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Captulo 4
Micologia
Aurea Maria Lage de Moraes
Rodrigo de Almeida Paes
Vernica Leite de Holanda
1. Introduo micologia
Micologia | 401
o assexuada.
Teleomorfo: aquele que no ciclo de vida realiza apenas a reprodu-
o sexuada.
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organismos vivos.
Os fungos so considerados seres cosmopolitas, pois esto presentes
em qualquer parte do planeta. Sendo amplamente distribudos pela natureza,
so encontrados na gua, no ar atmosfrico, no solo, sobre os animais e
vegetais vivos, na matria orgnica em decomposio, nos produtos alimentcios e industriais.
A maioria dos fungos tm como necessidades nutricionais, os elementos C, O, H, N, P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Mo, Fe e Zn. Muitas espcies
no necessitam de luz para seu desenvolvimento, j outras necessitam para
formar suas estruturas de reproduo, podendo ser consideradas fototrficas
(que buscam a luz). A temperatura ideal para o crescimento dos fungos fica
entre 0 a 350C, mas o timo para a maioria fica entre 20 a 300C e a
umidade ideal fica em torno da saturao.
1.3. Posio sistemtica dos fungos
Os representantes do filo Chytridiomycota so considerados cosmopolitas e saprfitos aquticos. A maioria de gua doce poucos so
marinhos. A principal caracterstica do grupo a formao de zosporo
flagelado, estruturas de propagao no ambiente aqutico, onde o flagelo
ajuda na sua movimentao.
Ex: Chytriomyces sp.
1.3.2. Filo Neocallimastigomycota
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O filo Ascomycota compreende o maior grupo do reino Fungi, constitudo de aproximadamente 75% de todos os fungos descritos. Seus representantes so considerados cosmopolitas e so encontrados na natureza como
saprfitos, parasitas (especialmente de plantas), ou em associao mutualstica
(com algas unicelulares) formando os liquens.
A principal caracterstica do grupo a presena de asco contendo
ascosporos, geralmente oito, que representam a estrutura de propagao do
grupo. So produzidos por reproduo sexuada.
A reproduo assexuada tambm pode ser encontrada. O asco formado em uma estrutura denominada ascocarpo (corpo de frutificao), que
pode ser encontrado nas seguintes formas: apotcio (ascocarpo em forma de
taa), cleistotcio (ascocarpo totalmente fechado, que se rompe com a maturidade), e peritcio (ascocarpo em forma de balo, com um poro na sua
ponta). A ausncia da formao de ascocarpo tambm observada, sendo
este considerado como ascos nus.
Ex: Eurotium sp. e Emericella sp.
Os Fungos Anamrficos formam um grupo de fungos onde a reproduo assexuada predominante, com a formao de condios como estrutura de
propagao.
A reproduo sexuada ausente, desconhecida ou teve a capacidade
perdida. Esse grupo est relacionado a gneros do filo Ascomycota e
Basidiomycota por comparao de sequncias gnicas. So considerados como
cosmopolitas, saprfitos, e parasitas de animais e plantas.
Os condios so formados por clulas conidiognicas, presentes nos
conidiforos, que so prolongamentos de hifas modificadas, com funo
reprodutiva. Os condios podem ter diferentes formas, tamanhos e cores,
podem possuir ou no a superfcie texturizada, ornamento ou septo.
Ex: Aspergillus sp e Penicillium sp.
2. P
or que estudamos os fungos
Por
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3. Micologia Mdica
A Micologia mdica tem como principal objetivo estabelecer o diagnstico micolgico das infeces por fungos, que por sua vez se baseia em
correta coleta e processamento de espcimes clnicos. A observao das normas de preservao, e transporte adequados dos materiais clnicos at os locais
de processamento, como laboratrio de Microbiologia/Micologia tambm tem
enorme importncia para a obteno de resultados acurados.
3.1. Classificao das micoses
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des rugosas.
Epidermophyton So clavados, robustos bi ou trisseptados com
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Fungo dermatfito
Macromorfologia
Micromorfologia
Trichophyton rubrum
Microcondios em gota de
lgrima dispostos ao longo
da hifa e macrocondios,
que quando existem, so
comuns do gnero
T. mentagrophytes
Macrocondios do gnero,
microcondios redondos
numerosos
T. tonsurans
Microcondios numerosos e
polimrficos, usualmente
clavados ou alongados
Microsporum canis
Macrocondios fusiformes,
multisseptados de paredes
rugosas e mais espessas que
a dos septos, poucos
microcondios
M. gypseum
Numerosos macrocondios
fusiformes, multissepados,
de paredes rugosas e finais
poucos microcondios
Epidermophyton flocosum
Colnia membranosa de
cor verde-limo
Macrocondios em grupos
de trs ou mais na extremidade de conidiforos,
microcondios inexistentes
peculiar: nas unhas das mos e nas reas intertriginosas da pele (regio inguinal,
espaos interdigitais das mos, regio submamria e axilar). Tambm possvel
ocorrerem leses nas unhas dos ps.
H ainda outras micoses de pele e de unha que no so causadas nem
por fungos dermatfitos nem por fungos do gnero Candida. Dentre esses
fungos destacam-se: Fusarium sp., Scytalidium dimidiatum, e S. hyalinum
que podem causar leses principalmente em unhas e em espaos interdigitais
dos ps. Em cultivo, S. dimidiatum se apresenta como colnia cotonosa,
branca no incio tornando-se cinza a negra em dez dias. Microscopicamente,
se compe de hifas demceas e hialinas, com artrocondios septados e no
septados. S. hyalinum considerado um mutante de S. dimidiatum incapaz
de sintetizar melanina e, com isso, as hifas e os condios so sempre hialinos.
As culturas de Fusarium sp. podem ser as mais variadas possveis, quanto
macroscopia. Esta depender da espcie que causa a leso. Porm, microscopicamente, o que caracteriza Fusarium sp. a presena de macrocondios
em forma de lua, bi ou trisseptados.
3.1.2 . Micoses subcutneas
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M. grisea
Pyrenochaeta romeroi
Exophiala jeanselmei
Neotestudina rosatii
Aspergillus nidulans (Emerciella nidulans)
Actinomadura pelletieri
Actinomadura madurae
Nocardia brasiliensis
N. asteroides, N. caviae
Streptomyces somaliensis
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capsulatum bem como do antgeno obtido da sua fase filamentosa para aplicao no teste, uma vez que o antgeno leveduriforme apresenta uma maior
especificidade e o antgeno filamentoso maior sensibilidade. Os resultados
inespecficos esto geralmente relacionados aos ttulos de 1:8 e 1:32.
Consequentemente ttulos inferiores a 1:8 so considerados normais, e
entre 1:8 e 1:32 so considerados de valor presuntivo. Ttulos de 1:32
ou mais elevados so altamente sugestivos de histoplasmose em atividade.
Aps a cura clnica, os ttulos caem rapidamente e normalmente desaparecem aps nove meses. Reaes cruzadas podem ocorrer com soros de
portadores de paracoccidioidomicose.
Na imunodifuso dupla podem ser verificadas duas faixas de precipitao de importncia diagnstica, denominadas bandas H e M. A faixa M
forma-se prxima do orifcio que recebe o antgeno e pode ser demonstrada com soros de pacientes com formas agudas ou crnicas de histoplasmose,
ou em indivduos sensveis a histoplasmina e que se submeteram a recente
teste intradrmico com o antgeno. A precipitina H demonstrada no soro
de pacientes com a doena ativa ou at dois anos aps recuperao clnica,
raramente ocorre na ausncia de M.
A contraimunoeletroforese tem praticamente o mesmo valor da
imunodifuso dupla, permitindo ainda a titulao dos anticorpos anti- H.
capsulatum.
A deteco de antgeno de H. capsulatum em espcimes de urina,
sangue e fluido crebroespinhal oferece um mtodo rpido para o diagnstico, para o monitoramento de terapia, assim como para a identificao
de recadas na histoplasmose disseminada. Resultados falso-positivos tm
sido observados somente em pacientes com blastomicose,
paracoccidioidomicose e infeco por Penicillium marneffei, e menos frequentemente em pacientes com coccidioidomicose.
3.4.3. Aspergilose
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orgnico que a clula deve conter para crescer, mas incapaz de sintetizar. Exemplos: aminocidos, purinas, etc.
Observao: Para o preparo do meio de cultura, as drogas usadas devem ser
de maior pureza. O pH, a temperatura e a aerao devem ser cuidadosamente
controlados. Sempre se deve observar o prazo de validade do produto.
Os meios de cultura podem ser classificados da seguinte forma:
Quanto ao estado fsico
Slido: contm gar (agente solidificante) na concentrao de 1,5g
Agentes solidificantes:
Gelatina: pode ser hidrolizada. mais utilizada hoje em provas
bioqumicas.
gar: uma substncia hidrocarbonada extrada de vrias espcies
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qumica no definida.
Sintticos: quando a composio qumica conhecida e seus com-
ponentes servem para suprir as fontes necessrias de carbono, nitrognio, vitaminas, etc.
Quanto ao emprego
Meios de enriquecimento: so meios enriquecidos com determina-
desejado.
b) Dissoluo dos ingredientes
Nunca usar recipientes de cobre ou zinco para dissoluo dos
lquidos.
Completar o volume do meio com a gua aps a formao de
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cador de pH.
Ajustar o pH com soluo de cido clordrico (HCl) 0,1N ou
em tubos para meio inclinado, 5ml para camada alta e 6ml para
caldos em geral.
A distribuio nos tubos deve ser feita com pipetas;
Codificar os meios conforme padro ou conveno do laboratrio;
durante 15 minutos.
f) Preparo de gar inclinado em tubos
Ao retirar os tubos contendo meio slido da autoclave, inclin-los
distribu-lo na placa.
Prximo chama do bico de Bunsen, verter o meio, levantando
de cultura.
Para que no haja perda de gua do meio para o ambiente, os
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15g
30g
1000mL
Dextrose
Peptona
gar
gua destilada
10 g
10 g
0,4 g
0,05 g
15 g
1000 mL
30 g
3g
1g
0,5 g
0,5 g
0,01g
30 g
1000mL
Misturar e dissolver os reagentes. Juntar o gar e deixar embeber durante trinta minutos. Ajustar o pH para 7,3 antes de
esterilizar. Fundir o gar e esterilizar em autoclave por quinze
minutos a 121 C. Para o meio desidratado, seguir o mesmo
procedimento sem adio do gar.
gar infuso de crebro e corao (Brain Heart Infusion agar BHI)
Infuso de 200g de crebro de bezerro 7,7 g
Infuso de 250g de corao de vaca
9,8 g
Proteose Peptona
10 g
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Dextrose
Cloreto de sdio
Fosfato dissdico
gar
2g
5g
2,5 g
20 g
Misturar e dissolver os reagentes. Juntar o gar e deixar embeber durante trinta minutos. Ajustar o pH para 7,4 antes de
esterilizar. Fundir o gar e esterilizar em autoclave por quinze
minutos a 121 C. Para o meio desidratado seguir o mesmo
procedimento sem adio do gar.
gar dextrose farinha de milho (Corn meal agar CMA)
Farinha de milho
40 g
Dextrose
20 g
gar
20 g
gua destilada
1000 mL
Colocar a farinha em Becker com gua e aquecer em banho-maria
a 60 C por uma hora. Em seguida, filtrar em gaze dobrada duas
vezes. Restabelecer o volume inicial com gua destilada. Transferir
para balo que j contenha o gar e a dextrose pesados. Esterilizar em autoclave a 121 C por vinte minutos. Para o meio
desidratado usar o mesmo procedimento usado no BDA, porm
esterilizar a 121 C por vinte minutos.
OBS: Quando este meio utilizado para Mucoracea, trocar a
dextrose por glicose.
Extrato de malte gar (Malt extract agar MEA)
Extrato de malte
30 g
gar
30 g
gua destilada
1000 mL
Usar o mesmo procedimento do meio BDA, e ajustar o pH para
7,0.
Sabouraud
Glicose
Peptona
gar
gua destilada
30 g
10 g
20 g
1000 mL
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Concentraes:
KOH em lentilhas
gua destilada
30 g
70 mL
Preparo:
Usado para tornar mais distintas as estruturas hialinas dos fungos (corante
citoplasmtico)
Frmula:
cido fnico
cido ltico
Glicerina
gua destilada
Azul de Poirrierblau
20 g
20 g
40 g
20 mL
0,05 g
Preparo:
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c) Acridine Orange
Corante vital usado para teste de viabilidade que distingue clulas vivas
e mortas, onde as clulas vivas adquirem colorao laranja, e as clulas
mortas, colorao verde.
Frmula:
Acridine orange
PBS pH 7,7
0,02 g
100 mL
Preparo:
Usado na diferenciao de clulas vivas e mortas. As clulas vivas permanecem incolor, enquanto as clulas mortas adquirem colorao azul.
Frmula:
Verde-janus B
gua destilada
0,05 g
100 mL
Preparo:
Frmula:
Iodo
Potssio iodado
Hidrato de cloro
gua destilada
0,5 g
1,5 g
20 g
20 mL
Preparo:
Floxina B
Glicerina
gua destilada
10 g
75 mL
175 mL
Preparo:
Glicerina
gua
10 mL
90 mL
Preparo:
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5. Tcnicas micolgicas
5.1. Diluio seriada
A diluio seriada uma tcnica simples que pode ser usada para vrios
propsitos, como: separao de duas cepas fngicas que estejam misturadas
em um tubo ou placa (contaminao no tubo ou na placa), contagem de
colnias em amostras, isolamento de fungos de substratos lquidos (anlise de
gua, leite, etc) e de solo, alm da determinao da quantidade e qualidade
de um inculo para processos fermentativos ou inculos lquidos.
a) Preparo da amostra
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Inoculao em placas
As tcnicas usadas para inocular fungos em placas so fundamentalmente efetuadas para obter culturas axnicas (culturas puras) e so bem desenvolvidas, j que a identificao de fungos filamentosos baseia-se principalmente
nas caractersticas morfolgicas.
Procedimento:
Flambar a ala ao rubro e esfriar.
No caso de a amostra estar em tubo:
remover a tampa de rosca ou tampo de algodo do tubo
inoculao;
No caso de a amostra tambm estar em placa:
tomar a placa com a mo esquerda, de modo que a base da
placa fique segura e a tampa possa ser manipulada num movimento de abrir e fechar, com os dedos polegar e indicador;
proceder a uma rpida flambagem na placa toda vez que esta
crorganismo, tais como temperatura ideal de incubao, iluminao, tempo de incubao, etc.
Inoculao em tubos ou frascos de Erlenmeyers
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meio lquido.
Introduzir a ala sobre a superfcie do gar inclinado, at a base do
mesmo.
Fazer estrias ou um esfregao em direo boca do tubo, sobre a
slido.
Introduzir a agulha sobre a superfcie do gar inclinado, at a sua base.
Fazer estrias ou um esfregao em direo boca do tubo, sobre a
superfcie inclinada, at aproximadamente da sua extenso. O procedimento o mesmo da inoculao de meio lquido para o meio slido.
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Procedimento:
Vazar em placa de Petri uma camada fina do meio de cultura adequado
cmara mida.
Deixar em temperatura ambiente, por aproximadamente uma semana
Esta tcnica d excelentes resultados quando o fungo est sendo cultivado em placa de Petri. Na maioria das vezes, suas estruturas aparecero inteiras,
como no cultivo em lmina.
Procedimento:
Cortar um pedao de fita adesiva um pouco menor do que a lmina e
na fita.
Colar a fita sobre o corante na lmina.
Observar ao microscpio tico com objetivas de 10X, 40X e 100X.
Cultivo sob lamnula
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Procedimento:
O uso de um microscpio estereoscpico (lupa) indispensvel para
o exame do material.
Seces verticais no corpo frutfero do fungo estudado podero ser
montada normalmente em gua para medio dos ascosporos e observao de sua colorao, o reagente de Melzer s tambm devendo ser
usado para o estudo dos anis apicais das ascas.
O estudo destes fungos em meio de cultura tambm deve ser feito
para que se conhea o seu anamorfo. Isto poder ser feito atravs da
tcnica de isolamento de ascoporos (single ascospore isolation).
Tcnica para estudo de Basidiomycotina
Agaricceos.
Impresso de esporos:
Uma das mais importantes caractersticas que permite o agrupamento dos
gneros em sees a colorao dos basidisporos em massa, ou seja, a
impresso de esporos.
Procedimento:
Selecionar um corpo frutfero fresco e maduro e cortar sua haste junto
ao pleo.
uma campnula. Se o corpo frutfero do fungo estiver em boas condies, a impresso de seus esporos poder ser obtida em uma hora.
5.3. Coleta e isolamento de fungos ambientais
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A. Solo
novo tubo contendo tambm 9 mL de soluo salina esterilizada, sempre aps agitao (soluo 1:1000).
Por fim, se necessrio, a mesma operao anterior pode ser repetida, e
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B. Fungos macroscpicos
Existe uma variao muito grande de fungos macroscpicos, de consistncia diferente. Alguns se decompem logo aps serem coletados,
outros so mais resistentes. De qualquer modo, cuidado e bomsenso tornam-se necessrios para o sucesso de uma coleta. Os materiais comumente
usados so:
Cristalizador.
Folha de papel dupla face (branca/preta), para coleta de esporos.
Frascos de vidro escuros com fixador lcool a 5%.
Papel de filtro ou algodo.
C. Ar atmosfrico
Fungos aquticos
Em ambientes aquticos, encontramos tanto fungos zoospricos como
tetraradiados (no zoospricos). Os primeiros so realmente adaptados ao
ambiente aqutico, pois possuem esporos flagelados mveis. O segundo
grupo, sem flagelos, apresenta esporos de forma radiada, com trs ou quatro braos partindo de um mesmo ponto, ou ainda sigmides ou ovalados.
Esta morfologia concede maior facilidade de flutuao, disperso e aderncia
ao substrato.
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zada com gua destilada estril e duas a trs metades de sementes de cnhamo. Decorridas 48 horas, o material deve estar pronto para ser observado
diretamente ou montado em lmina.
Todos os substratos que portarem crescimento micelial devem ser separados, lavados em gua destilada e recolocados em placas contendo novas
amostras do mesmo substrato com gua destilada esterilizada renovada. Em
lmina, pode-se observar os flagelos colocando-se uma a duas gotas de Karo
na montagem, a fim de diminuir a mobilidade dos zosporos.
Para as espcies que dificilmente ocorrem neste tipo de iscagem, recomenda-se a submerso de frutos, gravetos ou folhas dentro de latas perfuradas
ou bolsas de nilon. Estas devem ser amarradas com fio plstico e, de preferncia, protegidas da observao pblica. Aps duas ou trs semanas, este
material deve ser retirado e lavado em gua corrente por cerca de trinta minutos, para a remoo de detritos, bactrias, protozorios e pequenos
invertebrados. Se os fungos estiverem presentes, pstulas esbranquiadas aparecero na epiderme do fruto, as quais devero ser observadas.
Culturas microbianas so extremamente vulnerveis e podem se contaminar, mutar ou morrer. Muitas vezes, culturas so insubstituveis, e sua perda
pode ser muito grave. Outras vezes ela pode ser reisolada ou adquirida de
uma coleo de culturas. Em qualquer um dos casos, tempo, informao e
dinheiro so desperdiados, mas isto pode ser evitado ou minimizado com um
sistema eficiente de preservao de linhagens. Esta uma das funes mais
importantes de uma coleo de culturas. A preocupao central a preservao de linhagens com suas caractersticas originais durante um longo perodo de
tempo. Novas espcies, mutantes, organismos portadores de plasmdeos e
linhagens produzidas por engenharia gentica devem ser preservadas, de forma
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gar
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Congelamento:
A preservao das caractersticas de microrganismos armazenados em um
freezer com faixa de temperatura de 0 a -20C produz resultados
diversos, sendo que seu sucesso depende da espcie de fungo.
Parmetro de congelamento:
Escolha do tipo de refrigerador, escolha de ampolas e frascos, agentes
crioprotetores, culturas e preparao de suspenso, velocidade de
resfriamento, estocagem e velocidade de descongelamento.
Pr-resfriamento para congelamento:
Freezer (velocidade de resfriamento, vr = 1C/min.).
Gelo seco (vr = 7C/min).
Fase vapor de nitrognio (vr = 18oC/min).
Congelamento direto:
Fase lquida de nitrognio (vr = 200 C).
D. Armazenamento em nitrognio lquido
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Procedimento:
Tiras de papel de filtro previamente esterilizadas (estufa 105C por
24h), so distribudas sobre o meio BDA (batata dextrose gar), em
placas de Petri, pouco antes de endurecer.
Culturas fngicas so transferidas para estas placas e incubadas por
oito dias (dependendo do isolado) a 28C.
As tiras de papel apresentando estruturas fngicas so retiradas das
placas e transferidas para placas de Petri, para ento serem mantidas em
dessecador contendo slica gel, onde devero permanecer por 48 horas
temperatura ambiente.
Procedimento:
Preparar recipientes (vidrinhos com tampa ou tubos Eppendorfs)
parcialmente cheios com slica gel (6 a 22 meshs) sem indicador, seca e
esterilizada com calor seco (180C/90 min).
Cultivar os isolados em meio de cultura at a fase de esporulao.
Preparar suspenso de esporos em leite em p desnatado (10%),
esterilizado e esfriado a 4C.
Adicionar a suspenso de esporos slica, resfriada a 4C, sendo
0,5 mL da suspenso para 4 g de slica.
Incubar a 4C por trinta minutos.
Armazenar temperatura ambiente por duas semanas e depois vedar
as tampas.
Transferir para geladeira (4 C) para longo perodo de armazenamento.
6. Tcnicas utilizadas em Micologia mdica
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Tipos de micose
Superficiais e cutneas
Subcutneas
Sistmicas e oportunistas
A. Coleta
Limpar com lcool etlico ou ter (Em alguns casos nenhuma antissepsia
pode ser feita). Se a leso for mida, limpar com gua destilada ou
soluo salina estril. Lmpada de Wood pode ser usada para orientar a
coleta e o diagnstico.
Raspar com lmina de bistur estril ou cureta dermatolgica a borda
das leses, evitar colher o material do centro da leso.
Colocar o material em placa de Petri entre duas lminas ou em
envelope (estreis).
B. Processamento
Exame microscpico direto - KOH 10% ou NaOH 4%.
Cultivo.
Meios
Semeadura
Incubao
Observao
Identificao
6.1.2. Pelos
A. Coleta
Com pina estril coletar o mximo de pelos afetados. A lmpada de
Wood pode ajudar na seleo.
Colocar em placa de Petri, entre duas lminas ou em envelope
(estreis).
Procurar sempre colher, por raspagem, amostra de pele onde se
implantam os pelos afetados, mesmo se tiverem aparncia sadia.
B. Processamento
realizado da mesma maneira que para amostras de pele.
6.1.3. Unhas
A. Coleta
Limpar com lcool etlico ou ter.
Raspar com lmina de bisturi estril ou com tesoura cirrgica de ponta
reta grande quantidade da parte lesada da unha. Desprezar as primeiras
raspagens. Excelente para exame e cultivo a parte da unha aparentemente so na borda da leso ungueal.
Raspar o material sob a unha, em caso de leso na parte proximal e
periungueal.
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A. Coleta
Quantidade: 5 a 10 mL so suficientes.
Coletar, de preferncia em jejum, o primeiro da manh, aps escovar
os dentes e bochechar com soluo antissptica.
Colher em recipiente estril.
Processar at duas horas aps a coleta.
B. Processamento
Fluidificao e concentrao de escarro:
Adicionar ao escarro 10 mL de soluo de citrato de sdio
0,10 mol/L e 0,10g de N-acetil L-cistena.
Agitar bastante, centrifugar e desprezar o sobrenadante.
Exame microscpico direto: KOH 10% ou NaOH 4%.
Cultivo:
Meios
Semeadura
Incubao
Observao
Identificao
* Em geral realizada atravs de observao ao microscpio das colnias isoladas, em preparaes com
lactofenol-azul de algodo, cultivo em lminas, demonstrao de termotolerncia e demonstrao do
dimorfismo entre outras tcnicas.
7.1.5. Pus
A. Coleta
Colher assepticamente, de preferncia atravs de puno (nesse caso
o procedimento realizado por um mdico).
Colocar em recipiente estril ou processar imediatamente.
Processar o mais rpido possvel, caso o processamento no tenha
sido realizado no momento da coleta.
B. Processamento
Exame microscpico direto: KOH 10% ou NaOH 4%.
Cultivo:
Meios
Semeadura
Incubao
Observao
Identificao
Observao: Caso se observe gros no pus, deve-se limpar a leso com salina
estril, cobri-la com gaze estril e, comprimir a regio ao redor da leso, a fim
de que os gros fiquem retidos na gaze. Se houver dificuldade de se obter
material, deixar a gaze sobre a leso do paciente at o dia seguinte. Observamos este material ao microscpio estereoscpico pescando os gros, com
auxilio de uma agulha ala de platina e, colocando-os em uma placa com
salina estril para lav-los.
Aps a lavagem, processar:
1. Exame direto: NaOH 4% ou KOH 10%.
2. Cultivo:
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A. Coleta
O mdico deve coletar por puno.
Colocar em frasco estril com heparina. Evitar heparina de reuso, pois
esta deve ser rigorosamente estril. Nunca colher em frascos com EDTA,
pois esta substncia se combina com elementos da parede do fungo,
diminuindo a sensibilidade do exame.
Processar at duas horas aps a coleta.
B. Processamento
Exame direto geralmente no realizado. Mas se necessrio, corar
lminas com Giemsa ou Gram.
Cultivo:
Meios
Incubao
Observao
Identificao
A. Coleta
O procedimento de coleta realizado pelo mdico
Colocar, preferencialmente em tubo estril, contendo 2 a 3 mL de
soro fisiolgico tambm estril. Na ausncia de frascos estreis com
salina, colocar entre duas gazes estreis umedecidas com soro fisiolgico, acondicionando em recipiente estril para transporte.
Processar rapidamente, no mximo em duas a quatro horas.
B. Processamento
Pinando firmemente o tecido, cortar pequenos fragmentos e em
seguida macerar (em gral, homogeneizador ou com tesoura cirrgica
estril).
Exame microscpico direto: KOH 10% ou NaOH 4%.
Cultivo:
Meios
Incubao
Observao
Identificao
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Processar rapidamente;
Se for preciso conservar: guardar sob refrigerao (4C).
Observao: Cryptococcus tolera bem a refrigerao.
B. Processamento
Centrifugar o lquor;
Exame microscpio direto do sedimento com tinta nanquim
(OBRIGATRIO) e esfregaos corados com Gram e Giemsa
(caso necessrio).
Cultivo:
Meios
Semeadura
Incubao
Observao
Identificao
A. Coleta
Colher em tubo estril com heparina estril. O ideal j ter heparina
na seringa.
Processar rapidamente.
B. Processamento
Centrifugar e desprezar o sobrenadante.
Exame microscpico direto do sedimento com KOH 10% ou NaOH
4% e tinta nanquim.
Cultivo: realizado da mesma forma que escarro (item 6.1.4 deste
captulo)
A. Coleta
Quantidade 25 a 50 mL em frasco estril;
Recomendar:
Primeira urina da manh.
Cuidados de higiene local.
Desprezar o primeiro jato.
Processar no mximo em duas a quatro horas.
Conservar sob refrigerao (4C), excepcionalmente.
B. Processamento
Exame microscpico direto do sedimento com KOH 10% ou NaOH
4% e tinta nanquim.
Cultivo:
Meios
Semeadura
Incubao
Observao
Identificao
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A. Coleta
Fazer assepsia local com lcool iodado.
Quantidade: 4 a 5 mL de sangue (utilizando escalpe e seringa
descartvel).
Colocar diretamente em frasco de hemocultura contendo meio de
BHI lquido ou liquoid.
Manter o frasco (j inoculado) em temperatura ambiente, invertido
em estantes apropriadas.
Processar em 48 horas aps a colheita; dez dias aps a primeira
semeadura e dez dias aps a segunda semeadura.
Se forem utilizados frascos de sistemas automatizados, seguir instrues do fabricante.
B. Processamento
Exame direto em geral no realizado, se necessrio, corar lminas
pelo Gram ou Giemsa.
Cultivo:
Meios
Semeadura
Observao
Incubao
Identificao
leveduriformes do fungo.
Micologia | 475
sobrenadante.
k) Repetir as operaes i e j por mais duas vezes.
l) Repetir as operaes i, j e k, com ter sulfrico.
m) Anotar o volume do sedimento e deix-lo em frasco aberto em
cado a 4C.
A padronizao do antgeno polissacardico para emprego na reao de
fixao de complemento se faz atravs da titulao desse antgeno ante o soro
de paciente portador de paracoccidioidomicose e, que reconhecidamente seja
positivo em tal reao diante do antgeno padro.
Nas reaes intradrmicas, o antgeno deve ser padronizado em pacientes portadores de paracoccidioidomicose, ou em animais experimentalmente
infectados. Atravs da utilizao de antgeno padro, chega-se diluio tima
que dever ser utilizada para o novo antgeno. Fava Netto, atravs de sua
experincia pessoal, verificou que a diluio do antgeno a ser utilizado nas
provas intradrmicas corresponde a 1/10 daquela que representa a dose tima
de antgeno para fixar unidades de complemento 50% de hemlise, na prova
de fixao de complemento. Geralmente a diluio tima do antgeno para
utilizao nas reaes intradrmicas est em torno de 1:10.
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Observao: Se no houver disponibilidade de manter os cultivos sob agitao constante, os mesmos podero ser mantidos estticos a 35C durante
12 semanas.
Decorrido o tempo de cultivo, adicionar mertiolato na concentrao
seguir:
Utilizao em reaes sorolgicas (Reaes de fixao de com-
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37C, at que o volume seja reduzido para 1/20 do volume original, ou utilizar polietilenoglicol para concentrar.
Centrifugar a 2.500 rpm durante trinta minutos.
Distribuir o antgeno em alquotas de 1-5 mL, em frascos tipo
Reagente 1
gar noble ...............0,5 g
gua destilada..........100 mL
(Estocar em erlermayer a 4 C)
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Reagente 2
gar noble ...............1,0 g
Azida sdica .............0,1 g
PBS 7.2 ................100 mL
*Aquecer em banho-maria at o gar dissolver
* Colocar 3,5 mL em tubo de ensaio e estocar a 4 C
Reagente 3
PBS (Tampo fosfato 0,01 mol/L , NaCl 0,15 mol/L) pH 7.2-7.4
Soluo A: NaH2PO4 0,2 M (Fosfato de sdio monobsico)
Soluo B: Na2HPO4 0,2 M (Fosfato de sdio dibsico)
*Tampo fosfato 0,01mol/L
Adicionar 280 mL da soluo A a 720 mL da soluo B
PBS: 50 mL do tampo fosfato + 50 mL de NaCl 3 mol/L.
Completar para 1000 mL com gua destilada.
Reagente 4
Citrato de sdio 5 g ................100 mL de gua destilada
Reagente 5
SOLUO CORANTE
Coomassie brilliant blue ..............0,5 g
cido actico .........................10 mL
Etanol ...................................45 mL
gua destilada ........................45 mL
Reagente 6
SOLUO DESCORANTE
Metanol ...............................400 mL
cido actico .........................100 mL
gua destilada ........................500 mL
1 Etapa (filmagem das lminas):
Mergulhar as lminas de microscia, devidamente limpas, no reagente
2 Etapa:
Utilizando uma mesa nivelada, colocar a lmina previamente filma-
da com o reagente 1.
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3 Etapa
Colocar o soro - 10 mL em cada orifcio - respeitando o esquema
acima. Nas extremidades superiores e inferiores adicionar soro padro. Nos poos 1, 2, 3 e 4, adicionar os soros a serem testados.
Aps a colocao dos soros, aguardar uma hora para adicionar os
horas.
5 Etapa
Iniciar os banhos Colocar as lminas (aps 48 horas) em uma
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9 Etapa
Leitura: considera-se reao positiva (soro reagente) quando hou-
As leveduras so um grupo de fungos heterogneos que superficialmente aparentam ser homogneas. A identificao desses fungos baseada nas
caractersticas morfofisiolgicas e bioqumicas. A morfologia primariamente
usada para estabelecer o gnero, entretanto, as provas bioqumicas (Teste de
reduo do nitrato e hidrolise da ureia), e de assimilao e fermentao de
acares so usadas para diferenciar vrias espcies.
6.7.1. Provas morfolgicas
Tween 80.
Com um bisturi estril, fazer um sulco no meio de cultura, aproxi-
Micologia | 487
co. Fazer trs furos no meio de cultivo com a mesma ala direita do
sulco, formando um pequeno tringulo.
Colocar uma lamnula (24 mm x 24 mm) estril sobre o meio de
Microrganismo pr-identificado
Verde
Candida albicans
Azul-metlico
Candida tropicalis
Rosa, rugosa
Candida krusei
Branco violeta
Outras espcies
Entre os testes preconizados para detectar resistncia a antifgicos, apenas alguns deles foram at agora suficientemante avaliados em estudos amplos e
bem conduzidos, a fim de comprovar boa reprodutibilidade intra e interlaboratorial, alm de correlao com a evoluo clinica dos pacientes. Os mais
conhecidos e difundidos so os do National Commitee for Clinical Laboratory
Standards (NCCLS), denominado, desde 2005, Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI), publicado a partir de 1985, sob a forma de
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Resumo do captulo
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Questes
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