Protocolos para Preparo de Meios de Cultura Da Embrapa Agrobiologia

ISSN 0104-6187
Documentos
Dezembro/1999
0
Nmero, 110
Protocolos para Preparo de Meios de Cultura da

Embrapa Agrobiologia
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria

Agrobiologia
Ministrio da Agricultura e do Abastecimento
Repblica Federativa do Brasil

Presidente
Fernando Henrique Cardoso
Ministrio da Agricultura e do Abastecimento
Ministro
Marcus Vinicius Prantini de Moraes
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria - Embrapa
Diretor Presidente
Alberto Duque Portugal
Diretores
Elza ngela Battaggia Brito da Cunha
Dante Daniel Giacomelli Scolari
Jos Roberto Rodrigues Peres
Chefe Geral
Maria Cristina Prata Neves
Chefe Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
Sebastio Manhes Souto
Chefe Adjunto Administrativo
Vanderlei Pinto
DOCUMENTO N 110
ISSN 0104-6187
Dezembro 1999
Protocolos para Preparo de Meios de Cultura da

Johanna Dbereiner
Vanderlei de Oliveira Andrade
Vera Lcia Divan Baldani
Seropdica RJ
1999
Exemplares desta publicao podem ser solicitadas :

Caixa Postal: 74505
23851-970 Seropdica RJ
Telefone: (021) 682-1500
Fax: (021) 682-1230
e-mail: sac@cnpab.embrapa.br
Expediente:
Revisor e/ou ad hoc: Vera Lcia Divan Baldani
Normalizao Bibliogrfica/Confeco/Padronizao: Dorimar dos Santos Felix
Tiragem: 50 exemplares
Comit de Publicaes: Sebastio Manhes Souto (Presidente)
Johanna Dbereiner
Jos Ivo Baldani
Norma Gouva Rumjanek
Jos Antnio Ramos Pereira
Robert Michael Boddey
Dorimar dos Santos Felix (Bibliotecria)
Coordenadora Editorial: rica Cruz Rosas de Oliveira
DBEREINER, J.; ANDRADE, V. de O.; BALDANI, V.L.D. Protocolos para

Preparo de Meios de Cultura da Embrapa Agrobiologia. Seropdica: Embrapa
Agrobiologia, dez. 1999. 38p. (Embrapa-CNPAB. Documentos, 110).
ISSN 0104-6187
1. Cultura de tecido. 2. Meio de cultura. I. Andrade, V. de O., colab. II.
Baldani, V.L.D., colab. III. Embrapa. Centro Nacional de Pesquisa de Agrobiologia
(Seropdica, RJ). IV. Ttulo. V. Srie.
CDD 571.538
SUMRIO
INTRODUO.....................................................................................................................6
1. MEIO DE CULTURA GENERALIZADO.....................................................................6
1.1 MEIO DE CULTURA DIGS..........................................................................................6
1.1.1 Material Necessrio .......................................................................................6
1.1.2 Procedimento..................................................................................................7
2. MEIO DE CULTURA PARA APLICAO EM Rhizobium ......................................8
2.1 MEIO DE CULTURA TY ..............................................................................................8
2.1.2 Procedimento..................................................................................................8
2.2 MEIO DE CULTURA 79 BSICO E VARIAES ...........................................................9
2.2.2 Procedimento................................................................................................10
2.2.3 Variaes .......................................................................................................11
2.3 MEIO DE CULTURA HP ............................................................................................11
2.3.1 Material Necessrio .....................................................................................11
2.3.2 Procedimento................................................................................................12
3. MEIO DE CULTURA PARA PURIFICAO DE Burkholderia brasilensis ..........13
3.1 MEIO DE CULTURA JMV .........................................................................................13
3.1.2 Procedimento................................................................................................14
4. MEIO DE CULTURA PARA APLICAO EM Azospirillum spp...........................15
4.1 MEIO DE CULTURA NFB .........................................................................................15
4.1.2 Procedimento................................................................................................16
4.2 MEIO DE CULTURA NFB GLUCOSE.........................................................................17
4.2.2 Procedimento................................................................................................18
4.3 MEIO DE CULTURA LGI...........................................................................................19
4.3.2 Procedimento................................................................................................20
4.4 MEIO DE CULTURA NFB NH4NO3 ...........................................................................21
4.4.2 Procedimento................................................................................................22
4.5 MEIO DE CULTURA BATATA ....................................................................................22
4.3.2 Procedimento................................................................................................23
5. MEIO DE CULTURA PARA APLICAO EM Herbaspirillum spp.......................24
5.1 MEIO DE CULTURA JNFB ........................................................................................24
5.1.2
Procedimento................................................................................................25
6. MEIO DE CULTURA PARA APLICAO EM Acetobacter sp.............................26

6.1 MEIO DE CULTURA BATATA P.................................................................................26
6.1.2 Procedimento................................................................................................27
6.2 MEIO DE CULTURA LGI-P .......................................................................................28
6.2.2 Procedimento................................................................................................29
6.3 MEIO DE CULTURA CALDO DE CANA (LGI-P CALDO) .............................................30
6.3.2 Procedimento................................................................................................31
6.4 MEIO DE CULTURA LG ............................................................................................31
6.4.2 Procedimento................................................................................................32
7. MEIO DE CULTURA PARA APLICAO EM Derxia............................................33
7.1 MEIO DE CULTURA LG+79 .....................................................................................33
7.1.2 Procedimento................................................................................................34
8. MEIO DE CULTURA PARA APLICAO EM Escherichia coli...........................35
8.1 MEIO DE CULTURA LB ............................................................................................35
8.1.2 Procedimento................................................................................................36
9. FORMULAO QUMICA DAS SOLUES E REAGENTES ............................36
10.
DOCUMENTAO COMPLEMENTAR................................................................37
11.
REFERNCIA BIBLIOGRFICA............................................................................37
Manual de Preparo de Meio de Cultura
Johanna Dbereiner1
Vanderlei de Oliveira Andrade2
Vera Lcia Divan Baldani1
INTRODUO
Preparar Meios de Cultura em suas diversas formas para o crescimento de
diversos tipos de bactrias.
Este manual est organizado nos diferentes tipos de Meios de Culturas em
relao ao tipo de microrganismo que pode ser, atravs dele identificado.
1. MEIO DE CULTURA GENERALIZADO

1.1 Meio de Cultura DIGS
Este meio considerado um meio rico para favorecer o crescimento de
bactrias em menor tempo de incubao.
1.1.1
Material Necessrio
1.1.1.1
Reagentes e solues
cido Glutmico,
cido Mlico,
cido Sulfrico 5% V/V,
Agar,
Extrato de Levedura,
Fosfato de Potssio Dibsico,
Pesquisadora, Embrapa Agrobiologia, Caixa postal 74505, CEP 23.851-970, Seropdica - RJ

Assistente de Operaes III, Embrapa Agrobiologia, Caixa postal 74505, CEP 23.851-970, Seropdica RJ
2
Glicose,
Hidrxido de Potssio 5% P/V,
Peptona Bacteriolgica,
Sulfato de Magnsio Heptahidratado.
1.1.1.2
Equipamentos e vidraria
Algodo,
Balo de fundo chato de 1000 ml,
Becher de 500 ml,
Mamadeiras,
Pipetas sorolgicas,
Placa de petri,
Proveta,
Tubo de ensaio.
1.1.2
Procedimento
Colocar aproximadamente 500 ml de gua destilada, em um balo de fundo

chato de1000 ml
Adicionar os reagentes abaixo, agitando entre cada adio:
2,0 g de Glicose
2,0 g de cido Mlico
1,.5 g de Peptona Bacteriolgica
2,0 g de Extrato de Levedura
0,5 g de Fosfato de Potssio Dibsico
0,5 g de Sulfato de Magnsio Hidratado
1,5 g de cido Glutmico
1000 ml de gua destilada
Completar o volume a 1000 ml com gua destilada
Ajustar pH com KOH soluo 10% e/ou H
SO
soluo 5%
Use: pH. 6,0 p/ Herbaspirillum;

pH. 6,8 p/ Azospirillum;
pH. 6,0 p/ Acetobacter (sem cido mlico) .
Preparar o meio slido: 15 g por litro para meio de cultura DIGS
2. MEIO DE CULTURA PARA APLICAO EM Rhizobium

2.1 Meio de Cultura TY
Este meio mais utilizado na obteno de perfil de plamdeos e conjugaes
com esta bacteria.
2.1.1
Material Necessrio
2.1.1.1
Reagentes e solues
Cloreto de Clcio Dihidratado,
Extrato de Levedura3,
Triptona.
2.1.1.2
Balo de fundo chato ou erlenmeyer de 1000 ml,
Pipeta,
Placa de petri,
Proveta de 1000 ml,
Tubo de ensaio.
2.1.2
Procedimento
Ver PO 12.023 Protocolo Operacional para Preparao de Extrato de Levedura, disponibilizado no

Laboratrio de Maio de Cultura ou no Controle de Qualidade da Embrapa Agrobiologia.
Tomar um erlenmeyer ou balo de fundo chato de 1000 ml, colocar 500 ml de

gua destilada e adicionar os seguintes reagentes:
5 g de Triptona
3 g de Extrato de Levedura
0.9 g de Cloreto de Clcio Dihidratado
Completar com gua destilada para 1000 ml
2.2 Meio de Cultura 79 Bsico e Variaes

Este meio utilizado para o crescimento de Rhizobium, porm se for para
crescimento lento usar Manitol como fonte de Carbono. E para crescimento rpido
usar Acar Cristal como fonte de Carbono.
2.2.1
Material Necessrio
2.2.1.1
Reagentes e solues
cido Sulfrico a 5% 4,
Acar Cristal ou Manitol,
Agar,
Azul de Bromotimol a 0,5 % em 0,2 N de KOH P/V4,
Cloreto de Sdio a 10% P/V4,
Fosfato de Potssio Dibsico a 10% P/V4,
Fosfato de Potssio Monobsico a 10% P/V4,
Hidrxido de Potssio a 10% P/V4,
Sulfato de Magnsio Heptahidratado a 10% P/V4.
Nota: Os reagentes devem ser de qualidade analtica e a gua deve

desmineralizada.
2.2.1.2
Algodo,
ser destilada ou
10
Erlenmeyer de 125 ml,
Esptulas,
Mamadeiras,
Papel alumnio,
Pipetas sorolgicas (1, 2, 4 e 5 ml),
Proveta de 1000 ml.
2.2.2
Procedimento
Adicionar aproximadamente 500 ml de gua destilada em um balo de fundo

chato ou erlenmeyer de l000 ml e adicionar os reagentes abaixo relacionados, na
ordem que se apresentam, agitando levemente entre uma adio e outra:
10 g de Acar Cristal ou Manitol
1 ml de soluo de Fosfato de Potssio Dibsico
4 ml de soluo de Fosfato de Potssio Monobsico
2 ml de soluo de Sulfato de Magnsio Heptahidratado
1 ml de soluo de Cloreto de Sdio
0,4 g Extrato de Levedura ou 100 ml de Extrato Lquido de Levedura5
5 ml de Soluo de Azul de Bromotimol
Transferir para a proveta e completar o volume a 1000 ml com gua
destilada,
Retornar para o balo e ajustar o pH para 6,8-7,0 com soluo de KOH
a 10% e/ou H
SO
a 5%,
Adicionar agar, nas seguintes quantidades:
1 g por litro para meio semi-slido:
Distribuir no erlenmeyer, vedar com rolhas de algodo e cobrir com

papel alumnio.
15 g por litro para meio slido:
11
Distribuir o meio de cultura nas mamadeiras, vedar com rolhas de

algodo e cobrir com papel alumnio
Autoclavar o material preparado por 30 minutos a 120 C.
Deixar esfriar e reservar para uso em local adequado.
2.2.3
Variaes
2.2.3.1
Meio 79 com vermelho congo
Substituir o azul de bromotimol por vermelho congo soluo 0,25 % 4 ,

usando 10 ml desta soluo por litro de meio de cultura.
2.2.3.2
Meio 79 com carbonato de clcio
Adicionar 1 g de CaCO3 (bruto ou comercial) por litro de meio de cultura.

Obs1 - Usado quando a bactria forte produtora de cido.
2.3 Meio de Cultura HP

Este meio classificado como sendo semi seletivo utilizado para o
Rhizobium, de crescimento rpido e determinao do perfil de plamdeos em
Burkholderia.
2.3.1
Material Necessrio
2.3.1.1
Reagentes e solues
Agar,
Cloreto de Clcio Dihidratado a 1% P/V4,
Peptona,
Sulfato de Magnsio Heptahidratado a 10% P/V4,
Triptona.
12
2.3.1.2
Algodo,
Balo de fundo ou erlenmeyer chato de 1000 ml,
Becher,
Pipeta sorolgica,
Placa de petri,
Proveta,
Tubo de ensaio,
Tubo de ensaio rosquevel.
2.3.2
Procedimento
Colocar 500 ml de gua destilada em um erlenmeyer ou balo de fundo chato

de l000 ml e adicionar os seguintes reagentes abaixo:
4 g de Peptona
0,7 g de Triptona
0,2 g de Sulfato de Magnsio Heptahidratado
0,3 g de Cloreto de clcio dihidratado
Completar para 1000 ml com gua destilada.
1,8 g por litro para meio semi slido (dissolver antes da distribuio).
15 g por litro de meio slido.
13
3. MEIO DE CULTURA PARA PURIFICAO DE Burkholderia

Brasilensis
3.1 Meio de Cultura JMV

Este meio utilizado para o isolamento e purificao de bactrias
diazotrficas, Burkholderia brasilensis.
3.1.1
Material Necessrio
3.1.1.1
Reagentes e solues
cido Sulfrico a 5% V/V4,
Agar,
Azul de Bromotimol a 0,5% em 0,2N de KOH4 ,
EDTA de Ferro a 1,64% P/V4,
Fosfato de Potssio Dibsico a 10% P/V4 ,
Manitol,
Soluo de Micronutrientes para Meio de Cultura4,
Soluo de Vitamina para Meio de Cultura5,
Sulfato de Magnsio Hidratado a 10% P/V4.
3.1.1.2
4
5
Algodo,
PO 12.027 Protocolo Operacional para Preparao de Soluo de Micronutrientes para Meio de Cultura.
PO 12.029 Protocolo Operacional para Preparao de Soluo de Vitamina para Meio de Cultura.
14
Becher,
Mamadeira,
Pipeta sorolgica,
Placa de petri,
Proveta de 1000 ml,
Tubo de ensaio,
Vidro de penicilina.
3.1.2
Procedimento
Medir em torno de 500 ml de gua destilada e transferir para um erlenmeyer

ou balo de fundo chato de 1000 ml
Adicionar os reagentes abaixo relacionados na ordem em que esto
apresentados, agitando levemente entre uma adio e outra:
5 g de Manitol
6 ml de Soluo de Fosfato de Potssio Dibsico
18 ml de Soluo de Fosfato de Potssio Monobsico
2 ml de Soluo de Sulfato de Magnsio Hidratado
1 ml de Soluo de Cloreto de Sdio
2 ml de Soluo de Cloreto de Clcio
2 ml de Soluo de Micronutrientes para Meio de Cultura6
4 ml de Soluo de EDTA de Ferro
1 ml de Soluo de Vitamina para Meio de Cultura7
Adicionar gua destilada at completar 1000 ml
Ajustar o p.H. para 4,2 4,5 usando H
SO
a 5% e/ou KOH a 10%
15
25 g por litro de meio slido, adicionar 100 mg de extrato de levedura.
Obs 2 - Para meio lquido adicionar 10 mm de glutamato / litro (1,87 g/l), indicador
opcional +100mg de extrato de levedura.
Convm usar as placas somente 24h aps o preparo.
4. MEIO DE CULTURA PARA APLICAO EM Azospirillum spp

4.1 Meio de Cultura NFB
Este meio semi seletivo para efetuar o isolamento Azospirillum spp.
4.1.1
Material Necessrio
4.1.1.1
Reagentes e solues
cido Mlico,
Agar,
Azul de Bromotimol a 0,5 % em 0,2 N de KOH4 ,
EDTA de Ferro a 1,64% P/V4,
Soluo de Micronutrientes para Meio de Cultura6 ,
Soluo de Vitamina para Meio de Cultura7 ,
16
4.1.1.2
Algodo,
Papel alumnio,
Pipetas sorolgicas,
Proveta de 500 ml,
Vidros de penicilina.
4.1.2
Procedimento

de l000 ml e adicionar os seguintes reagentes e solues abaixo nas concentraes
indicadas:
5 g de cido Mlico
2 ml de Soluo de Sulfato de Magnsio Heptahidratado
2 ml de Soluo de Cloreto de Clcio Dihidratado
2 ml de Azul de Bromotimol 0,5% em 0,2N de KOH
2 ml de Soluo de Micronutrientes para Meio de Cultura
1ml de Soluo de Vitamina para Meio de Cultura
4,5 g de Hidrxido de Potssio

Ajustar o p.H. para 6,5 com soluo de KOH a 10% e/ou soluo H
a 5%.
SO
17
15 g por litro de meio slido, colocando 50 mg de extrato de levedura por

litro de meio de cultura.
Distribuir 5 ml de meio de cultura por frasco de penicilina. Tampar com

algodo e autoclavar.
4.2 Meio de Cultura NFB Glucose

Este meio semi seletivo utilizado para realizar a diferenciao de espcies
de Azospirillum brasiliense e A. lipoferum.
4.2.1
Material Necessrio
4.2.1.1
Reagentes e solues
Agar,
Azul de Bromotimol a 0,5% em 0,2N de KOH4,
Cloreto de Clcio Dihidratado a 1 % P/V4,
Cloreto de Sdio a 10 % P/V4,
EDTA de Ferro a 1,64 % P/V4,
Fosfato de Potssio Dibsico a 10 % P/V4,
Fosfato de Potssio Monobsico a 10 % P/V4,
Soluo de Glucose a 12,5% P/V4,
Soluo de Hidrxido de Potssio a 10 % P/V4,
Sulfato de Magnsio Heptahidratado a 10 % P/V4.
4.2.1.2
Algodo,
18
Balo volumtrico,
Basto de vidro,
Funil,
Mamadeira,
Pipeta sorolgica,
Placa de petri,
Proveta,
4.2.2
Procedimento

indicadas:
2 ml de Azul de Bromotimol

Ajustar o p.H. para 6,5 com soluo de KOH 10%
Esterilizar separado (em filtro millipore) a Soluo de Glucose 12,5%,
colocando 0.2 ml por frasco com 5 ml de meio de cultura.
19
Colocar 1,8 g de agar por litro de meio de cultura semi slido, misturando
bem (Dissolver antes de distribuir o meio de cultura).
4.3 Meio de Cultura LGI

Este meio semi seletivo para isolamento de Azospirillum amazonense.
4.3.1
Material Necessrio
4.3.1.1
Reagentes e solues
cido Sulfrico a 5 % V/V4,
Acar Cristal,
Agar,
Cloreto Frrico Hexhidratado a 1 % P/V4,
Fosfato de Potssio Monobsico a 10 % P/V4,
Molibdato de Sdio Dihidratado a 0,1 % P/V4,
Nitrato de potssio,
4.3.1.2
Algodo,
Papel alumnio,
Pipeta sorolgica,
20
Proveta de 500 ml,
4.3.2
Procedimento

indicadas:
5 g de Acar Cristal
2 ml de Soluo de Molibdato de Sdio Dihidratado
1 ml de Soluo de Cloreto Frrico Hexhidratado
1 ml de Soluo de Vitamina para Meio de Cultura

Ajustar o p.H. para 6,0 6,2, usando soluo de cido Sulfrico.
Adicionar agar nas seguintes quantidades:
15 g por litro de meio de cultura slido, colocando tambm 0,02 g de

extrato de levedura.
1,8 g por litro de meio de cultura semi slido (Dissolver antes de

distribuir).
1 g por litro de Nitrato de potssio.
21
4.4 Meio de Cultura NFb NH4NO3

Este meio semi seletivo para verificar a desnitrificao de bactria
Azospirillum spp.
4.4.1
Material Necessrio
4.4.1.1
Reagentes e solues
cido Mlico,
cido Sulfrico a 5 % P/V4,
Agar,
Cloreto de Sdio a 10 % P/V4,
Edta de Ferro a 1,64 % P/V4,
Hidrxido de Potssio,
Hidrxido de Potssio a 10 % P/V4,
Nitrato de Amnia,
4.4.1.2
Algodo,
Papel Alumnio,
Pipeta sorolgica,
Proveta de 500 ml,
22
4.4.2
Procedimento

indicadas:
5 g de cido Mlico
2 ml de Azul de Bromotimol
1.6 g Nitrato de Amnia

Ajustar o p.H. para 6,5 com soluo de KOH a 10% e/ou H
SO
a 5%.
Colocar 1,8 g de agar por litro de meio de cultura semi slido, misturando
bem (Dissolver antes de distribuir o meio de cultura).
Distribuir 5 ml de meio de cultura por frasco de penicilina. Tampar com
algodo e autoclavar.
4.5 Meio de Cultura Batata

Este meio semi seletivo utilizado para realizar a purificao de bactrias
diazotrficas, para o crescimento de Azospirillum spp e Herbaspirillum spp.
23
4.5.1
Material Necessrio
4.5.1.1
Reagentes e solues
cido Mlico,
Acar Cristal,
Agar,
Batata Inglesa,
Hidrxido de Potssio,
Soluo de Micronutriente para Meios de Cultura6,
Vermelho Congo (Kongorot) a 0,25%4.
4.5.1.2
Algodo,
Becher,
Erlenmeyer de 100 ml,
Esptula,
Funil,
Mamadeiras,
Papel Alumnio,
Pipetas.
4.3.2
Procedimento
Colocar aproximadamente 50 ml de gua destilada em um erlenmeyer de 100

ml e adicionar 2,5 g de cido mlico e 2 gotas de azul de bromotimol (sol. 0,5% em
0,2 N de KOH).
Levar o pH da Soluo a 6,8-7,0 (verde) utilizando soluo de KOH a 10%.
24
Adicionar a esta soluo 2,5 g de acar cristal, 2 ml de soluo de

micronutrientes para meio de cultura e 1 ml de soluo de vitamina para meio de
cultura, agitando levemente.
Pesar 200 g de batata inglesa, descascar, lavar, cortar em pedaos grandes
e colocar para cozinhar durante meia hora.
Depois de cozida, filtrar a batata com algodo, juntando ao filtrado a soluo
vitaminada de cido mlico recm preparada.
Completar o volume para l000 ml com gua destilada.
Obs3 - Para preparar o meio batata com vermelho congo, usar 5 ml de soluo de
vermelho congo (0,25%) por litro de meio de cultura.
Colocar agar por ltimo, dissolvendo bem, antes de distribuir.
Usar as seguintes quantidades:
1,8 g por litro para meio semi-slido,
15 g por litro para meio slido.
Distribuir o meio de cultura nas mamadeiras, vedar com rolhas de algodo e

cobrir com papel alumnio.
Autoclavar as mamadeiras por 30 minutos a 120o C.
Deixar esfriar e reservar para uso em local adequado.
5. MEIO DE CULTURA PARA APLICAO EM Herbaspirillum spp

5.1 Meio de Cultura JNFb
Este meio para efetuar o isolamento Hebaspirillum spp.
5.1.1
Material Necessrio
5.1.1.1
Reagentes e solues
cido mlico
cido Sulfrico a 5% V/V4
25
Agar,
Azul de Bromotimol a 0,5 % em 0,2 N de KOH4,
EDTA de Ferro a 1.64% P/V4,
Soluo de Vitamina para Meio de Cultura7 ,
5.1.1.2
Algodo,
Becher,
Mamadeiras,
Pipetas sorolgicas,
Placa de Petri,
Proveta de 1000 ml,
Tubo de ensaio,
5.1.2
Procedimento

26
5 g de cido Mlico
2 ml de Sulfato de Magnsio Heptahidratado
4 ml de Soluo de EDTA de erro

Ajustar o p.H. para 5,8 usando soluo de KOH a 10% e/ou soluo de cido
Sulfrico a 5%
1,9 g por litro para meio semi slido(dissolver antes da distribuio).
17 g por litro de meio slido, adicionar 20 mg de extrato de levedura.
6. MEIO DE CULTURA PARA APLICAO EM Acetobacter spp

6.1 Meio de Cultura Batata P
Este meio semi seletivo para efetuar a purificao de bactrias
diazotrficas, Acetobacter sp.
6.1.1
Material Necessrio
6.1.1.1
Reagentes e solues
27
Acar Cristal,
Agar,
Batata Inglesa,
Soluo de cido Actico a 10% P/V6,
Soluo de Vitamina para Meio de Cultura7 .
6.1.1.2
Algodo,
Becher 500 ml,
Erlenmeyer 1000 ml,
Funil,
Mamadeiras,
Pipetas sorolgicas 1 e 2 ml.
6.1.2
Procedimento
Pesar 200 g de batata, descascar, lavar, cortar e colocar para ferver por meia
hora, em 500 ml de gua.
Filtrar a batata com algodo e recolher o filtrado e descartar a batata.
Colocar 100 g de acar cristal, 2 ml de soluo de micronutrientes para meio
de cultura, e 1 ml de soluo de vitamina para meio de cultura.
Ajustar o pH para 5,5 com cido actico 10 %.
Colocar agar por ltimo, dissolvendo bem, antes de distribuir
Usar a seguinte quantidade:
25 g de agar por litro de meio de cultura .
28
Distribuir o meio de cultura nas mamadeiras, vedar com rolhas de algodo e

cobrir com papel alumnio.
Autoclavar as mamadeiras por 30 minutos a 120C.
Deixar esfriar e reservar para uso, em local adequado.
6.2 Meio de Cultura LGI-P

Este meio utilizado como meio semi seletivo na purificao e caracterizao
de Acetobacter spp.
6.2.1
Material Necessrio
6.2.1.1
Reagentes e solues
cido Actico,
Acar Cristal,
Agar,
Cloreto de Frrico Hexhidratado a 1% P/V4,
Molibdato de Sdio Dihidratado a 0,1% P/V4,
6.2.1.2
Balo volumtrico,
Basto de vidro,
Becher,
Mamadeiras,
29
Pipetas sorolgicas,
Placa de Petri,
Proveta de 1000 ml,
Tubo de ensaio,
6.2.2
Procedimento

100 g de Acar Cristal
2 ml de Soluo de Sulfato de Magnsio Hidratado
1 ml de Soluo de Cloreto Frrico Hexahidratado

Ajustar o pH para 5,5 usando soluo de cido actico a 10%
1,6 g por litro para meio semi slido (dissolver, antes da distribuio).
30
6.3 Meio de Cultura Caldo de Cana (LGI-P caldo)

Este meio semi seletivo para efetuar o isolamento e contagem do nmero
mais provvel de Acetobacter em plantas.
6.3.1
Material Necessrio
6.3.1.1
Reagentes e solues
cido Actico a 10% P/V4,
Acar Cristal,
Agar,
Caldo de Cana em p,
Molbidato de Sdio Dihidratado a 0,1% P/V4,
Sulfato de Magnsio Heptahidratado a 10% P/V4,
6.3.1.2
Algodo,
Balo volumtrico,
Basto de vidro,
Becher,
Mamadeiras,
Pipetas sorolgicas,
Placa de Petri,
Proveta de 1000 ml,
31
Tubo de ensaio,
6.3.2
Procedimento

5 ml ou 0,8g de Caldo de Cana em p

Ajustar o p.H. para 5,5 usando soluo de cido actico a 10%
2 g por litro para meio semi slido(dissolver antes da distribuio).
6.4 Meio de Cultura LG

Este utilizado como meio semi seletivo para isolamento de Azotobacter.
32
6.4.1
Material Necessrio
6.4.1.1
Reagentes e solues
cido Sulfrico a 5% P/V4 ,
Acar Cristal,
Agar,
Carbonato de Clcio,
Hidrxido de Sdio a 0,1% P/V4,
6.4.1.2
Basto de vidro,
Funil,
Pipetas sorolgicas,
Proveta de 1000 ml,
6.4.2
Procedimento

de 1000 ml e adicionar os seguintes reagentes e solues abaixo nas
concentraes indicadas:
0,5 ml de Soluo de Fosfato de Potssio Dibsico
33
1,5 ml de Soluo de Fosfato de Potssio Monobsico
5 ml de Soluo de Azul de Bromotimol 0,5% alcolica

Ajustar o p.H. para 6,8 7,0 com soluo de KOH a 10% e/ou soluo de
H
SO
a 5%.
Colocar 15 g de agar por litro de meio de cultura slido, misturando bem.
Obs4 - Para fazer LG+ CaCO3 colocar 1 g de CaCO3 bruto por litro de meio de
cultura (No necessrio ajustar o pH).
7. MEIO DE CULTURA PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO DE

Derxia
7.1 Meio de Cultura LG+79
Este meio semi seletivo utilizado no crescimento de Derxia.
7.1.1
Material Necessrio
7.1.1.1
Reagentes e solues
Acar Cristal,
Agar,
34
7.1.1.2
Algodo,
Balo Volumtrico,
Basto de Vidro,
Becher,
Funil,
Mamadeiras,
Pipeta Sorolgica,
Placa de Petri,
Proveta de 1000 ml,
Tubo de ensaio,
Tubo de ensaio rosquevel.
7.1.2
Procedimento

35

Ajustar o pH para 6,8 7,0 com soluo de KOH a 10% e/ou H2SO4 a 5%
1 g por litro para meio semi slido (dissolver antes da distribuio).
8. MEIO DE CULTURA PARA APLICAO EM Escherichia Coli

8.1 Meio de Cultura LB
Este meio de cultura utilizado no crescimento de E-coli e outras bacterias
para extrao de DNA.
8.1.1
Material Necessrio
8.1.1.1
Reagentes e solues
Triptona.
36
8.1.1.2
Algodo,
Becher,
Funil,
Pipeta Sorolgica,
Placa de Petri,
Proveta de 1000 ml,
Tubo de ensaio.
8.1.2
Procedimento
Tomar um erlenmeyer ou balo de fundo chato de 1000 ml, colocar 500 ml de

gua destilada e adicionar os seguintes reagentes:
10 g Triptona
5 g Extrato de levedura
5 g Cloreto de sdio

Adicionar agar nas seguintes quantidades:
1,8 g por litro para meio semi-slido (dissolver antes da distribuio)
Obs5 - Para pesar o Agar, verificar antes a tabela de pesagem, ao qual se refere ao
tipo de gar Lote X Marca Y.
9. FORMULAO QUMICA DAS SOLUES E REAGENTES

Nomenclatura
Frmula qumica
37
cido Glutmico
C5H9NO4
cido Mlico
C4H6O5
cido Sulfrico a 5% V/V
H2SO4
Cloreto de Clcio Dihidratado a 1% P/V
CaCl2.2H2O
Cloreto de Sdio a 10% P/V
NaCl
Cloreto Frrico Hexhidratado 1% P/V
FeCl3.6H2O
EDTA de Ferro a 1,64 % P/V
FeEDTA
Fosfato de Potssio Dibsico a 10% P/V
K2HPO4
Fosfato de Potssio Monobsico a 10 % P/V
KH2PO4
Hidrxido de Potssio a 10 % P/V
KOH
Molibdato de Sdio Dihidratado a 0,1% P/V
Na2MoO4.2H2O
Nitrato de Amnia
NH4NO3
Nitrato de Potssio
KNO3
Sulfato de Magnsio Heptahidratado a 10 % P/V MgSO4.7H2O
10. DOCUMENTAO COMPLEMENTAR

P.O. 12.023 Protocolo Operacional para Preparao de Extrato de Levedura
P.O. 12.027 Protocolo Operacional
Micronutrientes para meio de cultura
para
Preparao
de
Soluo
de
P.O. 12.029 Protocolo Operacional para Preparao de Soluo de Vitamina para

meio de cultura
11. REFERNCIA BIBLIOGRFICAS

BALDANI, V. L. D. Especificidade na infeco de razes de milho, trigo e arroz
por Azospirillum spp. Itagua: UFRRJ, 1980. 123p. Tese de Mestrado.
38
BALDANI, V. L. D.; ANDRADE, V.O.; NEVES, M.C.P.; BARBOSA, A. L., PEIXOTO,

R. C.; OLIVEIRA, E.C.R. Manual de solues e reagentes da Embrapa
Agrobiologia. Seropdica: Embrapa Agrobiologia, mar. 1999. 16p. (Embrapa
CNPAB. Documentos, 86).
BALDANI. V.L.D.; DBEREINER, J. Host-plant specificity in the infection of cereals
with Azospirillum spp. Soil Biology & Biochemistry, Oxford, v.12, n.4, p.433439, 1980.
FRED, E.B.; WAKSMAN, S.A. Laboratory manual of general microbiology with
special reference to the microorganismo of the soil. New York; Mc-Graw-Hill,
1928. 145p.
MAGALHES, F.M.; BALDANI, J.I.; SOUTO, S.M.; KUYENDALL, J.R.;
DOBEREINER, J. A new acid tolerant Azospirillum species. Anais da Academia
Brasileira de Cincia, Rio de Janeiro, 55, n.4, p.417-430, 1983.
PEIXOTO, R.C. Manual de boas prticas para laboratrio. Seropdica: Embrapa
Agrobiologia, mar. 1999. 52p. (Embrapa CNPAB. Documentos, 87).

Protocolos para Preparo de Meios de Cultura Da Embrapa Agrobiologia

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Protocolos para Preparo de Meios de Cultura da

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria

Repblica Federativa do Brasil

Protocolos para Preparo de Meios de Cultura da

Exemplares desta publicao podem ser solicitadas :

DBEREINER, J.; ANDRADE, V. de O.; BALDANI, V.L.D. Protocolos para

6. MEIO DE CULTURA PARA APLICAO EM Acetobacter sp.............................26

Manual de Preparo de Meio de Cultura

1. MEIO DE CULTURA GENERALIZADO

cido Sulfrico 5% V/V,

Fosfato de Potssio Dibsico,

Pesquisadora, Embrapa Agrobiologia, Caixa postal 74505, CEP 23.851-970, Seropdica - RJ

Hidrxido de Potssio 5% P/V,

Sulfato de Magnsio Heptahidratado.

Balo de fundo chato de 1000 ml,

Becher de 500 ml,

Colocar aproximadamente 500 ml de gua destilada, em um balo de fundo

2,0 g de cido Mlico

1,.5 g de Peptona Bacteriolgica

2,0 g de Extrato de Levedura

0,5 g de Fosfato de Potssio Dibsico

0,5 g de Sulfato de Magnsio Hidratado

1,5 g de cido Glutmico

1000 ml de gua destilada

Completar o volume a 1000 ml com gua destilada

Ajustar pH com KOH soluo 10% e/ou H

Use: pH. 6,0 p/ Herbaspirillum;

Preparar o meio slido: 15 g por litro para meio de cultura DIGS

2. MEIO DE CULTURA PARA APLICAO EM Rhizobium

Cloreto de Clcio Dihidratado,

Balo de fundo chato ou erlenmeyer de 1000 ml,

Proveta de 1000 ml,

Ver PO 12.023 Protocolo Operacional para Preparao de Extrato de Levedura, disponibilizado no

Tomar um erlenmeyer ou balo de fundo chato de 1000 ml, colocar 500 ml de

0.9 g de Cloreto de Clcio Dihidratado

Completar com gua destilada para 1000 ml

2.2 Meio de Cultura 79 Bsico e Variaes

Acar Cristal ou Manitol,

Azul de Bromotimol a 0,5 % em 0,2 N de KOH P/V4,

Cloreto de Sdio a 10% P/V4,

Fosfato de Potssio Dibsico a 10% P/V4,

Fosfato de Potssio Monobsico a 10% P/V4,

Hidrxido de Potssio a 10% P/V4,

Sulfato de Magnsio Heptahidratado a 10% P/V4.

Nota: Os reagentes devem ser de qualidade analtica e a gua deve

Balo de fundo chato ou erlenmeyer de 1000 ml,

Erlenmeyer de 125 ml,

Pipetas sorolgicas (1, 2, 4 e 5 ml),

Proveta de 1000 ml.

Adicionar aproximadamente 500 ml de gua destilada em um balo de fundo

10 g de Acar Cristal ou Manitol

1 ml de soluo de Fosfato de Potssio Dibsico

4 ml de soluo de Fosfato de Potssio Monobsico

2 ml de soluo de Sulfato de Magnsio Heptahidratado

1 ml de soluo de Cloreto de Sdio

0,4 g Extrato de Levedura ou 100 ml de Extrato Lquido de Levedura5

5 ml de Soluo de Azul de Bromotimol

Transferir para a proveta e completar o volume a 1000 ml com gua

Retornar para o balo e ajustar o pH para 6,8-7,0 com soluo de KOH

Adicionar agar, nas seguintes quantidades:

1 g por litro para meio semi-slido:

Distribuir no erlenmeyer, vedar com rolhas de algodo e cobrir com