Enzimas de Restrio

Enzimas de restrio
1970 Purifica-se a primeira enzima de
restrio tipo II: o Hind II (Smith & Wilcox).
1972 Primeiras experincias com DNA
recombinante.
1978 Isolamento e caracterizao de mais de
200 enzimas de restrio.

Enzimas de restrio
As enzimas restrio ou endonucleases de restrio, so enzimas
que cortam a molcula de DNA atravs do reconhecimento de
sequncias nucleotdicas especficas.

So enzimas bacterianas que funcionam como tesoura molecular

reconhecendo sequncias especficas do DNA.

So altamente especficas.

Estas enzimas funcionam nas clulas bacterianas como parte de

um mecanismo de proteo ao ataque de bacterifagos.

 O uso das enzimas de restrio permite a

obteno dos fragmentos de DNA in vitro.
A explorao de sua atividade e
comercializao permitiu um avano na
Engenharia Gentica.
Stio normalmente uma palndrome (mesma
sequncia de nucleotdeos com polaridade
invertida). Ex: osso, anilina.
5'-GAATTC-3
3'-CTTAAG-5'

Enzima de Restrio EcoRI

Hidrlise Enzimtica
" As enzimas de
restrio atuam sobre
sequncias especficas
do DNA, catalisando a
destruio da ligao
fosfodister entre
nucleotdeos.
" Produtos da hidrlise
resultam em
extremidades 3-OH e
5-P

Enzimas de restrio
Podem ser de 3 tipos: I, II e III.
Reconhecem seqncias de 4 a 8 pares de bases.
Cortes com extremidades abruptas ou coesivas.
Pode-se recombinar DNA humano com qualquer outra
espcie.
Fragmentos separados por eletroforese.

Nomenclatura das enzimas

Primeira letra maiscula gnero e as duas outras
minsculas so espcies. Por exemplo a enzima EcoRI.
E

Escherichia

(gnero)

co coli

(espcie)

(estirpe)
(ordem de identificao da
bactria)

RY13
Primeira
identificada

5N-N-N-G-A-A-T-T-C-N-N-N 3
3N-N-N-C-T-T-A-A-G-N-N-N 5

Extremidades abruptas X coesivas

Extremidades Coesivas

Extremidades Cegas

ENZIMAS DE RESTRIO E O DNA RECOMBINANTE

Endonucleases que conferem proteo s
bactrias contra vrus invasores.
Stios de restrio: seqncias
palndrmicas

 Quando se separa o DNA cortado pela

EcoRI obtemos extremidades coesivas ou
adesivas (corte assimtrico) porque se
podem sobrepor novamente.

 Nem todas as enzimas de restrio produzem

extremidades coesivas. Algumas fazem cortes
simtricos resultando extremidades
denominadas abruptas ou retas.
A sequncia a seguir apresentada a
sequncia de reconhecimento da SmaI,
endonuclease de restrio isolada a partir
da Serratia marcescens.

 Resultado:

Em concluso, da especificidade da
sequncia de determinada molcula de
DNA, cada enzima de restrio gera um
conjunto nico de fragmentos.

 Quais as enzimas que produzem:

a) Extremidades abruptas?
b) Extremidades coesivas?

Izoesquizmeros
" Diferentes enzimas de restrio que possuem a
mesma sequncia de reconhecimento
" Diferem nas condies timas de reao, na
estabilidade
Exemplo:
Enzimas de
restrio

Sequncia de
reconhecimento

SacI

GAGCTC
CTCGAG

SstI

GAGCTC
CTCGAG

Fatores que influenciam a atividade das enzimas de

restrio:
" Composio do tampo
Diferem na fora inica (concentrao de sal)
Diferem no ction principal (Na+ ou K+)
Soluo: Manter o pH da reao (geralmente em 8.0)

" Temperatura de incubao

A maioria das enzimas cliva melhor a 37C
Excees: Bactrias termoflicas clivam melhor entre 50 a 60C.
Enzimas com tempo de meia vida pequeno a 37C, recomenda-se a
incubao a 20C.

Restrio enzimtica