09/06/2022 23:44 Soluções e reagentes para MegaBACE

SOLUÇÕES
E REAGENTES PARA MEGABACE
 
 
Fazer todas as soluções com
vidraria queimada (2 horas a 180-200c).
As soluções estoque devem ser
feitas utilizando água milli-Q estéril.
 
1)                    
Ampicilina
Concentração: 100 mg/ml
Volume total: 10 ml
Pesar 1 g e diluir em 10 ml
deH20 estéril (tubo falcon ou vacutainer estéril)
Filtrar em millipore0,22 uM na
capela de fluxo laminar
Aliquotar nos tubos de 1,5 ml
e armazenar a -20c.
 
2)                    
Glicerol 50%
Volume:  300 ml
Glicerol: 150 ml
H20 estéril: 150 ml
Autoclavar..
 
3)                    
Água
estéril
Aliquotar água milli-Q em
vidros novos (separar recipientes exclusivamente
para isso).
Autoclavar.
Para PCR: Usar tubos
vacutainer ou tubos Falcon novos. Abrir na capela de
fluxo laminar e aliquotar
em tubos de 1,5ml. Guardar no freezer.
 
4)                    
Tris HCl 1 M pH 7,4
1 vidro de Gatorade
Volume: 250 ml
Tris Base: 30,3 g (PM: 121,14)
Antes de ajustar pH, esperar
solução esfriar. Ajustar pH 7,4 com HCl
fumegante. (para 250ml de solução: +/-
50ml de HCl fumegante + 30 ml de
HCl 1M).
qsp 250 ml com dd H20
Filtrar com papel de filtro
comum.
Autoclavar
 
 
5)                    
EDTA
0,5 M pH 8,0
Volume: 50 ml
EDTA: 9,305 g (PM: 372,22)
Ajustar pH 8,0 com NaOH pellet ou concentrado até dissolver
(Neusa:+- 70g
NaOH/ 1L de solução)
Após dissolução, terminar de
ajustar com NaOH concentrado até pH 8,0
qsp 50 ml com dd H20
Filtrar com papel de filtro
comum.
Autoclavar
 
 
6)                    
Glicose
20%
Volume final: 500 ml
Glicose: 100 g

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H20 estéril: 500 ml

Não autoclavar (pode
caramelizar). Filtrar em Millipore 0,22 uM.
 
7)                    
GET
Volume final: 1 litro
Glicose 20%: 46 ml ou 9g de
glicose
EDTA 0,5 M pH 8,0: 20 ml
Tris HCl 1 M pH 7,4: 26 ml
qsp 1000 ml com H20
Autoclavar (carameliza um
pouco) ou filtrar c/ Millipore 0,22 uM perto do fogo.
Estocar à 4°C para não contaminar.
Abrir na capela.
 
8)                    
SDS
10% (Dodecil sulfato de sódio)
Volume: 100 ml
SDS: 10 g (PM: 288,38)
Concentração: 0,35 M
Vidraria ao forno.
Aquecer à 68°C para dissolver e ajustar pH 7,2 com HCl diluído.
qsp 100 ml com dd H20
estéril
Não pode autoclavar nem
filtrar.
Armazenar em vidro âmbar.
OBS: Usar máscara para pesar o
SDS (irritante de mucosa).
 
9)                    
NaOH
4 N
Volume: 100 ml
NaOH: 16 g
qsp 100 ml com dd H20
estéril
Estocar em frasco de plástico
Não pode autoclavar nem
filtrar.
 
10)                
NaOH
(0,2N)/SDS (1%)
Preparar no momento de usar a solução
Volume: 20ml (2 placas de 96
poços)
SDS 10%: 2 ml
15 ml com dd H20
estéril
NaOH 4N: 1ml
qsp 20 ml com dd H20
estéril
 
11)                
Acetato
de potássio 5M
Volume: 500ml
Acetato de potássio: 246,87g
(PM: 98,7) (volume enorme!)
qsp 500 ml com dd H20
estéril., colocando água aos poucos porque o volume
aumenta   muito.
Não pode autoclavar acetato.
Usar vidraria queimada.
Estocar a 4c.
 
12)                
KOAc
3M (é utilizada fria)
Volume: 200 ml
Acetato de potássio 5M: 120ml
Ácido acético glacial: 23 ml

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qsp 200 ml com dd H20

estéril.
Não pode autoclavar acetato.
Usar vidraria queimada.
Filtrar em Millipore 0,22 uM
Estocar a 4c.
 
13)                
TAE
50x
Volume: 1 litro
Tris Base: 242 g (PM: 121,14)
Ácido Acético Glacial: 57,1 g
EDTA 5M pH 8,0: 100 ml
qsp 1000 ml com dd H20
- filtrar
Autoclavar
 
14)                
Brometo
de etídio (MUTAGÊNICO) - 10 mg/ml
Volume: 10 ml
Brometo de etídio: 100 mg
qsp 10 ml com dd H20
estéril
Agitar até dissolução
Estocar à 4°C no escuro
OBS: Usar máscara e luvas;
pesar em capela de exaustão
  Armazenar em vidro âmbar.
 
15)                
Tampão
da amostra 5X
(TBE 5x; azul de bromofenol
0,25%; xilenocianol 0,25%; FICOLL 400 25%)
Volume: 50 ml
Azul de bromofenol: 0,05 g
Xilenocianol: 0,05 g
FICOLL 400: 12,5 g
pré-dissolvido em 25 ml de TBE 5x, 60°C
TBE 5x qsp 50 ml
 
16)                
HCl  1N 
Volume: 1L
HCl fumegante: 30,6 ml (medir
em capela) (PM: 36,46; D= 1,19 Kg/L)
qsp 1000 ml com dd H20
estéril
Não autoclavar.
17)                
NaOH
3M
Volume: 100 ml
NaOH: 12 g
qsp 100 ml com dd H20
Estocar em frasco de plástico.
Não autoclavar.
 
18)                
Acetato
de sódio 3M pH5,2 ou pH 7,0
Volume: 1 litro
Acetato de sódio 3H2O: 408,1g
H2O estéril: 800ml;
Ajustar pH para 5,2 com ácido
acético glacial ou para pH 7,2 com ácido
acético diluído.
Ajustar para 1 litro de H2O.
Autoclavar.
 
19)                
RNAase
A
Concentração: 10mg/ml

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Volume: 1 ml
RNAase: 0,01 g
Acetato de sódio 0,01M pH5,2:
0,9 ml
Ferver a 100c por 15
minutos.(desnaturar proteínas contaminantes)
TrisHCl 1M pH7,4: 0,1 volumes
(0,1 ml).
       Se ferver a RNAase depois de acrescentar o TrisHCl, ela
precipitará (pH
neutro).
       Obs: Dilui a RNAase nos dois reagentes citados sem ferver, e
ela
funcionou bem.
 
20)                
Diluição
escada 1Kb (1mg/ml - Gibco)
Concentração de uso: 20 ng/ml
Volume final: 200ml
1Kb: 20ml
Tampão 6X: 66,7ml
H2O milliQ: 133,3ml
Aplicar 10ml no gel
 
21)                
Meio
de cultura Circle Grow (Bio 101)
Volume: 1litro
Circle Grow : 40 g
Aliquotar e autoclavar.
 
22)                
Meio
de cultura Terrific broth
Volume: 1litro
Triptona ou peptona: 11,8g
Extrato de levedura: 23,6g
K2HPO4: 9,4g
KH2PO4: 2,2g
Glicerol: 2ml
Completar com água destilada e
autoclavar no mesmo dia.
 
 
 
 
23)                
Meio
de cultura LB
Volume: 1 litro
Triptona: 10g
Extrato de levedura: 5g
NaCl: 5g
Água deionizada (completar o
volume)
NaOH 4N: para ajustar o pH
para 7,4 (aproximadamente 12 gotas).
Autoclavar.
 
24)                
Meio
de cultura LB com Ágar
Seguir protocolo do meio LB
Acrescentar 15g de Ágar por
litro de solução.
Dissolver em microondas
(potência em 7 no máximo), até a solução ficar
límpida. Deixar mais 10 minutos
em banho-maria a 100°C.
 
Soluções para o protocolo de células
competentes
 
25)                
Meio
A

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Volume: 55ml
MgSO4 1M: 550ml (filtrado)
Glicose 0,2%:
550 ml (filtrada)
      Completar com Meio LB p/ 55ml
(autoclavado)
 
26)                
Solução
B
Volume: 10ml
Glicerina
36%: 7,2ml de glicerol 50%
PEG 12% p/v
(polietilenoglicol): 1,2g de PEG
                pesar direto na solução,
aquecendo-a.
MgSO4 1M: 120ml
(12mM)
Completar com
LB para 10ml
Esterilizar
por filtração em 0,22mm (em capela)
       Guardar a -4°C
 
27)                
MgSO4
1M
Volume: 1ml
MgSO4: 0,120g
(PM: 120,35)
Completar com
água milliQ.
Filtrar (0.22mm)
Congelar a
-20°C

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