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Cincia em Movimento
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2011/2
Determinao do Km e V Max: reviso
e uma nova proposta
Determination of Km and Max V: review
and a new proposal
A.J.S. Siqueira
1
A.M.P. Azevedo
1
A. Mattos-Dutra
1
C.A Fin
1
V.R. Lando
1
L.N. Rotta
1
M.R. Wink
1
R.L. Bjerk
1
M.S. Ferracini
2
SUMRIO
O objetivo do presente trabalho foi o de apresentar uma anlise das trs equaes da reta que permitem a
determinao do Km e da Vmax de uma reao enzimtica. Os autores sugerem uma nova equao capaz de
calcular o Km e a Vmax com maior preciso e assim como Hofstee, Eadie, Scatchard e Wilkinson recomendam
o abandono da equao de Lineweaver-Burk.
PALAVRAS-CHAVE
Cintica enzimtica - Km - Vmax.
1
Departamento de Cincias Fisiolgicas setor de Bioqumica, Universidade Federal de Cincias da Sade de Porto Alegre.
2
Professora com Licenciatura Plena em Matemtica, Colgio Bom Conselho, Porto Alegre, RS.
Artigo de rev iso
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SUMMARY
The objective of the work was to analyse three different equations used to calculate the Km and Vmax of
enzymatic reaction. The authors suggested a new equation that is capable to calculate with more precision both
constants and is in agreement with the Hofstee, Eadie, Scatchard and Wilkinson who recommended to abolish-
ment of the Lineweaver-Burk equation.
KEYWORDS
Enzymatic kinetic Km Vmax
Determinao do Km e V Max: reviso e uma nova proposta
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Determinao do Km e V Max: reviso e uma nova proposta
Introduo
No presente artigo os autores procuraram fazer
uma anlise das equaes utilizadas para determi-
nao do Km e Vmax das reaes enzimticas.
O Km e Vmax so duas constantes de extrema
importncia no estudo das reaes enzimticas. O
Km permite entender a funo de enzimas que cat-
alisam uma reao especca, como o caso das
isoenzimas, hexoquinase e glicoquinase. A primeira
tem um Km pequeno para a glicose e a segunda, um
Km maior para o mesmo substrato, o que explica
suas diferentes funes.
Quando uma mesma enzima atua sobre mais de
um substrato, esta constante permite identicar o
substrato natural (principal) que ser o de menor
Km sendo que este inversamente relacionado com
a anidade da enzima pelo substrato. Existe uma de-
pendncia entre Km e Vmax (NEILANDS; STUMPF,
1955). Na determinao da atividade de uma enzima,
a concentrao do substrato deve car em torno de
10 Km ou, se no for possvel, dever atingir o limite
da solubilidade. Nestas condies esta reao aproxi-
ma-se de 90% da velocidade mxima (PANASSE,
1974), que est vinculada atividade molecular.
A noo de enzima iniciou em 1833 com Payen
e Persoz, citado por Wallach (1997). O ponto de par-
tida dos estudos sobre cintica enzimtica ocorreu
em 1902 quando Henri sugeriu a existncia da for-
mao de um complexo enzima-substrato. Partindo
desta hiptese, Michaelis e Mentem (1913, p. 333)
apresentaram um clculo matemtico mais tarde
desenvolvido por Briggs e Haldane (1925, p. 38) que
resultou na equao: v = Vmax.s ou

A partir da igualdade acima foram derivadas trs
equaes lineares capazes de determinar Km e veloci-
dade mxima: equaes de Eadie-Hofstee (DIXON;
WEEB, 1964), Hanes e Woolf (1932) e Lineweaver-
Burk (1934) representadas nas igualdades 1, 2 e 3
abaixo. Foi possvel estabelecer uma quarta equao
que se mostrou mais precisa e que foi denominada
CMPA (Equao 4).
Material e Mtodos
Para realizao do presente trabalho foram obti-
dos os valores de concentrao de substrato e das
respectivas velocidades com enzimas conhecidas
(invertase e adenililtransferase) e de cinco reaes
hipotticas. O Km e a Vmax das reaes foram calcu-
ladas com as quatro reaes calculadas. Os resulta-
dos obtidos foram comparados e analisados. Os gr-
cos das reaes da invertase foram desenvolvidos
com as quatro equaes e o da adenililtransferase
com as equaes Linewear-Burk e CMPA.
Resultados
Os resultados encontram-se nas tabelas 1,
2,e 3.
Km+s
Km=s(Vmax _ 1) onde v a velocidade de reao,
v
Vmax a velocidade mxima, s a

concentrao do substrato e Km quando v = Vmax
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Discusso
A equao de Lineweaver-Burk, a mais recomen-
dada pelos diversos autores, apresenta dois erros
matemticos.
Para determinar o Km considera 1 igual a zero.
v
Ento
Considera, tambm, 1 igual a zero para a deter-

s
minao da Vmax
As igualdades (I) e (II) foram obtidas considerando os
valores de 1/v e 1/s igual a zero.
As dedues que levam s igualdades I e II esto mal
conduzidas, pois 1/s e 1/v nunca sero iguais a zero. A
equao de Lineweaver-Burk leva o estudante a um raci-
ocnio falso, formulado dentro de princpios aparentemente
lgicos.
Scatchard, citado por Hofstee (1952) arma ...o mtodo
dos inversos (1/s x 1/v) tem a desvantagem de encobrir des-
vios da reta ideal e de forar uma linha reta onde deveria ser
uma curva. Esta armao fcil de vericar em um experi-
mento para determinar o Km e Vmax da invertase (gura
1, C). Nesta gura possvel observar que na equao de
Lineweaver-Burk o traado da reta foi forado. Na realidade,
os pontos indicam uma curva e no uma reta. O grco A
da gura 2, e o da Eadie-Hofstee (gura 1, A) mostram o
mesmo defeito.
De acordo com Hofstee (1952) no h nenhuma razo
que justique o uso da equao de Lineweaver-Burk.
Wilkinson (1961, p. 324) arma que consideraes estatsti-
cas recomendam a equao linear S/v x S no lugar de 1/s x
1/v. Com os dados das reaes enzimticas hipotticas, da
invertase (VILLELA; BACILA; TASTALDI, 1973) e da adenilil-
transferase (WILKINSON, 1961, p.324), que se encontram
nas Tabelas 1, 2 e 3, procuramos comparar os valores encon-
trados para Km e Vmax, os quais encontram-se na Tabela 2.
possvel observar que as quatro equaes apresentaram
desvios da mdia menores que 5%, o que tolervel tanto
para Km quanto para Vmax. (HOFSTEE, 1952). No entanto
a nova equao mostra a menor mdia dos desvios para
a Vmax, a de Eadie-Hofster menor para Km; no entanto
a equao de Lineweaver-Burk, evidencia a maior mdia
dos desvios tanto para Km quanto para Vmax. Na equao
CMPA, como na de Eadie-Hofstee, as duas constantes so
obtidas sem clculos adicionais. Para a equao 1/s x 1/v
devem ser calculadas as recprocas dos dados experimen-
tais e os valores de Km e Vmax, com os inversos dos dados
indicados pelo grco. Na equao de Hanes a Vmax cal-
culada pelo inverso da inclinao da reta.
A gura 1, A, B, C, e D, que indicam o experimento
com a invertase da levedura, mostra que as melhores dis-
tribuies dos pontos foram obtidas com as equaes de
Hanes-Woolf e CMPA.

1
=
Km . 1
+
1
v V s V

0
=
Km . 1
+
1 ou km . 1
=
- 1 ou, ainda
V s V V s V

-
1
1
=
V
s Km
V

1
=

-
1 . V
= 1 =
-
1
(I)
s V Km s Km

1
=

-
Km .
0
+ 1
ou 1 =1
(II)
v v V v V
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Para Dixon (1964) as trs equaes de reta para a deter-
minao do Km so vlidas, mas d preferncia equao
de Lineweaver-Burk que , infelizmente pouco convel,
segundo Wallach (1997). Os argumentos do autor para con-
siderar 1/s x 1/v o melhor caminho para determinar as duas
constantes, so inconsistentes. Conforme Dixon o mtodo
dos inversos permite identicar facilmente os pontos cor-
respondentes s diferentes concentraes de substrato, o
que no acontece com os outros mtodos.
No entanto, as equaes de Hanes e Wolf e a CMPA
no apresentam este problema.
Para o mesmo autor na equao de Eadie-Hofstee
qualquer erro em vafeta ambas coordenadas deslocando
o ponto da reta ideal.
Esse ltimo argumento no pode ser aceito consid-
erando que um experimento para determinao do Km e
Vmax deve ser realizado com diversos pontos e, portanto,
o desvio de um ou dois pontos no impede que o resultado
mantenha a preciso desejada.
Os pontos desviados podem ser desprezados no mo-
mento da confeco do grco. Alm disso, para deter-
minao das duas constantes, necessrio repetir vrias
vezes o mesmo experimento a m de permitir uma anlise
estatstica dos resultados.
Valores de Km e Vmax da adenililtranferase com dados
da Tabela 3 (WILKINSON, 1961) calculados pela equao
CMPA (Km=0,5889 e Vmax= 0,6884) apresentaram uma
diferena de apenas 1,02% para a primeira constante e
de 0,084% para a segunda quando comparados com os
resultados estatsticos de Wilkinson (Km=0,595 e Vmax
0,69). Como possvel vericar na Figura 2, os resultados
obtidos com a equao de Lineweaver-Burk as variaes
foram de 7,5% e de 11,5% para Vmax em relao aos ach-
ados estatsticos.
Consideraes Finais
As mdias dos desvios e os desvios das mdias mos-
traram claramente que a equao de Lineweaver-Burk
evidencia o maior desvio da mdia tanto do Km como da
Vmax. A mesma equao exige que sejam calculadas as
recprocas das concentraes do substrato e das veloci-
dades das reaes no incio e no nal dos clculos o que
no ocorre com as outras equaes.
Pelas razes apresentadas concordamos com os
autores que recomendam o abandono da equao de
Lineweaver-Burk para determinao do Km e Vmax.
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Referncias
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nylyltransferase of Pig-Liver Nuclei. Bioch. v. 80, p. 318, 1961.
BRIGGS, G. F.; HALDANE, J. B. S. A note on kinetics of
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DIXON, M. & WEBB, E. C. Note, Nature, v. 184, p. 1298,
1959.
EADIE, G. S. The Inibition of cholinesterase by physostig-
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HANES, C. S. CLXVII. Studies on plant amylases. Bioch.
J. v. 112, p. 1406, 1932.
HOFSTEE, B. H. On the Evaluation of the Constants Vm
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LINEWEAVER, H. & BURK, D. The determination of En-
zyme Dissociation Constanto. J. Amer. Chem. Soc. V. 56,
p. 658, 1934.
MICHAELIS, L.; MENTEN, M. L. Die Kinetik der In-
vestinwirkung Bioch. Z, v. 49, 1913. p. 333.
NEILANDS, J. B.; STUMPF, P. K. Outlines of Enzyme
Chemistry. New York: John Wiley & Sons Inc, 1958. p.
95-109.
PANASSE, L. Les Enzymes: Cintique et Mcanisme
DAction. Paris: Masson et Cie, diteurs, 1974. p. 24-25.
WALLACH, J. Les enzymes. Paris: Editeur Nathan,
1997.
WILKINSON, G. N. Statistical Estimations in Enzyme
Kinetics. Bioch. J. v. 80, p. 324, 1961.