Tecnologia do DNA Recombinante

BIOTECNOLOGIA CINCIAS BIOLGICAS

Prof. Esp. Roberto Venerando Fundao Educacional Miguel Mofarrej. FIO robertovenerando@fio.edu.br

FIO Faculdades Integradas de Ourinhos.

Tecnologia do DNA recombinante.

Engenharia Gentica
VENERANDO,R .2009

INTRODUO
Dcada de 70 surgimento da Engenharia Gentica ou Tecnologia do DNA recombinante ou Biotecnologia Moderna.

Engenharia Gentica Conjunto de tcnicas que tornam possvel a criao de novas combinaes gnicas, inexistentes na natureza, mediante recombinao ou alterao de seqncias de DNA.

TECNOLOGIA DO DNAr
Caracteriza-se pela aplicao de tcnicas para manipulao de cidos nuclicos. Consiste em isolar e transferir genes responsveis pela produo de certas substncias para outros seres vivos que no produziam estas substncias. Permite manipular diretamente os genes de determinados organismos com objetivos prticos. Permite combinar na mesma molcula de DNA genes provenientes de fontes diferentes, mas no necessariamente de espcies diferentes, dando origem a uma molcula de DNA recombinante (rDNA).

TECNOLOGIA DO DNAr
No entanto, necessita que:
DNA recombinante seja duplicado. DNA recombinante deve ser transcrito e traduzido. Produtos da traduo por vezes, ainda, devero sofrer passos adicionais de processamento ps-traducional na clula hospedeira.

TECNOLOGIA DO DNAr
Objetivos
Produo de grandes quantidades de um gene especfico. Produo de grandes quantidades de uma protena especfica.

TECNOLOGIA DO DNAr
Aplicao prtica Clonagem de fragmentos de DNA em plasmdios de bactrias. Seqnciamento de DNA. Amplificao de uma seq. especifica de DNA pela tcnica da reao em cadeia da polimerase (PCR). Construo de bibliotecas genmicas e de cDNAs. Vetores de expresso (procariotos e eucariotos). Plantas transgnicas. Animais transgnicos.

TECNOLOGIA DO DNAr
Requer: Um mtodo para clivar e voltar a ligar in vitro diferentes molculas de DNA originando molculas de DNA recombinante. Um elemento transportador de genes, o vetor gentico, que, ao ser multiplicado por uma clula hospedeira, possibilitar que o gene estrangeiro que transporta tambm o seja. Um meio de introduzir o vetor numa clula viva, capaz de multiplic-lo. Uma maneira de selecionar, dentre uma grande populao de clulas, apenas aquelas que tiverem efetivamente incorporado o rDNA.

TECNOLOGIA DO DNAr
Metodologia de obteno de DNAr Primeiro fragmento do DNA de interesse (inserto) obtido por enzima de restrio e ligado (DNA ligase) a uma outra molcula de DNA (vetor) para formar o DNA recombinante; Segundo a molcula do DNA recombinante introduzida numa clula hospedeira compatvel (transformao). Terceiro clula hospedeira com o DNA recombinante (transformante). Quarto diviso celular resultando em milhares de cpias do DNA recombinante (clonagem).

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obteno do gene de interesse

Enzimas de restrio ou endonucleases de restrio Encontradas nas bactrias e so utilizadas como sistema de defesa contra vrus (cortam o DNA viral que penetrar no citoplasma); no so encontradas em eucariotos. Trs tipos: tipo I, II e III, onde a II apresenta importncia na Engenharia Gentica. Reconhecem seqncias especficas de nucleotdeos na molcula de DNA e cortam ambas as fitas da hlice, em lugares determinados (stios). O stio de reconhecimento normalmente uma seqncia palindrmica (ARARA)

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obteno do gene de interesse

Enzimas de restrio ou endonucleases de restrio

Tipos de clivagem Cega ou Abrupta: no eixo de simetria;

Coesiva: fora do eixo de simetria;

Fonte: http://www.images.google.com.br

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obteno do gene de interesse

Enzimas de restrio ou endonucleases de restrio Nomenclatura Primeira letra representa o gnero Segunda e terceira letra espcie. Algarismo romano (ou outra letra) indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada. Exemplo: EcoRI Escherichia coli que carrega um fator de transferncia de resistncia RI.

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obteno do gene de interesse

Enzimas de restrio ou endonucleases de restrio

Fonte: http://www.images.google.com.br

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obteno do gene de interesse Depois da clivagem...

A famlia de fragmentos gerados por digesto com enzima de restrio geralmente detectada pela separao destes fragmentos por eletroforese em gel de agarose. Os fragmentos migram em funo de seus pesos moleculares sendo que os menores migram mais rapidamente.

Fonte: http://www.images.google.com.br

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obteno do gene de interesse

Molculas de menor massa iro migrar mais rapidamente que molculas de maior massa. Isso permite a separao de molculas de DNA de diferentes tamanhos !!!

Fonte: http://www.images.google.com.br

Cortes com vrias enzimas:

Fonte: http://www.images.google.com.br

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obteno do gene de interesse Em alguns casos no possvel utilizar enzimas de restrio, logo:
procede-se fragmentao mecnica do DNA; sntese qumica do DNA; obteno do DNA complementar (cDNA) obtido pela ao da transcriptase reversa a partir de um mRNA; biblioteca genmica, banco genmico ou genoteca arquivo de DNA de interesse inserido num vetor para uso posterior.

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obteno do gene

Biblioteca de cDNA Biblioteca genmica

Fonte: adaptado de www.unb.br/ib/cel/pg/tecnologiaDNArecombinante2006

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obteno do gene de interesse Em alguns casos no possvel utilizar enzimas de restrio, logo:
Tcnica de PCR (Reao da polimerase em cadeia)

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: vetores genticos Vetores genticos

Molculas de DNA que transportaro o DNA heterlogo para o interior da clula hospedeira. Molcula de DNA que aceita introduo de DNA estrangeiro em regies no essenciais para sua multiplicao dentro da clula hospedeira.

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: vetores genticos Vetores genticos

Caractersticas bsicas necessrias Ser uma pequena molcula de DNA. Possuir uma origem de replicao. Dois ou mais stios nicos de clivagem para as enzimas de restrio Mltiplos stios de Clonagem (MSC) local onde o inserto incorporado ao vetor de clonagem. Possuir um marcador que permita a seleo do hospedeiro transformado (Ex.: Antibitico). Exemplos: plasmdio, bacterifagos, cosmdios.

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: vetores genticos Vetores genticos

Caractersticas bsicas necessrias

Fonte: docentes.esa.ipcb.pt/lab.biologia/disciplinas/bcm/recombinante.pdf

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: vetores genticos Vetores genticos

Plasmdio Fago

Cosmdio

Fonte: www.ibb.unesp.br/extensao/acidos_nucleicos/material_didatico/9_clonagem_genes_fragme ntos_DNA_de_interesse.pdf

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: ligao do gene no vetor

Digesto do vetor e do DNA pela enzima de restrio

Fragmentos de DNA, vetor e DNA ligase: DNAr

Fonte: adaptado de www.unb.br/ib/cel/pg/tecnologiaDNArecom binante2006

TECNOLOGIA DO DNAr Segundo passo: hospedeiros do DNAr

Hospedeiros do DNA recombinante
Caractersticas ideais: Capacidade de crescer em meios de cultura baratos. Estveis em cultura. No patognicos. Organismos utilizados: Hospedeiros procariticos E. coli, B. subtilis. Hospedeiro eucaritico S. cerevesiae, clulas de mamferos em cultura.

TECNOLOGIA DO DNAr Segundo passo: hospedeiros do DNAr

Transformao
Transformao Transfeco Microprojteis Eletroporao

Fonte: www.labimuno.org.br/aulas/producao%20proteinas%20recombinantes.ppt

TECNOLOGIA DO DNAr Segundo passo: insero dos vetores recombinantes em uma clula hospedeira
Transformao a clula hospedeira tornada competente (cloreto de clcio e choque trmico) para o vetor de clonagem ser introduzido; normalmente empregada para procariotos. Transfeco quando o vetor de clonagem tem caractersticas de vrus ou plasmdio, a clula hospedeira pode ser transfectada para inserir a molcula recombinante; normalmente empregada para eucariotos.

TECNOLOGIA DO DNAr Segundo passo: insero dos vetores recombinantes em uma clula hospedeira
Microprojteis partculas cobertas com DNA so projetadas contra uma clula e penetram em sua membrana.

Fonte: http://www.ufv.br/dbg/trab2002/TRANSG/TRG004.htm

TECNOLOGIA DO DNAr Segundo passo: insero dos vetores recombinantes em uma clula hospedeira
Eletroporao a clula submetida a um campo eltrico que faz com que pequenos poros sejam abertos temporariamente em sua membrana por onde o DNA pode ser inserido.

Fonte: www.unb.br/ib/cel/pg/tecnologiaDNArecombinante2006.ppt

TECNOLOGIA DO DNAr Terceiro e quarto passos

Transformao Transformante

Clulas transformantes

Fonte: miguelcorreia25.googlepages.com/fundamentosdeengenhariagentica2

TECNOLOGIA DO DNAr Terceiro e quarto passos

Seleo das clulas recombinantes
Crescimento de bactrias em meio de cultura contendo antibitico

Fonte: www.ibb.unesp.br/extensao/acidos_nucleicos/material_didatico/9_clonagem_genes_fragme ntos_DNA_de_interesse.pdf

Referncias bibliogrficas
BORZANI, W. et al. Biotecologia industrial. 1 ed. V. 1: Fundamentos. Edgard Blucher: So Paulo, 2001. VOET,D.; VOET, J. G. Bioqumica. 3 ed. Porto Alegre: Artmed, 2006. SOUZA, S. R. Recombinao gnica. Apontamentos de aula, 2007.

Sites: http://miguelcorreia25.googlepages.com/fundamentosdeengenhariag en%C3%A9tica2 www.ibb.unesp.br/extensao/acidos_nucleicos/material_didatico/9_cl onagem_genes_fragmentos_DNA_de_interesse.pdf docentes.esa.ipcb.pt/lab.biologia/disciplinas/bcm/recombinante.pdf ww.unb.br/ib/cel/pg/tecnologiaDNArecombinante2006.ppt http://www.ufv.br/dbg/trab2002/TRANSG/TRG004.htm