Gentica Molecular Humana Profa. Dra.

Ana Elizabete Silva

SUMRIO
Histrico e Conceito Tipos de morte celular: Apoptose x Necrose Caractersticas gerais da apoptose Funes da apoptose Mecanismos bioqumicos e moleculares Regulao da apoptose: -famlia Bcl-2 -caspases
Vias apoptticas: -via extrnseca -via intrnseca Funo da mitocndria Mtodos de deteco da apoptose Doenas associadas apoptose Apoptose e cncer Alvos para terapia

1858: achavam que a M.C.P. era um processo patolgico

1951: consideraram um fenmeno fisiolgico necessrio (tecidos e embries)

Anos 70 : relacionaram alta freqncia de M.C.P. nos tumores com mecanismos homeostticos (perda e ganho celular) Kerr, Willie e Currie (1972) Constataram que o padro de morte celular que ocorria durante o desenvolvimento embrionrio tambm se repetia em organismos adultos. Cada clula vtima dessa ativa forma de morte Apo = de Ptosis = cair
queda de folhas das rvores no outono

FUNES DA APOPTOSE
1-Elimina clulas danificadas/prejudiciais 2-Fisiologicamente ocorre: na renovao de clulas epiteliais e hematopoticas Mantm nmero constante de clulas nos tecidos adultos: Ex.: 5x10 clulas do sangue eliminadas por morte celular programada (dia/adultos) # colapso endometrial durante a menstruao # deleo de clulas nas criptas intestinais # na regresso de tumores 3-Papel importante no desenvolvimento embrionrio: -eliminao do tecido larval durante metamorfose (anfbios e insetos) -regresso da cauda do girino -eliminao de tecidos entre os dedos (membrana interdigital) -eliminao de neurnios em excesso 4- Mecanismo de defesa: -clulas infectadas por vrus -clulas com danos no DNA

Exemplos da importncia da Apoptose no desenvolvimento

Exemplos da importncia da Apoptose no desenvolvimento embrionrio em mamferos

manuteno do tamanho e forma dos rgos e tecidos

Equilbrio entre a taxa de gerao celular (60 bi/dia) e taxa de morte celular (10 bi/dia)

Razo da morte celular

Desordem e acmulo celular

Homeostase
Desordem e perda celular

CATEGORIAS DE MORTE CELULAR ORGANISMOS SUPERIORES

NECROSE:
-processo patolgico (autlise das clulas): resultado de uma leso macia no tecido caracterizada por: -inchao citoplsmatico e mitocondrial, - ruptura da membrana celular e vazamento do plasma celular -resposta inflamatria e reao de tecido patolgico grande nmero de clulas afetadas simultaneamente

APOPTOSE: -evento fisiolgico (processo de eleminao celular controlado) sequncia de eventos que levam a morte celular em uma variedade de diferentes sistemas AUTOFAGIA: autocanibalizao da clula: degradao de organelas e citoplasma pelos lisossomos e vacolos

NECROSE X APOPTOSE

NECROSE X APOPTOSE

APOPTOSE

-vacolos citoplasmticos -encolhimento e diminuio do contato clula-clula Fragmentao da membrana nuclear -condensao cromatnica -Despolarizao da membrana mitocondrial -fragmentao internucleossomal do DNA -desintegrao nuclear e corpos apoptticos -fagocitose pelos macrfagos

Estmulo fisiolgico Ocorrncia unicelular Sem reversibilidade

PROCESSO HISTOLGICO DA APOPTOSE

Passos histolgicos distintos:

-durao de 2-3 horas -processo no sincrnico -mudanas bioqumicas e morfolgicas

PROCESSO HISTOLGICO DA APOPTOSE

1.Condensao da cromatina no ncleo e rompimento da interao clula-clula clula apopttica isolada das vizinhas -Condensao da cromatina antes da clivagem do DNA ACINUS
degradao DNA nuclear (espaos inter-nucleossomal ) endonucleases (Dnase I) dependentes de Ca2+ e Mg2+

produz quebras de cadeia nica no DNA extremidades com grupos 3-OH

-Condensao citoplasmtica: (preservao integridade de organelas) disrupo dos contatos desmossomais entre clulas e disrupo do citoesqueleto (enzimas transglutaminase, colagenase, TRPM2) formao de blebs sobre a superfcie celular.

Fragmentao do DNA internucleossomal produz padro de escada no gel de eletroforese.

PROCESSO HISTOLGICO DA APOPTOSE

2.Fragmentao da clula em corpos apoptticos ncleos fragmentados e organelas intactas (mitocndrias e lisossomos) enzimas envolvidas: catepsina D, ativador plasminognio tipo-tecido e RNase.

3.Fagocitose dos corpos apoptticos clulas vizinhas normais e macrfagos degradao pelos lisossomos das clulas recipientes

TROFOBLASTO ETAPAS DAS MUDANAS MORFOLGICAS A- Condensao do citoplasma clivagem da lmina e filamentos de actina
B- Condensao nuclear quebra da cromatina e protenas estruturais nucleares C-D- Fragmentao da clula corpos apoptticos translocao de fosfatidilserina superfcie celular degradao macrfagos
http://www.sgul.ac.uk/depts/immunology/~dash/apoptosis/intro.html

Fagocitose dos corpos apoptticos por macrfagos

Clulas em apoptose proliferao)

APOPTOSE E CICLO CELULAR

CLULA Go

maioria dos casos na fase Go (sem

Estmulo apopttico

morte celular programada

Fase morfolgica de pr-condensao: acmulo de produtos gnicos necessrios para a apoptose

passo irreversvel ativao de endonucleases

FASE A1 DE APOPTOSE

FASE A2 DE APOPTOSE

(tempo de durao da apoptose: 2-3 horas)

REGULAO DA APOPTOSE mediada por muitos fatores e em vrios nveis do metabolismo celular Infeco viral Pertubao metablica: mudanas repentinas na concentrao de glicose Temperatura Irradiao Toxinas e drogas Fatores hormonais, como citocinas e hormnios (peptdeos e esterides)

Mecnismos Bioqumicos e Moleculares

mudanas bioqumicas e moleculares da cascata dependente de energia

Fatores que previnem a apoptose (fatores de sobrevivncia tecido-especfico ou gerais): hormnios, citocinas e fatores de crescimento

Fatores que induzem ou aumentam apoptose: hormnios, depleo de fatores de crescimento, etc.

ESTMULOS PR E ANTI-APOPTTICOS

1-Extrnsecos: ligantes de morte (1) granzima (4) linfcitos

citotxicos

2- Intrnsecos aps estresse celular: radiao (2) agente qumico (3) infeco viral deprivao de fator de crescimento estresse oxidativo

www.sghms.ac.uk/.../ ~dash/apoptosis/mito.html

INIBIDORES DA APOPTOSE testosterona estradiol Progesterona Prolactina fatores de crescimento (EGF, IGF-I, NGF, PDGF) interleucinas hormnio de crescimento gonadotrofinas

INDUTORES DE APOPTOSE esterides glucocorticides progesterona hormnio tireide privao de fator de crescimento (IGF-I, EGF, PDGF, NGF) fator de crescimento transformante Citocinas: TNF-, IL-1, IL-6 Fas ligante radicais livres xido ntrico

REGULAO DA APOPTOSE
Famlia de protenas Bcl-2: -controla alguns passos chaves da sinalizao da apoptose: -liberao do citocromo c, -ativao da caspase-9 e homeostase de clcio alterando o limiar celular de sensibilidade apoptose. Caspases: cisteno proteases

REGULAO DA APOPTOSE
Genes responsveis pela regulao da apoptose

conservados desde Nematodos a Humanos

Caenohabditis elegans 1090 clulas somticas (diferenciadas)

131 eliminadas por apoptose durante o desenvolvimento

Regulao da apoptose: 14 genes ced (cell death abnormal)

ced-3 e ced-4 levam apoptose

ced-9 anti-apopttico

FAMLIA DE PROTENA Bcl-2

25 genes Primeira oncoprotena anti-apopttica

Descoberta em Linfoma de Clulas B: t(14;18), gene Bcl-2 translocado para locos da cadeia pesada da Ig expresso elevada em clulas B. Localizao de Bcl-2: membranas intracelulares mitocndria, retculo endoplasmtico e membrana perinuclear Oncogene Bcl-2: no tem capacidade para estimular crescimento celular aumenta a sobrevivncia celular em condies de crescimento subtimas inibindo a apoptose Protena bcl-2: capaz de proteger as clulas de uma ampla variedade de estmulos apoptticos privao de fator de crescimento, irradiao, drogas citotxicas, calor, moncitos, oncogenes desregulados (previne a liberao do citocromo c mitocndria)

citoplasma

mitocndria

Localizadas no citosol e translocadas p/mitocndria

Localizadas no citosol (Bax), membranas mitocndria e RE (Bak)

Bcl-2: ligada membr. mit. e RE

CASPASES
Cytosolic Aspartate-Specific Proteases (famlia de 12 protenas: 7 envolvidas na apoptose) Possuem um resduo de cistena no stio ativo clivam protenas em resduos de cido asprtico Pro-caspases (forma inativa): quando clivadas (ativas) geram uma cascata de caspases que clivam protenas crticas para a sobrevivncia da clula, como:
-desmontagem do envoltrio nuclear e arcabouo da lmina -hipercondensao da cromatina -degradao proteoltica das estruturas nucleares e citoplasmticas

-duas subunidades

1 grande

1 pequena
-pro-enzimas inativas durante a apoptose; cascata sinais pr-apoptticos ativam as caspases iniciadoras (-2, -8, -9 e -10) caspases efetoras (-3, -6 e -7)

clivam protenas celulares vitais (fase de degradao)

Caspases inflamatrias:(-1,-4,-5)

CASPASES
CASPASES INICIADORAS caspases -2, -8, -9 e -10 CASPASES EFETORAS caspases -3, -6 e -7

processadas e ativadas com a ajuda de molculas adaptadoras: pro-caspase-9: Apaf-1 pro-caspase-8: FADD/MORT1

quando clivadas: responsveis pela clivagem de vrias protenas

quando ativadas clivam e ativam as pro-caspases efetoras

mudanas morfolgicas e bioqumicas caractersticas da morte celular apopttica

CASCATA DE CASPASES Caspase-6 Caspases-2,-3,-9 Caspase-3 Clivagem de Lmina e NuMA Clivagem de protenas nuclear PARP,DNA-PK, ICAD, Gelsolina, Topoisomerase I e II

Clivagem de Acinus

Condensao da cromatina

Fragmentao do DNA

Condensao da cromatina

SUBSTRATOS DAS CASPASES

CASPASE-6 Lmina NuMA (protena do aparelho mitticonuclear)

manuteno da integridade estrutural nuclear (condensao do envelope nuclear)

SUBSTRATOS DAS CASPASES

CASPASE-3 ICAD (inibidor de DNase ativada por caspase) PARP (polimerase poli ADP-ribose) DNA-PK (protena quinase dependente de DNA) PAK2 (protena quinase ativada pela p21) Todas participam do reparo do DNA e integridade genmica

Fragmentao do DNA Condensao da cromatina Gelsolina: envolvida na montagem e desmontagem de actina (parte do citoesqueleto estrutura da clula) Acinus (fator nuclear): aps clivagem essencial para a condensao da cromatina

VIAS APOPTTICAS

Via independente de caspase

VIAS APOPTTICAS
Via extrnseca ligao dos receptores de morte: Fas/CD95/Apo-1, TNFR e TRAIL: expressos em timcitos, clulas B ativas, clulas T, moncitos, macrfagos e neutrfilos -estmulo externo ( radiao,drogas, inflamao) ligao com ligantes especficos aos receptores de Morte: FasL/Fas; TNF- /TNFR) DISC (complexo de sinal indutor de morte) Fasl/Fas + FADD + procaspase 8 caspase 8 ativada cascata de caspases Via intrnseca-Mitocondrial: estmulo interno:ROS, NO, citocinas (IL-1, IL-6) ativao Bax, Bid translocao do citosol p/ membrana mitocondrial liberao do citocromo c formao do apoptossomo clivagem da procaspase-9 caspase-9 ativa cascata de caspases clivagem da caspase-3 ativa fator de fragmentao do DNA quebra do DNA a cada 200pb

DUAS PRINCIPAIS VIAS DA APOPTOSE

CD95

Degradao DNA
Degradao protenas nuclear e citoesqueleto Condensao da cromatina e citoplasma Fragmentao nuclear Mudanas na permeabilidade da membr. mitocndria

Via extrnseca da apoptose

TNF, TRAIL, CD95 (FAS ou APO1)

1) Ligantes de morte ligam-se aos receptores de morte

Bloqueia a ativao da caspase-8

2) Molcula adaptadora FADD recrutada

DISC: complexo sinalizao indutor de morte

3) Ligao de caspases-8 e 10
Cliva e ativa a caspase-3 efetora

Ativa o domnio BID, membro apopttico da famlia Bcl-2

Bloqueia a ativao da caspase-8

Apoptose --- Via extrnseca

Apoptose --- Via intrnseca

APOPTOSE EFEITO NUCLEAR

Clivagem do DNA nas unidades nucleossomais: -PARP (reparo DNA) clivada pela caspase 3 -Laminas degradap pela caspase 6 condensao da cromatina e fragmentao nuclear

-Fragmentao do DNA:
Realizada pela enzima CAD (DNase ativada por caspase)

Complexo inativo CAD+ICAD

ICAD clivado Caspase 3 CAD fragmentao DNA

www.sghms.ac.uk/.../ ~dash/apoptosis/mito.html

FUNO DA MITOCNDRIA

Membrana externa:
membros anti-apoptticos: Bcl-2, Bcl-Xl sobrevivncia celular Membros pr-apoptticos: Bad e Bax interagem com Bcl-2 e Bcl-Xl

Mitocndria: liberao do citocromo C (poros Bad e Bax)

Apoptossomo
[citocromoC + Apaf-1 + ATP + pro-caspase 9]

caspase 9

caspase 3

www.sghms.ac.uk/.../ ~dash/apoptosis/mito.html

APOPTOSSOMO Ativao das Caspases

Estrutura em roda:
7 molculas Apaf-1 + citocromomo C + ATP

7 molculas pr-caspase 9

www.sghms.ac.uk/.../ ~dash/apoptosis/mito.html

MTODOS PARA DETECO DA APOPTOSE

Citomorfolgico: hematoxilina-eosina Fragmentao do DNA: TUNEL (Terminal dUTP Nick EndLabeling) insero de nucleotdeos marcados- dUTP nas extremidades 3-OH DNA fragmentado Anticorpos: - caspases clivadas: caspase-3 ativada ou CPP32 - Anexina 5: externalizao da fosfatidilserina membrana externa da clula Ensaio mitocondrial e liberao do citocromo c: corantes fluorescentes e microscopia eletrnica PCR microarray: perfil de expresso de ~112 genes painel de genes relacionados a apoptose
Combinar uma ou mais tcnicas bioqumicas com morfolgica eventos precoces e tardios

Colorao H&E:

Pncreas de camundongo: setas clulas apoptticas: citoplasma condensado e ncleos picnticos

Colorao H&E:

miocrdio de rato: setas indicam clulas apoptticas: ncleo fragmentado

Toxicol Pathol 2007 35: 495

TUNEL: clulas mamrias

TUNEL: testculo

TUNEL:
ncleo marrom
mucosa gstrica normal

gastrite crnica superficial

gastrite crnica moderada

gastrite atrfica

CASPASE-3:
mucosa gstrica normal

citoplasma marrom
gastrite crnica superficial

gastrite crnica moderada

gastrite atrfica

Doenas Associadas com Aumento da apoptose

1- AIDS destruio apopttica dos linfcitos T/CD4

induo da permeabilizao da membrana mitocondrial

2- Doenas neurodegenerativas: Alzheimer e Parkinson

apoptose precoce dos neurnios demncia progressiva, perda cognitiva e memria

3- Infarto do miocrdio por isquemia necrose das clulas

que dependem dos vasos afetados e apoptose das clulas vizinhas pela gerao de ROS

4- Doenas hepticas induzidas por toxinas e alcoolismo

5- Osteoporose perda da massa ssea

Doenas Associadas com Diminuio da apoptose

Cncer
Linfoma folicular, Carcinoma mamrio Tumores hormnios dependentes Cncer de prstata e ovrio

Doenas auto-imunes falhas (no timo) na apoptose de

clulas T que reagem com substncias do prprio organismo
Lupus eritrematoso sistmico Glomerulonefrite imuno-mediada

Infeces virais inibem apoptose das clulas infectadas

Herpesvrus Poxvrus Adenovrus

APOPTOSE E CNCER

DEFEITOS NAS VIAS DE SINALIZAO DA APOPTOSE

CNCER

APOPTOSE: elimina as clulas com DNA lesado ou ciclo celular desregulado

ALTERAO DA APOPTOSE

INICIAO DO TUMOR

AUMENTA A PROGRESSO TUMORAL E PROMOVE METSTASES: permitem as clulas tumorais sobreviverem durante o trnsito na circulao sangunea e crescerem em stios de tecidos ectpicos, sem os fatores de crescimento necessrios.

Oncogenes :
Regulam ou controlam o crescimento e a proliferao celular

Atuam no controle do mecanismo da morte celular

BCL-2 Ras

INIBEM A APOPTOSE

FUNO DA PROTENA P53

~50% dos cnceres humanos apresentam mutao de p53 (fator de transcrio):

-parada do ciclo celular

-reparo do DNA -apoptose

Mutao de p53

Resistncia quimio e radioterapia: clulas no entram em Apoptose

Limiar aumentado da apoptose: pode conferir s celulas cancerosas resistncia a vrias formas de terapia.
Apoptose: tem uma funo importante na regulao do crescimento tumoral e resposta do tumor terapia
Tratamento citotxico: radiao ou quimioterapia Resposta apopttica: Dependente da dose

Candidato da Terapia Antitumoral: Aumentando a resposta apopttica de tecidos cancerosos ou inibindo a resposta apopttica de tecidos normais

ALVOS PARA A TERAPIA DO CNCER

Reguladores da apoptose : principais fatores que contribuem p/ resistncia a quimioterapia Estratgias de terapias indutoras de apoptose:

tecnologia antisense: oligos antisense contra Bcl-2, XIAP e survinina protenas antagonistas como Bax: inibio da atividade anti-apopttica;utilizando ou elaborando compostos farmacuticos que liguem-se em seus stios ativos siRNA p/ c-FLIP, Bcl-2, XIAP: induz apoptose p/ tratamento do cncer Inibidores de caspases Terapia gnica: restaurao da funo de p53

ALVOS PARA A TERAPIA DO CNCER

Exemplos:
Inibidores de caspase: - z-VAD-fmk (sinttico) reduz a gravidade da injria de reperfuso do miocrdio (modelos de ratos) -inibidores de ICE (Interleukin-1 beta-converting enzyme) ou caspase-1:tratar artrite reumatide e outras doenas inflamatrias via reduo de interleucina-1 -K-777: inibidor de caspase p/ tratar doena Chagas Inibidores de PARP1: atenuar clulas inflamatrias e isqumicas e injria de rgos Inibidores de Bax: previnir liberao do cit c da mitocndria