Rita Luz BioCell

Faculdade de Medicina de Lisboa
Biologia Molecular da Clula
1Ano 2003/2004
FML Biologia Molecular da Clula
Este documento inclui resumos de uma parte da matria leccionada na disciplina de Biologia Molecular da Clula. Os captulos correspondem aos do livro aconselhado (The Cell, Cooper and Hausman) estando ausentes os referentes a Cancro e Ciclo Celular. Torna-se importante referir que os seguintes apontamentos no foram revistos, logo, natural que se encontrem erros. Espero que este resumo seja til para a reviso de matria, pois sempre aconselhvel estudar pelo livro. Rita Luz
3. Princpios Fundamentais da Biologia

Hereditariedade, Genes e DNA
1. Genes e Cromossomas
Genes: Nucletidos com determinada sequncia de bases no DNA Unidade dos cromossomas que transmite caractersticas de pais para filhos Unidade de diferena que torna distintos os indivduos de uma populao Registo histrico das alteraes sofridas pelos organismos ao longo do tempo. Os genes podem apresentar formas alternativas responsveis pelos caracteres contrastantes. As formas alternativas de um mesmo gene so chamadas genes alelos. Locus: a zona de um cromossoma onde se situa um gene e corresponde, portanto, localizao fsica do gene. Loci: o plural de locus e onde os dois alelos que controlam um determinado carcter esto localizados, nos dois cromossomas homlogos. Genes autossmicos: so os genes que se localizam nos autossomas e o seu modo de transmisso define a hereditariedade autossmica. Factor dominante: o factor que se manifesta quando os dois factores se encontram em presena um do outro. Factor recessivo: o factor que no se manifesta quando em presena do dominante correspondente. Gentipo: constituio gentica de um indivduo em relao a uma determinada caracterstica, isto , o gentipo diz respeito poro da molcula de DNA que se expressa numa determinada caracterstica. Fentipo: o conjunto de caracteres que um indivduo manifesta resultantes do seu gentipo, corresponde ao modo como o gentipo se expressa. O fentipo compreende as caractersticas anatmicas, fisiolgicas e at comportamentais que se observam no indivduo. Homozigtico: quando os dois alelos de um par de cromossomas homlogos so idnticos. Todos os seus gmetas so idnticos relativamente aos genes considerados. Pode ser homozigtico dominante, se o par de alelos for o factor dominante e pode ser homozigtico recessivo, se o par de alelos for o factor recessivo. Heterozigtico: se os dois alelos de um par de cromosomas homlogos so diferentes, origina gmetas que so uns portadores de uma forma allica e outros da outra forma allica. Caritipo: conjunto de cromossomas de uma clula, que pelo nmero, forma e tamanho caracteriza uma dada espcie. Cromossomas homlogos: so pares de cromossomas que so semelhantes entre si e que contm informao gentica para o mesmo fim, embora possam ser diferente. Clulas haplides: clulas cujos ncleos no apresentam cromossomas homlogos. (n) Clulas diplides: clulas cujos ncleos apresentam cromossomas homlogos. (2n) Meiose: processo de diviso nuclear atravs do qual um ncleo diploide origina quatro ncleos haplides, isto , h reduo do nmero de cromossomas em cada nova clula (passa a metade). Assim, os organismos que se reproduzem sexualmente atravs da fecundao mantm nas suas clulas somticas o mesmo nmero de cromossomas, de gerao para gerao. Durante a meiose, os cromossomas trocam de material, levando recombinao entre genes.
2. Genes e Enzimas
Cada gene especifica a estrutura de uma nica enzima: um gene uma enzima.
3. Identificao do DNA como material Gentico

Descoberta que o principio transformador era o DNA atravs da demonstrao que a actividade deste principio era abolida pela digesto enzimtica do DNA e no das protenas.
4. Estrutura do DNA
Constituintes dos nucletidos: cido fosfrico: molcula com um tomo de fsforo, que confere aos cidos nucleicos as suas caractersticas cidas. Pentoses: monossacardeo com cinco tomos de carbono. A pentose do DNA a desoxirrobose (com apenas 4 tomos de carbono) e a pentose do RNA a ribose (com 5 tomos de carbono). Bases azotadas (varivel de nucletido para nucletido) Purinas (anel duplo) - Adenina (A) e Guanina (G) Pirimidinas (anel simples) - Timina (T) - apenas no ADN, Uracilo (U) - apenas no RNA, Citosina (C) Estrutura do DNA: So polmeros constitudos por nucletidos A sua unio realizada por reaces de condensao O grupo hidroxilo do C5 da desoxirribose reage com o oxignio do grupo fosfato (que est ligado ao C1) resultando numa ponte fosfodister com libertao de gua. Cada novo nucletido liga-se pelo grupo fosfato que est ligado ao carbono 5' da base azotada, ao carbono 3' da pentose do ltimo nucletido da cadeia, repetindo-se o processo 5' 3'. Segundo o modelo da dupla hlice de Watson e Crick, cada molcula de DNA constituda por duas cadeias enroladas helicoidalmente volta de um mesmo eixo, antiparalelamente. A pentose e o cido fosfrico so hidroflicos por isso encontram-se no exterior da estrutura do DNA. As bases azotadas so hidrofbicas por isso encontram-se na parte interior da estrutura do DNA. As bases que se emparelham so as bases complementares: a Adenina liga-se Timina ( A = T) por duas ligaes de hidrognio; a Guanina liga-se Citosina (G C) por trs ligaes de hidrognio. Se uma cadeia tiver mais ligaes A = T torna-se mais instvel. As duas cadeias polinucleotidcas da dupla hlice desenvolvem-se em direces opostas. Cada uma delas inicia-se por uma extremidade 5' e termina em 3'.
5. Replicao do DNA
A descoberta da complementaridade de bases entre as cadeias de DNA sugeriu que elas poderiam separar-se para servir como molde para a sntese de novas cadeias complementares hiptese de replicao semiconservativa. Segundo a hiptese de replicao semiconservativa podem considerar-se vrias etapas: 1. As duas cadeias da dupla hlice na presena de enzimas especficas, DNA polimerases, separam-se por ruptura das ligaes de hidrognio. 2. Cada uma dessas cadeias serve de molde formao de uma cadeia complementar, sendo utilizados nucletidos que existem livres na clula. 3. Formam-se simultaneamente duas cadeias de desoxirribonucletidos de acordo coma regra das bases complementares. Os novos nucletidos, medida que se vo colocando, ligam-se por aco enzimtica desoxirribose do nucletido anterior, desenvolvendo-se duas cadeias complementares das duas cadeias originais, sendo cada cadeia antiparalela em relao que lhes serviu de molde. 4. As reaces de condensao ordenada de nucletido processam-se no sentido 5' 3', crescendo duas cadeias em sentidos opostos. 5. Quando o processo de replicao termina esto formadas duas molculas de DNA idnticas entre si e idnticas molcula original. Replicao: provm do facto de as novas cadeias formadas serem uma rplica das cadeias originais, o que leva a uma identidade entre as molculas recm-formadas e a molcula original. Semiconservativa: pelo facto de permanecer, em cada uma das novas molculas, uma das cadeias polinucleotdicas da molcula original. AZT Liga-se extremidade 3 da sequncia de nucletidos Impede a ligao do grupo fosfato do nucletido seguinte eficaz no tratamento da SIDA, pois o vrus HIV ao entrar na clula tem que se replicar, se existir AZT na extremidade da sequncia impossvel a adio de novos nucletidos Trava o crescimento do DNA, mas no para, pois existem muitas cadeias de DNA.
Expresso da Informao Gentica

Os genes actuam na determinao da estrutura das protenas, responsveis pelo metabolismo celular atravs da actividade das enzimas As protenas so polmeros de 20 aminocidos cuja sequncia determina a funo e estrutura.
1. Colinearidade de Genes e Protenas

A ordem dos nucletidos especifica a ordem dos aminocidos da protena. Mutaes num gene implica alteraes na sequncia de DNA, a qual poderia resultar na substituio de um nucletido por outro, adio ou deleco. A posio da mutao no gene reflecte-se na posio do aminocido da protena codificada.
2. A funo do RNA mensageiro

Apesar do DNA especificar a ordem dos aminocidos nas protenas no necessariamente o responsvel directo pela sntese proteica. O DNA encontra-se no ncleo celular, nas clulas eucariotas, e a sntese proteica d-se no citoplasma, logo existe uma molcula que transporta a informao gentica para os locais de sntese proteica (ribossomas) O RNA sintetizado a partir de uma molde de DNA, sendo o intermedirio para a sntese proteica.
RNA DNA, porque: constitudo por uma nica cadeia O componente glicidico a ribose e no a desoxirribose Tem como base pirimidinica o uracilo em substituio da timina Como o RNA se encontra no citoplasma, este aparece como intermedirio da converso da informao do DNA para os ribossomas, assim: As molculas de RNA so sintetizadas a partir do mode de DNA transcrio As porteinas so sintetizadas de moldes de RNA - traduo O RNA mensageiro (por servir de intermedirio) transcrito do DNA pela RNA polimerase que cataliza a sntese de RNA a partir do molde de DNA.
Existem mais tipos de RNA importantes para a sntese proteica: RNA ribossomal (rRNA): um componente dos ribossomas RNA de transferncia (tRNA): serve como molcula adaptadora dos aminocidos ao longo do mRNA.
3. Cdigo Gentico
No existe complementaridade entre os aminocidos e o mRNA, logo existem tRNAs que servem de adaptadores durante a traduo. Cada aminocido ligado, por uma enzima especfica, ao tRNA apropriado O emparelhamento entre as bases de mRNA e tRNA dirige o aminocido que lhe est ligado para o local correcto do molde de mRNA. A partir de sequncias das quatro bases nucleotdicas do DNA - adenina (A), timina (T), citosina (C) e guanina (G) - possvel formar exactamente 64 palavras cdigo de trs letras diferentes, tripletos ou codes. Estes tripletos representam a mais pequena unidade da mensagem gentica que vo codificar a ordenao de sries de aminocidos que caracterizam diversas protenas. Trs das 64 palavras possveis so utilizadas como sinais de paragem (codes STOP), significando que se, chegou ao fim do cdigo de uma protena. As outras codificam os 20 aminocidos. Mais que uma palavra, alis entre uma e seis, podem codificar o mesmo aminocido. A introduo ou retirada de 1 ou 2 nucletidos alteram a leitura do gene inteiro, enquanto que a introduo ou retirada de 3 nucletidos leva a que a protena tenha mais ou menos um aminocido; o resto da sequncia mantm-se inalterada. A leitura dos nucletidos comea num local fixo.
Caractersticas do cdigo gentico: "Universalidade" - h uma linguagem comum a quase todas as clulas, mas existem excepes regra tal como o caso dos protozorios ou o caso do ADN das mitocdrias. Redundncia - neste cdigo vrios codes so sinnimos, isto , podem codificar o mesmo aminocido. Este fenmeno tambm conhecido por degenerescncia do cdigo gentico. O cdigo no ambguo - o mesmo codo em regra no codifica aminocidos diferentes. O terceiro nucletido de cada codo no to especfico como o primeiro O tripleto AUG tem uma dupla funo - codifica o aminocido metionina e uma codo de iniciao da sntese proteica. Os tripletos UAA, UAG e UGA so codes de finalizao - estes codes representam sinais de fim de sntese e no codificam aminocidos.
4. Vrus RNA e transcrio reversa

Existem vrus que contm apenas RNA e protenas. So capazes de sintetizar RNA atravs do RNA modelo, usando o mesmo sistema de complementaridade de bases que na replicao de DNA ou transcrio de DNA para RNA. Este processo implica a aco de uma enzima especfica. Os vrus que contm apenas RNA (os retrovirus) replicam, via sntese de DNA intermdio, o DNA provirus. Os retrovirus, contm uma enzima especifica (transcriptase reversa) que cataliza a sntese de DNA a partir de RNA transcrio reversa. A transcrio reversa importante: 1. Para a replicao dos retrovirus 2. Como no restrita aos retrovirus, tambm ocorre nas clulas, responsvel pela transposio de sequncia de DNA de um cromossoma para outro. 3. As transcriptases reversas podem ser utilizadas para gerar copias de DNA a partir do RNA, permitindo o estudo de mRNAs de clulas eucariotas.
DNA Recombinante
A manipulao gentica permite a criao de uma nova molcula de DNA, geralmente pela recombinao de DNA de diferentes organismos, por meios artificiais, utilizando-se enzimas conhecidas como enzimas de restrio, e a consequente produo de muitas cpias de DNA recombinante. Este processo designa-se clonagem. Os passos bsicos numa experincia de clonagem molecular so os seguintes: 1. Insere-se o fragmento de DNA a ser clonado numa molcula de DNA com capacidade de auto-replicao, denominada vector, originando uma molcula de DNA recombinante. 2. O vector funciona com um veculo que introduz o DNA numa clula hospedeira, geralmente bactria, embora se possam usar outros tipos de clulas. 3. Uma vez no interior da clula hospedeira o vector multiplica-se, produzindo-se inmeras cpias idnticas, no s do vector mas tambm do fragmento de DNA que ele contm. 4. Quando a clula hospedeira se divide, as cpias das molculas de DNA recombinante so transmitidas descendncia e ocorre novo ciclo de replicao. 5. Aps um grande nmero de divises celulares, uma colnia ou clone de clulas hospedeiras geneticamente idnticas gerado. Cada clula do clone contm muitas cpias da molcula de DNA recombinante; o fragmento de DNA introduzido na molcula de DNA recombinante diz-se agora clonado. 6. Para alm da obteno de mltiplas cpias idnticas de um fragmento de DNA, a clonagem de um gene num vector adequado (vector de expresso) permite a obteno de grandes quantidades de protena recombinante.
1. Vectores de clonagem
Molculas de DNA que tm como funo transportar o DNA de interesse para a clula hospedeira. Geralmente so vectores plasmdicos que tm como base plasmdeos naturais que so posteriormente modificados por tcnicas de engenharia gentica. Os plasmideos so pequenas molculas de DNA circular que se replicam independentemente (sem estarem associados ao cromossosma). As caractersticas mais importantes de um vector de clonagem so: Origem de replicao (ORI): permite que o vector e a molcula de DNA recombinante, se mantenha na clula e seja transmitida descendncia. Marca de seleco: a maioria dos vectores plasmdicos possui um gene que confere resistncia a um antibitico. Assim, apenas as bactrias que possuem o DNA recombinante sobrevivem quando crescidas em presena desse antibitico. Local de policlonagem (MCS): pequena Promotor sequncia de DNA (~100 pb) que contm locais de corte nicos para vrias enzimas de Local de restrio. neste local que introduzido o Origem de policlonagem fragmento de DNA que se pretende clonar. replicao Promotor: presente apenas em vectores de Vector B expresso e localizado a montante do local de policlonagem. A maquinaria de transcrio gentica identifica a sequncia do promotor e transcreve a partir desse local. Serve para quando se pretende a sntese de Resistncia a ampicilina protenas.
2. Enzimas de restrio
So o bisturi que permitem cortar o DNA de um modo preciso e reprodutvel. Fazem parte do grupo das nucleases, enzimas que clivam ligaes fosfodiester entre nucletidos adjacentes. Clivam apenas as ligaes entre nucletidos com uma sequncia especfica. Existem nas bactrias servindo como o modo de defesa contra a entrada de DNA estranho (p.ex.: viral) na clula que contenha a sequncia especifica identificada pela enzima em causa. Reconhecem sequncias com 4 a 8 pares de bases. Existem enzimas que de modo a evitar a autodestruio de cadeia, ao reconhecerem sequncias estranhas introduzem um grupo metilo (metilases).
Mapas de restrio: mostram os locais de quebra de diferentes endonucleases de restrio de molculas de DNA.
3. Formao de molculas de DNA recombinante

As enzimas de restrio digerem o plasmideo e o DNA deixando livres extremidades com sequncias especificas. As extremidades do vector e do fragmento de DNA so unidas pela complementaridade das bases pela aco de DNA ligases no especificas. Se o vector e o DNA forem tratados com a mesma enzima de restrio, as extremidades so complementares, facilitando o processo, no entanto existem 4 possbilidades para a ligao: 1. O vector liga-se a si prprio 2. O fragmento de DNA liga-se correctamente 3. O fragmento de DNA liga-se ao contrrio 4. Liga-se mais do que um fragmento de DNA ao mesmo vector. Se as 2 extremidades forem cortadas com enzimas de restrio diferentes, a especificidade maior, logo o fragmento s se pode ligar correctamente. Os fragmentos de DNA que so clonados no esto limitados aqueles que terminam em locais de quebra das enzimas de restrio. Existem DNA linkers sintticos contendo locais das endonucleases de restrio que podem ser unidos s extremidades cegas de qualquer fragmento de DNA Estes linkers so pequenos oligonucletidos que podem ser obtidos por sntese qumica, permitindo virtualmente que qualquer fragmento esteja preparado para a ligao com o vector. As extremidades protuberantes tambm podem ser tornadas cegas (blunt) atravs do uso exonucleases. O RNA tambm pode ser clonado utilizando a transcriptase reversa que sintetiza DNA (cDNA) a partir do RNA. Como o mRNA contm sequncias que no codificam aminocidos para determinada protena, os intres, a sntese de cDNA a partir do mRNA sem os intres, crucial para o estudo de um gene.
Fosfatases: retiram os grupos fosfato do plasmideo, no entanto a ligao s se estabelece na 1 volta da replicao, j na bactria.
9 Aps a produo de DNA recombinante, abrem-se poros na bactria (pela destabilizao dos ies) para a entrada da molcula produzida. 9 De seguida necessrio realizar uma seleco das bactrias que contm o DNA recombinante, partindo do principio que se o tiverem so resistentes ao antibitico. Para este processo as bactrias so colocadas num meio com antibitico, as clulas que no tiverem DNA recombinante no sobrevivem. 9 Depois, necessrio realizar um extraco do DNA, aps lise das paredes celulares, de modo a poder analis-lo. 9 O cromossoma separado do DNA recombinante por centrifugao, devido s suas diferenas de tamanho. 9 O DNA recombinante novamente sujeito digesto por aco das enzimas de restrio, linearizando a molcula. 9 Os fragmentos de DNA so sujeitos a electroforese. 9 Como nem todos os insertos se ligam ao vector, ou podem ligar-se correcta ou incorrectamente, a electroforese de DNA permite distinguir pelo tamanho e utilizando enzimas de restrio, pelo estudos dos mapas de restrio, todas estas sequncias.
4. Electroforese de DNA em gel

o mtodo utilizado para separar, identificar e purificar fragmentos de DNA consoante o seu comportamento num campo elctrico. O gel geralmente a agarose (polmero extrado do agar) ou poliacrilamida. Os geis preparam-se fundindo a agarose na presena de um tampo apropriado. A soluo obtida deitada num molde e deixada arrefecer at solidificar. Ao solidificar forma-se uma matriz cuja densidade determinada pela concentrao da agarose. Quando se aplica um campo elctrico atravs do gel, o DNA carregado negativamente (devido aos grupos fosfato) migra em direco ao nodo (elctrodo positivo). A velocidade de migrao determinada por um conjunto de parmetros, entre os quais o tamanho da molcula e a concentrao da agarose. O gel actua como um filtro, retardando selectivamente as molculas maiores, enquanto que as molculas mais pequenas movem-se mais rapidamente. A velocidade de migrao inversamente proporcional ao log10 do tamanho do fragmento (em bp) e, para um mesmo tamanho de fragmento de DNA, a velocidade de migrao maior num gel com menor concentrao de agarose. Para a separao de molculas maiores utilizam-se gis pouco concentrados e vice-versa. A migrao das molculas de DNA atravs do gel, depende ainda da voltagem aplicada; quanto mais alta for a voltagem, mais rpida a migrao. Para visualizar o DNA nos geis de agarose utiliza-se o corante fluorescente brometo de etdio. Esta substncia possui grupos qumicos que se intercalam entre as bases do DNA. Em consequncia, o corante ligado ao DNA fluoresce com mais intensidade do que o corante livre, quando irradiado com luz ultravioleta. O brometo de etdio permite detectar cadeias simples e duplas de cidos nucleicos, tanto DNA como RNA. Por conveno, os gis de DNA so lidos da esquerda para a direita, com os poos colocados no topo. A rea do gel perpendicular ao poo designa-se pista ou lane. Ao olhar para uma lane analisam-se os fragmentos de DNA colocados nesse poo. Fragmentos de DNA com o mesmo tamanho migram a mesma distncia no gel dando origem a bandas. Por conveno, o tamanho de cada fragmento de DNA expresso pelo nmero de pares de bases que o constituem (bp).
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5. Sequenciao de DNA
A clonagem molecular permite o isolamento de fragmentos individuais de DNA em quantidades adequadas para caracterizao adequada, inclusive determinao da sequencia de nucletidos. A sequenciao permite: Saber a protena produto Estudar as propriedades de sequencias de DNA que regulam a expresso do gene.
Processo: 1. Desnatura-se o DNA a sequenciar 2. Incuba-se com um primer, na presena de DNA polimerase e dos quatro desoxinucletidos (dATP, dCTP, dTTP, e dCTP), um dos quais radioactivo. 3. O produto desta reaco depois dividido por quatro tubos, a cada um dos quais se junta um didesoxiribonucleosido-trifosfato (ddATP, ddCTP, ddTTP, e ddCTP). Didesoxiribonucleosido-trifosfato: nucletidos modificados so desprovidos de grupo hidroxilo ligado ao carbono 3, e, portanto, impedem o alongamento das cadeias de DNA em que so incorporados. 4. Como em cada tubo existem milhes de molculas de DNA, originam-se fragmentos de diversos tamanhos consoante a posio de cada nucletido na sequncia original. 5. O DNA de cada tubo (A, C, T, e G) desnaturado e colocado num gel de acrilamida com ureia (para evitar a renaturao do DNA durante a electroforese). 6. No final, o gel seco e autoradiografado. Os nucletidos radioactivos incorporados do origem a uma srie de bandas que indicam o tamanho dos fragmentos de DNA produzidos em cada tubo de reaco. Ao contrrio dos gis de agarose, os gis de acrilamida permitem resolver molculas de DNA cujo comprimento difere apenas num nucletido. Como a sntese de DNA ocorre de 5 para 3, os fragmentos menores resultam de uma incorporao do dNTP mais prxima da extremidade 5. Em consequncia, a leitura do gel de baixo para cima indica a sequncia de nucletidos da cadeia 5-3. Para iniciar a reaco de sequenciao necessrio um primer, logo o DNA desconhecido tem de ser enquadrado numa sequncia conhecida, para a qual o primer ser complementar.
Primers: oligonucletidos sintetizados quimicamente de modo a obter sequncias com cerca de 20 bases complementares do incio da cadeia de DNA que se pretende sequenciar. A sequenciao automtica permite acelerar e mecanizar a maior parte do processo de anlise dos resultados. Os diferentes produtos de reaco (G; A; T; C) tm incorporados nucletidos fluorescentes em vez de nucletidos radioactivos, cada um deles com uma cor diferente, num total de 4 cores. A leitura do sinal fluorescente feita por um scanner apropriado que, estando acoplado ao aparelho de electroforese, faz a leitura directamente do gel enquanto a electroforese decorre. A leitura feita em simultneo com a migrao dos fragmentos atravs do gel: sempre que no local do scanner passa uma banda que fluoresce numa cor representado um pico no grfico dos resultados e o software atribui-lhe a letra correspondente cor detectada.
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6. PCR (polymerase chain reaction)

Permite obter in vitro grandes quantidades de uma sequncia definida de DNA S necessrio conhecer as sequncias que ladeiam o fragmento a amplificar uma alternativa clonagem molecular
Componentes de uma reaco de PCR Molde, template Primer (ligam-se s extremidades que se pretende ladear, sendo complementares s regies que flanqueiam a sequncia a amplificar) DNA polimerase (taq polimerase, termoestvel e assegura a polimerizao 5 3) Nucletidos dNTP Termocycler (assegura ciclos rpidos de aquecimento e arrefecimento) Tampo de reaco Processo: Desnaturao da cadeia por aquecimento Adio de um excesso de primers e de dNTP Ligao dos primers por arrefecimento Polimerizao pela adio da DNA polimerase
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Deteco de cidos Nucleicos e Protenas

1. Hibridao de cidos nucleicos
A chave para detectar sequncias especificas de cidos nucelicos o emparelhamento de bases complementares de cadeias de DNA e RNA A temperaturas altas, as cadeias complementares de DNA separam-se (desnaturam-se) originando cadeias simples de DNA Se as cadeias separadas forem incubadas nas condies ideais, renaturam pela complementaridade de bases hibridao de cidos nucleicos. Podem-se formar hbridos com 2 cadeias de DNA, 2 de RNA ou uma de cada. A hibridao de cidos nucleicos permite detectar sequncias de DNA ou RNA complementares de um cido nucleico isolado, como um genoma viral ou sequncia de DNA clonado. O DNA clonado marcado radioactivamente, sendo sintetizado na presena de nucletidos radioactivos. DNA radioactivo usado como sonda para hibridao com sequncias complementares de DNA e RNA, detectados devido radioactividade dos hbridos resultantes de 2 cadeias. Southern Blotting O Southern blotting permite a anlise de fragmentos genmicos de grandes dimenses e no exige o conhecimento prvio da sequncia de nucletidos da regio de interesse. A tcnica de Southern blotting envolve: Separao de DNA genmico por electroforese em gel de agarose Transferncia das molculas separadas para um suporte slido (membrana ou filtro de nitrocelulose) hibridao com uma sonda marcada (em geral, radioactivamente) Deteco do sinal da sonda (por autoradiografia). Devido s grandes dimenses do DNA genmico, para que se possa proceder sua separao, necessrio trat-lo com uma enzima de restrio. Esta enzima vai cortar o DNA de forma previsvel, dando origem a milhares de fragmentos genmicos diferentes que cobrem um leque vasto de tamanhos, produzindo um aspecto tpico de mancha arrastada (smear) aps electroforese. As dimenses dos fragmentos genmicos formados vo ser caractersticos de cada indivduo, j que so consequncia da existncia de um local de restrio da enzima usada em determinada posio do genoma e, portanto, reflectem a sequncia do genoma. Aplicaes da Southern blotting: Variaes polimrficas da sequncia do genoma 9 STRs short tandem repeats 9 VNTRs - variable number of tandem repeats 9 SNPs - single nucleotide polymorphisms) Mutaes podem causar diferenas no tamanho dos fragmentos de restrio observados numa populao (RFLPs - restriction fragment length polymorfisms) 9 por destruio ou criao de locais de restrio 9 por aumento ou reduo do nmero de nucletidos situado entre dois locais de restrio. So diferenas de dimenso facilmente detectveis por esta tcnica.
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Northen Blotting Permite analisar o RNA, da mesma forma que o Southern para DNA Como o RNA j fragmentado o passo da digesto com enzimas no necessrio. D-nos a informao da expresso de um gene Hibridao in situ (FISH) A hibridao de cidos nucleicos tambm pode ser usada para detectar sequncias de DNA ou RNA homlogas em cromossomas ou clulas intactas Os resultados so analisados por examinao microscpica Pode ser usado para detectar o locus do gene no cromossoma mRNAs especficos em clulas do mesmo tecido.
2. Deteco de pequenas quantidades de DNA e RNA por PCR

uma tcnica muito sensvel Amplifica-se DNA (ou RNA aps transcrio reversa) at atingir nveis detectveis Usam-se primers de oligonucletidos que hibridam com a sequncia complementar do molde Pode detectar-se DNA especifico em pequenas quantidades de material gentico
3. Anticorpos como sondas para protenas

Os anticorpos reagem selectivamente com protenas nicas. Os anticorpos so protenas produzidas pelo sistema imunitrio (linfcitos B) que reagem contra molculas (antignios) presentes em substncias estranhas, identificando-as. O sistema imunitrio produz milhes de anticorpos que identificam antignios especficos, que podem ser protenas, carbohidratos, etc. Um linfcitos apenas produz um tipo de antignio Os anticorpos podem ser produzidos pela inoculao de um animal com qualquer protena diferente Os anticorpos podem ser criados contra protenas purificadas de clulas, tal como outros materiais que podem ser utilizados para imunizao. Os anticorpos podem tambm servir para reconhecer protenas recombinantes Existem anticorpos que reconhecem pptidos de 10 a 15 aminocidos, por isso, conhecendo apenas o inicio do gene que se pretende clonar, possvel produzir anticorpos que reagem contra a protena inteira. Western Blotting ou Imunoblot As protenas extradas das clulas so separadas por electroforese (electroforese em gel de poliacrilamida-SDS), devido aos diferentes tamanhos e carga elctrica. As protenas so colocadas numa soluo de SDS, um detergente carregado negativamente que se liga s protenas desnaturando-as. As protenas passam a ter uma estrutura linear, estando carregadas negativamente. As protenas passam depois para um filtro que permite a reaco com os anticorpos contra a protena de interesse.
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Imunoprecipitao As clulas so incubadas com aminocidos radioactivos que vo marcar as suas protenas Os extractos celulares marcados so incubados com anticorpos que se ligam com o seu antignio-alvo Os complexos anticorpo-antignio obtidos so isolados e sujeitos a electroforese permitindo a deteco dos antignios radioactivos por autoradiografia.
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4. Organizao do Genoma Celular

Complexidade do Genoma Eucaritico
O Genoma Eucaritico muito maior e mais complexo que o procaritico. Um genoma maior nem sempre est relacionado com a complexidade gentica de alguns eucariotas. O genoma eucriota contm no s genes funcionais, mas tambm grande quantidade de DNA que no codifica protenas. Da totalidade do genoma humano (6x109bp) s cerca de 1,5% que contribuem para a codificao de proteinas.
1. Intres e Exes
Gene: segmento de DNA que expresso num produto funcional (RNA ou protena) Muito do DNA eucariotico consiste em sequncias entre genes (space sequences) Dentro do prprio gene tambm podem existir: Exes: sequncias codificantes Intres: sequncias no cidificantes O gene transcrito a RNA que posteriormente sofre splicing, removendo-se os intres e permanecendo os exes de modo a formar um mRNA maduro. A quantidade de DNA em intres e exes varivel, sendo que o 1 pode ser superior ao 2. Os intres esto presentes na maioria dos genes eucariticos, excepto nalguns seres mais simples e tambm em alguns procariotas Pensa-se que os intres representam sequncias que forma importantes no inicio da evoluo, ou que a facilitaram, permitindo a recombinao de exes de alguns genes. O desaparecimento de intres em alguns procariotas deve-se seleco natural por rpida replicao como a rpida diminuio celular no vantajosa em eucariotas superiores, os intres permanecem no seu genoma. Podem ter surgido depois da divergncia, pela insero de DNA em genes j formados como sequncias codificantes contnuas, para permitir o exon shuffling (recombinao entre regies codificantes de diferentes genes)
2. Sequncias repetitivas de DNA

Uma poro substancial dos genomas eucariticos consiste em sequncias de DNA no-codificantes, muito repetidas. As cadeias desnaturadas de DNA hibridam entre si para formar molculas de cadeia dupla Como a hibridao de DNA um processo bimolecular, a taxa de reassociao depende da concentrao de cadeias simples de DNA que colidem entre si. Os fragmentos de DNA de E. coli forma desnaturados e criadas as condies para hibridarem todo o DNA hbrida mesma taxa, uma Vaz que cada sequncia de DNA existe num s local por genoma (no se repete) A reassociao de fragmentos de DNA extrado de clulas de mamferos diferente: 60% hbrida taxa esperada pois existe apenas uma vez no genoma 40% hbrida mais rapidamente, devido existncia de sequncias que existem vrias vezes no genoma (maior a probabilidade de se encontraram e hibridarem)
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Tipos de sequncias repetitivas DNA de sequncias simples Contm milhares de copias de sequncias pequenas. Podem ser separadas do resto do genoma por centrifugao de equilbrio em gradiente de densidade de CsCl As suas densidades so variveis, sendo que as sequncias ricas em A e T so menos densas que as mais ricas em G e C. As sequncias que se separam da cadeia de DNA de acordo com a sua densidade so denominadas de DNAs satlites. Estas sequncias: no so transcritas no contm informao gentica podem desempenhar um papel importante na estrutura dos cromossomas SINEs (elementos curtos dispersos) e LINEs (elementos longos dispersos) Sequencias repetitivas de DNA espalhadas pelo genoma Podem mover-se por diferentes locais de DNA genmico, podendo regular a expresso dos genes ou ter desempenhado um papel evolutivo importante, gerando diversidade gentica.
3. Famlia de genes e pseudogenes

A grande extenso do genoma eucaritico deve-se tambm ao facto de que muitos genes apresentam mltiplas cpias (muito repetidas), pois podem ser necessrios para a produo de grandes quantidades de RNA ou de protenas. Podem tambm encontrar-se no funcionais Por outro lado, a maioria dos genes dos procariotas s existe uma vez no genoma s cpias dos genes eucariotas denominam-se famlias de genes, os quais permitem: Produzir RNA e protenas em grandes quantidades Membros distintos da famlia podem ser transcritos em diferentes tecidos ou diferentes estdios de desenvolvimento Estas famlias podem estar prximas numa regio de DNA, ou estar dispersas em diferentes cromossomas. Origem das famlias de genes Existe duplicao do gene original ancestral Os diferentes membros da famlia divergem como consequncia de mutaes ao longo da evoluo A divergncia pode levar evoluo de protenas envolvidas em diferentes tecidos e estdios ou pode levar perda da capacidade de produzir protenas ou produtos funcionais do gene. Pseudogenes: cpias de genes no funcionais que aumentam o genoma eucaritico sem apresentarem uma contribuio gentica funcional.
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4. Nmero de Genes
Um polipptico mdio possui cerca de 400aa, que correspondem a 1200 b de um mRNA
Genoma bacteriano: Maioria do DNA codifica protenas (90%) Aproximadamente 4300 genes Genoma de leveduras Apenas 4% de genes possui intres 70% dos genes codificam protenas Genoma de animais superiores e humano 1,1% a 1,4% codifica protenas 45% inclui DNA repetitivo O restante til na regulao da expresso, normalmente atravs de sequncias reconhecidas por ehnancers e repressores. Para determinar e identificar o gene usa-se mRNA que passado para DNA por aco da transcriptase reversa (cDNA) ficando apenas a sequncia de exes.
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Cromossomas e Cromatina
O genoma de procariotas contm cromossomas nicos, que so normalmente molculas de DNA circular. O genoma de eucariotas composto por vrios cromossomas, contendo cada um uma molcula de DNA linear. O DNA de clulas eucariotas est ligado a pequenas protenas (histonas) que compactam o DNA de forma ordenada no ncleo.
1. Cromatina
o complexo formado pelo DNA e as protenas As protenas mais abundantes so as histonas que contm uma proporo alta de aminocidos bsicos que facilitam a ligao molcula de DNA carregada negativamente. Existem outras protenas para alm das histonas (nonhistone chromossomal proteins) que participam em vrios processos como a replicao de DNA e a expresso gentica. Nucleossoma: a unidade estrutural bsica da cromatina Cromatossoma: subunidade da cromatina que consiste numa sequncia de 166 pb enroladas volta do ncleo das histonas. O empacotamento do DNA com as histonas compem uma fibra de cromatina composta por cromatossomas separados por segmentos de DNA ligante (DNA linker) A condensao da cromatina varia durante o ciclo celular: Interfase: A maior parte da cromatina est relativamente descondensada (eucromatina) e distribuda para fora do ncleo. Os genes so expressos e o DNA replicado, em preparao para a diviso celular. Os genes que so mais expressos esto num estado mais descondensado para facilitar o acesso da maquinaria de transcrio. 10% da cromatina em interfase est altamente condensada (heterocromatina) e est inactiva para transcrio e contm muitas sequncias repetitivas. Mitose: os cromossomas esto muito condensados e no podem servir de molde para a sntese de RNA, assim a transcrio cessa durante a mitose.
2. Centrmeros
uma regio especializada do cromossoma que assegura a distribuio correcta dos cromossomas duplicados nas clulas filhas, durante a mitose 1. O DNA replicado durante a interfase, resultando na formao de 2 cpias de cada cromossoma 2. Assim que a clula entra em mitose, a condensao da cromatina leva formao de cromossoma que consistem em 2 cromtideos idnticos 3. Estes cromatdeos esto ligados na regio do centrmero 4. Os microtubulos do fuso acromtico ligam-se ao centrmero e as 2 cromatideos separam-se e movem-se para plos opostos. 5. No fim da mitose, a membrana nuclear reposta e os cromossomas descondensam
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Os centrmeros servem como locais de associao entre os cromatideos e de ligao dos microtubulos. Consistem em sequncias especificas de DNA qual protenas (centromereassociated protenas) se ligam, formando uma estrutura especializada: kinetochore. A ligao dos microtubulos ao kinetochore medeia a juno dos cromossomas ao fuso acromtico As protenas associadas aos centrmeros actuam como motores molculas que conduzem o movimento dos cromossomas ao longo das fibras
3. Telmeros
So sequncias no final dos cromossomas eucariticos que so importantes para a replicao e manuteno. Consistem em sequencias simples de DNA repetidas, contendo resduos G numa cadeia. Estas sequncias so repetidas milhares de vezes terminado com uma cadeia simples de DNA. As sequncias repetidas do telmero formam loops no final dos cromossomas aos quais se juntam protenas que protegem a terminao do cromossoma de ser degradado. Os telmeros so importantes da replicao do final das molculas de DNA linear. DNA polimerase capaz de estender uma cadeia de DNA em crescimento, mas no capaz de iniciar a sntese na terminao de uma cadeia de DNA linear. Assim, as extremidades dos cromossomas no podem ser replicados pela aco normal da DNA polimerase. A manuteno dos telmeros parece determinar a capacidade reprodutiva das clulas. Telomerase Protena capaz de produzir telmeros e dos associar molcula que est a ser replicada para continuar a replicao. uma transcriptase reversa da classe das DNA polimerases que sintetiza DNA a partir do RNA. Ela carrega consigo o RNA que lhe serve de molde e que complementar s sequncias repetidas que sintetiza os telmeros.
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6. Sntese e Processamento de RNA

A regulao da expresso gentica permite clula adaptar-se a mudanas no meio ambiente e permite a diferenciao celular das plantas e animais complexos A expresso de um gene comporta as seguintes fases: Transcrio da mensagem gentica - segmentos de DNA codificam a produo de RNA. Processamento de RNA (em eucariotas) Traduo da mensagem gentica - RNA codifica a produo de protenas. Estrutura do RNA O cido ribonucleico, polmero de ribonucletidos em cadeia simples, constitui molculas de dimenses muito inferiores s dimenses das molculas do DNA. Em algumas situaes a cadeia pode dobrar-se sobre si prpria, estabelecendo ligaes com bases complementares da mesma cadeia segundo a complementaridade dos pares de bases: A = U e C G. Apesar da sua simplicidade molecular, funcionalmente as molculas de ARN so diferentes existindo sob trs formas: RNA mensageiro, RNA ribossmico e RNA de transferncia, variando tambm a sua estrutura. O RNA mensageiro o que faz a ligao entre o DNA que se encontra no ncleo das clulas eucariotas e os ribossomas, onde se processa a sntese proteica.
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Transcrio em Procariotas
A sntese de RNA similar de DNA, tal como a DNA polimerase, a RNA polimerase cataliza o crescimento de cadeias de RNA na direco 5 3. Ao contrrio da DNA polimerase, a RNA polimerase no necessita de um modelo (primer) para iniciar a sntese de RNA. A transcrio comea de novo em stios especficos no incio dos genes. O incio da transcrio a etapa reguladora
1. RNA polimerase
Cataliza a polimerizao de ribonuclesido 5trifosfatos (NTPs) constituda por mltiplas cadeias polipeptidicas constituda por 5 subunidades: 2x , , , e . A subunidade est fracamente ligada s outras O ncleo (constitudo pelas subunidades , , e ) totalmente capaz de catalizar a polimerizao (no selectiva), no sendo necessrio a presena da subunidade . A subunidade identifica os stios correctos para iniciar a transcrio, que convm ser no incio do gene.
2. Promotor
a sequncia qual se liga a RNA polimerase para iniciar a transcrio do gene, mas no transcrito. A comparao de vrios genes da E. coli revelou 2 zonas numa regio acima do local de iniciao da transcrio comuns Estas 2 zonas so compostas por 6 nucletidos e esto colocadas a cerca de 10 e 35 pares de bases acima do local de inicio de transcrio so os elementos -10 e -35. As regies onde a RNA polimerase se liga podem ser identificadas por footprinting. Atravs desta tcnica incuba-se o gene de uma protena com a RNA polimerase e em seguida trata-se com DNase que digere o gene. As pores onde a RNA polimerase se ligam ficam protegidas e no so digeridas e atravs de electroforese e comparao reconhece-se os locais de ligao. Nucletido +1: o 1 nucletido a ser reconhecido e a partir do qual comea a transcrio. O promotor prprio de cada tipo de organismo. O promotor da bactria no serve no DNA humano Tem uma direco de transcrio A RNA polimerase identifica a sequncia do promotor pela subunidade . O promotor est sempre ligado extremidade 5 do gene, de modo a tornar possvel a transcrio. Promotor induzvel: pode estar on/off, para a transcrio Sequncias de consenso: sequncias que esto conservadas em vrios genes, ou seja, so mais frequentemente encontradas naquelas posies. Promotor fraco: tem menos atraco para a polimerase, ou seja, menos consensual, pois a ligao entre o promotor e a polimerase tanto mais forte e estvel quanto mais consensual for a sequncia do promotor. Promotor forte: mais consensual e atrai mais a polimerase. Os genes que tm promotores fortes so mais frequentemente transcritos.
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3. Transcrio
A RNA polimerase liga-se ao DNA numa regio de 60 pb (-40 e +20) A subunidade liga-se especificamente s sequncias das regies -35 e -10. Sem a subunidade , a RNA polimerase liga-se no especificamente e com menor afinidade. A RNA polimerase liga-se ao promotor formando um complexo promotor-fechado, pois o DNA est enrolado. A polimerase desenrola o DNA numa regio de 14 pb formando um complexo promotor-aberto, em que uma nica cadeia de DNA serve de molde para a transcrio. A transcrio iniciada pela juno de 2 NTPs. Depois da adio de 10 nucletidos, a subunidade libertada da RNA polimerase que continua o alongamento da cadeia de RNA. A RNA polimerase vai desenrolando DNA, mantendo sempre um espao de 15pb desenroladas. A sntese de RNA continua at que a polimerase encontre um sinal de terminao, aps o qual a transcrio pra, o RNA liberta-se da polimerase e esta dissocia-se do DNA modelo. Na E. coli, o sinal de paragem consiste numa sequncia de RNA rica em C e G, interrompida por 4 ou mais resduos A, o que vai conduzir a uma destabilizao da cadeia pela complementaridade de bases disrupo do processo.
4. Repressores e controlo negativo da transcrio

O estudo da expresso de enzimas no metabolismo da lactose na E. coli, permitiu compreender a regulao da transcrio em procariotas, pois sabia-se que as enzimas envolvidas neste metabolismo (ex. -galactosidase, permease e transacetilase) s so expressas quando existe lactose no meio. Opero: unidade de expresso das enzimas do metabolismo da lactose Operador: regula a transcrio do opero, adjacente ao local de iniciao da transcrio do gene. Repressor: bloqueia a transcrio ligando-se ao operador. No metabolismo da lactose, esta liga-se ao repressor que j no se liga ao operador. Elementos de controlo cis-actuantes: sequencias reguladoras que afectam a expresso de genes ligados na mesma molcula de DNA, tal como o operador. Factores trans-actuantes: afectam a transcrio de genes localizados noutros cromossomas, assim como o repressor.
5. Controlo positivo da transcrio

O estudo do efeito da glucose na expresso de genes que codificam enzimas envolvidas no metabolismo de outros acares um exemplo de controlo positivo, pois aquelas enzimas apenas so expressas quando a glucose no est disponvel. Quando existem baixos nveis de glucose, a adenil ciclase converte ATP em AMPc. O AMPc liga-se a uma protena reguladora da transcrio (CAP catabolite activator protein), que se vai ligar sequencia de DNA alvo (sequencia do lac opero) CAP interage com a RNA polimerase, facilitando a sua ligao ao promotor e activando a transcrio.
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RNA polimerases Eucariticas e Factores de Transcrio

A transcrio ocorre do mesmo modo em todas as clulas, no entanto mais um processo mais complexo em eucariotas que nos procariotas, pois: Enquanto que os procariotas tm uma RNA polimerase que transcreve todos os genes, nos eucariotas existem diferentes RNA polimerases que transcrevem classes de genes distintas. A RNA polimerase eucariota necessita de interagir com vrias protenas para iniciar o processo factores de transcrio.
1. RNA polimerases eucarioticas

RNA polimerase II: transcreve genes codificantes de protenas (mRNAs). RNA polimerase I: transcreve espcies maiores de rRNA RNA polimerase III: transcreve espcies pequenas de rRNAs e tRNAs; RNAs envolvidos em splicing e transporte de protenas (snRNAs e scRNAs) RNA polimerase mitocondrial: transcreve o DNA deste organelo. RNA polimerases: So enzimas complexas (12 a 17 subunidades) Reconhecem promotores diferentes Transcrevem classes de genes distintas.
2. Factores de transcrio gerais e inicio da transcrio pela RNA polimerase II

A actividade da RNA polimerase II diferente da RNA polimerase procariota A RNA polimerase II apenas inicia a transcrio se forem adicionadas protenas factores de transcrio Factores de transcrio: Factores de transcrio gerais (envolvidos na transcrio de todos os promotores da polimerase II) Factores de transcrio especficos para o gene (ligam-se a sequencias de DNA que controlam a expresso de genes individuais) Factores de transcrio necessrios para iniciar a transcrio: TFIID TFIIB TFIIF TFIIE TFIIH Complexo proteico mediador (permite a resposta da RNA polimerase II a factores reguladores) Os promotores de vrios genes transcritos pela polimerase II contm uma sequncia semelhante a TATAA com 25 a 30 nucletidos (TATAA box) acima do local de iniciao da transcrio Um factor de transcrio geral (TFIID) liga-se a TATAA box, atravs da TATA-binding protein (TBP) e a outros nucletidos atravs de TBP-associated factors (TAFs). Depois liga-se outro factor (TFIIB) que se liga a TBP tal como sequncia de DNA que est atrs da TATA box. A TFIIB serve como uma ponte para a RNA polimerase II que se liga ao complexo TBP-TFIIB em associao ao TFIIF De seguida ligam-se mais 2 factores de transcrio (TFIIE e TFIIH)
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A TFIIH desenrola o DNA na regio do inicio da transcrio e fosforila uma parte da RNA polimerase (CTD) libertando-a do complexo de iniciao. Para alm da TATAA box, muitos promotores transcritos pela RNA polimerase contm outro sequncia importante (sequncia iniciadora ou Inr) que expande a regio iniciadora. Existem promotores que no tm a TATAA box, mas a sequncia iniciadora e uma outra (DPE downstream promotor element) que so reconhecidas por TBPassociated factors (TAFs) pois no existe TATAA box para ser reconhecida pela TBP que continua a ter um papel fundamental neste processo.
3. Transcrio pela RNA polimerase I

A TBP (TATAA binding protein) requerido pelas 3 polimerases, apesar de cada uma reconhecer promotores distintos. A RNA polimerase I transcreve genes ribossomais que leva formao de 48S prrRNA que processado e forma os rRNAs 28S, 18S e 5,8S. O promotor dos genes ribossomais reconhecido por 2 factores de transcrio: UBF (upstream binding factor) e SL1 (selectivity factor 1; que contem a TBP); que se juntam RNA polimerase I formando o complexo de iniciao. Na ausncia da TATAA box no promotor, a TBP no se liga a sequncias especficas, so algumas protenas do SL1 que se ligam ao promotor.
4. Transcrio pela RNA polimerase III

A polimerase III transcreve o tRNA, 5S rRNA e algum RNA pequeno envolvido em splicing (snRNA). Estes genes so transcritos a partir de diferentes promotores
5S rRNA: ligao de TFIIIA a sequncias especificas no promotor e formao de um complexo iniciador (TFIIIC, TFIIIB e polimerase). tRNA: o promotor no contm a sequncia reconhecida por TFIIIA, logo o TFIIIC liga-se directamente ao promotor formando o complexo com a ligao do TFIIIB e da polimerase. RNAs envolvidos em Splicing: o promotor contm a TATAA box (reconhecida pela TFIIIB atravs da TBP) tal como um local de ligao para outro factor (SNAP). A polimerase ligao posteriormente TFIIIB.
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Regulao da Transcrio em Eucariotas

Tipos de controlo: Ao nvel da iniciao da transcrio Ao nvel do elongamento Protenas reguladoras Enrolamento do DNA Metilao do DNA
1. Sequncias reguladoras cis-actuante: promotores e enhancers

A transcrio na bactria regulada pela ligao de protenas a sequncias cisactivadoras que regulam a transcrio dos genes adjacentes. No eucariotas tambm existe um gnero de regulao similar a esse.
Para estudar essas sequncias em eucariotas: Liga-se a sequncia reguladora a um gene reprter (codifica uma enzima facilmente detectvel) A expresso do gene reprter promove um conhecimento sobre a funo da sequncia reguladora clonada. Os genes transcritos pela RNA polimerase II tm 2 elementos centrais no promotor: TATAA box e a sequncia Inr, que servem de locais especficos de ligao dos factores de transcrio gerais. Outras sequncias cis-activadoras servem de local de ligao para uma grande variedade de factores de regulao que controlam a expresso individual de genes. Estas sequncias esto muito frequentemente acima da TATAA box.
Enhancers: So sequncias que, embora estejam longe do local de transcrio, podem estimul-la. Funcionam, tal como os promotores, pela ligao de factores de transcrio que regulam a RNA polimerase Isto possvel pela formao de um DNA looping que permite que os factores ligados ao enhancer interajam com as protenas associadas RNA polimerase e ao promotor. A ligao de factores aos enhancers reponsvel pelo controlo da expresso gentica durante o desenvolvimento e diferenciao, tal como durante a resposta a hormonas e factores de crescimento. Os enhancers geralmente contm inmeros elementos sequenciais funcionais que se ligam a diferentes protenas reguladoras de transcrio. a expresso especfica de cada tecido em protenas reguladoras que resultam em diferentes combinados de diferentes elementos no enhancer.
2. Protenas reguladoras de transcrio

O isolamento de protenas reguladoras de transcrio baseado na sua ligao especfica a um promotor ou a sequncias amplificadoras Estudo desta ligao: 1. Footprinting
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2. Electrophoretic-mobility shift assay (ensaio de retardamento em gel) Incubao de DNA marcado radioactivamente com protenas Electroforese num gel no desnaturante A ligao s protenas detectado pelo retardamento da mobilidade electrofortica do fragmento de DNA.
3. Purificao de protenas por cromatografia de DNA por afinidade Liga-se oligonucletidos iguais a esferas (composto celular) numa coluna Introduz-se extracto celular As protenas que se ligaram s esferas envolvidas naquela sequncia ficaram presas enquanto que as outras saem depois da lavagem.
3. Estrutura e funo dos activadores de transcrio

Activadores: Ligam-se a sequncias de DNA reguladoras e estimulam a transcrio. Tm 2 regies: Onde a protena se liga especificamente ao DNA Outra que activa a transcrio interagindo com outros componentes da maquinaria de transcrio.
4. Repressores eucariotas
Ligam-se a sequncias de DNA e inibem a transcrio Podem apenas interferir com a ligao de outro factor de transcrio de DNA ou da RNA polimerase. Outros repressores competem com activadores no local de ligao ao DNA, possuindo o domnio da ligao mas no o domnio da activao Os repressores activos inibem a transcrio por interaco entre as protenas.
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5. Relao entre a estrutura da cromatina e a transcrio

O DNA de todas as clulas eucariotas est intimamente ligado a histonas, formando os nucleossomas. O empacotamento do DNA no ncleo interfere com a transcrio Os genes transcritos activamente so encontrados numa cromatina descondensada, mas o DNA continua enrolado nos nucleossomas, constituindo um obstculo maquinaria de transcrio. A cromatina activa para transcrio atravessa determinadas modificao, tal como: Modificao das histonas Rearranjos nos nucleossomas Associao a 2 proteinas (nonhistone chromossomal proteins) protenas HMGN Acetilao das Histonas As histonas tm 2 pores, uma envolvida no ncleo e enrolamento do DNA e um domnio amino-terminal. O domnio amino-terminal rico em lisina que pode ser modificada por acetilao. A acetilao: Reduz a carga positiva das histonas enfraquecendo a ligao destas ao DNA. Facilita a ligao dos factores de transcrio.
6. Regulao da transcrio por RNAs no codificantes

Um forma da actuao de RNAs no codificantes inibir a traduo por interferncia de RNA Reprime a transcrio de alguns loci cromossomais, pela induo da condensao da cromatina
7. Metilao de DNA
Controla a transcrio em vertebrados Resduos de citosina podem ser modificados pela adio de grupos metil ao C5 Esta metilao ocorre em Cs que precedem Gs, na cadeia de DNA (dinucletidos CpG) Esta metilao est relacionada com a reduo da transcrio, em genes que contm grande frequncia de dinucletidos CpG, atravs da interferncia na ligao de factores de transcrio e pela ligao de repressores. Parece que a metilao apenas serve para manter e estabilizar a inactivao de um gene Genomic imprinting Controla a expresso de alguns genes envolvidos no desenvolvimento embrionrio de mamferos Na maior parte dos casos os 2 alelos so expressos em clulas diploides, no entanto existem alguns genes imprinted cuja expresso depende de quem so herdados. A metilao importante na distino entre os alelos maternos ou paternos dos genes imprinted.
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Processamento de RNA e Turnover

O pr-RNA tem de sofrer modificaes para se tornar funcional, excepto o RNA bacteriano.
Procariotas: os ribossomas tm acesso directo ao mRNA e a traduo comea com o mRNA nascente, enquanto a transcrio ainda est a ocorrer. Eucariotas: o mRNA sintetizado no ncleo tem que ser transportado para o citoplasma antes de ser usado como molde para sntese proteica. No entanto, todo o rRNA e tRNA necessita de processamento, quer em clulas eucarioticas quer em procariotas.
1. Processamento de mRNA em eucariotas

Processamento do mRNA: Modificao das extremidades (caping e adenilao) Remoo de intres (splicing) A transcrio e o processamento do mRNA so processos que esto coordenados devido a uma poro (CTD) da RNA polimerase II que serve como local de ligao para as enzimas envolvidas no processamento. Modificao da extremidade 5 (capping) Adio de uma estrutura (7-metilguanosina cap), pelas caping enzimes, que estabiliza o RNA e alinha-o com o ribossoma, na traduo. Modificao da extremidadde 3 (poliadenilao) Clivagem desta terminao e adio de uma cauda poli-A poliadenilao. Um sinal de poliadenilao (hexanucletido AAUAAA, em mamferos) localiza-se 10 a 30 nucletidos acima do local de poliadenilao. Estas sequncias so reconhecidas por um complexo de protenas: uma endonuclease que corta o RNA a poli-A polimerase que adiciona a cauda poli-A a poliadenilao representa o fim da transcrio, estando o complexo proteico de poliadenilao associado RNA polimerase II. Regula a transcrio e a estabilidade do mRNA
2. Mecanismos de Splicing
Splicing: remoo de intres do pr-RNA e produo de mRNA funcional. Este mecanismo ocorre em 5 passos: 1. O pr-mRNA clivado na extremidade 5 do splicing site. 2. A terminao 5 do intro unida a um nucletido de adenina dentro do intro (prximo da extremidade 3) resulta numa ponte de ramificao (um loop) devido unio a extremidade 5 ao 2 OH da adenina. 3. Clivagem da extremidade 3 4. Ligao dos 2 exes. 5. Linearizao e degradao do intro. O pr-mRNA contm sequncias consensuais em cada posio critica, permitindo que a maquinaria de splinging reconhea o pr-mRNA e desenvolva as reaces de clivagem e ligao.
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Spliceossomas: Complexos envolvidos no processo de splicing, compostos por protenas e RNAs (snRNAs: U1, U2, U4, U5, U6). Cada snRNA est complexado com 6 a 10 protenas formando small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs) que exercem o papel principal no processo: U1, U2 e U5 so molculas isoladas U4 e U6 esto num complexo formando um nico snRNP. Associao do spliceossoma: 1. Ligao do snRNP U1 extremidade 5 do splicing site (devido complementaridade de bases com a extremidade 5do snRNA U1) 2. snRNP U2 liga-se ao ponto de ramificao (tambm por complementaridade de bases) 3. O complexo formado snRNPs U4/U6 e U5 incorporam-se no spliceossoma, ligando-se o U5 acima do ponto de ramificao. Rearranjos antes de comear o splicing: 1. U6 dissocia-se do U4 e retira o U1 da extremidade 5. 2. U5 liga-se sequncia da extremidade 3 3. Exciso do intro e ligao dos exes. snRNAs: Reconhecem as sequncias no ponto de ramificao e na extremidades Catalizam as reaces directamente Alguns RNAs podem fazer auto-splicing Factores de Splicing: direccionam os spliceossomas para os locais de splicing correctos atravs da ligao de sequncias de RNA nos exes e depois recrutando os snRNPs U1 e U2 para os locais apropriados no pr-mRNA por intereces protena-proteina.
3. Splicing Alternativo
Processo que ocorre em eucariotas e permite a regulao da expresso gentica em diferentes tecidos e durante o desenvolvimento. Obtm-se diferentes combinaes de locais de splicing originando vrios RNAs. Combinaes dos mesmos exes.
4. Edio de RNA
Processo que altera as sequncias codificantes de protenas de alguns mRNAs. Resulta na mudana de bases como resultado de reaces de modificao de bases: desaminao da citosina a uridina desaminao da adenosina a inosina.
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5. Degradao de RNA
Os processos acima descritos resultam na formao de RNA maduro, que transportado para o citoplasma onde ocorre a sntese proteica No entanto muitas sequncias transcritas para pr-mRNA so degradadas no ncleo, tal como os intres. Esta funo exercida por: uma enzima que reconhece a ligao 2-5 formada no ponto de ramificao outras enzimas que reconhecem as extremidades 3 e 5 e catalizam a degradao de RNA em qualquer direco. As clulas possuem um sistema de controlo de qualidade (nonsense-mediated mRNA decay) que leva degradao de: mRNAs que no tm a sequncia completa prevenindo a sntese de protenas anormais codo de terminao prematuro encontrado pelo ribossoma (no caso das bactrias) A degradao no citoplasma outro modo de controlo da expresso dos genes: O rRNA e tRNA so muito estveis O mRNA bacteriano rapidamente degradado, permitindo respostas rpidas e variaes ambientais. mRNA eucariota tem um degradao variada, com vista a facilitar a regulao dos genes.
Processo de degradao no citoplasma: Encurtamento das cadeias poli-A Remoo do cap na extremidade 5 Degradao por nucleases a partir das extremidades. mRNAs instveis: Codificam protenas reguladoras Contm muitas sequncias ricas em AU perto da extremidade 3.
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7. Sntese Proteica
Traduo de mRNA
A traduo corresponde transformao da mensagem contida no mRNA na sequncia de aminocidos que constituem a cadeia polipeptdica. O mRNA contm a informao para a sntese proteica e lido de 5 para 3. A cadeia polipeptidica sintetizada da extremidade amina para a terminao carbolixo. Cada aminocido especificado por codes do RNA O mecanismo de traduo semelhante em todas as clulas
Intervenientes: mRNA: contm a informao gentica para a sntese de protenas Aminocidos: molculas bsicas para a construo das protenas. tRNA: selecciona e transporta o aminocido apropriado e reconhece o codo correspondente do ARNm. Funcionam como intrpretes entre a linguagem do ARNm e a linguagem das protenas. Ribossomas: sistemas de leitura. Promovem a ligao entre aminocidos. Na sua constituio entra o RNA ribossmico (rRNA) e protenas. Enzimas: catalisam as reaces que ocorrem em todo o processo ATP: Transfere energia para o sistema.
1. RNA de transferncia (tRNA)

Cada um dos 20 aminocidos tem que ser alinhado com os codes correspondentes do mRNA O tRNA serve como adaptador para este processo, fazendo a ligao entre o mRNA e o aminocido correspondente. Tem uma estrutura de L, requerida para se encaixar do ribossoma durante a traduo Todos terminam em CCA ao qual se liga o aminocido, na extremidade 3 Contm um anticodo na outra extremidade que se liga ao codo respectivo, devido complementaridade das bases. A ligao dos aminocidos no tRNA especifico catalizada pela aminoacil tRNA sintetase, que reconhece um aminocido para o tRNA correcto. Esta reaco ATP-dependente.
2. Ribossoma
o local de sntese proteica de todas as clulas Faz a ligao entre o tRNA e o mRNA Tem 2 subunidades que normalmente esto separadas no citoplasma e s se ligam para realizar a sntese proteica, contendo cada uma delas protenas caractersticas e rRNA. O rRNA tem um papel cataltico, pois so essenciais para a juno de ribossomas funcionais in vitro e um papel estrutural, na qual se renem as protenas ribossomais. O ribossoma mantm os aminocidos juntos, permitindo a ligao peptidica, catalisada pela subunidade maior. A cadeia vai crescendo medida que se vai adicionando aminocidos.
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A cada mRNA correspondem 3 locais de leitura diferentes que correspondem a aminocidos diferentes. O ribossoma tem que saber o quadro de leitura para a sequncia de aminocidos que se pretende sintetizar.
3. A organizao do mRNA e o inicio da traduo

A traduo no comea na extremidade 5 do mRNA, mas em locais especficos de iniciao. Vo existir locais entre a extremidade 5 e o local de iniciao que no vo ser traduzidas UTR (untranslated region) O mRNA eucaritico codifica apenas uma cadeia polipeptidica especifica (monocistronico), enquanto que o mRNA procaritico pode codificar mais do que uma, dependendo do local de iniciao (policistronico) Em ambas as clulas, a traduo comea no codo AUG que codifica o aminocido metionina. A sequncia de iniciao diferente nos eucariotas e procariotas. O mRNA bacteriano contm uma sequncia (sequncia de Shine-Delgarno) que alinha o mRNA no ribossoma para a traduo pela complementaridade das bases do rRNA. Esta sequncia impede que a traduo comece na extremidade 5 e noutros locais de iniciao internos. O RNA humano no contem a sequencia de Shine-Delgarmo, logo o ribossoma no reconhece o sitio a partir do qual comea a sntese. Quando se corta o DNA plasmidico para se introduzir o Gene necessrio ter em conta este factor.
4. Processo de Traduo
composta por 3 etapas: iniciao, alongamento e finalizao 1. Iniciao: Verifica-se a ligao do mRNA e de um tRNA iniciador, que transporta usualmente o aminocido metionina subunidade menor de um ribossoma. A subunidade maior do ribossoma liga-se ao conjunto. O ribossoma est ento funcional. necessrio protenas no ribossomais especificas factores eucariticas de transcrio que reconhecem a extremidade 5 e 3 do mRNA, sendo responsveis pela estimulao da poliadenilao durante a traduo. 2. Alongamento: a fase de traduo dos codes sucessivos do mRNA e da ligao dos aminocidos. Os locais do ribossoma a que se liga o tRNA designam-se stios P, A e E. O tRNA iniciador liga-se ao stio P O prximo tRNA liga-se ao sitio A, pelo emparelhamento com o segundo codo. H a formao de uma primeira ligao peptdica entre o aminocido que ele transporta e a metionina. Durante este processo o ribossoma move 3 nucletidos ao longo do mRNA, posicionando o codo seguinte no sitio A vazio. O alongamento do pptido continua at que um codo STOP seja translocado no sitio A do ribossoma.
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3. Finalizao: Os codes de finalizao no tm nenhum anticodo complementar, mas existem factores de libertao que reconhecem os sinais e terminam a sntese proteica. Estes factores ligam-se a um codo STOP no sitio A e estimulam a hidrlise do polipptido completo do ribossoma. O tRNA libertado, as subunidades do ribossoma e o mRNA dissociam-se Caractersticas da biossntese de protenas: - Complexidade: faz interferir vrios agentes - Rapidez: uma clula eucaritica junta 140 aminocido de uma cadeia de hemoglobina em dois a trs minutos. - Amplificao: a mesma zona de DNA pode ser transcrita vrias vezes, formando-se assim vrias molculas de mRNA idnticas. Por outro lado, os polirribossomas mostram que a traduo da mesma mensagem descodificada simultaneamente por vrios ribossomas. Originam-se, deste modo, vrias cadeias polipeptdicas idnticas, resultando cada uma delas da traduo efectuada por cada ribossoma. Desta forma, apesar de o mRNA ter curta durao, como a sua mensagem podem ser traduzida vrias vezes amplificada a sua actividade.
5. Regulao da Traduo
Um mecanismo de regulao deste processo a ligao de protenas repressoras a sequncias especficas de mRNA, bloqueando a traduo. A ligao da mesma protena reguladora a diferentes stios nas molculas de mRNA pode ter efeitos distintos na expresso gentica: inibir a traduo estabilizar o mRNA para aumentar a sntese proteica. Outro mecanismo regulador envolve a modulao da actividade de factores de iniciao.
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8. Ncleo
A presena de ncleo a principal diferena entre clulas eucariotas eprocariotas. O ncleo serve como reservatrio para a informao gentica e como centro de controlo da clula
Processos que ocorrem no ncleo: Replicao de DNA Transcrio Processamento de RNA
Invlucro Nuclear e o Trfico entre o Ncleo e o Citoplasma

Invlucro nuclear: Separa o contedo nuclear do citoplasma consitituido por 2 membranas Impede a passagem livre de molculas entre o ncleo e o citoplasma Mantm o ncleo como um compartimento bioqumico distinto interrompido por poros que permitem a passagem de molculas Permite um trfico selectivo de protenas e RNAs.
1. Estrutura do invlucro nuclear

2 membranas nucleares: So uma expanso do retculo endoplasmtico A externa est directamente em contacto com o RE O espao intermembranar contacta com o lmen do RE A membrana externa tem ribossomas ligados superfcie citoplasmtica So constitudas por uma bicamada fosfolipidica apenas permevel a molculas apolares (pequenas) Lmina nuclear Localiza-se na membrana interna Fornece suporte estrutural ao ncleo consitituido por protenas as lminas As protenas filamentosas relacionam-se entre si formando filamentos Esta associao comea com a formao de dimeros, nos quais as regies em hlice enrolam-se entre si. Depois estes dimeros associam-se uns aos outros. Existem lminas que servem como pontos onde a cromatina se vai juntar A organizao normal da lmina nuclear essencial para a replicao do DNA e na regulao da transcrio.
2. Complexo do poro nuclear

Poros: So canais que permitem a passagem de pequenas molculas polares, ies e macromolculas (protenas e RNAs) Desempenha um papel fundamental na clula eucaritica visto que controlam a passagem de substncias entre o citoplasma e o ncleo So estruturas selectivas e complexas
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Molcula que sai do ncleo: RNA Molculas que entram no ncleo: Protenas com funes nucleares (polimerase) Hitonas Consoante o tamanho da molcula, existem diferentes mecanismos de passagem pelos poros: Molculas pequenas: Passam livremente pelo poro nos 2 sentidos (ncleo citoplasma; citoplasma ncleo) Passam por difuso passiva Molculas grandes (protenas e RNAs) Passam por um processo activo As protenas e RNAs so reconhecidas pelos poros e so seleccionadas numa direco especfica.
3. Transporte selectivo de protenas para e do ncleo

Protenas essenciais para o transporte atravs do poro nuclear: Receptor de transporte nuclear 9 Importinas (transportam macromolculas para dentro do ncleo) 9 Exportinas (transportam macromolculas para o citoplasma) Protena ligante do GTP (small GTP-binding protein) Ran A actividade e conformao da Ran so reguladas pela ligao de GTP e hidrlise. As enzimas que estimulam a passagem de GTP a GDP encontram-se no lado citoslico do invlucro, enquanto que as que transformam GDP em GTP localizamse no lado nuclear. Este facto vai gerar um gradiente GTP/Ran ao longo do poro nuclear que poder determinar a direco do transporte nuclear. Protenas importadas para o ncleo Tem um sinal de reconhecimento nuclear composto por aminocidos que no necessitam de estar juntos na cadeia polipeptidica (sequncia bipartida) Durante a importao de protenas, a importina reconhece o sinal de reconhecimento nuclear da protena, processo facilitado pela interaco com Ran. 1. O complexo importina-Ran/GDP liga-se protena que contm o sinal de reconhecimento nuclear. 2. O complexo formado liga-se a filamentos citoplasmticos do poro. 3. Ligao a protenas nucleares especificas que se vo localizando cada vez mais longe o poro. 4. O GDP ligado ao Ran transformado em GTP, o que vai modificar a conformao da importina que se separa da protena importada. 5. O complexo importina-Ran/GTP exportado para o complexo do poro 6. O GTP hidrolisado a GDP para regenerar o complexo importina-Ran/GDP. Existem protenas que entram e saem do ncleo: transportadores (p. ex. de RNA) ou coordenadores de funes nucleares e citoplasmticas.
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Protenas exportadas do ncleo para o citoplasma: Contm um sinal de exportao nuclear Este sinal reconhecido pelas exportinas, se ligam a Ran Ran/GTP promove a formao de complexos estveis entre as exportinas e as protenas O complexo atravessa o poro nuclear O GTP hidrolisado a GDP levando dissociao da protena.
4. Transporte de RNAs
O RNA transportado do ncleo para o citoplasma O transporte de RNA um processo activo, dependente de energia que requere Ran para se ligar ao GTP. Os RNAs so transportados como complexos ribonucleicos (RNPs) Algumas protenas do complexo tm sinais de exportao nuclear que so reconhecidos pelos receptores de transporte nuclear. O rRNA est associado a protenas ribossomais, mRNA especifico e s subunidades ribossomais.
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Organizao Interna no Ncleo

O ncleo mais que um contentor de cromatina, RNAs e protenas nucleares pois contm uma estrutura interna que organiza o material gentico e localiza as funes nucleares para domnios especficos. Durante a interfase, existe: Heterocromatina: cromatina que se mantm condensada 9 Heterocromatina constutiva: contm DNA que nunca transcrito 9 Heterocromatina facultativa: contm DNA que no transcrito naquela clula, mas pode ser noutra. Eucromatina: cromatina que descondensa e distribui-se para fora do ncleo. Durante a interfase os cromossomas esto organizados e divididos em domnios funcionais discretos que impe um papel importante na regulao da expresso gentica. Os genes transcritos activamente esto localizados na periferia destes territrios, perto de canais que separam os cromossomas. Como clulas diferentes, expresso genes diferentes, a heterocromatina facultativa diferente e varia nos cromossomas.
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Nuclolo
o local de transcrio e processamento de rRNA e da formao de ribossomas. uma fbrica de ribossomas designada para preencher as necessidades de produo regulada e eficiente de rRNA e formao das subunidades do ribossoma. O nuclolo no est envolvido por membrana, est associado s regies cromossmicas que contm os genes que transcreve: 5,8S, 18S e 28S.
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9. Seleco e Transporte Proteico

Cada protena pode ter diferentes destinos, consoante o seu tipo e funo. Os destinos possveis so: Ncleo Retculo endoplasmtico Aparelho de Golgi Membrana Plasmtica Lisossomas Secreo Citoplasma Peroxissomas Mitocondrias
Retculo Endoplasmtico
um centro de membranas em tubos e sacos (cisterna) que se estende do invlucro nuclear para o citoplasma Tipos de RE: Rugoso (coberto de ribossomas) Transitrio (local onde as vesculas saem para o aparelho de Golgi) RE liso ( envolvido em lpidos)
1. Retculo endoplasmtico e secreo de protenas

Via de secreo: RE rugoso A. Golgi Vesculas de Secreo Lisossomas Membrana celular Exterior da clula As protenas que so transferidas para o retculo endoplasmtico so sintetizadas nos ribossomas ligados ao RE (rugoso), apesar do incio ocorrer em ribossomas livres no citoplasma. As protenas que ficam no citoplasma so sintetizadas em ribossomas livres (sempre)
Existem 2 tipos de translocao: Translocao co-translacional: sntese proteica nos ribossomas do RE. Translocao ps-translacional: sntese proteica nos ribossomas livres. Translocao co-translacional 1. Associao de ribossomas com o RE: Os ribossomas esto marcados para se ligarem ao RE pela cadeia polipeptidica que est a ser sintetizada. Os ribossomas ligados ao RE e livre no tm diferena alguma. A sntese comea sempre com ribossomas livres. 2. Marcao da protena por um sinal: A marcao ocorre na extremidade amina O sinal constitudo por aminocidos hidrofbicos Este sinal marca as protenas para a sua correcta localizao
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O sinal reconhecido e liga-se partcula reconhecedora do sinal (SRP) = 6 pptidos. O SRP liga-se ao ribossoma tal como o sinal, inibindo a traduo, marcando o complexo para o RE pela ligao ao receptor SRP Esta ligao liberta o SRP do ribossoma e do sinal
3. Ligao do ribossoma a um complexo proteico de translocao O sinal entra para dentro do canal membranar ou transloco. 4. Sntese da cadeia polipeptidica para dentro do RE O sinal liga-se a uma peptidase e o polipptido libertado para o lmen do RE.
Translocao pos-translacional 1. Sntese em ribossomas livres no citoplasma 2. O sinal reconhecido por protenas receptoras associadas ao transloco 3. necessrio a ligao de Hsp70 citoslico cadeia polipeptidica para manter a cadeia numa conformao para entrar no transloco 4. Hsp70 serve para puxar para dentro a cadeia polipeptidica (BiP)
2. Insero de protenas na membrana do RE

As protenas destinadas incorporao da membrana plasmtica ou outras membranas so inicialmente inseridas na membrana no RE, em vez de irem para o lmen. As protenas membranares so embebidas na membrana por regies hidrofbicas que se expandem da bicamada fosfolipidica. A poro intramembranar destas protenas geralmente em -hlice consistindo em 20 a 25 aminocidos hidrofbicos. A formao da -hlice maximiza as pontes de hidrognio entre o pptido e os aminocidos hidrofbicos das cadeias laterais interagem com os cidos gordos dos fosfolipidos da bicamada.
Variaes na insero de protenas intrnsecas: Algumas tm mais que um domnio transmembranar A orientao pode ser diferente (extremidade carboxilo para o lado citoslico ou para o interior do lmen)
A orientao das protenas mantm-se ao longo da via: A parte que est virada para o lmen fica virada para o lado extracelular (no caso de protenas da membrana plasmtica), pois a composio do lmen do RE semelhante do espao extracelular. A poro que contacta com o citosol, permanece sempre em contacto com o citosol.
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Insero de protenas transmembranares com a extremidade carboxilo orientada para o citosol: 1. O sinal da extremidade amina que direcciona a protena para o retculo endoplasmtico clivado 2. A sntese continua at que uma sequncia STOP transferncia bloqueia a transferncia e a protena fica ancorada membrana por um domnio hlice. 3. O transloco fecha devido sinalizao 4. A poro com a extremidade C sintetizada no citosol 5. As subunidades do transloco separam-se e o domnio transmembranar fica na bicamada. Insero de protenas transmembranar ancoradas pelo sinal de internalizao: O sinal de internalizao reconhecido pela SRP O sinal no clivado e actua como um domnio transmembranar em -hlice. A protena fica ancorada membrana atravs do sinal.
As protenas inseridas na membrana deste modo podem estar orientadas dos 2 modos possveis, dependendo de onde se encontra o sinal. As protenas transmembranares com mais que um domnio membranar tm sries alternativas de sequncias de sinalizao interna e seqncias STOP transferncia.
3. Moldagem e processamento proteico no RE

Na via secretria, as protenas so moldadas durante a sua translocao no RE ou j dentro do lmen Processos que ocorrem no RE: Moldao de protenas (para 3 dimenses) Formao de subunidades Formao de ligaes dissulfito (o ambiente oxidante do RE permite a formao destas ligaes numa reaco catalizada pela Protena Disulfito Isomerase) Glicolisao (primeiras etapas N glicolizao) Adio de ancoras de glicolipidos Chaperona Hsp70 (Bip): liga-se cadeia polipeptidica durante a sua passagem para o RE e medeia a moldagem e formao de subunidades nas protenas. Glicosilao: Ocorre nos resduos de asparagina (N-glicolisao) Os oligossacardeos (14 aucares) so sintetizados num lipido (dolicol) ligado membrana do RE. A enzima, oligossacarideo transferase, transfere o bloco para os resduos de asparagina 4 aucares (3 glicose e 1 manose) so removidos Processam-se vrias alteraes antes da protena passar para o A. Golgi.
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Algumas protenas esto ligadas membrana por glicolipidos ncoras de glicosilfosfatidilinositol (GPI) atravs da extremidade carboxilo. Estas protenas so transportadas tal como as protenas transmembranares na via secretria. Muitas protenas so degradadas assim que so produzidas, devido sua incorrecta formao Um papel do RE marcar essas protenas e dirigi-las para a via de degradao controlo de qualidade.
4. Exportao de protenas e lpidos do RE

Tanto as protenas como os lpidos viajam ao longo da via secretria em vesculas As membranas das vesculas fundem-se com as do organelo para onde viajam. As protenas que so transportadas por meio de vesculas mantm a sua orientao o lado que est virado para o citosol fica no citosol. Algumas protenas permanecem no RE, estando sinalizadas.
Sinal das protenas: Que ficam no RE (KDEL protenas que voltam para o RE; KKXX protenas transmembranares que ficam no RE) Que vo para o A. Golgi Se ocorrerem mutaes ao nvel dos sinais que identificam as protenas que ficam no RE, vo ocorrer alteraes no seu destino. Estas vo passar para o A. Golgi e vo ser secretadas para fora da clula. A introduo do sinal KDEL vai fazer com que as protenas que normalmente iriam para o Golgi permaneam no RE.
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Aparelho de Golgi
1. Organizao do Golgi
consitituido por membranas em cisterna associadas a vesculas Tem uma polaridade diferente na sua estrutura e funo As protenas do RE entram, na face cis (face de entrada) e saem pela face trans (face de sade) O aparelho de Golgi aparenta ter 4 regies distintas Cis Golgi Golgi Stack 9 Medial 9 Trans Trans Golgi
2. Glicolisao proteica no aparelho de Golgi

O processamento de protenas no aparelho de Golgi envolve a modificao e sntese de carbohidratos das glicoproteinas, tal como a modificao da ligao Nglicosodica (realizada no RE) Aps a glicosilao no RE, a protena processada sendo alterada por diversos processos: 1. Remoo de 3 residuos adicionais de manose 2. Adio sequencial de N-acetilglucosaminas 3. Adio de 3 galactores e 3 cidos sialicos As glicoproteinas processadas podero ser diferentes dependendo da protena e das enzimas presentes neste processo que vo originar diferentes ligaes Nglicosidicas.
O processamento das ligaes N-glicosidicas das protenas lisossomais difere daquelas que so secretadas e das plasmticas. 1. Adio de N-acetilglucosamina fosfato a resduos especficos de manose 2. Remoo do grupo N-acetilglucosamina, deixando os resduos de manose 6fosfato na ligao N-glicolitica Estes resduos de manose 6-P so depois reconhecidos por receptores ao nvel da membrana do trans Golgi que direcciona o transporte destas protenas para os lisossomas. O passo crtico deste processo envolve o reconhecimento da forma da protena lisossomas pela enzima que adiciona a N-acetilglucosamina fosfato. No aparelho de Golgi tambm ocorre a O-glicosilao, pela adio de carbohidratos a cadeias laterais.
3. Metabolismo lipdico e polissacardeo no A. Golgi

O glicerol, fosfolipidos, colesterol e ceramida so sintetizados no RE A Esfingomielina e glicolipidos so sintetizados a partir da ceramida no Aparelho de Golgi A esfingomielina sintetizada no interior do A. Golgi mas a adio de glicose ceramida ocorre no lado citoslico.
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4. Seleco de protenas e exportao do aparelho de Golgi

As protenas, lipidos e polissacardeos so transportados do aparelho de Golgi pela via secretria As vesculas formam-se no trans Golgi e entregam o contedo aos locais celulares apropriados Existem protenas que tm que se manter no aparelho de Golgi, contendo o seu sinal na parte transmembranar, evitando a incorporao em vesculas deixando o trans Golgi
Via secretria constitutiva: Existe a incorporao de novas protenas e lipidos na membrana plasmtica Leva a uma secreo de protenas no regulada Veia secretria regulada Protenas especficas so secretadas de acordo com sinais do meio.
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Mecanismo de Transporte Vesicular

O transporte vesicular responsvel pelo trfico molecular entre os vrios compartimentos membranares. A selectividade do transporte baseada num envolvimento selectivo dependente das vesculas que reconhecem e se fundem com a membrana apropriada.
1. Seleco, protenas e vesculas

Processos da via secretria, na qual as protenas transmembranares e protenas do lmen e os seus receptores so envolvidos em vesculas 1. Protenas so selecionadas de protenas marcadas para outros destinos e de protenas que necessitam de ficar para trs. 2. Formao da vescula por enrugamento da membrana 3. Transporte da vescula para a membrana marcada. Vesculas revestidas por clatrina: responsveis pela endocitose e transporte do aparelho de Golgi para o lisossoma. O revestimento de clatrina resulta da unio de 2 complexos de protenas: clatrina e adaptadores proteicos (que se agregam no lado citoslico da membrana e unem a clatrina membrana) Vesculas sem clatrina: interagem com os sinais de permanncia no RE e aparelho de Golgi.
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Lisossomas
So organelos membranares que contm uma srie de enzimas capazes de destruir qualquer tipo de polmeros. Funo Degradar material: 9 Vindo do exterior da clula 9 Componentes obsoletos da prpria Sistema imunitrio
1. Hidrolases cidas lisossmicas

So capazes de hidrolisar protenas, DNA, RNA, polissacardeos e lipidos Mutaes nessas enzimas so responsveis por muitas doenas genticas. Doenas lisossomais: causadas por defeitos na produo das enzimas; a alterao de um nucletido por alterar toda a funo da hidrolase pH O pH ptimo de actuao das hidrolases cido (5) ao contrrio do pH do citoplasma (7) O pH cido fornece uma dupla proteco para a degradao incontrolada: 1. Inactiva as hidrolases fora dos lisossomas de modo a no destrurem tudo 2. Transporta protes (H+) para dentro da clula de modo a manter o pH cido, acompanhado pela hidrlise de ATP.
2. Endocitose e formao de lisossomas

O material do exterior da clula captado por vesculas endociticas (cobertas por clatrina) As vesculas depois fundem-se com endossomas que amadurecem e so percurssores de lisossomas, baixando o pH para 5,5 e recebendo as hidrolases As hidrolases so marcadas com resduos de manose 6-P que so reconhecidos por receptores especficos no trans Golgi e incorporam em vesculas envolvidas por clatrina No endossoma maduro, as hidrolases so libertadas dos receptores devido ao pH baixo.
3. Fagocitose e Autofagia
Fagocitose Os macrofagos apanham e degrada partculas grandes (bactrias, clulas velhas) As partculas so transportadas em vesculas facociticas (fagossoma) que se fundem com os lisossomas Os lisossomas resultantes fagolisossoma podem ser grandes e ter diferentes formas Autofagia O organito envolvido por uma membrana formando uma vescula autofagossoma A membrana de vescula interage com a membrana do lisossoma, sendo o organito posteriormente destrudo.
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10. Bioenergtica e Metabolismo

Mitocndria
Geram grande parte da energia metablica em clulas eucariotas produzindo ATP por fosforilao oxidativa. Muitas protenas mitocondriais so traduzidas em ribossomas livre no citoplasma e so importadas para o organelo por sinais especficos. As mitocondrias contm o seu prprio DNA que codifica tRNA, rRNA e algumas protenas mitocondriais.
1. Organizao e funo da mitocndria

A mitocndria est rodeada de um sistema membranar duplo (membrana interna e membrana externa) cujas membranas esto separadas por um espao intermembranar. A membrana interna forma cristas que se estendem para a matriz mitocondial, aumentando a rea da superfcie interna levando a um aumento da produo de ATP (nas clulas musculares, as mitocondrias tm maior nmero de cristas)
A matriz contm: DNA mitocondrial Enzimas do metabolismo oxidativo (ciclo de Krebs, via de degradao de cidos gordos e glicose)
Membrana interna: Contm os complexos que fazem parte da cadeia respiratria (fosforilao oxidativa) Tm uma superfcie aumentada devido presena de cristas Contm as enzimas que participam na fosforilao oxidativa bem como protenas que intervm no transporte de metabolitos, entre o citosol e a mitocndria impermevel a ies e molculas pequenas (propriedade critica para manter o gradiente de protes)
Membrana externa permevel a pequenas molculas Contm porinas, protenas que formam canais que permite a difuso livre de pequenas molculas
Espao intermembranar Tem uma composio semelhante do citosol
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2. O sistema gentico da mitocndria

As mitocndrias contm o seu prprio DNA, que separado e distinto do genoma nuclear da clula. Este facto apoia a hiptese endossimbitica, pois foram encontradas bactrias parasitas que s se reproduzem em clulas eucariotas O DNA mitocondrial circular, cujo tamanho caria consoante as espcies Mas nos genomas mitocondriais maiores predominam sequncias no codificantes e sem informao gentica, apesar destes genomas codificarem mais protenas O DNA mitocondrial codifica o rRNA e tRNA necessrio para a traduo das sequncias codificantes Outras protenas so codificadas por genes nucleares que foram transferidos da mitocondria ancestral para o ncleo.
3. Genoma da mitocndria humana

Codifica 13 protenas envolvidas no transporte de electres e na fosforilao oxidativa Codifica 16S e 12S rRNAs e 22 tRNAs, que so necessrios para a traduo das protenas O pequeno n de tRNAs permite o uso de um cdigo gentico diferente do cdigo universal. Tal como o genoma nuclear, o DNA mitocondrial pode sofrer mutaes Como todas as mitocndrias dos ovos fertilizados provm do ocito e no do espermatozide, uma mutao nas clulas germinais do seu DNA mitocondrial so transmitidos prxima gerao pela me. So mutaes hereditrias que podem causar doenas: Neuropatia ptica hereditria de Leber Envelhecimento devido acumulao de mutaes no genoma mitocondrial Caractersticas do DNA mitocondrial face a mutaes: Tem a mesma probabilidade de mutaes espontnea que o nuclear Como mais pequeno a probabilidade de ocorrerem mutaes menor Como so mais abundantes por existirem em todas as mitocondrias vai originar mais mutaes Existe uma maior probabilidade de mutaes no DNA mitocondrial, devido: Maior n de divises mitocondriais Radicais livres de oxignio Inexistncia de sistemas de reparao de DNA Pelo facto de existirem poucas regies no codificantes, a probabilidade das mutaes afectarem as protenas maior.
Clulas mais sujeitas a doenas por mutaes no DNA mitocondrial: Neurnios Clulas musculares Manifestao da doena Depende do n de mitocndrias mutadas herdadas Manifesta-se em idade tardia A anlise de DNA nuclear substituda pela anlise do genoma mitocondrial, porque: mais pequeno, longo menos sujeito a degradao (mas no mais resistente) Existe em maior n visto que existem em todas as mitocondrias de todas as clulas, ao invs de ser uma molcula nica no ncleo de cada clula. A resistncia do DNA mitocondrial e do DNA nuclear igual, pois tem a ver com a quebra das ligaes fosfodister entre os nucletidos.
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Peroxissomas
So pequenos organelos membranares Contm enzimas envolvidas numa variedade de reaces So morfologicamente semelhantes a lisossomas Tambm so produzidos a partir de protenas livres no citoplasma, tal como as mitocondrias No entanto, os peroxissomas no contm o seu prprio genoma, apenas se replicam por diviso tal como as mitocondrias
1. Funo dos peroxissomas

Tm enzimas envolvidas em vrias vias bioqumicas Promovem as reaces oxidativas que produzem perxido de hidrognio Possuem a catalase que permite a decomposio do perxido de hidrognio a gua ou a sua utilizao para oxidar outro componente As enzimas oxidativas degradam: cido rico Aminocidos Purinas Metanol cidos gordos Esto envolvidos na biossintese: Lpidos (colesterol e dolicol) Aminocido lisina cidos biliares (no fgado) Plasmogneos (famlia dos fosfolipidos, constituinte membranar) Os peroxissomas tm diferentes funes consoante o tecido.
2. Formao dos peroxissomas

semelhante das mitocondrias e cloroplastos As enzimas necessrias so sintetizadas em ribossomas livres no citoplasma e depois so transportadas para os peroxissomas Os fosfolipidos tambm so importados para os peroxissomas do RE Os novos peroxissomas so formados por diviso dos mais velhos.
Translocao de protenas para os peroxissomas: 1. As protenas esto marcadas por uma sequncia de 3 aminocidos na sua extremidade carboxilo (PTS1); PTS2 marcao por 9 aminocidos 2. PTS1 e PTS2 so reconhecidos por diferentes receptores citoslicos ou protenas transportadoras 3. As protenas so transferidas para um complexo que medeia a sua translocao atravs da membrana peroxissomal. 4. O sinal de marcao no clivado A maturao do peroxissoma envolve a importao de diferentes classes de protenas em diferentes alturas. Primeiro chegam os receptores das membranas peroxissomais (atravs de uma vescula lipidica pr-peroxissomal)
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12. Superfcie Celular

Endocitose
Processo de internalizao de material pela clula, rodeando-o de membrana plasmtica, que se enruga para o interior da clula e forma um endossoma.
1. Facocitose
A clula endocita partculas grandes ou clulas intactas: 1. A partcula liga-se a receptores 2. Emisso de pseudopodes que rodeiam a partcula 3. Formao do fagossoma 4. Fuso com o lisossoma fagolisossoma 5. Digesto no interior pelas hidrolases cidas 6. Reciclagem dos receptores da membrana plasmtica Em seres multicelulares, a endocitose permite a defesa contra microorganismos e elimina clulas velhas ou degradadas.
2. Endocitose mediada por receptores

Pinocitose: ingesto de partculas dissolvidas atravs de endocitose mediada por receptores Endocitose mediada por receptores: ingesto especifica de macromolculas por um mecanismo selectivo 1. As macromolculas ligam-se a receptores especficos da superfcie celular, recobertos internamento por clatrina coated-pits 2. Formao de vesculas recobertas por clatrina com os receptores e os ligandos 3. Fuso das vesculas com outros endossomas 4. Seleco do transporte para a membrana plasmtica ou lisossoma. Ex.: Internalizao do colesterol 1. Incorporao de colesterol em lipoproteinas (LDL) 2. Ligao das apoproteinas, que se encontram na superfcie da lipoproteina, a receptores especficos 3. Formao de vesculas revestidas por clatrina 4. Reciclagem dos receptores para a membrana plasmtica 5. A LDL funde-se com o lisossoma libertando o colesterol Hipercolesterolmia familiar: Elevada concentrao de colesterol no sangue No h internalizao das LDL Mutaes possves: 9 Na zona do receptor que se liga s apoproteinas 9 Na zona do receptor que interage com a clatrina, impedindo a internalizao Os fluidos celulares tambm podem ser endocitados sem seleco endocitose de fase fluida A endocitose pode ser independente da clatrina
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3. Trfico proteico na endocitose

As vesculas com clatrina perdem o seu revestimento e fundem-se com endossomas Endossoma: vescula com extenses tubulares localizadas na periferia da clula. A fuso das vesculas endociticas com endossomas mediada por: Rab GTP-binding proteins Os seus receptores Pares complementares das protenas transmembranares Membranas marcadas O endossoma serve como um compartimento selectivo do destino das molculas, que poder ser: Reciclagem para a membrana plasmtica Degradao nos lisossomas Os endossomas mantm um pH interno cido (6 a 6,2) e como resultado vai haver a dissociao dos ligando dos receptores Os ligandos e as protenas membranares destinadas degradao nos lisossomas, so transportadas dos endossomas mais recentes para outros mais velhos, localizados perto do ncleo. Este transporte mediado pelo movimento de grandes vesculas endociticas atravs de microtubulos O endossoma velho mais cido (5,5 a 6) sendo por isso capaz de se fundir com vesculas provenientes do aparelho de Golgi com hidrolases cidas Os endossomas velhos transformam-se em lisossomas com pH ainda mais baixo (5) Com as hidrolases o material endocitico degradado. Os receptores tanto podem ser reciclados para a membrana plasmtica como podem ser degradados em conjunto com os seus ligandos nos lisossomas (ex.: factores de crescimento)
Nos neurnios: Os neurotransmissores a mais so endocitados Ficam no endossoma at que so exocitados aquando o disparar do potencial de aco Transcitose: Ocorre em clulas polarizadas (clulas epiteliais) Permite que os receptores internalizados sejam transferidos para o domnio oposto da membrana plasmtica.
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