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ELETROFORESE DE PROTEÍNAS EM GEL DE

POLIACRILAMIDA - SDS (SDS-PAGE)

- Misturar as amostras protéicas com tampão de amostra q.s.p. 1X (loading buffer-2X). Ferver as
o
amostras 98 C por 5 minutos.
- Montar as placas com espassadores – Mini protean II- Bio Rad.
- Preparar o gel de resolução (tabela 18.3 – Maniatis).
- Aplicar o gel de resolução no aparato até o nível desejado (no mínimo 0,5cm abaixo do pente).
Aplicar água Milli-Q para nivelar o gel.
- Após polimerização, retirar a água e secar com papel.
- Aplicar o gel de empacotamento (tabela 18.4 – Maniatis) e inserir o pente.
- Montar o aparato de eletroforese contendo o tampão de corrida.
- Realizar eletroforese (100V a 130V).
- A seguir, o gel deve ser submetido ao ensaio de western blot ou corado com coomassie blue por
20 minutos a temperatura ambiente seguido de tratamento com o descorante.
- Após coloração por coomassie blue, o gel deve ser tratato por 15 minutos com glicerol 5% para
posterior secagem. Acondicionar o gel no "bastidor" entre duas folhas de papel celofane
umidecidas em água. Manter a temperatura ambiente até secagem do gel.

SOLUÇÕES:

• Tampão de Amostra 2X (Loading buffer-2X)

Tris/HCl pH 6,8 100mM

SDS 4,0%
Azul de bromofenol 0,2%
Glicerol 20,0%
o
Antes do uso, adicionar dithiotreitol q.s.p. 200mM (estoque: 1 M armazenado a –20 C)

• Tampão de corrida 10X

Tris 250mM
glicina pH 8,3 2,5M
SDS 1%

• Corante coomassie blue (1L) • Descorante (1L)

Coomassie blue 2,5g Metanol 450mL

Metanol 450mL Ácido acético glacial 100mL
Ácido acético glacial 100mL Água Milli-Q 450mL
Água Milli-Q 450mL

Protocolos – Sandro R. Valentini

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Protocolos – Sandro R. Valentini