1

Cintica das reaces bioqumicas

As clulas vivas dos organismos obtm a
energia de que imediatamente necessitam a
partir da oxidao dos polisidos de reserva
a CO
2
e gua.
Esse conjunto de processos, como tambm
os processos de sntese das
macromolculas, s possvel devido
interveno dos catalisadores bioqumicos
as enzimas.
Cintica das reaces bioqumicas
Embora alguns RNA sejam capazes de intervir
cataliticamente na sua prpria duplicao, todas
as enzimas so protenas; concretamente,
protenas globulares.
As enzimas so, de entre todos os tipos de
catalisadores, os mais eficientes.
Enquanto um catalisador no enzimtico pode
aumentar entre 100 e 10.000 vezes a velocidade
de uma reaco, algumas enzimas so capazes
de a multiplicar por um factor 10
12
.
2
Cintica das reaces bioqumicas
A catlise das reaces bioqumicas segue uma
cintica especial embora os parmetros
fundamentais em que se baseia sejam os mesmos
dos outros processos qumicos.
Catalisadores
A energia de activao requerida para iniciar um
processo qumico pode ser fornecida atravs de uma
elevao de temperatura que aumente a agitao
molecular.
Em bioqumica, porm, a temperatura dos sistemas
no pode ultrapassar os valores compatveis com a
vida dos organismos (o aquecimento provoca,
nomeadamente, a desnaturao das protenas).
Cintica das reaces bioqumicas
ento que intervm os catalisadores bioqumicos - enzimas enzimas cuja
funo baixar a energia de activao necessria reaco e
permitir que esta decorra a velocidade muito mais elevada.
O catalisador (qualquer catalisador):
- No modifica K (constante de equilbrio)
- No permite que passe a ocorrer uma reaco que no seja possvel
do ponto de vista termodinmico. Ter sempre de ser G < O (a
menos que seja fornecida a energia necessria)
- Encontra-se intacto no final da reaco
- Diminui a energia de activao necessria a reaco, permitindo
que esta decorra a velocidade mais elevada.
3
Cintica das reaces bioqumicas
Enzimas - as ferramentas do metabolismo
As enzimas possuem as propriedades dos catalisadores qumicos e:
- Baixam ainda mais a energia de activao;
- Possuem todas natureza proteica, o que lhes confere
especificidade muito elevada;
- A sua actividade pode ser sujeita a controlo (o que da maior
importncia na regulao do metabolismo celular).
As enzimas podem ser:
- Inteiramente proteicas
- Constitudas por: parte proteica (apoenzima) e ainda
ies metlicos,
grupos prosteticos e coenzimas
Cintica das reaces bioqumicas
A energia de activao (Ea ou E)
em Bioqumica, expressa em G
Catalisada
enzimticamente
4
Cintica das reaces bioqumicas
Centro activo
O centro activo ou stio activo constitudo pelo conjunto
de aminocidos que entram em contacto com o substrato.
Compreende o local de fixao, que se combina com o
substrato por ligaes fracas, e o centro cataltico, que
actua sobre o substrato levando-o a sofrer a reaco
qumica.
Nos centros catalticos da maior parte das enzimas
conhecidas vamos encontrar com muita frequncia a
serina, a cistena, a histidina, a tirosina e a usina.
Muitas enzimas hidrolticas possuem a serina no seu
centro activo.
Cintica das reaces bioqumicas
5
A conformao do local de fixao modifica-se em
consequncia da ligao ao substrato; diz-se que este
induz a alterao da conformao.
Cintica das reaces bioqumicas
O centro activo
compreende regies
responsveis pela
ligao ao substrato
(local de fixao) e
regies que catalisam a
reaco
(centro cataltico).
Nas enzimas que actuam atravs de um
cofactor que o responsvel pela
transformao estrutural do substrato ,
essa estrutura (trate-se de um metal, de
um grupo prosttico ou de uma coenzima)
encontra-se ligada enzima na vizinhana
muito prxima do centro cataltico.
Cintica das reaces bioqumicas
6
Cintica das reaces bioqumicas
O enrolamento
determinante para a
formao do centro activo.
A construo da bolsa do
heme na hemoglobina est
dependente do enrolamento
das cadeias peptdicas da
protena enzimtica, o qual
aproxima e coloca em
posio resduos de
aminocidos que podem
estar distanciados na
sequncia.
Cintica das reaces bioqumicas
Velocidade da reaco enzimtica
A velocidade de uma reaco enzimtica em geral
seguida atravs da medio da quantidade de produto (ou
produtos) formado por unidade de tempo.
S+E P+E
S - substrato
E - enzima
P produto
A determinao experimental da velocidade da reaco
realizada recolhendo do meio reaccional, a intervalos de
tempo regulares, alquotas (o mesmo volume de amostra)
da soluo.
7
Cintica das reaces bioqumicas
O seu estudo
realizado a partir de
uma representao
grfica.
At certa altura a variao linear. Torna-se, portanto,
vantajoso medir a velocidade no incio da reaco,
quando foi transformado pouco substrato e a
velocidade inversa desprezvel (na prtica introduz-
se na reaco excesso de substrato, o que
corresponde a uma situao normal no metabolismo).
O declive ento mximo, o que permite ter a
velocidade inicial da reaco (v0).
Cintica das reaces bioqumicas
Pode tambm medir-se a velocidade a partir
do decrscimo da concentrao de
substrato; nesse caso e v = - [S].
t
Esta opo vantajosa, em condies em
que a medio da concentrao de produto
formado difcil p. ex., quando ela muito
baixa.
8
Cintica das reaces bioqumicas
Actividade enzimtica
A actividade enzimtica pode avaliar-se de vrios modos
- A actividade molar ou nmero de turnover o nmero
de moles de substrato transformado (ou de produto
formado) por mole de enzima e por unidade de tempo
(minuto ou segundo). Pressupe-se que a enzima est
totalmente saturada de substrato e, portanto, que a
reaco ocorre velocidade mxima.
- A unidade enzimtica a quantidade de enzima que
catalisa a transformao de 1 micro mole de substrato
em 1 minuto, a 25C, nas condies ptimas de pH e de
concentrao de substrato.
Por vezes a unidade de concentrao o milimole ou o
miligrama.
Cintica das reaces bioqumicas
A velocidade inicial proporcional concentrao de enzima
9
Cintica das reaces bioqumicas
Variao da velocidade da reaco com a concentrao de
substrato Equao de Michaelis e Menten
Estes autores, Leonor Michaelis e Maud Menten, concluram em 1913
o estudo quantitativo das variaes da velocidade de uma reaco
enzimtica em funo do aumento de [S]. Esse estudo baseia-se na
representao
A quantidade de P formado, assim como a velocidade da reaco, vo
depender directamente da concentrao em complexo E - S, isto , da
concentrao de enzima que se liga ao substrato. Dai que o estudo do
equilbrio E + S E - S permita a interpretao simplificada da cintica
da reaco sem comprometer o seu rigor.
A constante de equilbrio ou constante de Michaelis para a dissociao
do complexo E-S:
Cintica das reaces bioqumicas
onde [E] a concentrao em enzima livre (i.e. que no
est ligada ao substrato), igual concentrao inicial da
enzima [E
0
] menos [E-S] (concentrao de enzima que
se ligou):
[E] = [E
0
] - [E-S]
Repare que a constante de Michaelis definida, no
para a formao do complexo {E-S] mas sim para o
sentido inverso (o da sua dissociao). uma
interpretao igualmente vlida do equilbrio, e foi a
preferida pelos autores apenas por o seu
desenvolvimento originar uma representao grfica de
leitura mais simples.
10
Cintica das reaces bioqumicas
Substituindo na expresso da constante de Michaelis:
Observe-se agora o seguinte:
1 - A velocidade da reaco directamente proporcional concentrao de
enzima ligada ao substrato, ou seja, concentrao do complexo E-S:
v = k [E-S]
2 - A velocidade mxima atingida quando toda a enzima est ligada ao
substrato. Ento: vmx = k [Eo]
visto [Eo] ser a concentrao total de enzima (pressupe-se que existe
substrato em excesso, isto , que toda a enzima disponvel se lhe pode ligar).
Portanto,
Substituindo na expresso de K
M
, fica
Cintica das reaces bioqumicas
A equao de Michaelis e Menten permite, aps a
determinao experimental das variaes de v em funo
de [S], obter o valor de v
mx
e calcular K
M
.
Em geral os K
M
esto compreendidos entre 10
-2
M e 10
-8
M (por conveno atribuem-se a K
M
as unidades de
concentrao.
K
M
uma medida da afinidade da enzima para o
substrato: essa afinidade igual a 1/K
M
.
Se K
M
for elevado a afinidade baixa.
11
Cintica das reaces bioqumicas
Variao da velocidade
de reaco em funo da
concentrao de substrato
curva de
Michaelis:
v= k[E-S]; a velocidade
mxima ocorre quando
toda a enzima (Eo) est
ligada ao substrato:
vmx = k [Eo]
Tomando um valor de v igual a vmx / 2, vem:
1 = . [S] . ou KM=[S] isto
2 KM+[S]
KM igual concentrao de substrato para a qual v = Vmx / 2
Cintica das reaces bioqumicas
Comentrio -_Esta constatao, fundamentada afinal numa coincidncia, que
permite ler o valor de K
M
no eixo das abcissas aps se ter constatado que a
velocidade passou a ser constante (i.e, que se atingiu a velocidade mxima),
constitui a chave do interesse experimental do grfico de Michaelis e Menten.
O problema, porm, que o clculo de K
M
no rigoroso e, por outro lado, o
traado da curva de Michaelis exige um nmero elevado de determinaes:
repare-se, desde logo, que necessrio, para cada valor de
concentrao de substrato, determinar uma velocidade (um ponto da
curva); e que, para determinar cada um desses pontos (cada um
representa um valor de v), so necessrias leituras de concentrao,
em alquotas do meio reaccional, a intervalos de tempo idnticos e
sucessivos o que implica que cada ponto da curva de Michaelis
custa 5 ou 6 leituras para a determinao de v.
Alm disso, a determinao de K
M
que constitui o principal objectivo num
estudo cintico depende da determinao de vmx, ou seja, da deteco da
concentrao de S a partir da qual v j no aumenta ( o patamar); ora esse
valor tem de ser determinado, afinal, por aproximao, j que no se pode
afirmar com todo o rigor esta a concentrao de S para a qual v estaciona.
12
Cintica das reaces bioqumicas
Da que outros autores tenham tentado
transformar a interpretao cintica de
Michaelis numa interpretao linear: o
objectivo era obter uma relao entre v e S
que pudesse ser traduzida graficamente por
uma recta.
Lineweaver e Burk foram os primeiros a
consegui-lo, aps terem verificado que,
representando 1/v em funo de 1/[S]
(bastava, portanto, inverter os respectivos
valores), o grfico era linear.
Cintica das reaces bioqumicas
A cintica de Lineweaver-Burk
Esta interpretao tomou mais simples o estado da
cintica bioqumica, j que
o traado de uma recta exige menos leituras
experimentais (menos pontos) do que o da curva; e, por
outro lado a determinao de KM mais expedita e
rigorosa.
Muitas outras interpretaes lineares vieram depois. Mas
um facto indiscutvel: toda a interpretao da cintica
das reaces bioqumicas ( excepo da cintica
alostrica) se baseia na equao de Michaelis-Menten.
13
Cintica das reaces bioqumicas
Invertendo ambos os membros da equao de Michaelis e
isolando 1/v no 1 membro, pode transformar-se essa
equao em:
Sob esta forma temos uma equao do tipo y = ax + b
(onde 1/v e 1/[S] so as variveis y e x).
A representao grfica uma recta, o que evidentemente
apresenta vantagens:
alm de o traado de uma recta exigir menos pontos
(menor nmero de determinaes experimentais), KM
lido com rigor: o simtrico do inverso da interseco com
o eixo das abcissas (veja no grfico seguinte).
Cintica das reaces bioqumicas
declive
14
Influncia da temperatura
e do pH na actividade enzimtica
Temperatura e actividade enzimtica
A velocidade de todas as reaces qumicas aumenta com a
temperatura.
um facto que a velocidade das reaces endergnicas muito
mais favorecida por esse factor que a das reaces exergnicas.
Ateno: a velocidade da reaco endotrmica aumenta muito mais
do que a da reaco exotrmica a qual, no entanto, tambm
aumenta.
A temperatura ptima de uma reaco enzimtica ser, portanto
um compromisso entre o facto de que o aumento de temperatura
favorece a velocidade e a circunstncia de, a partir de um certo
valor de T, a enzima se desnaturar.
Influncia da temperatura
e do pH na actividade enzimtica
1 - A velocidade da reaco (curva a cinzento) aumenta com a
temperatura, espontaneamente ou em presena de um catalisador;
2 - a partir de uma dada temperatura a protena enzimtica desnatura-
se (a preto).
A velocidade da reaco enzimtica a resultante (a vermelho) das
duas curvas.
15
As reaces enzimticas e o pH
- Os pH extremos modificam irreversivelmente a
estrutura da enzima, quer devido
desnaturao da protena, quer possibilidade
de modificao da ligao entre apoenzima e
coenzima
- Em grande nmero de casos o pH modifica o
estado de ionizao do substrato
- o pH tem influncia na reaco enzima-
substrato e na catlise, em particular devido
modificao da dissociao (ionizao) dos
aminocidos do centro activo.
Influncia da temperatura
e do pH na actividade enzimtica
Influncia da temperatura
e do pH na actividade enzimtica
As enzimas podem apresentar dois tipos de curva
de actividade em funo do pH.
16
Cintica dos inibidores reversveis
Inibidor qualquer composto que, ao ligar-se enzima,
lhe reduz a actividade e diminui a velocidade da
reaco.
Os chamados inibidores reversveis so reguladores
(por inibio) da actividade enzimtica, que no
provocam alteraes irreversveis nas enzimas sobre as
quais actuam.
O tipo de interveno que a seguir se refere no aceita a
actuao com sinal contrrio - isto , a de activadores.
Regulao enzimtica por
activadores e inibidores
Regulao enzimtica por
activadores e inibidores
Cintica dos inibidores reversveis
Inibidor qualquer composto que, ao ligar-se
enzima, lhe reduz a actividade e diminui a
velocidade da reaco.
Os chamados inibidores reversveis so
reguladores (por inibio) da actividade
enzimtica, que no provocam alteraes
irreversveis nas enzimas sobre as quais actuam.
O tipo de interveno que a seguir se refere no
aceita a actuao com sinal contrrio - isto , a de
activadores.
17
Inibidores competitivos aumentam KM
Do ponto de vista qumico estes inibidores
caracterizam-se por uma grande analogia
estrutural com os substratos. Podemos
considerar que a especificidade da enzima no lhe
permite distinguir entre o substrato e o inibidor;
este vai-se ligar ao centro activo da enzima,
impedindo desse modo a ligao do substrato.
Este tipo de inibio ocorre em relao a todas as
enzimas: qualquer anlogo estrutural do substrato
pode, em princpio, intervir como inibidor
competitivo.
Regulao enzimtica por
activadores e inibidores
Regulao enzimtica por
activadores e inibidores
O exemplo clssico de inibio competitiva, pelas
repercusses clnicas que obteve, o das sulfamidas.
Muitas bactrias perniciosas para o organismo humano
necessitam do cido p-aminobenzico para a sntese de
um composto que lhes vital: o cido flico. Fornecendo-
lhes sulfamidas, a enzima que responsvel nesses
organismos pela sntese do cido flico no distingue
esses compostos do substrato que deviam incorporar (o
cido p-aminobenzico).
18
Regulao enzimtica por
activadores e inibidores
Isso sucede com muito maior probabilidade se a
concentrao de sulfamidas for mais elevada o que o
caso, quando se administram como medicamento Na
competio, o substrato natural da enzima vai ser
inevitavelmente excludo da ligao ao centro activo e, aps
cometido o erro, a situao irreparvel: a enzima no
consegue sintetizar cido flico e a bactria morre.
Temos duas reaces que ocorrem simultaneamente (I o
inibidor).
O inibidor I fixa-se em E e portanto desloca o equilbrio 1 para a esquerda;
a dissociao de E-S aumenta, logo KM aumenta.
Em presena de excesso de S, o equilbrio deslocado para E-S: como a
inibio anulada por excesso de substrato, vmx no modificada
+
Regulao enzimtica por
activadores e inibidores
Um inibidor competitivo em pequena quantidade (curva 1) ou em maior
quantidade (curva 2) no altera a velocidade mxima mas torna-se
necessria maior quantidade de substrato para atingir essa velocidade. K
M
aumenta.
19
Regulao enzimtica por
activadores e inibidores
Inibidor competitivo:
representao de Lineweaver-
-Burk
Factor igual a 1 + [I]
K
I
Declive das rectas (com inibidor):
KM (1+ [I] )
vmx K
I
Um exemplo: o metanol txico para os mamferos por ser um inibidor
competitivo da lcool-desidrogenase, cujo substrato natural o etanol.
Regulao enzimtica por
activadores e inibidores
Um inibidor competitivo para o tratamento da Sida
O AG-1284, um potente inibidor de uma hidrolase responsvel pela
multiplicao intracelular do HIV
Perante as dificuldades que se levantam criao de uma vacina, uma
das abordagens que tem sido tentada no tratamento do sndroma da
imunodeficincia adquirida (SIDA) tem sido a pesquisa de inibidores
especficos que bloqueiem a actividade de enzimas exclusivas do vrus. A
HIV-protease uma dessas enzimas. Catalisa o processamento das
protenas virais numa clula infectada, e sem essa protena as partculas
virais do HIV no so libertadas nas clulas hospedeiras.
Uma empresa farmacutica americana, a Agouron Pharaceutical,
sintetizou um composto que designou AG-l284, o qual se revelou um
potente inibidor da HIV-protease.
Conhecida a estrutura da enzima por cristalografia de raios X, e sobretudo
a do seu centro activo, os investigadores da Agouron desenharam e
sintetizaram aquele composto, que se comporta como inibidor competitivo
ligando-se fortemente ao centro activo e provocando a inibio da enzima
mesmo em concentraes muito baixas (1 x 10
-6
M).
20
Regulao enzimtica por
activadores e inibidores
Inibidores no competitivos diminuem Vmx
So inibidores que se fixam reversivelmente na enzima
noutro local que no o centro activo, no diminuindo a sua
aco por adio de um excesso de substrato.
A enzima pode ligar-se ao mesmo tempo ao substrato e ao
inibidor no competitivo
Dado que o inibidor se liga num local diferente do centro
activo, a enzima pode continuar a ligar a si o substrato
No entanto, como a conformao do centro activo de
algum modo afectada pela presena do inibidor, essa
ligao efectua-se com menos facilidade: a velocidade da
reaco diminui.
Regulao enzimtica por
activadores e inibidores
Representao de Michaelis para a cintica dos
inibidores no competitivos
O inibidor no competitivo
em pequena quantidade (curva
1) ou, em maior quantidade
(curva 2) diminui a velocidade
da reaco e em particular a
velocidade mxima
21
Regulao enzimtica por
activadores e inibidores
Inibidor no competitivo:
representao de Lineweaver-
-Burk.
Estes inibidores diminuem a
velocidade, pelo que o declive da
recta aumenta Vmx diminui.
Como os inibidores no
competitivos no alteram a
afinidade, KM no se altera.
Regulao alostrica
Este tipo de regulao, que inclui activao e inibio,
assume a maior relevncia em bioqumica pois
aquele que intervm no controlo das sequncias centrais
do metabolismo.
O primeiro caso de inibio alostrica conhecido foi
detectado durante o estudo da sntese do triptofano em
E. coli; Novick e Sziland verificaram que, quando a
concentrao deste aminocido atingia determinados
valores ele prprio se encarregava de suspender a sua
sntese actuando sobre a primeira enzima por ela
directamente responsvel. Chamou-se a este processo
retroinibio (feed-back inibition.), e o estudo da
actividade desse enzima veio a revelar que ela no
segue a cintica de Michaelis
22
Regulao alostrica
Os efectores alostricos actuam sobre a primeira
enzima especifica da cadeia metablica que conduz
sua prpria formao (efectores so os compostos
qumicos que modificam a velocidade da reaco
enzimtica; podem ser activadores ou inibidores).
A retroinibio permite suspender a sntese de um
composto que j no utilizado pela clula, o que se
traduz, para alm do mais, numa economia para o
organismo, sobretudo por se tratar de processos que
requerem energia.
A regulao alostrica de uma sequncia metablica pode
ser efectuada por um inibidor (ou activador) alostrico de
outra sequncia. Trata-se, porm, de um tipo de
regulao especfico de algumas vias.
Regulao alostrica
Estrutura e conformao das enzimas alostricas
1 As enzimas alostricas so constitudas por vrias
subunidades idnticas (protmeros), formadas cada
uma delas por uma ou mais cadeias polipeptdicas.
Tm, portanto, estrutura quaternria.
2 Cada protmero possui trs locais de fixao: um para
o substrato, outro para o activador e outro para o inibidor.
3 Existem dois estados conformacionais da enzima
que esto em equilbrio: um estado cataltico (activo) (R
ou relax) e um estado inibido (T ou tense). No estado
cataltico a conformao da enzima permite-lhe
combinar-se ao substrato e ao activador. Na forma
inibida apenas o inibidor se consegue ligar enzima.
A passagem de uma forma outra designada transio
alostrica.
23
Regulao alostrica
Assim, o substrato e o activador deslocam o equilbrio
para a forma R, permitindo molcula enzimtica fixar
uma molcula de substrato por protmero. Pelo contrrio,
o inibidor desloca o equilbrio para a forma T, e a enzima
torna-se inactiva.
Representao do equilbrio entre as formas ismeras R e
T de uma enzima alostrica constituda por 2 protmeros.
Cada protmero possui um stio especfico de ligao para
cada ligando (substrato, activador e inibidor).
Regulao alostrica
Efeito cooperativo do substrato
O efeito cooperativo ou homotrpico positivo do
substrato consiste no facto de a fixao da
primeira molcula de substrato facilitar a fixao
da segunda (no caso geral, das seguintes).
De um modo geral. o efeito homotrpico o efeito
de um ligando sobre a sua prpria fixao,
entendendo-se por ligando um composto que se
fixa especificamente na enzima (substrato ou
efectores).
24
Regulao alostrica
A adio de um activador alostrico (+) desloca a curva
para a esquerda e a adio de um inibidor (-) para a
direita, O efeito cooperativo igualmente manifestado
pelos inibidores e pelos activadores.
As enzimas no dia-a-dia
As enzimas tm utilizao comercial muito diversa.
Os detergentes bioactivos contm uma enzima produzida pela
bactria Bacillus subtillis, muito estvel sob a aco do calor,
que hidrolisa completamente as protenas das manchas. Em
muitos pases a carne amaciada com papana, uma enzima
de aco proteoltica extrada da papaia. A mesma papana
elimina a turvao da cerveja produzida por protenas; as
pectinases so utilizadas na clarificao dos vinhos; as a e -
amilases extradas do malte e do fungo spergillus niger so
utilizadas no fabrico de bebidas alcolicas, nomeadamente do
usque. A celulase utiliza-se para obter acar a partir da
celulose; a invertase utilizada nos bombons de licor uma
pequena quantidade de invertase decompe a sacarose em
glucose e frutose que, ao contrrio do acar de cana, so
acares higroscpicos e, como tal, acumulam lquido no
interior do bombom.
25
As enzimas no dia-a-dia
Em Portugal, um grupo da Faculdade de Cincias e
Tecnologia da Universidade de Coimbra estudou a
estrutura de uma enzima da flor do cardo (a cardosina,
como designada) utilizada no fabrico do queijo da Serra,
e prope-se agora isolar essa enzima, ou o gene que a
codifica, e conseguir que uma levedura ou uma bactria a
produzam.
As enzimas actualmente utilizadas como catalisadores em
numerosas indstrias so, em grande parte, obtidas por
engenharia gentica. o caso de uma lipase produzido
pelo microrganismo Candida antarctica e que fabricada,
entre outras, pela empresa dinamarquesa Novo; essa
enzima utilizada para alterar a composio em cidos
gordos dos triglicridos das gorduras naturais, de modo a
permitir, por exemplo, a obteno de margarinas de
melhor qualidade.