado e o respetivo valor certificado, expresso em percentagem deste valor) e de preciso (RSDR, desvio-padro relativo, calculado a partir de resultados obtidos em condies de reprodutibilidade).

6.2.2.

6.3. 6.3.1.

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6.3.2.

No que diz respeito aos mtodos bioanalticos, deve determinar-se a recuperao aparente do bioensaio. Por recuperao aparente do bioensaio, entende-se o valor BEQ calculado a partir da curva de calibrao da TCDD ou do PCB 126 corrigida em funo do resultado do ensaio em branco e, em seguida, dividido pelo valor TEQ determinado por GC/HRMS. Visa corrigir fatores como a perda de PCDD/PCDF e de compostos sob a forma de dioxina durante as fases de extrao e de limpeza, compostos co-extrados que aumentam ou diminuem a resposta (efeitos agonsticos e antagnicos), a qualidade de ajustamento da curva, ou diferenas entre os valores dos fatores de equivalncia txica (FET) e da potncia relativa (REP). A recuperao aparente do bioensaio calculada a partir de amostras de referncia apropriadas com padres de congneres representativos prximos do teor requerido. Validao na gama do teor requerido e medidas gerais de controlo da qualidade Os laboratrios devem demonstrar o desempenho de um mtodo na gama do teor requerido (por exemplo, 0,5 1 e 2 o teor requerido) com um coeficiente de variao aceitvel para anlises repetidas, durante o proce dimento de validao e durante a anlise de rotina. Devem realizar-se controlos regulares com ensaios em branco e com amostras enriquecidas ou anlises de amostras de controlo (de preferncia, se disponvel, material de referncia certificado) como medidas internas de controlo da qualidade. Devem registar-se e verificar-se os grficos de controlo da qualidade para ensaios em branco, com amostras enriquecidas, ou anlises de amostras de controlo, a fim de garantir que o desempenho analtico est em conformidade com os requisitos. Limite de quantificao No que diz respeito ao mtodo bioanaltico de pr-seleo, o estabelecimento do limite de quantificao (LOQ) no um requisito indispensvel, mas deve provar-se que o mtodo capaz de distinguir entre o valor do ensaio em branco e o valor-limite. Quando se proporciona um valor BEQ, deve estabelecer-se um nvel de notificao para lidar com amostras que revelam uma resposta abaixo deste nvel. Deve demonstrar-se que o nvel de notificao diferente das amostras em branco do procedimento pelo menos por um fator de trs, com uma resposta inferior gama de trabalho. Por conseguinte, deve ser calculado a partir de amostras que contenham os compostos-alvo prximos do teor mnimo exigido, e no a partir de um rcio S/R ou de um ensaio em branco. O limite de quantificao (LOQ) de um mtodo de confirmao deve ser de cerca de um quinto do teor requerido. Critrios analticos Para se obterem resultados fiveis de mtodos de confirmao ou de pr-seleo, devem ser satisfeitos os seguintes critrios, respetivamente, para o valor TEQ ou o valor BEQ, quer determinado como valor TEQ total (como a soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina) ou separadamente para PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina.
Pr-seleo com mtodos bioanalticos ou fsico-qumicos

6.4. 6.4.1.

6.4.2.

6.5. 6.5.1.

6.5.2.

6.6.

Mtodos de confirmao

Taxa de falsos resultados confor mes (*) Rigor Repetibilidade (RSDr) Reprodutibilidade (RSDR) intralaboratorial

< 5% 20 % a + 20 % < 20 % < 25 % < 15 %

(*) no que diz respeito aos limites mximos

6.7. 6.7.1.

Requisitos especficos para mtodos de pr-seleo Na pr-seleo podem ser utilizados tanto GC/MS como mtodos bioanalticos. Em relao aos mtodos GC/MS, devem respeitar-se os requisitos descritos no ponto 7. Quanto aos mtodos bioanalticos baseados em clulas, os requisitos especficos esto descritos no ponto 8. Os laboratrios que aplicam mtodos de pr-seleo e de controlo de rotina de amostras devem estabelecer uma estreita cooperao com os laboratrios que aplicam o mtodo de confirmao. A verificao de desempenho do mtodo de pr-seleo necessria durante a anlise de rotina, por controlo de qualidade analtica e validao do mtodo em curso. Deve existir um programa contnuo para o controlo dos resultados conformes.

6.7.2.

6.7.3.

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6.7.4.

Controlo da eventual supresso da resposta das clulas e da citotoxicidade 20 % dos extratos de amostras devem ser medidos em pr-seleo de rotina com e sem adio de 2,3,7,8-TCDD, correspondente ao teor requerido, a fim de verificar se a resposta eventualmente suprimida por substncias interferentes presentes no extrato da amostra. A concentrao medida da amostra enriquecida deve ser compa rada com a soma da concentrao do extrato no enriquecido mais a concentrao do enriquecimento. Se esta concentrao medida for mais de 25 % inferior concentrao (soma) calculada, tal uma indicao de uma potencial supresso do sinal e a respetiva amostra deve ser submetida a anlise de confirmao GC/HRMS. Os resultados devem ser controlados em grficos de controlo de qualidade.

6.7.5.

Controlo da qualidade de amostras conformes Aproximadamente 2 % a 10 % das amostras conformes, dependendo da matriz da amostra e da experincia adquirida no laboratrio, deve ser confirmada por GC/HRMS.

6.7.6.

Determinao das taxas de falsos resultados conformes a partir de dados de controlo da qualidade Deve determinar-se a taxa de falsos resultados conformes obtidos na pr-seleo de amostras abaixo e acima do limite mximo ou do limiar de interveno. As taxas reais de falsos resultados conformes devem ser inferiores a 5 %. Quando o controlo da qualidade de amostras conformes revelar, pelo menos, 20 resultados confirmados por matriz/grupo de matrizes, devem ser retiradas concluses sobre a taxa de falsos resultados conformes a partir dessa base de dados. Os resultados das amostras analisadas em ensaios interlaboratoriais ou durante incidentes de contaminao, abrangendo uma gama de concentraes que pode atingir, por exemplo, 2 o limite mximo (LM), podem tambm ser includos no mnimo de 20 resultados para a avaliao da taxa de falsos resultados conformes. As amostras devem abranger os padres de congneres mais frequentes, que representem diferentes fontes. Embora os ensaios de pr-seleo devam, de preferncia, ter como objetivo a deteo de amostras superiores ao limiar de interveno, o critrio para determinar as taxas de falsos resultados conformes o limite mximo, tendo em conta a incerteza de medio do mtodo de confirmao.

6.7.7.

As amostras no conformes suspeitas obtidas na pr-seleo devem ser sempre verificadas por um mtodo de anlise de confirmao (GC/HRMS). Estas amostras podem tambm servir para avaliar a taxa de falsos resultados no conformes. Relativamente aos mtodos de pr-seleo, a taxa de falsos resultados no conformes a frao de resultados conformes confirmados por anlises de confirmao GC/HRMS, enquanto na pr-seleo anterior, a amostra tinha sido declarada suspeita de ser no conforme. A avaliao da vantagem do mtodo de pr-seleo baseia-se na comparao de amostras de falsos no conformes com o nmero total de amostras verificadas. Esta taxa deve ser suficientemente baixa para tornar benfico o uso do instrumento de pr-seleo. Pelo menos nas condies de validao, os mtodos bioanalticos devem fornecer uma indicao vlida do valor TEQ, calculado e expresso em BEQ. Tambm em relao aos mtodos bioanalticos realizados em condies de repetibilidade, o RSDr intralabora torial deveria tipicamente ser inferior ao RSDR de reprodutibilidade.

6.7.8.

7. 7.1.

Requisitos especficos aplicveis aos mtodos gc/ms a respeitar para efeitos de pr-seleco ou de confirmao Requisitos gerais A diferena entre o limite superior e o limite inferior no deve exceder 20 % no caso de alimentos para animais com uma contaminao de cerca de 1 ng TEQ-OMS/kg de produto com um teor de humidade de 12 % (com base na soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina). Relativamente a teores de contaminao inferiores, por exemplo, 0,5 ng TEQ-OMS/kg de produto, a diferena entre o limite superior e o limite inferior pode situar-se na gama de 25 %-40 %.

7.2. 7.2.1.

Controlo das recuperaes Logo no incio do mtodo analtico, por exemplo antes da extrao, deve proceder-se adio de padres internos de PCDD/F marcados com 13C e substitudos com cloro nas posies 2,3,7 e 8 e de padres internos de PCB sob a forma de dioxina marcados com 13C, por forma a validar o procedimento analtico. Deve ser adicionado, pelo menos, um congnere para cada grupo homlogo de PCDD/F tetra a octo-clorados e, pelo menos, um congnere para cada grupo homlogo de PCB sob a forma de dioxina (em alternativa, deve ser utilizado para o controlo de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina, pelo menos, um congnere para cada funo de registo de ies selecionados por espetrometria de massa). No caso de mtodos de confirmao, deve utilizar-se a totalidade dos 17 padres internos de PCDD/F substitudos nas posies 2,3,7 e 8 e marcados com 13 C e a totalidade dos 12 padres internos de PCB sob a forma de dioxina marcados com 13C.

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7.2.2. 7.2.3.

Tambm devem ser determinados fatores de resposta relativos no caso dos congneres para os quais no se adiciona um composto anlogo marcado com 13C, atravs da utilizao de solues de calibrao adequadas. Em relao aos alimentos para animais de origem vegetal e aos alimentos para animais de origem animal que contenham menos de 10 % de gorduras, a adio de padres internos obrigatria antes da extrao. Em relao aos alimentos para animais de origem animal que contenham mais de 10 % de gorduras, os padres internos so adicionados antes ou aps a extrao de gorduras. Deve ser efetuada uma validao adequada da eficcia da extrao, dependendo da fase em que so introduzidos os padres internos e de os resultados serem notificados com base no produto ou nas gorduras. Antes da anlise por GC/MS, devem ser adicionados 1 ou 2 padres de recuperao (substitutos). necessrio efetuar o controlo da recuperao. Para os mtodos de confirmao, as recuperaes de cada padro interno devem situar-se na gama de 60 % a 120 %. So aceitveis recuperaes inferiores ou superiores para congneres individuais, nomeadamente para algumas dibenzo-p-dioxinas e alguns dibenzofuranos hepta- e octo-clorados, desde que o seu contributo para o valor TEQ no exceda 10 % do valor TEQ total (com base na soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina). Para os mtodos de pr-seleo GC/MS, as recuperaes devem situar-se na gama de 30 % a 140 %. Remoo de substncias interferentes Deve proceder-se separao entre PCDD/F e compostos clorados interferentes, tais como PCB no seme lhantes a dioxina e teres difenlicos clorados atravs de tcnicas cromatogrficas adequadas (de preferncia, com uma coluna de florisil, alumina e/ou carbono). A separao de ismeros por cromatografia gasosa deve ser < 25 % de pico a pico entre 1,2,3,4,7,8-HxCDF e 1,2,3,6,7,8-HxCDF.

7.2.4. 7.2.5.

7.3.

7.4.

Calibrao com curva-padro A gama da curva de calibrao deve abranger a gama relevante dos teores requeridos.

8.

Requisitos especficos para mtodos bioanalticos Mtodos bioanalticos so mtodos baseados na utilizao de princpios biolgicos, como ensaios com clulas, ensaios com recetores ou imunoensaios. O presente ponto 8 estabelece requisitos para mtodos bioanalticos em geral. Um mtodo de pr-seleo, em princpio, classifica uma amostra como conforme ou suspeita de ser no conforme. Para tal, o valor BEQ calculado comparado com o valor-limite (ver 8.3). As amostras abaixo do valor-limite so declaradas conformes, as amostras iguais ou acima do valor-limite so declaradas suspeitas de ser no conformes e necessitam de uma anlise por um mtodo de confirmao. Na prtica, um valor BEQ correspondente a 2/3 do limite mximo pode servir como valor-limite mais adequado, assegurando uma taxa de falsos resultados conformes inferior a 5 % e uma taxa aceitvel de falsos resultados no conformes. Com limites mximos distintos para PCDD/F e para a soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina, a verificao da conformidade das amostras sem fracionamento requer valores-limite de bioensaio adequados para os PCDD/F. Para a verificao de amostras que excedam os limiares de interveno, o valor-limite poderia ser uma per centagem adequada do respetivo teor requerido. Alm disso, no caso de determinados mtodos bioanalticos, pode ser dado um teor indicativo expresso em BEQ para amostras na gama de trabalho e excedendo o limite de notificao (ver 8.1.1 e 8.1.6).

8.1. 8.1.1.

Avaliao da resposta do teste Requisitos gerais O clculo das concentraes a partir de uma curva de calibrao da TCDD apresenta uma grande variao [elevado coeficiente de variao (CV)] dos valores nas extremidades inferior e superior da curva. A gama de trabalho a rea em que esta CV inferior a 15 %. A extremidade inferior da gama de trabalho (limite de notificao) deve ser estabelecida em, pelo menos, trs vezes o valor dos ensaios em branco do procedi mento. A extremidade superior da gama de trabalho habitualmente representada pelo valor EC70 (70 % da concentrao efetiva mxima), mas mais abaixo, caso a CV seja superior a 15 % nesta gama. A gama de trabalho estabelecida durante a validao. Os valores-limite (ver 8.3) devem situar-se dentro da gama de trabalho. As solues-padro e os extratos de amostras devem ser testados, pelo menos, em duplicado. No caso de utilizao de duplicados, uma soluo-padro ou um extracto-testemunha testado em 4 a 6 cavidades repartidas ao longo da placa deve produzir uma resposta ou concentrao (apenas possvel na gama de trabalho) com base numa CV < 15 %.

8.1.2.

Calibrao

8.1.2.1. C a l i b r a o c o m c u r v a - p a d r o Podem estimar-se os teores das amostras comparando a resposta do teste com uma curva de calibrao da TCDD (ou do PCB 126 ou de uma mistura-padro de PCDD/F/PCB sob a forma de dioxina) para calcular o valor BEQ no extrato e, posteriormente, na amostra.

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As curvas de calibrao devem conter 8 a 12 concentraes (pelo menos, nos duplicados), com concen traes suficientes na parte inferior da curva (gama de trabalho). Ser dada especial ateno qualidade de ajustamento da curva na gama de trabalho. Como tal, o valor R2 tem pouco ou nenhum valor para estimar a adequao do ajustamento em regresso no linear. Um melhor ajustamento ser alcanado atravs de uma reduo da diferena entre os teores calculados e os teores observados na gama de trabalho da curva, por exemplo, reduzindo ao mnimo a soma de resduos ao quadrado. O teor estimado no extrato de amostra posteriormente corrigido em funo do valor BEQ calculado para uma amostra em branco de matriz/solvente (para ter em conta impurezas provenientes de solventes e produtos qumicos utilizados) e da recuperao aparente (calculada a partir do valor BEQ de amostras de referncia adequadas com padres de congneres representativos prximos do teor requerido). Para a corre o da recuperao, a recuperao aparente deve situar-se dentro da gama exigida (ver ponto 8.1.4). As amostras de referncia utilizadas para a correo da recuperao devem cumprir os requisitos indicados no ponto 8.2. 8.1.2.2. C a l i b r a o c o m a m o s t r a s d e r e f e r n c i a Em alternativa, pode utilizar-se uma curva de calibrao preparada a partir de, pelo menos, 4 amostras de referncia (ver ponto 8.2.4: um ensaio branco de matriz e trs amostras de referncia com 0,5 , 1,0 e 2,0 o teor requerido) prximas do teor requerido, eliminando a necessidade de correo em funo do ensaio em branco e da recuperao. Neste caso, a resposta do teste correspondente a 2/3 do limite mximo (ver ponto 8.3) pode ser calculada diretamente a partir destas amostras e servir de valor-limite. Para a verificao de amostras que excedam os limiares de interveno, o valor-limite poderia ser uma percentagem adequada destes limiares de interveno. 8.1.3. Determinao em separado de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina Os extratos podem ser divididos em fraes contendo PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina, permitindo uma indicao separada de valores TEQ de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina (em BEQ). Convm utilizar, de preferncia, uma curva de calibrao-padro do PCB 126 para avaliar os resultados da frao que contm PCB sob a forma de dioxina. 8.1.4. Recuperaes aparentes do bioensaio A recuperao aparente do bioensaio deve ser calculada a partir de amostras de referncia adequadas com padres de congneres representativos prximos do teor requerido e expressa em percentagem do valor BEQ em comparao com o valor TEQ. Em funo do tipo de ensaio e do sistema TEF (**********) utilizado, as diferenas entre os fatores TEF e REP relativos aos PCB sob a forma de dioxina podem causar recuperaes aparentes baixas para os PCB sob a forma de dioxina em comparao com os PCDD/F. Por conseguinte, no caso de uma determinao em separado de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina, as recuperaes aparentes do bioensaio devem ser: para os PCB sob a forma de dioxina, de 25 % a 60 %, para os PCDD/F, de 50 % a 130 % (as gamas aplicam-se curva de calibrao da TCDD). Como o contributo dos PCB sob a forma de dioxina para a soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina pode variar entre diferentes matrizes e amostras, as recuperaes aparentes do bioensaio para a soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina refletem estas gamas e devem situar-se entre 30 % e 130 %. Qualquer implicao que a reviso substantiva dos valores FET tenha para a legislao da Unio relativa aos PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina exige a reviso destas gamas.

___________
(**********) Os requisitos atuais baseiam-se nos FET publicados em: M. Van den Berg et al, Toxicol Sci 93 (2), 223-241 (2006). 8.1.5. Controlo das recuperaes para limpeza A perda de compostos durante a limpeza deve ser verificada durante a validao. Uma amostra em branco enriquecida com uma mistura dos diferentes congneres deve ser submetida a limpeza (pelo menos, n = 3) e a recuperao e a variabilidade verificadas por anlise GC/HRMS. A recuperao deve situar-se entre 60 % e 120 %, em especial para congneres que contribuam mais de 10 % para o valor TEQ em vrias misturas. 8.1.6. Limite de notificao Ao notificar valores BEQ, deve ser determinado um limite de notificao a partir de amostras de matriz pertinentes que envolvam padres de congneres tpicos, mas no a partir da curva de calibrao das normas, devido baixa preciso na gama inferior da curva. Devem ser tidos em conta os efeitos da extrao e da limpeza. O limite de notificao deve ser estabelecido em, pelo menos, trs vezes o valor dos ensaios em branco do procedimento. 8.2. 8.2.1. 8.2.2. Utilizao de amostras de referncia As amostras de referncia representam a matriz da amostra, os padres de congneres e as gamas de concen traes dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina prximos do teor requerido. Cada srie de testes deve comportar um ensaio em branco da matriz e, caso tal no seja possvel, um ensaio em branco do procedimento, bem como uma amostra de referncia com o teor requerido. Estas amostras devem ser extradas e testadas no mesmo momento e em condies idnticas. A amostra de referncia deve apresentar uma resposta claramente elevada em comparao com a amostra em branco, assegurando assim a adequao do teste. Estas amostras podem servir para as correes em funo do ensaio em branco e da recuperao.

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8.2.3.

As amostras de referncia escolhidas para efetuar uma correo em funo da recuperao devem ser represen tativas das amostras de ensaio, o que significa que os padres dos congneres no podem conduzir a uma subestimao dos teores. Podem incluir-se amostras de referncia suplementares com teores 0,5 e 2 superiores ao teor requerido, para demonstrar o desempenho correto do teste dentro da gama requerida para o controlo do teor requerido. Combinadas, estas amostras podem servir para calcular os valores BEQ das amostras de ensaio (ver ponto 8.1.2.2). Determinao de valores-limite A relao entre os resultados bioanalticos em BEQ e os resultados da GC/HRMS em TEQ deve ser estabelecida, por exemplo, atravs de experincias de calibrao ajustadas em funo da matriz, envolvendo amostras de referncia enriquecidas a 0, 0,5 , 1 e 2 o limite mximo, com seis repeties em cada nvel (n = 24). Os fatores de correo (em branco e de recuperao) podem ser estimados a partir desta relao, mas devem ser verificados em conformidade com o ponto 8.2.2. Devem ser estabelecidos valores-limite para decidir da conformidade da amostra com limites mximos ou para verificar se os limiares de interveno, se relevantes, esto conformes aos respetivos teores requeridos fixados tanto para os PCDD/F e os PCB sob a forma de dioxina, isoladamente, como para a soma dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina. So representados pela extremidade inferior da distribuio dos resultados bioanalticos (corrigidos em funo do ensaio em branco e da recuperao) correspondendo ao limite de deciso GC/HRMS com base num nvel de confiana de 95 %, o que implica uma taxa de falsos resultados conformes < 5 %, e num RSDR < 25 %. O limite de deciso da GG/HRMS o limite mximo, tendo em conta a incerteza de medio. O valor-limite (em BEQ) pode ser calculado em conformidade com uma das abordagens mencionadas nos pontos 8.3.1, 8.3.2 e 8.3.3 (ver figura 1).

8.2.4.

8.3.

8.3.1.

Utilizao da faixa inferior do intervalo de previso de 95 % no limite de deciso da GC/HRMS:

Valor-limite BEQDL sy;x t;fm2 em que: BEQDL sy,x t

,f = m-2

q 1=n 1=m xi x2 =Qxx

o BEQ correspondente ao limite de deciso da GC/HRMS o limite mximo incluindo a incerteza de medio desvio-padro residual fator de Student ( = 5 %, f = graus de liberdade, unilateral) nmero total de pontos de calibrao (ndice j) nmero de repeties em cada nvel concentrao da amostra de GC/HRMS (em TEQ) do ponto de calibrao i mdia das concentraes (em TEQ) de todas as amostras de calibrao
m X j1

m n xi x Qxx 8.3.2.

xi x2 parmetro do quadrado da soma, i = ndice do ponto de calibrao i

Clculo a partir dos resultados bioanalticos (corrigidos em funo do ensaio em branco e da recuperao) de mltiplas anlises de amostras (n 6), contaminadas no limite de deciso da GC/HRMS, como a extremidade inferior da distribuio dos dados no valor BEQ mdio correspondente: Valor-limite = BEQDL 1,64 SDR em que SDR desvio-padro dos resultados do bioensaio no BEQDL, medidos em condies de reprodutibilidade intralaboratorial

8.3.3.

Clculo como valor mdio dos resultados bioanalticos (em BEQ, corrigido em funo do ensaio em branco e da recuperao) a partir de anlises mltiplas de amostras (n 6) contaminadas em 2/3 do teor requerido, com base na observao de que este teor estar prximo do valor-limite determinado em conformidade com o ponto 8.3.1 ou com o ponto 8.3.2:

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Figura 1

Clculo dos valores-limite com base num nvel de confiana de 95 %, o que implica uma taxa de falsos resultados conformes < 5 %, e num RSDR < 25 %: 1.a partir da faixa inferior do intervalo de previso de 95 %, no limite de deciso da HRGC/HRMS, 2.a partir de anlises mltiplas de amostras (n 6) contaminadas no limite de deciso HRGC/HRMS como a extremidade inferior da distribuio de dados (representada na figura por uma curva em forma de sino) no valor BEQ mdio correspondente. 8.3.4. Restries aos valores-limite: Os valores-limite baseados no BEQ, calculados a partir do RSDR obtido durante a validao com um nmero limitado de amostras com diferentes padres de matriz/congneres, podem ser superiores aos teores requeridos baseados em TEQ, devido a uma melhor preciso do que a que possvel em anlises de rotina quando um espetro desconhecido de eventuais padres de congneres tem de ser controlado. Em tais casos, os valores-limite devem ser calculados a partir de um RSDR = 25 %, ou, de preferncia, a dois teros do teor requerido. 8.4. 8.4.1. Caractersticas de desempenho Devem realizar-se testes repetibilidade dos mtodos bioanalticos para se obterem informaes sobre o desvio-padro numa srie de testes e entre sries de testes. A repetibilidade deve ser inferior a 20 % e a reprodutibilidade intralaboratorial inferior a 25 %. Tal deve basear-se nos valores calculados em BEQ aps correo em funo do ensaio em branco e da recuperao. Como parte do processo de validao, o teste deve demonstrar que discrimina entre uma amostra em branco e um teor no valor-limite, permitindo a identificao de amostras acima do valor-limite correspondente (ver ponto 8.1.2). Devem ser definidos compostos-alvo, eventuais interferncias e limites mximos tolerveis para a amostra em branco. O desvio-padro percentual na resposta ou concentrao calculada a partir da resposta (apenas possvel na gama de trabalho) de uma determinao em triplicado de um extrato da amostra no pode ser superior a 15 %. Os resultados no corrigidos das amostras de referncia expressos em BEQ (ensaio em branco e teor requerido) devem ser utilizados para a avaliao do desempenho do mtodo bioanaltico durante um perodo de tempo constante. Devem registar-se e verificar-se os grficos de controlo da qualidade para ensaios em branco do procedimento e para cada tipo de amostra de referncia, a fim de garantir que o desempenho analtico est em conformidade com os requisitos, nomeadamente no tocante aos ensaios em branco do procedimento, no que respeita diferena mnima requerida em relao extremidade inferior da gama de trabalho, e, no tocante s amostras de referncia, no que respeita reprodutibilidade intralaboratorial. Os ensaios em branco do procedimento devem ser controlados de modo a evitar falsos resultados conformes quando subtrados.

8.4.2.

8.4.3. 8.4.4. 8.4.5.

8.4.6.

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8.4.7.

Os resultados das anlises por GC/HRMS de amostras suspeitas e 2 % a 10 % das amostras conformes (mnimo de 20 amostras por matriz) devem ser recolhidos e utilizados para avaliar o desempenho do mtodo de pr-seleo e a relao entre BEQ e TEQ. Esta base de dados pode ser utilizada para efeitos de reavaliao de valores-limite aplicveis s amostras de rotina para as matrizes validadas. Os bons desempenhos do mtodo podem tambm ser demonstrados pela participao em ensaios interlabora toriais. Os resultados de amostras analisadas em ensaios interlaboratoriais, abrangendo uma gama de concen traes que pode atingir, por exemplo, 2 o limite mximo, podem ser includos na avaliao da taxa de falsos resultados conformes, se um laboratrio estiver em condies de demonstrar os seus bons desempenhos. As amostras devem abranger os padres de congneres mais frequentes, que representem diferentes fontes. Em caso de incidentes, os valores-limite podem ser reavaliados, refletindo a matriz e os padres de congneres especficos para cada incidente. Notificao dos resultados Mtodos de confirmao Na medida em que o procedimento analtico utilizado o permita, os resultados analticos devem conter os teores de cada congnere de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina e serem notificados em termos de limite inferior, limite superior e limite mdio, a fim de incluir o mximo de informaes possvel na notificao dos resultados e, deste modo, permitir a interpretao dos resultados de acordo com requisitos especficos. O relatrio deve incluir o mtodo utilizado para a extrao dos PCDD/F, dos PCB sob a forma de dioxina e dos lpidos. As recuperaes de cada padro interno devem ser disponibilizadas no caso de as recuperaes estarem fora da gama mencionada no ponto 7.2.5, se o limite mximo for excedido e noutros casos mediante pedido. Como a incerteza de medio deve ser tida em conta ao decidir da conformidade de uma amostra, este parmetro deve ser disponibilizado. Assim, os resultados analticos devem ser notificados enquanto x +/ U, em que x o resultado analtico e U a incerteza expandida da medio, utilizando um fator de expanso de 2, o que permite obter um nvel de confiana de cerca de 95 %. No caso de uma determinao em separado dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina, a soma da incerteza expandida estimada dos resultados analticos separados dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina deve ser utilizada para a soma dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina. Se a incerteza de medio for tida em conta mediante a aplicao de CC (tal como descrito no ponto 2.2), este parmetro deve ser mencionado. Os resultados devem ser expressos nas mesmas unidades e com, pelo menos, o mesmo nmero de algarismos significativos que os limites mximos definidos na Diretiva 2002/32/CE. Mtodos bioanalticos de pr-seleo O resultado da pr-seleo deve ser expresso como conforme ou suspeito de ser no conforme (suspeito). Alm disso, pode ser dado um resultado de PCDD/F e/ou de PCB sob a forma de dioxina expresso em BEQ, e no TEQ. Se a incerteza de medio do valor BEQ calculado for dada, por exemplo, sob a forma de um desvio-padro, deve basear-se em, pelo menos, uma anlise em triplicado, incluindo extrao, limpeza e determinao da resposta de ensaio. As amostras com uma resposta inferior ao limite de notificao devem ser indicadas como inferiores ao limite de notificao. Para cada tipo de matriz da amostra, o relatrio deve mencionar o teor requerido em que se baseia a avaliao. O relatrio deve mencionar o tipo de teste aplicado, o princpio de base do teste e o tipo de calibrao. O relatrio deve incluir o mtodo utilizado para a extrao dos PCDD/F, dos PCB sob a forma de dioxina e dos lpidos. CAPTULO III

8.4.8.

8.4.9. 9. 9.1. 9.1.1.

9.1.2. 9.1.3. 9.1.4.

9.1.5. 9.1.6. 9.2. 9.2.1. 9.2.2. 9.2.3.

9.2.4. 9.2.5. 9.2.6. 9.2.7.

Preparao de amostras e requisitos respeitantes aos mtodos de anlise utilizados no controlo oficial dos teores de PCB no semelhantes a dioxinas (PCB # 28, 52, 101, 138, 153 e 180) 1. Mtodos de deteco aplicveis Cromatografia gasosa/Deteo por captura de eletres (GC/ECD), GC/LRMS, GC/MS-MS, GC/HRMS ou mtodos equivalentes.

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2. 2.1.

Identificao e confirmao dos analitos requeridos Tempo de reteno relativo em relao a normas ou padres de referncia internos (desvio aceitvel de +/ 0,25 %). Deve confirmar-se, por cromatografia gasosa, que houve separao entre os seis PCB indicadores (PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 e PCB 180) e substncias interferentes, especialmente PCB co-eludos, em especial se os teores das amostras se situarem na gama dos limites legais e de no conformidade.
Nota: Os congneres que co-eluem frequentemente so, por exemplo, PCB 28/31, PCB 52/69 e PCB 138/163/164. Em relao CG/EM, devem tambm ter-se em conta as eventuais interferncias de fragmentos de congneres mais fortemente clorados.

2.2.

2.3.

Requisitos aplicveis a tcnicas GC/MS Verificao de, pelo menos: a) dois ies especficos, para a HRMS, b) dois ies especficos de m/z > 200 ou trs ies especficos de m/z > 100 para a LRMS, c) 1 precursor e 2 ies-produto para MS-MS. Tolerncias mximas permitidas para os rcios de abundncia relativos a fragmentos de massa selecionados: Desvio relativo do rcio de abundncia de massas de fragmentos selecionados em relao abundncia terica ou ao padro de calibrao de ies-alvo (io mais abundante controlado) e de ies qualificadores:
Intensidade relativa de ies qualificadores em relao a ies-alvo GC-EI-MS (desvio relativo) GC-CI-MS, GC-MSn (desvio relativo)

> 50 % > 20 % a 50 % > 10 % a 20 % 10 %

10 % 15 % 20 % 50 % (*)

20 % 25 % 30 % 50 % (*)

(*) Nmero suficiente de fragmentos de massa com intensidade relativa > 10 % disponveis, pelo que no recomendvel a utilizao de ies qualificadores com uma intensidade relativa inferior a 10 % quando comparados com o io-alvo.

2.4.

Requisitos aplicveis a tcnicas GC/ECD: Devem confirmar-se os resultados que excedem a tolerncia por meio de duas colunas de GC com fases estacionrias de polaridade diferente.

3.

Demonstrao do desempenho do mtodo Deve validar-se o desempenho do mtodo na gama do teor requerido (0,5 a 2 vezes o teor requerido) com um coeficiente de variao aceitvel para anlises repetidas (ver requisitos aplicveis preciso intermdia mencio nados no ponto 8).

4.

Limite de quantificao Os valores dos ensaios em branco no devem ser superiores a 30 % do nvel de contaminao correspondente ao nvel mximo (***********).

___________
(***********) Recomenda-se vivamente um contributo inferior do teor do ensaio em branco do reagente para o teor de um contaminante numa amostra. Cabe ao laboratrio controlar a variao dos teores dos ensaios em branco, em especial, se se subtrarem os teores dos ensaios em branco. 5. Controlo da qualidade Controlos regulares com ensaios em branco, anlise de amostras enriquecidas, amostras de controlo da qualidade, participao em estudos interlaboratoriais em matrizes relevantes.

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6. 6.1. 6.2.

Controlo de recuperaes Devem utilizar-se padres internos adequados, com propriedades fsico-qumicas comparveis s dos analitos requeridos. Adio de padres internos: Adio a produtos (antes do processo de extrao e limpeza).

6.3.

Requisitos aplicveis a mtodos que utilizem os seis congneres de PCB indicadores marcados com istopos: a) os resultados devem ser corrigidos em funo das recuperaes de padres internos, b) as recuperaes de padres internos marcados com istopos devem situar-se entre 50 % e 120 %, c) so aceitveis recuperaes inferiores ou superiores para congneres individuais cujo contributo para a soma dos seis PCB indicadores seja inferior a 10 %.

6.4.

Requisitos aplicveis a mtodos que no utilizem os seis padres internos marcados com istopos ou que utilizem outros padres internos: a) a recuperao de padres internos deve ser controlada para cada amostra, b) as recuperaes de padres internos devem situar-se entre 60 % e 120 %, c) os resultados devem ser corrigidos em funo das recuperaes de padres internos.

6.5.

As recuperaes de congneres no marcados devem ser verificadas com amostras enriquecidas ou amostras de controlo da qualidade com concentraes na gama do teor requerido. Consideram-se aceitveis as recuperaes destes congneres se se situarem entre 70 % e 120 %. Requisitos aplicveis aos laboratrios Em conformidade com o disposto no Regulamento (CE) n.o 882/2004, os laboratrios devem ser acreditados por um organismo reconhecido que opere em conformidade com o Guia ISO 58, a fim de assegurar que aplicam a garantia de qualidade analtica. Os laboratrios devem ser acreditados em conformidade com a norma EN ISO/IEC 17025.

7.

8.

Caractersticas de desempenho: critrios aplicveis soma dos seis pcb indicadores no teor requerido: Rigor Preciso intermdia (RSD %) Diferena do clculo entre limite superior e limite in ferior 30 % a + 30 % 20 % 20 %

9. 9.1.

Notificao dos resultados Na medida em que o procedimento analtico utilizado o permita, os resultados analticos devem conter os nveis de cada congnere de PCB e ser indicados como limite inferior, limite superior e limite mdio, a fim de incluir o mximo de informaes possvel na notificao dos resultados e, deste modo, permitir a interpretao dos resultados de acordo com requisitos especficos. Deve constar da notificao o mtodo utilizado na extrao de PCB e de lpidos. As recuperaes de cada padro interno devem ser disponibilizadas no caso de as recuperaes estarem fora da gama mencionada no ponto 6, se o limite mximo for excedido e noutros casos mediante pedido. Como a incerteza de medio deve ser tida em conta ao decidir da conformidade de uma amostra, este parmetro deve igualmente ser disponibilizado. Assim, os resultados analticos devem ser notificados enquanto x +/- U, em que x o resultado analtico e U a incerteza expandida da medio, utilizando um fator de expanso de 2, o que permite obter um nvel de confiana de cerca de 95 %. Se a incerteza de medio for tida em conta mediante a aplicao de CC (tal como descrito no ponto 2.1 do captulo I), este parmetro deve ser mencionado. Os resultados devem ser expressos nas mesmas unidades e com, pelo menos, o mesmo nmero de algarismos significativos que os limites mximos definidos na Diretiva 2002/32/CE..

9.2. 9.3. 9.4.

9.5. 9.6.