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Manaus – AM
2016
Câncer de cólon INTRODUÇÃO
Cultura de células
Linhagens:
HT-29
LoVo
RKO
HUVEC
Cultura celular:
Meio de cultura RPMI -1640; DMEM e
M199 contendo 10% de Soro Fetal
Bovino (SFB) e 1% de antibiótico
Penicilina/Estreptomicina.
24hs 48 hs
1 x 104 cells /poço TRATAMENTO Adição de 20 µL de MTT
100 µL/poço KI-10F e 5-FU: 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1e (2mg/mL)
5µM
Remoção do sobrenadante
e adição de 200 uL de Incubar por 4hs em
Leitura – 540 nm
DMSO, agitação por 5´ estufa a 37oC 5% CO2
Resultados e Discussão
CI50 = 0,33µM
Morte Senescência
Catástrofe mitótica
Fonte: Adaptado de GALLUZZI et al. 2012
Materiais e Métodos
Coleta e fixação em
HT-29 etanol 70% a 4oC
Tratamento das
células
24hs KI-10F : 0 a 1 µM 24 horas
Citômetro de fluxo
Incubação
1 hora no escuro
Equipamento FACSCalibur
(Becton Dickinson, San José, CA)
Análise Quest (Becton Dickinson)
Resultados e Discussão
Figura 2. Efeito de KI-10F sobre a distribuição do ciclo celular em células HT-29. As células foram tratados com KI-10F (0,01 - 1 µM)
durante 48 horas, coradas com iodeto de propídio (PI) e, em seguida, analisadas num citômetro de fluxo FACSCalibur. M1, sub-G1;
M2, G0 / G1; M3, S; M4, G2 / M. A quantificação da coloração dados PI são apresentados como as percentagens de distribuição do
ciclo celular
Materiais e Métodos
HT-29
Fixação em PFA 2%
Tratamento das
células
24horas KI-10F : 5 µM
24 horas
Figura 2. (B) A indução de apoptose por KI-10F foi avaliada por coloração TUNEL e DAPI, cujos
resultados foram fotografados com uma ampliação de 200x.
Materiais e Métodos
48 horas
Células tratadas com KI-10F Lise das células Quantificação de Eletroforese em gel
proteínas desnaturante de
poliacrilamida
Revelação com reagente Lavagem da membrana e Lavagem da membrana e Transferência das proteínas do
quimioluminescente incubação anticorpo incubação anticorpo gel para membrana de
secundário primário nitrocelulose
Figura 2: (C) A indução da apoptose por KI-10F foi avaliada por análise de Western blot da expressão
de Bcl-2, Bax e clivagem da caspase-3, -8 e -9 nas células tratadas com KI-10F nas doses indicadas
durante 48 h.
Resultados e Discussão
Figura 3. Efeito de KI-10F na angiogênese. (B) Efeitos de KI-10F na formação de tubo HUVEC. As
HUVECs foram semeadas em Matrigel (200 ul / poço) e tratou-se com várias concentrações de KI-
10F. A formação do tubo capilar foi avaliada após 14 h e foi observada sob um microscópio de
contraste de fase e fotografados com uma ampliação de 400 x.
Materiais e Métodos
Foram feitas
feridas com uma
lâmina de barbear
2 mm e marcado
na linha de lesão.
Figura 3. Efeito de KI-10F na angiogénese. (C) Efeitos de KI-10F sobre migração in vitro.
As HUVECs foram semeadas a 90% de confluência e um zero foi feita com uma lâmina de
barbear. Após o ferimento, as células foram incubadas em M199 com FBS a 5%, 5 ng / ml
de bFGF, timidina 1 mM e / ou Kl-10F (1 µg / mL).
Materiais e Métodos
Figura 4. Efeitos de KI-10F in vivo, utilizando um modelo de xenoenxerto de HT-29. Os tumores foram
implantados em camundongos por injeção subcutânea de células HT-29 (2x106 células / 200 µL de PBS) no
flanco. Após os tumores atingiram 50-100 mm3 de tamanho, os ratos receberam uma administração oral diária
de KI-10F (1 mg / kg), 5-FU (10 mg / kg) ou veículo (0,7% de CMC) durante 3 semanas. (A) O volume do tumor e
(B) de peso corporal alterações dos ratinhos nudes foram medidos antes do tratamento.
Resultados e Discussão
Indução de apoptose