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Eletroforese Sds Page

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ELETROFORESE DE PROTEÍNAS EM GEL DE POLIACRILAMIDA - SDS (SDS-PAGE)
Misturar as amostras protéicas com tampão de amostra q.s.p. 1X (loading buffer-2X). Ferver as amostras 98 C por 5 minutos. Montar as placas com espassadores – Mini protean II- Bio Rad. Preparar o gel de resolução (tabela 18.3 – Maniatis). Aplicar o gel de resolução no aparato até o nível desejado (no mínimo 0,5cm abaixo do pente). Aplicar água Milli-Q para nivelar o gel. Após polimerização, retirar a água e secar com papel. Aplicar o gel de empacotamento (tabela 18.4 – Maniatis) e inserir o pente. Montar o aparato de eletroforese contendo o tampão de corrida. Realizar eletroforese (100V a 130V). A seguir, o gel deve ser submetido ao ensaio de western blot ou corado com coomassie blue por 20 minutos a temperatura ambiente seguido de tratamento com o descorante. Após coloração por coomassie blue, o gel deve ser tratato por 15 minutos com glicerol 5% para posterior secagem. Acondicionar o gel no "bastidor" entre duas folhas de papel celofane umidecidas em água. Manter a temperatura ambiente até secagem do gel.
o

SOLUÇÕES:
• Tampão de Amostra 2X (Loading buffer-2X) Tris/HCl pH 6,8 SDS Azul de bromofenol Glicerol 100mM 4,0% 0,2% 20,0%
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Antes do uso, adicionar dithiotreitol q.s.p. 200mM (estoque: 1 M armazenado a –20 C) •

Tampão de corrida 10X Tris glicina pH 8,3 SDS 250mM 2,5M 1%

Corante coomassie blue (1L) Coomassie blue Metanol Ácido acético glacial Água Milli-Q 2,5g 450mL 100mL 450mL

Descorante (1L) Metanol Ácido acético glacial Água Milli-Q 450mL 100mL 450mL

Protocolos – Sandro R. Valentini

P5. Valentini .2 Protocolos – Sandro R.

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