UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA
CURSO DE GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
DISCIPLINA: EPIGENÉTICA PARA BIOMONITORAMENTO

Esgotamento Materno de Piwi e

seus impactos na formação da heterocromatina
em Drosophila

Alunas: Dhara Isabelly Alves

Nicole Fernandes Silva
Orientador(a): Profª. Drª. Rute Magalhães Brito
Heterocromatina X Eucromatina
o Material cromossômico denso
o Pobre em genes
o Mais condensada
o Arranjos cromossômicos regulares
o Rica em marcadores de
o Rica em genes
silenciamento:
H3K9me2/3 e proteína HP1a o Acessível a transcrição
o Rica em acetilação de histonas e
o Regulação do DNA:
Reparo, silenciamento de elementos de marcas H3K4me2/3
transposição e manutenção da
integridade do genoma.
o Ausência da regulação de proteínas
constitutivas e reguladoras
Disfunção celular
 PAPEL DO RNA NÃO CODIFICANTE (ncRNA) PARA A PRODUÇÃO DA HETEROCROMATINA

Schizosaccharomyces pombe
o Repetições dg/dh em regiões heterocromáticas
do centrômero ativamente transcritas na fase S

siRNAs

Guiam o complexo de silenciamento

transcricional induzido para regiões a serem
heterocromatinizadas
 siRNAs
Histona
metiltransferase
Clr4
(H3K9me2/3)
Estabilização
do complexo
RITS
Ligação
homóloga P1a
Swi6 através do
seu
cromodomínio
Dispersão da
cromatina
enriquecida com
H3K9me2/3.
Plantas, ciliados, vermes (C.elegans), mamíferos e moscas (Drosophila)
 Drosophila melanogaster

Gene eucromático justaposto com uma massa de

PIWI
heterocromatina

Expressão aleatória em diferentes células

Entra no núcleo e auxilia no
silenciamento de TEs Variegação de efeito de posição (PEV)

Auxilia na formação da heterocromatina Silenciamento do gene alvo (reporter)

Dispersão de componentes de silenciamento da

***Desconhecido se o estado da massa de heterocromatina adjacente
cromatina pode ser herdado depois da
PEV
mitose ou se depende de um estímulo
Reporter sensitivo do ambiente heterocromático
recorrente de elementos cis.
1. DEPLEÇÃO DA HP1a FUNCIONAL EM EMBRIÕES LEVA AO
IMPACTO DURADOURO EM PEV REPORTERS VISTOS EM
ANIMAIS ADULTOS
 HP1: Montagem e manutenção da heterocromatina
Silenciamento de PEV reporters é sensível a dosagem e HP1a

Ovário c/ embriões(0 a 12h): alto nível de expressão do gene da HP1a [Su(var)205]

Adultos: nível moderado

Efeitos da perda da função da HP1a em PEV reporter line BL1

embriões iniciais
o Alteração no cromodomínio da HP1a, impedindo o
sua ligação com a H3K9me2/34
Macho selvagem X Fêmea c/ depleção de HP1a
o Inversão no alelo do transgênico hsp70-lacZ reporter
Gene reporter posicionado adjacente a massa
pericentrica de heterocromatina no cromossomo 3L
o Mutação na HP1a  aumento significante na
expressão de hsp70-lacZ em moscas adultas.

Impactos da depleção maternal: Moscas M e Z aumento da atividade de B-

Linhagem germinativa materna; galactosidase;
Zigoto inicial Moscas M+ZSupressão de PEV é aditiva.
 Imunoprecipitação da cromatina- PCR quantitativo
o Moscas adultas;
o Medir enriquecimento nos níveis de marcas
Fenótipo PEV, acoplado a alguma depleção
silenciadoras (HP1a e H3K9me2) no 118E10 reporter;
nas marcas de silenciamento HP1a e
o Explorar a perturbação na estrutura da cromatina;
H3K9me2

HP1a e H3K9me2 Dimínuido na sequencia promotora

Observado no adulto, mesmo quando o zigoto
hsp70 dos reporters M, Z e M+Z.
em desenvolvimento possui dois alelos do tipo
selvagem de Su (var) 205.
Nível de H3K9me2
Moscas C > moscas M
Mutação HP1a  impacto na montagem
Moscas Z >moscas M + Z
posterior da heterocromatina.
Depleção materna do HP1a funcionalimpacto persistente
no zigoto inicial no momento da formação da
heterocromatina
o Papel na formação e / ou manutenção da heterocromatina
durante o desenvolvimento posterior;
o Apesar dos efeitos maternos serem pequenos

Maior perda de silenciamento nas moscas M + Z , quando

comparadas com Z

******Déficit durante a formação de heterocromatina não

pode ser totalmente superado através do fornecimento da
proteína necessária posteriormente durante o
desenvolvimento.
2. O IMPACTO DO PIWI NA CROMATINA DE UM TECIDO
SOMÁTICO NÃO-GONODAL EM ADULTOS, REFLETE SUA
FUNÇÃO NO ESTABELECIMENTO DA HETEROCROMATINA
NO EMBRIÃO INCIAL
 Alelo nulo piwi2
o Reduzir os níveis de Piwi em todos os tipos de células;
PIWI
o Proteína de ligação ao piRNA
Ovários das fêmeas heterozigotas piwi2 / +
o Transporta pequenos RNAs para o
núcleo
Diminuição de 2x nos níveis de proteína Piwi em
o Interage com HP1a
comparação com o tipo selvagem
o Acúmulo de marcas silenciosas locais
 silenciar alvos transcricionalmente.
Redução de 2 vezes na carga materna de Piwi nos ovos
 
das mães piwi2 / +

Filhotes que herdaram o alelo do tipo selvagem de piwi de

ambos os pais

Esgotamento materno de Piwi (M).

Filhotes de piwi2 / +

Esgotamento materno e zigótico (M + Z)

Efeito da depleção materna de Piwi sobre
o silenciamento nas células somáticas Depleção materna de Piwi
não gonadais
Menos silenciamento da expressão do repórter BL1 em ​
o Atividade da b-galactosidase em carcaças
tecidos somáticos não gonadais em adultos.
e ovários separadamente

Ovários
Moscas adultas M e M + Z

Níveis de expressão da b-galactosidase do repórter BL1

Piwi empobrecido em embriões precoces por
nas moscas M e M + Z são novamente mais altos que os
efeito materno
controles relevantes C e Z.
Reporter de PEV hsp70-lacZ localizado na
Níveis M e Z
heterocromatina pericêntrica 3L (reporter
BL1)
Mais altos que os das moscas C e menor que em moscas
M+Z
Maior expressão nas carcaças do que nos
controles relevantes (C e Z).
 Papel de Piwi no silenciamento de Moscas fêmeas geneticamente selvagens
heterocromatina em células somáticas
não gonadais
Sujeitas à depleção de Piwi
o Determinar se a depleção materna de
Piwi tem algum efeito nas linhagens
oculares; Embriões iniciais
o Linhas reporters 118E10 e wm4 ;
Perda de silenciamento do reporter de PEV nos
Níveis de pigmento ocular nas moscas M tecidos somáticos e gonadais (M)
e M + Z em comparação com as moscas
C e Z de controle

****** Impacto do material materno (proteínas e

Aumento fraco e significativo RNAs) envolvidos na formação da heterocromatina
são transmitidos às células polares, e também as
células somáticas da prole no estágio inicial do
Efeito materno embrião.
Resultado mostrado pela coloração com X-gal dos ovários

1. Piwi é importante tanto em embriões quanto no desenvolvimento de células gonadais

femininas para determinar o estado silencioso do reporter;

2. piRNAs maternos são necessários para silenciar retrotransposons nas células

somáticas do ovário;

3. Piwi é necessário na OSC (uma linha celular derivada de células somáticas do ovário)

e nas células foliculares para manter o silenciamento transcricional de elementos

transponíveis;
3. O SILENCIAMENTO DO PIWI EM EMBRIÕES INICIAIS TEM
UM EFEITO DURADOURO VISTO EM ANIMAIS EM
ESTÁGIOS AVANÇADOS
 EFEITO PRECOCE DE PIWI NO ESTABELECIMENTO DA HETEROCROMATINA
Knock-down (KD) da expressão de piwi no zigoto
inicial
o Drivers nanos-GAL4-tubulina (NGT) específicos
da linha germinativa do sexo feminino com as
linhas transgênicas UAS-shRNA produzidas pelo
projeto TRiP Níveis de RNA e proteína do gene
alvo KD foram medidos.
Fêmeas com drivers NGT cruzadas com machos
com shRNA hairpin targeting Piwi
mRNA de Piwi diminui 2 vezes em embriões F1
Consequência da GAL4 carregada pela mãe que
conduz o hairpin de shRNA fornecido paternalmente
 Nível da proteína Piwi é reduzido em 2 vezes
nesses embriões
 Knock-down de Piwi no início do zigoto pode
levar a qualquer perturbação na estrutura da
heterocromatina em animais em estágio
posterior.
Estratégia KD
Larvas e animais adultos
Depleção precoce de Piwi
Supressão da variegação de hsp70-lacZ
 Teste de atividade da b-galactosidase

Eventos no embrião inicial

Nível de expressão de hsp70-lacZ elevado em
2x em todo o animal
Testada em discos imaginários larvais usando
coloração com X-gal
Aumento no número de células com expressão
ativa de lacZ após Piwi KD
Zigotos iniciais
Piwi KD leva à supressão da variegação do
PEV reporter
*****Piwi possuim um papel no estabelecimento
da heterocromatina e suas consequencias são
mantidas pela herança mitótica.
ChIP-qPCR
o Analisar níveis de HP1a na região
promotora hsp70-lacZ em animais adultos
o Mecanismo baseado em cromatina (?)
Adultos
Nível diminuiu 2x após a KD nos zigotos
iniciais
*****Supressão do PEV causada pelo
esgotamento de Piwi no zigoto inicial é um
mecanismo baseado em cromatina
******Expressão aumentada do repórter
perturbação dos níveis de HP1a
 Enriquecimento de HP1a por ChIP-Qpcr

HeT-A

Depleção no embrião inicial

Diminuição de 2x na região promotora

Níveis de HP1a associados a sangue e bari

Inalterados

Fronteira da heterocromatina e da eucromatina

Reporters de PEV são alvos particulares do mecanismo

envolvido e / ou particularmente sensíveis

Depleção de Piwi nos zigotos iniciais

Pequeno impacto na estrutura da heterocromatina

4. O KD ESPECÍFICO DA LINHAGEM OCULAR DE HP1a OU
EGG, MAS NÃO DOS COMPONENTES DE RNAi PIWI OU
AGO2, SUPRIME A VARIEGAÇÃO
 Foi examinado o impacto da
mutação e diferentes genes, com
ênfase na linhagem dos olhos,
usando o driver ey-GAL4.

40% 80% 60% 50% Os resultados obtidos mostram que

HP1a e EGG estão ativamente
envolvidos na manutenção da
heterocromatina nos locais de
repórter na divisão celular
somáticas durante o
desenvolvimento após o estágio
embrionário tardio.
5. OS ANIMAIS MUTANTES NULOS DE PIWI EXIBEM
APENAS PEQUENAS ALTERAÇÕES NA DISTRIBUIÇÃO DE
HP1A EM MASSA
 Os ensaios de PEV demonstram que, para tecidos
somáticos em moscas, o impacto de Piwi na
formação de heterocromatina decorre de sua
função no embrião inicial, estágio em que o Piwi é
enriquecido nas células polares e na maior parte
do embrião.

O resultado mostra que a depleção de Piwi resulta

em um pequena redução geral de HP1a em
sequência heterocromáticas, com variações entre
diferentes classes e elementos de
Text Here heterocromatina.
Easy to change
colors, photos and
Text.
Esse resultado defende uma variedade de
mecanismos para a formação da heterocromatina,
com a Piwi desempenhando um papel significativo
Text Here Text Here em um subconjunto de ETEs.
Easy to change Easy to change
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Text. Text.
 CONCLUSÃO

o Piwi e o sistema piRNA associado são necessários (direta ou indiretamente) para

guiar HP1a a um subconjunto de TEs;

o Quando o Piwi está esgotado, o nível de HP1a é significativamente menor nos locais
de esgotamento;

o Perdas de HP1a é vista em geral nas regiões heterocromáticas, visto que a

heterocromatina é enriquecido em ETs e outros elementos repetitivos.
 CONCLUSÃO

o No geral, os experimentos demonstram que o papel de Piwi no recrutamento da HP1a e

outros componentes para algumas regiões TE acontecem no início do desenvolvimento,
enquanto HP1a é essencial para a formação da heterocromatina durante cada ciclo
celular.

o Dessa forma, qualquer interação HP1a-Piwi provavelmente ocorre nas células gonadais
e nos embriões iniciais

o Os resultados sugerem ainda que o sistema piRNA provavelmente atua no contexto de

múltiplos mecanismos para formação de heterocromatina.
 REFERÊNCIAS

o TINGTING GU, S.C.R.E. “Maternal Depletion of Piwi, a Component of the RNAi

System, Impacts Heterochromatin Formation in Drosophila”, 2013. Disponível em:
<https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24068954. Acesso em: 20 setembro 2019.