LABORATRIOS de BIOQUMICA e FISIOLOGIA ANIMAL

TRABALHOS PRTICOS
Licenciatura em Bioqumica
Ano lectivo 2013/2014

Instituto de Cincias Biomdicas de Abel Salazar Universidade do Porto

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Plano de aulas
(PMF) 26/27 Setembro: Introduo disciplina. Tutorial (MJS) 3/4 Outubro: Metabolismo de Glcidos
Glucose e lactato sricos em ratos normais e diabticos;

(MJS) 10/11 Outubro: Metabolismo de Lpidos I

Colosterol, triglicridos e HDL sricos em ratos normais e diabticos

(MJS) 17/18 Outubro: Metabolismo de Lpidos II Lipoprotenas: Lipase e Lipidograma

(MJS) 24/25 Outubro : Lipase Pancretica 31 Outubro/1 Novembro: Mid-term Break (MJS) 7/ 8 Novembro: Oxidao-Reduo
Doseamento da catalase em Leveduras

(PMF) 14/15 Novembro: Tutorial (MJS) 21/ 22 Novembro: Oxidao: Lpidos, DNA e protenas Deteco por imunohistoqumica

(MJS) 28/ 29 Novembro: Oxidao: Lpidos, DNA e protenas Deteco por Western blot

(PMF) 5/6 Dezembro: Tutorial (PMF) 12/13 Dezembro: Tutorial PMF Prof Moradas Ferreira MJS Prof MJ Saraiva

METABOLISMO DOS GLCIDOS I

Glucose e lactato sricos - ratos normais e diabticos 1 - MTODO DE GLUCOSE-OXIDASE
Princpio do Mtodo O glicognio pode ser hidrolizado em meio cido, obtendo-se unidades de glucose; sendo a eficincia da hidrlise dada pelo valor de glucose obtida. Existem vrios mtodos para o doseamento da glucose, no entanto dado que diferentes oses reagem do mesmo modo, necessrio, proceder a um ensaio especfico e portanto recorre-se normalmente a um ensaio enzimtico utilizando glucose oxidase. A enzima glucose oxidase cataliza a oxidao da glucose. Dado que se forma perxido de hidrognio, possvel promover uma reaco com um cromognio aceitador que pode ser oxidado, de tal modo que se establece uma relao espectofotomtrica entre a quantidade de glucose e do cromognio. Entre os cromognios que se utilizam correntemente inclui-se a Orto dianisina, a Orto - tolidina e a Orto - anisidina. No trabalho experimental a efectuar utiliza-se a Orto dianisina que por oxidao desvia o comprimento de onda de absoro para 420 nm, pode-se deste modo establecer uma relao entre a concentrao de Orto dianisina oxidada e a quantidade de glucose oxidada.
G.O. Glucose H2O2 + Ac. Glucnico

peroxidase H2O2 + O - Dred H2 O + O DOxid

Material e reagentes Reagente de TGO (Tris/glucose oxidase/ortodianisidina) 100 ml de reagente em tampo Tris-HCl 0,5 M a pH 7.0 contm: Glucose oxidase 125 mg Peroxidase 0,5 mg Ortodianisidina 5 mg Triton-X100 1,0 ml Plasma de ratos normais e diabticos em jejum Espectrofotmetro Cuvettes Tubos de ensaio Banho-maria a 37 C Vortex Pipetas automticas Pontas Procedimento 1. Fazer uma diluio de 1:10 do plasma fornecido em gua destilada. 2. Para tubos de ensaio pipetar, em duplicado, 0,1 ml (Pl N-Normal e Pl T-tratado) da diluio anterior. 3. Completar o volume, em cada tubo a 0,5 ml de gua destilada. 4. Adicionar 3,0 ml de reagente TGO a cada tubo, misturar por agitao em vortex . Pl N Plasma diludo (ml) H2O bidestilada (ml) Reagente TGO (ml) 0.1 0.4 3 Pl T Branc o 0.5 3

5. Incubar todos os tubos em banho-maria a 37 C por 30 min. Arrefecer em gua fria. 6. Efectuar leituras no espectrofotmetro a 420 nm, contra o ensaio em branco registando os respectivos valores. Pl 1 Abs 4 Pl 2

Abs duplicado Mdia Abs 7. Determine a concentrao, em glucose, por interpolao grfica na curva padro que lhe fornecida.

2 - Lactato
Princpio do Mtodo (ver em anexo) lactato a e lactato b

Material e reagentes Plasma de ratos normais e diabticos Espectrofotmetro Cuvettes Pipetas automticas Pontas Lactato Reagent Banho-maria a 25-37 C Procedimento 1. Prepare as seguintes cuvettes (duplicado ou no), segundo o esquema:
Plasma (l) H2O (l) Lactato Reagent (l) Test 10 1000 Branco 10 1000

2. Incube as cuvettes 5 -10 min a 25-37C. 3. Leia as Absorvncias a 540 nm, usando o branco para calibrar o espectofotmetro. 4. Registe os respectivos resultados.
Test Abs Abs duplicado Mdia Abs

Nota: Durante as incubaes proteja as cuvettes de luz

METABOLISMO DOS LIPIDOS I

Colesterol, triglicerdeos sricos - ratos normais e diabticos

1 - Colesterol
Princpio do Mtodo (Ver em anexo) anexo colesterol Material e Reagentes Plasma de rato normal e diabtico em jejum Reagente (Kit cholesterol liquicolor) gua destilada Cuvettes Espectofotmetro Estufa a 37 C Pontas Pipetas automticas Procedimento 1. Prepare as cuvetes em duplicado (ou no) segundo o esquema: P.S. Faa s um branco
Amostra 10 1000 Standard 10 1000 Branco 10 1000

Plasma (l) H2O (l) Standard (l) Reagente (l)

2. Misture e incube 5 min a 37 C

3. Leia a Absorvncia a 500 nm, usando o branco para calibrar o espectofotmetro 4. Registe os resultados na tabela.
Amostra Standard

Abs Abs duplicado Mdia Abs

2 Triglicerdeos Sricos
Princpio do Mtodo ( Ver em anexo) - triglicerdeos Material e Reagentes Plasma de rato normal e diabtico em jejum Reagente (Kit Triglicerdeos) gua destilada Cuvettes Espectofotmetro Estufa a 37 C Pontas Pipetas automticas Procedimento 1. Prepare as cuvetes em duplicado (ou no) segundo o esquema: P.S. Faa s um branco
Amostra 10 1000 Standard 10 1000 Branco 10 1000

Plasma (l) H2O (l) Standard (l) Reagente (l)

2. Misture e incube 10 min a 37 C 3. Leia a Absorvncia a 550 nm, usando o branco para calibrar o espectofotmetro 4. Registe os resultados na tabela.
Amostra Abs Abs duplicado Mdia Abs Standard

METABOLISMO DOS LIPIDOS II

Lipoprotenas - ratos normais e diabticos 1 Lipase
Princpio do Mtodo (ver em anexo) - lipase

Material e Reagentes Soro de rato normal e diabtico em jejum Reagentes (Kit Lipase) gua destilada Cuvettes Espectofotmetro Estufa a 37 C Parafilme Pontas Pipetas automticas

Procedimento 1. Prepare as cuvetes segundo o esquema:

P.S. No faa duplicados Amostra 15 900 Standard 15 900 Blank 15 900

Soro (l) H2O (l) Standard (l) Reagente (l)

2. Misture invertendo a cuvete gentilmente e incube 5 min a 37 C 3. Adicione 300 l de Activador Reagent e misture invertendo a cuvette gentilmente. 4. Incube 3 min a 37C 9

5. Leia a Absorvncia a 550 nm, usando gua destilada para calibrar o espectofotmetro. Este o Tempo A. 6. Continuar a incubao a 37C exactamente 2 min aps Tempo A, ler e registar a Abs de todas as cuvetes Tempo B. Amostra Tempo B Tempo A Tempo (TB-TA) Standard Blank

Actividade Lipase (U/L) = Tempo Amostra - Tempo Blank x 250* Tempo Standard - Tempo Blank

* Actividade do padro de Lipase

2 Lipidograma
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Material e Reagentes Soro de rato normal e diabtico em jejum Tiras de acetato de celulose Tina de electroforese Fonte Tampo ATX Tris Pipeta automtica (P10) Pontas Papel de filtro Sudan Black B Etanol NaOH 5%

Procedimento 1. Impregnar a tira de acetato de celulose no tampo ATX durante pelo menos 15 min. 2. Antes de colocar a tira na ponte da tina passa-las entre duas folhas de papel absorvente/filtro para lhe retirar o excesso de tampo, sem as espremer. 3. Colocar as tiras na ponte, observando que a face permevel fica para cima. Esta condio cumprida quando o canto cortado num dos extremos da tira fica virado para ns e para a nossa direita. Pode-se confirmar verificando o brilho das duas faces da tira, devendo estar para cima a face menos brilhante. 4. Colocar a ponte na tina e ligar esta fonte de alimentao a 200 Volts por apenas 5 minutos, para estabilizao das condies de migrao. 5. Depois de decorridos 5 minutos desligar a fonte de alimentao e fazer a aplicao das amostras previamente centrifugadas. Estas aplicaes devem ser feitas a cerca de 2 cm do ponto em que a tira dobra na ponte e do lado do polo negativo. 11

Ateno: Estas amostras so suplementadas com uma dieta lipdica. 6. APLICAO DAS AMOSTRAS Duas aplicaes de 5 l do mesmo soro no mesmo local (com uma P10), aguardando alguns segundos da primeira para a segunda aplicao para que a tira possa absorver o soro da primeira aplicao. 7. MIGRAO Correr durante 90 minutos a 200 Volts. 8. COLORAO Corar cerca de 1 hora numa soluo de 70 mg de Sudan Black B dissolvidos em 60 ml de Etanol a que se juntam, 15 minutos antes de usar, 70 ml de NaOH a 5%. S se usa esta soluo uma vez. Passados 15 minutos j possvel a visualizao das bandas. 9. DESCOLORAO Lava-se sobre gua da torneira. 10. CONSERVAO Conserva-se a tira em gua destilada.

3-Lipase Pancretica
Material e Reagentes Leite gordo 12

Copo de 250 ml Funil Falcons de 50ml Tubos de ensaio curtos Matrazes de 50 ml Pipetas automticas P1000; P20 e P10 Pontas azuis, amarelas e brancas Pipetas descartveis Pompetes Eppendorfs Proveta de 25 ml Pipetas Pasteur de plstico Almofariz com pisto Tinas de vidro Pankrion Flat NaOH 0,02 mol/l Glicerol:gua destilada 1:1 Fenolftalena/etanol 2g/l Deoxicolato de sdio 100g/l Padres LMW; GE Healthcare) Acrilamida stock 30% (29% Acrilamida, 1% bis-Acrilamida) 2 M Tris-HCl pH 8.85 1 M Tris-HCl pH 6.8 gua destilada Persulfato de Amnio 10 % TEMED Tampo de electroforese (25 mM Tris-HCl pH 8.3, 192 mM Glicina) 4x tampo de amostra (125 mM Tris-HCl pH 6.8; 80% glicerol; 0.02% azul bromofenol) Corante (0.25% Coomassie Blue R-250; 45% metanol; 10% cido actico) Descorante (45% metanol; 10%cido actico) Equipamento Centrfuga com rotor para tubos de 50 ml Centrfuga eppendorfs Fogo Fonte voltagem Banho Maria 37C Estufa 37C Placa de aquecimento Aparelho de electroforese Mtodo Preparao do Extrato; Titulao da soluo 1.Ferver 50 ml de leite e deixar arrefecer a 37C. 2. Preparar o extrato de lipase pancretica a partir de um comprimido de PANKRION FLAT. Partir o comprimido para um tubo de 50 ml para posteriormente desfazer num almofariz com 13

a ajuda de um pisto, obter um p bem fino. Recolher o p novamente para o tubo inicial. 3.Adicionar 20 ml da mistura Glicerol:gua destilada a 1:1, e agitar bem. 4. Centrifugar a 5000 rpm durante 5 minutos. Transferir o sobrenadante para um novo tubo. 5. Adicionar a 30 ml do leite fervido (e mantido a 37C) 3,5 ml do extrato. Agitar bem. 6. Preparar 5 tubos de ensaio curtos com 5 ml da mistura anterior e numerar de 1 a 5. Ao tubo 5 adicionar 1ml de Deoxicolato de sdio 100g/l. 7. Colocar os tubos ns 2, 3, 4 e 5 no banho maria a 37C. 8. Preparar uma proveta de 25 ml com NaOH 0,02 mol/l. 9. No momento zero titular o tubo n1 (colocar 5 ml de leite/extrato num erlenmeyer de 100 ml, adicionar 3 gotas de Fenolftalena/etanol 2g/l). Anotar o volume de NaOH gasto no ponto de viragem da soluo. 10. Nos tempos 10 min retirar o tubo n2 e efetuar o mesmo procedimento referido no passo anterior, no tempo 20 min o tubo n 3 e no tempo 30 min os restantes n4 e n5. Anotar em todos os pontos de viragem da soluo. 11.Crie um grfico simples dos tempos de hidrlise (x) min e (y) consumo de NaOH 0,02 mol/l. 12. Comente a experincia. Actividade em gel SDS-PAGE Preparao das amostras Pipete par um tubo eppendorf 10 ul do extrato e 5 ul de 4x tampo de amostra. Ferva as amostras e o padro durante 3 min. Centrifugue 20 segundos. Aplique em gel as amostras e o padro. Proceda eletroforese, aplicando uma corrente de 10 mA no gel de empacotamento e 20 mA no gel de resoluo at sair a frente do corante.

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OXIDAO - REDUO I
Doseamento da catalase em Leveduras

OXIDAO: Lpidos, DNA e Protenas

Deteco por imunohistoqumica de produtos oxidados em tecidos de modelos do animais de doenas central e neurodegenerativas perifrico.
O estudo de doenas neurodegenerativas associadas acumulao intra e/ extracelular de agregados protecos como a doena de Alzheimer demonstra que o stress oxidativo tem um papel importante e pode at mesmo desencadear o processo de neurodegenerao. Esta uma situao comum no s em doenas do sistema nervoso central, como em doenas de agregados proteicos envolvendo o sistema nervoso perifrico, como o caso da polineuropatia amiloidtica familiar (PAF). Esta vertente

sistema

nervoso

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fortalecida pelo fato de que os neurnios situaes de stress oxidativo. No stress oxidativo, a formao de

so altamente propensos a

espcies

reativas

excede

significativamente a capacidade de defesa antioxidante e de reparao do organismo, tendo como consequencia o aumento de danos a biomolculas (DNA, lipdos, protenas). Estes danos, quando no reparados, comprometem o funcionamento da clula e levando-a morte por apoptose ou necrose. Marcadores de stress oxidativo, como carbonilos proticos, nitro-tirosina, produtos de peroxidao lipdica e bases de DNA oxidadas, so detectados em concentraes aumentadas em tecidos de doentes e modelos animais de Alzheimer e outra doenas degenerativas do sistema nervoso central. Alm disso, diversos trabalhos relatam nveis alterados da expresso de enzimas antioxidantes, como tiorredoxina, tiorredoxina redutase, peroxirredoxina, glutationa peroxidase, CuZn-SOD. O metabolismo aerbio apresenta uma srie de reaes que podem formar espcies reativas de oxigenio e nitrogenio. reduzindo o O 2 a anio radical superxido (O2-) ou o perxido de hidrognio a radical hidroxilo (OH xido ntrico (NO) um radical pouco reativo, essencial
-

). O a

para

vasorregulao e neurotransmisso, formado pelas enzimas NO sintases (NOS). Em excesso, o NO pode reagir com O2- formando peroxinitrito (ONOO-). A gerao de peroxinitrito in vivo pode levar oxidao e nitrao de lipdos, DNA e protenas. Nesta aula prtica abordaremos em crebro de modelos animais da doena de Alzheimer (modelo APP/PS1) e em intestino/estomago (modelo TTR V30M) : (i) a nitrosilao de protenas que so modificadas em resduos de tirosina; pela deteco imunolgica com um anticorpo especfico para nitro-tirosina (Millipore) .

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(ii) a oxidao de DNA, nomeadamente a oxidao de dexosiguanosina, produto detetado com anticorpo especfico (Santa Cruz).

Compare os nveis de reactividade imunolgica entre vrias amostras: Srie de lminas I Deposio do pptido beta no hipocampo de um murganho APP/PS1 e nveis de 8-OH-dG versus crebro de murganho normal. Srie de lminas II - Deposio de transtirretina no intestino ou estmago de murganhos PAF control versus tratados com catequinas (remoo de depsitos); medio de nveis de nitrotirosina nas 2 situaes. Que outras metodologias poderia utilizar para investigar estes e outros produtos modificados por stress oxidativo ?

Referncia: Kohen, R, Nyska A. Oxidation of biological systems: oxidative stress phenomena, antioxidants,redox reactions, and methods for their quantification . Toxicol Pathol 30: 620-650, 2002. 17

OXIDAO: Lpidos, DNA e Protenas

Deteco por Western blot

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