UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DEPARTAMENTO DE QUMICA MESTRADO EM ENGENHARIA E CINCIA DE ALIMENTOS

PRODUO DE BIOSSURFACTANTES BACTERIANO E FNGICO POR FERMENTAO EM ESTADO SLIDO E SUBMERSA UTILIZANDO RESDUOS AGROINDUSTRIAIS

Marta Heidtmann Pinto

Prof. Dr. Jorge Alberto Vieira Costa Orientador

RIO GRANDE RS 2008

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DEPARTAMENTO DE QUMICA MESTRADO EM ENGENHARIA E CINCIA DE ALIMENTOS

PRODUO DE BIOSSURFACTANTES BACTERIANO E FNGICO POR FERMENTAO EM ESTADO SLIDO E SUBMERSA UTILIZANDO RESDUOS AGROINDUSTRIAIS

Marta Heidtmann Pinto Engenheira de Alimentos

Dissertao

apresentada

para

obteno do ttulo de Mestre em Engenharia e Cincia de Alimentos

Prof. Dr. Jorge Alberto Vieira Costa Orientador

RIO GRANDE RS 2008

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Bom mesmo ir a luta com determinao, abraar a vida com paixo, perder com classe e vencer com ousadia, pois o triunfo pertence a quem se atreve... Charles Chaplin

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minha me, Joice Heidtmann Pinto minha av, Iracema Landgraf Heidtmann (in memorium) Ao meu av, Jorge Henrique Heidtmann AGRADECIMENTOS Ao meu noivo, Luciano Henriques Gonalves

AGRADECIMENTOS Deus Que sempre me deu foras para seguir em frente. Ao meu orientador Prof. Dr. Jorge Alberto Vieira Costa Pela experincia transmitida, pelos ensinamentos de vida, por ser um exemplo de coragem, fora, determinao e persistncia em tudo o que faz. minha me Joice e meus avs maternos Iracema (in memorium) e Jorge Pela educao que me proporcionaram, pelo apoio e incentivo incondicionais, por tudo o que alcancei e pelo que sou hoje. Aos meus irmos Guilherme e Renata Por me apoiarem sempre. Ao meu noivo Luciano Pela compreenso, pacincia, amor e amizade. Aos bolsistas Roberta Martins, Michael da Silva, Vanessa Wendt e Tiago Trindade e a doutoranda Elisangela Radmann Pela grande contribuio ao trabalho e pela experincia pessoal proporcionada. Ana Priscila Centeno da Rosa, Elisangela Radmann, Felipe Camerini, Michele Andrade e Vanessa Cerqueira Pela amizade, pela agradvel convivncia, por me ouvirem e aconselharem e pela disposio em ajudar. Ao Fabrcio Butirres Santana Pelos conselhos que colaboraram com o engrandecimento do trabalho, pela disposio em ajudar e por proporcionar momentos alegres no laboratrio.

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Ao Roque Loureno Zlio Pela incondicional disposio para ajudar e pelos puxes de orelha que com certeza vo contribuir em meu futuro profissional. Aos demais colegas de ps-graduao e do laboratrio de Engenharia Bioqumica, em especial a Adriana Manetti, Cristiano Schmidt, Lcia Batista, Mrcio Hornes, Vilsia Martins e William Vega Pelos momentos agradveis que passamos juntos, pelas conversas e ajudas. Aos professores do programa de ps-graduao Pelos conhecimentos e experincias passados, em especial aos professores Susana Juliano Kalil, Eliana Badiale Furlong e Luiz Antnio de Almeida Pinto. Aos funcionrios e tcnicos da FURG Pelos auxlios indispensveis, em especial a Ana Sanzo, a Elisane Santos, a Islanda Passos, a Mara Alice Medeiros e aos funcionrios da oficina mecnica. Ao povo brasileiro e ao governo federal, representado pela CAPES Por proporcionarem o desenvolvimento de meus estudos. Enfim, a todos que de alguma forma contriburam para a concretizao deste trabalho.

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SUMRIO LISTA DE TABELAS .....................................................................................................i LISTA DE FIGURAS ....................................................................................................iii NOMENCLATURA........................................................................................................v RESUMO ....................................................................................................................vii ABSTRACT ...............................................................................................................viii 1 INTRODUO ...........................................................................................................1 2 OBJETIVOS...............................................................................................................3 2.1 Objetivo geral......................................................................................................3 2.2 Objetivos especficos ..........................................................................................3 3 JUSTIFICATIVA.........................................................................................................4 4 REVISO BIBLIOGRFICA ......................................................................................8 4.1 Processos fermentativos .....................................................................................8 4.1.1 Processo fermentativo em estado slido .....................................................8 4.1.2 Processo fermentativo submerso ................................................................9 4.2 Biossurfactantes .................................................................................................9 4.2.1 Principais classes de biossurfactantes ......................................................10 4.2.2 Propriedades dos biossurfactantes............................................................12 4.2.3 Produo de biossurfactantes ...................................................................13 4.2.4 Estimativa da atividade biossurfactante.....................................................16 4.2.5 Fatores que afetam a produo de biossurfactante ...................................18 4.2.5.1 Fonte de carbono ...............................................................................18 4.2.5.2 Fonte de nitrognio ............................................................................20 4.2.5.3 Fonte de outros nutrientes .................................................................20 4.2.5.4 Fatores ambientais ............................................................................21 4.2.6 Substratos renovveis e de baixo custo para a produo de biossurfactante ...........................................................................................................................22 4.2.7 Parmetros cinticos para avaliao da produo de biossurfactantes .....23 4.2.8 Aplicaes dos biossurfactantes ...............................................................24 4.2.8.1 Usos relacionados a indstria petrolfera ...........................................24 4.2.8.2 Biorremediao..................................................................................25 4.2.8.3 Indstria de alimentos ........................................................................28 4.2.8.4 Remoo de metais ...........................................................................28 4.2.8.5 Agentes teraputicos .........................................................................28

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4.2.8.6 Usos na agricultura ............................................................................29 4.2.8.7 Indstria de materiais de higiene e cosmticos ..................................29 5 DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO ..................................................................30 5.1 SELEO DE BACTRIAS E AVALIAO CINTICA DA PRODUO DE BIOSSURFACTANTES ..............................................................................................31 1 INTRODUO .........................................................................................................34 2 MATERIAL E MTODOS .........................................................................................36 2.1 Microrganismos ................................................................................................36 2.2 Manuteno e propagao dos inculos para a fermentao ...........................36 2.3 Meio de cultura .................................................................................................36 2.4 Cultivos .............................................................................................................36 2.5 Determinaes analticas..................................................................................37 2.5.1 Biomassa ..................................................................................................37 2.5.2 pH .............................................................................................................37 2.5.3 Estimativa da atividade biossurfactante.....................................................37 2.5.3.1 Tenso superficial ..............................................................................37 2.5.3.2 Atividade emulsificante ......................................................................37 2.6 Avaliao de parmetros cinticos....................................................................38 2.7 Anlise estatstica .............................................................................................40 3 RESULTADOS E DISCUSSO ................................................................................40 4 CONCLUSES ........................................................................................................48 5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .........................................................................49 5.2 BIOSSURFACTANTES BACTERIANO E FNGICO: PRODUO ATRAVS DE CULTIVO EM ESTADO SLIDO UTILIZANDO RESDUOS AGROINDUSTRIAIS ....53 1 INTRODUO .........................................................................................................56 2 MATERIAL E MTODOS .........................................................................................57 2.1 Microrganismos ................................................................................................57 2.2 Manuteno e propagao dos inculos para a fermentao ...........................57 2.2.1 Inculo bacteriano .....................................................................................57 2.2.2 Inculo fngico ..........................................................................................58 2.3 Cultivo em estado slido ...................................................................................58 2.4 Extrao do biossurfactante..............................................................................59 2.5 Determinaes analticas..................................................................................60 2.5.1 Biomassa ..................................................................................................60 2.5.2 Umidade....................................................................................................60

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2.5.3 pH .............................................................................................................60 2.5.4 Estimativa da atividade biossurfactante.....................................................61 2.5.4.1 Tenses superficial e interfacial .........................................................61 2.5.4.2 Atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo ...................61 2.6 Produtividade....................................................................................................62 2.7 Anlise estatstica .............................................................................................62 3 RESULTADOS E DISCUSSO ................................................................................63 4 CONCLUSES ........................................................................................................73 5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .........................................................................74 5.3 PRODUO DE BIOSSURFACTANTES BACTERIANO E FNGICO POR CULTIVO SUBMERSO DE FARELO DE TRIGO........................................................79 1 INTRODUO .........................................................................................................82 2 MATERIAL E MTODOS .........................................................................................83 2.1 Microrganismos ................................................................................................83 2.2 Manuteno e propagao dos inculos para a fermentao ...........................83 2.2.1 Inculo bacteriano .....................................................................................83 2.2.2 Inculo fngico ..........................................................................................84 2.3 Cultivo submerso ..............................................................................................84 2.4 Determinaes analticas..................................................................................85 2.4.1 Biomassa ..................................................................................................85 2.4.2 Oxignio dissolvido e velocidade de consumo de oxignio .......................85 2.4.3 pH .............................................................................................................86 2.4.4 Estimativa da atividade biossurfactante.....................................................86 2.4.4.1 Tenses superficial e interfacial .........................................................86 2.4.4.2 Atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo ...................87 2.5 Produtividade....................................................................................................88 2.6 Anlise estatstica .............................................................................................88 3 RESULTADOS E DISCUSSO ................................................................................89 4 CONCLUSES ........................................................................................................97 5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .........................................................................98 6 CONCLUSES GERAIS ....................................................................................... 104 7 SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS ..................................................... 106 8 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ...................................................................... 107 9 ANEXOS ................................................................................................................ 121

9.1 Mtodo do anel para medida das tenses superficial e interfacial ....................... 121 9.2 Acompanhamento das tenses superficiais do meio fermentado na presena e na ausncia das clulas de bactria durante os cultivos - Artigo 1 ................................. 121 9.3 Acompanhamento do pH durante os processos fermentativos - Artigo 1 ............. 122 9.4 Metodologia para determinao do teor de glicosamina - Artigos 2 e 3 ............... 122 9.5 Correlao entre o contedo de glicosamina e a biomassa fngica - Artigos 2 e 3...................................................................................................................................123 9.6 Acompanhamento do pH durante os processos fermentativos - Artigo 2 ............. 124 9.7 Acompanhamento do pH durante os processos fermentativos - Artigo 3 ............. 124 9.8 Procedimento para obteno do extrato de farelo de trigo - Artigo 3 ................... 125 9.9 Determinao do coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio - Artigo 3.............. .................................................................................................................. 125 9.10 Determinao da velocidade de consumo de oxignio pelas clulas - Artigo 3 . 125 9.11 Fotos dos experimentos e determinaes analticas ......................................... 126

LISTA DE TABELAS TABELA 1 Microrganismos produtores de biossurfactantes. .......................................14 TABELA 2 Composio centesimal do farelo de trigo. ................................................23 ARTIGO 1: Seleo de bactrias e avaliao cintica da produo de biossurfactantes TABELA 1 Valores mnimos das tenses superficiais e valores mximos das atividades emulsificantes durante os cultivos das culturas puras de Corynebacterium aquaticum (Cultura 1), mista de Corynebacterium aquaticum e Bacillus sp. (Cultura 2), mista de Corynebacterium sp., Bacillus cereus e Bacillus mycoides (Cultura 3) e pura de Bacillus subtilis (Cultura 4) ..........................................................................................43 TABELA 2 Parmetros cinticos determinados para as culturas puras de Corynebacterium aquaticum (Cultura 1), mista de Corynebacterium aquaticum e Bacillus sp. (Cultura 2), mista de Corynebacterium sp., Bacillus cereus e Bacillus mycoides (Cultura 3) e pura de Bacillus subtilis (Cultura 4) .........................................47 ARTIGO 2: Biossurfactantes bacteriano e fngico: produo atravs de cultivo em estado slido utilizando resduos agroindustriais TABELA 1 Variveis do planejamento experimental fatorial completo 22 e seus respectivos nveis reais e codificados..........................................................................63 TABELA 2 Resultados das menores tenses superficiais e interfaciais e produtividades mximas para os experimentos do planejamento fatorial completo 22.........................71 TABELA 3 Efeitos e nveis de significncia para as respostas tenso superficial, tenso interfacial e respectivas produtividades. ..........................................................71 TABELA 4 Resultados das maiores atividades emulsificantes leo/gua e gua/leo e produtividades mximas para os experimentos do planejamento fatorial completo 22. 72 TABELA 5 Efeitos e nveis de significncia para as respostas atividade emulsificante leo em gua, atividade emulsificante gua em leo e respectivas produtividades. ....72

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ARTIGO 3: Produo de biossurfactantes bacteriano e fngico por cultivo submerso de farelo de trigo TABELA 1 Variveis do planejamento experimental fatorial completo 22 e seus respectivos nveis reais e codificados..........................................................................89 TABELA 2 Resultados das menores tenses superficiais e interfaciais e produtividades mximas para os experimentos do planejamento fatorial completo 22.........................93 TABELA 3 Efeitos e nveis de significncia para as respostas tenso superficial, tenso interfacial e respectivas produtividades. ..........................................................94 TABELA 4 Resultados das maiores atividades emulsificantes leo/gua e gua/leo e produtividades mximas para os experimentos do planejamento fatorial completo 22. 94 TABELA 5 Efeitos e nveis de significncia para as respostas atividade emulsificante leo em gua, atividade emulsificante gua em leo e respectivas produtividades. ....95 ANEXOS TABELA 1 Tenses superficiais do meio fermentado na presena e na ausncia das clulas de bactria para os experimentos 1 e 2......................................................... 121 TABELA 2 Tenses superficiais do meio fermentado na presena e na ausncia das clulas de bactria para os experimentos 3 e 4......................................................... 122

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LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 Estruturas bsicas formadas por biossurfactantes. ....................................10 FIGURA 2 Diagrama esquemtico da variao da tenso superficial, interfacial e solubilidade em funo da concentrao de surfactante. ............................................10 FIGURA 3 Estruturas qumicas de alguns biossurfactantes. .......................................12 FIGURA 4 Ilustrao esquemtica mostrando diferentes tipos de cinticas de fermentao para a produo de biossurfactante........................................................24 FIGURA 5 Derrame de leo pelo navio Exxon Valdez. ................................................26 FIGURA 6 Representao da reduo da tenso interfacial leo/gua pela presena de surfactante..............................................................................................................27 FIGURA 7 Representao da solubilizao de molculas hidrofbicas orgnicas. .....27 ARTIGO 1: Seleo de bactrias e avaliao cintica da produo de biossurfactantes FIGURA 1 Biomassa de bactrias e tenses superficiais (TS) antes e aps filtrao do meio fermentado. ........................................................................................................41 FIGURA 2 Atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo durante os cultivos com diferentes culturas de bactrias. ..........................................................................42 ARTIGO 2: Biossurfactantes bacteriano e fngico: produo atravs de cultivo em estado slido utilizando resduos agroindustriais FIGURA 1 Esquema de cultivo em estado slido em biorreator de coluna. .................59 FIGURA 2 Crescimento dos microrganismos durante os cultivos. ...............................66 FIGURA 3 Umidade ao longo dos processos fermentativos. .......................................66 FIGURA 4 Tenses superficial e interfacial ao longo dos processos fermentativos.....69 FIGURA 5 Atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo durante os cultivos. ....................................................................................................................................69 ARTIGO 3: Produo de biossurfactantes bacteriano e fngico por cultivo submerso de farelo de trigo FIGURA 1 Crescimento dos microrganismos durante os cultivos. ...............................90

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FIGURA 2 Oxignio dissolvido e velocidade de consumo de oxignio nos ensaios em biorreator de mistura. ..................................................................................................90 FIGURA 3 Tenses superficial e interfacial ao longo do tempo de cultivo. ..................92 FIGURA 4 Atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo durante os cultivos. ....................................................................................................................................92 ANEXOS FIGURA 1 Comportamento do pH durante os cultivos do Artigo 1. ........................... 122 FIGURA 2 pH ao longo dos processos fermentativos do Artigo 2.............................. 124 FIGURA 3 pH ao longo dos processos fermentativos do Artigo 3.............................. 124 FIGURA 4 Cultivos bacterianos em estado slido.. ................................................... 126 FIGURA 5 Microtcnica do Nmero mais Provvel (NMP) para acompanhamento do crescimento de bactrias........................................................................................... 126 FIGURA 6 Cultivos fngicos em estado slido.. ........................................................ 127 FIGURA 7 Determinao do teor de glicosamina para acompanhamento do crescimento de fungos. ............................................................................................. 127 FIGURA 8 Cultivos bacterianos em meio lquido. ...................................................... 127 FIGURA 9 Cultivos fngicos em meio lquido. ........................................................... 128 FIGURA 10 Medida das tenses superficial e interfacial.. ......................................... 128 FIGURA 11 Determinao da tenso superficial de extratos fngicos. ...................... 128 FIGURA 12 Determinao das atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo. .......................................................................................................................... 129 FIGURA 13 Representao esquemtica do ensaio de atividade emulsificante gua em leo. .................................................................................................................... 129

NOMENCLATURA TS TS pre cl TS aus cl ProdTS TI ProdTI AEo/a Absamostra Absbranco AEa/o Eamostra Ebranco D Prodo/a Proda/o rX X X tg mx rP P t PP P0 Xmx rP TS
pre cl

tenso superficial (mN.m-1) tenso superficial do meio na presena de clulas de microrganismo (mN.m-1) tenso superficial do meio na ausncia de clulas de microrganismo (mN.m-1) produtividade relativa tenso superficial (mN.m-1.h-1) tenso interfacial (mN.m-1) produtividade relativa tenso interfacial (mN.m-1.h-1) atividade emulsificante leo em gua (UE) absorbncia da emulso leo/gua absorbncia da amostra diluda atividade emulsificante gua em leo (UE) relao centesimal entre a altura da emulso gua/leo e a altura total utilizando amostra relao centesimal entre a altura da emulso gua/leo e a altura total utilizando gua diluio da amostra em gua produtividade relativa a atividade emulsificante leo em gua (UE.h-1) produtividade relativa a atividade emulsificante gua em leo (UE.h-1) velocidade instantnea de crescimento celular (gcl.L-1.h-1) velocidade especfica de crescimento celular (h-1) concentrao celular (gcl.L-1) tempo de gerao (h) velocidade especfica mxima de crescimento celular (h-1) velocidade instantnea de formao de produto (gprod.L-1.h-1) concentrao de produto (gprod.L-1); tempo de cultivo (h) produtividade em produto (gprod.L-1.h-1) concentrao de produto no incio da fermentao (gprod.L-1) concentrao celular mxima (gcl.L-1) velocidade instantnea de formao de produto relativa tenso superficial do meio na presena de clulas de microrganismo (mN.m1

.h-1)

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rP TS

aus cl

velocidade instantnea de formao de produto relativa tenso superficial do meio na ausncia de clulas de microrganismo (mN.m1

.h-1)

rP AEo/a rP AEa/o PP TS PP TS

velocidade instantnea de formao de produto relativa atividade emulsificante leo em gua (UE.h-1) velocidade instantnea de formao de produto relativa atividade emulsificante gua em leo (UE.h-1) produtividade em produto relativa tenso superficial do meio na presena de clulas de microrganismo (mN.m-1.h-1) produtividade em produto relativa tenso superficial do meio na ausncia de clulas de microrganismo (mN.m-1.h-1) produtividade em produto relativa atividade emulsificante leo em gua (UE.h-1) produtividade em produto relativa atividade emulsificante gua em leo (UE.h-1) microrganismo biorreator biorreator de coluna biorreator de mistura frasco Erlenmeyer nmero mais provvel gramas de meio seco concentrao de oxignio medida durante o cultivo (mg.L-1) concentrao de oxignio na saturao coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (h-1) velocidade de consumo de oxignio pelas clulas (mg.L-1.h-1) oxignio dissolvido (mg.L-1) significncia estatstica

pre cl

aus cl

PP AEo/a PP AEa/o Mo BR C Bi E NMP gms C Cs KLa QO2X O2 dissolvido p

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RESUMO Os biossurfactantes so molculas anfipticas produzidas por microrganismos, que reduzem tenses superficiais e interfaciais e possuem propriedades de emulsificao. Apresentam vantagens com relao aos surfactantes qumicos como a biodegradabilidade e baixa toxicidade, podendo ser aplicados na indstria de alimentos, farmacutica, cosmtica, na biorremediao e na recuperao de petrleo. Os processos biotecnolgicos freqentemente so limitados pelo investimento de capital. A utilizao de resduos agroindustriais para a produo de biossurfactante importante do ponto de vista econmico, j que a matria-prima representa grande parte dos custos de obteno deste bioproduto. Os objetivos do presente trabalho foram selecionar bactrias com potencial para produzir biossurfactante e estudar a produo por bactria e fungo em diferentes biorreatores, atravs de cultivos em estado slido e submerso utilizando resduos agroindustriais. O trabalho foi dividido em trs etapas: 1) seleo de bactrias produtoras de biossurfactante e estudo da cintica dos processos fermentativos, 2) produo de biossurfactantes bacteriano e fngico em diferentes biorreatores atravs de cultivo em estado slido e 3) produo de biossurfactantes bacteriano e fngico em diferentes biorreatores atravs de cultivo submerso. Na primeira etapa foram utilizadas 4 culturas de bactrias: cultura pura de Corynebacterium aquaticum, cultura mista contendo Corynebacterium aquaticum e Bacillus sp., cultura mista contendo Corynebacterium sp., Bacillus cereus e Bacillus mycoides e cultura pura de Bacillus subtilis. A cultura pura de Corynebacterium aquaticum foi a que apresentou menor tenso superficial (28,8 mN.m-1) e, em geral, maiores valores para os parmetros cinticos, sendo selecionada como produtora de biossurfactante. Resultados da segunda etapa mostraram que as menores tenses superficiais foram encontradas no cultivo de Corynebacterium aquaticum em biorreator de coluna (33,1 mN.m-1) e frasco Erlenmeyer (31,3 mN.m-1). A menor tenso interfacial foi 6,2 mN.m-1, obtida em cultivo bacteriano em biorreator de coluna. Os cultivos com o fungo Aspergillus fumigatus em biorreator de coluna e frasco Erlenmeyer apresentaram maiores atividades emulsificantes leo em gua (291,8 UE e 327,9 UE, respectivamente). A atividade emulsificante gua em leo foi incrementada nos cultivos de Aspergillus fumigatus e pela utilizao do biorreator de coluna, atingindo 60,4 UE. Na terceira etapa verificou-se que as menores tenses superficiais foram encontradas no cultivo de Corynebacterium aquaticum em biorreator de mistura (28,6 mN.m-1) e frasco Erlenmeyer (29,1 mN.m-1). As menores tenses interfaciais foram obtidas nos cultivos bacterianos (3,0 mN.m-1). A maior atividade emulsificante leo em gua foi 232,0 UE, obtida no cultivo com a bactria Corynebacterium aquaticum em biorreator de mistura. Os cultivos bacterianos em biorreator de mistura e frasco Erlenmeyer apresentaram maiores atividades emulsificantes gua em leo (37,9 UE e 36,1 UE, respectivamente). Logo, o biossurfactante produzido pela bactria foi capaz de reduzir tenses e promover a formao de emulses tanto em meio slido quanto em meio lquido, enquanto o fungo mostrou-se apto a produzir biossurfactante com alta capacidade emulsificante em meio slido. Constatou-se a viabilidade de produo de biossurfactante a partir de resduos agroindustriais, o que torna o processo mais econmico, obtendo-se um bioproduto de valor agregado a partir de substratos de baixo custo, alm de contribuir com o meio ambiente pela diminuio da poluio e desequilbrio gerados pela emisso desses resduos. Palavras-chave: bioprocesso, molculas anfipticas, resduos agroindustriais.

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ABSTRACT Biosurfactants are amphipathic molecules produced by microorganisms that reduce surface and interfacial tensions and possess emulsification properties. They present advantages with relationship to the chemical surfactants as the biodegradability and low toxicity, and can be applied in the food, pharmaceutical and cosmetic industry, in the bioremediation and in the recovery of petroleum. The biotechnology processes are frequently limited by the capital investment. The use of agroindustrial wastes for the biosurfactant production is important from the economical point of view, since the raw material represents great part of the costs in the obtaining of this bioproduct. The purposes of this study were to select bacteria with potential to produce biosurfactant and to study the production by bacteria and fungus in different bioreactors, through solid-state and submerged cultivations using agroindustrial wastes. The work was divided in three stages: 1) selection of bacteria for biosurfactant production and fermentation process kinetics study, 2) bacterial and fungic biosurfactants production in different bioreactors through solid-state cultivation and 3) bacterial and fungic biosurfactants production in different bioreactors through submerged cultivation. In the first stage 4 bacterial strains were used: pure culture of Corynebacterium aquaticum, mixed culture containing Corynebacterium aquaticum and Bacillus sp., mixed culture containing Corynebacterium sp., Bacillus cereus and Bacillus mycoides and pure culture of Bacillus subtilis. The pure culture of Corynebacterium aquaticum presented the smallest surface tension (28.8 mN.m-1) and, in general, larger kinetic parameters, being selected as biosurfactant producer. Results of the second stage showed that the smallest surface tensions were found in the cultivation of Corynebacterium aquaticum in column bioreactor (33.1 mN.m-1) and Erlenmeyer flask (31.3 mN.m-1). The smallest interfacial tension was 6.2 mN.m-1, obtained in bacterial cultivation in column bioreactor. The cultivations with the fungus Aspergillus fumigatus in column bioreactor and Erlenmeyer flask presented larger emulsifying activities oil in water (291.8 UE and 327.9 UE, respectively). The emulsifying activity water in oil was increased in the cultivations of Aspergillus fumigatus and for the use of the column bioreactor, reaching 60.4 UE. In the third stage it was verified that the smallest surface tensions were found in the cultivation of Corynebacterium aquaticum in mixture bioreactor (28.6 mN.m-1) and Erlenmeyer flask (29.1 mN.m-1). The smallest interfacial tensions were obtained in the bacterial cultivations (3.0 mN.m-1). The largest emulsifying activity oil in water was 232.0 UE, obtained in the cultivation with the bacteria Corynebacterium aquaticum in mixture bioreactor. The bacterial cultivations in mixture bioreactor and Erlenmeyer flask presented larger emulsifying activities water in oil (37.9 UE and 36.1 UE, respectively). Therefore, the biosurfactant produced by the bacteria was able to reduce tensions and to promote emulsions formation in solid and liquid medium, while the fungus was able to produce biosurfactant with high emulsifying capacity in solid medium. The viability of biosurfactant production from agroindustrial wastes was verified, what makes the process more economical, with the obtaining of a value joined bioproduct from low cost substrates, besides contributing with the environment for the decrease of the pollution and unbalance generated by the emission of those residues. Keywords: bioprocess, amphipathic molecules, agroindustrial wastes.

1 INTRODUO Biossurfactantes so compostos de superfcie ativa, produzidos na superfcie da clula microbiana ou excretado extracelularmente, que reduzem tenses superficiais e interfaciais. Os biossurfactantes e bioemulsificantes apresentam propriedades de emulsificao (DYKE et al., 1991). Por causa de sua diversidade estrutural (glicolipdios, lipopeptdeos, cidos graxos, entre outros), baixa toxicidade e biodegradabilidade, os biossurfactantes podem ser amplamente utilizados em processos de produo de alimentos, cosmticos e produtos farmacuticos como emulsificantes, umectantes, conservantes e detergentes. Alm disso, eles so ecologicamente seguros e podem ser aplicados em biorremediao e tratamento de resduos (MAKKAR & CAMEOTRA, 2002). Devido a demanda pelos consumidores, os emulsificantes naturais esto se tornando cada vez mais importantes na indstria alimentcia frente aos agentes emulsificantes sintticos, para os quais a popularidade est diminuindo devido ao perigo potencial que representam sade humana (LUKONDEH et al., 2003). A poluio por leos um problema ambiental de grande importncia. Microrganismos degradadores de hidrocarbonetos, adaptados para crescerem em ambientes contaminados com leo, tm um importante papel no tratamento biolgico desta poluio, pois podem produzir biossurfactantes de diversas naturezas qumicas e massa molecular. Esses materiais de superfcie ativa aumentam a rea interfacial de substratos hidrofbicos insolveis em gua e aumentam a sua biodisponibilidade, desse modo aumentando o crescimento do microrganismo e a eficincia da biorremediao (RON & ROSENBERG, 2002). Os detergentes sintticos usados para a limpeza de derrames de leo tm freqentemente conduzido a uma maior destruio do meio ambiente. Provavelmente a vantagem mais importante dos biossurfactantes com relao aos surfactantes qumicos a sua aceitabilidade ecolgica. Muitos surfactantes sintetizados quimicamente ocasionam problemas ecolgicos devido a sua resistncia degradao, toxicidade e acmulo em ecossistemas naturais. Por outro lado, os biossurfactantes so biodegradveis (HEALY et al., 1996). Apesar dos biossurfactantes apresentarem diversas vantagens em relao aos surfactantes sintticos, os mesmos ainda no so amplamente utilizados devido ao alto custo de produo (NITSCHKE & PASTORE, 2002). Recentemente, a Companhia Jeneil de Biossurfactante (http://www.biosurfactant.com) comeou a produo

comercial de biossurfactante do tipo ramnolipdio. O elevado custo de produo tem limitado aplicaes comerciais. Porm, pode ser reduzido atravs da melhoria do rendimento e do uso de substratos baratos ou resduos agroindustriais (MULLIGAN, 2005). Em adio a fermentao submersa tradicionalmente utilizada, biossurfactantes podem ser produzidos por fermentao em estado slido, sendo esta uma rea interessante de pesquisa, j que poucos relatos so encontrados na literatura (VEENANADIG et al., 2000). Desta maneira, o presente trabalho visou selecionar bactrias com potencial para produzir biossurfactante e estudar a produo por bactria e fungo em diferentes biorreatores, atravs de cultivos em estado slido e submerso utilizando resduos agroindustriais gerados na regio, de forma a reduzir os custos de produo de um produto de alto valor agregado, alm de contribuir com o meio ambiente pela diminuio da poluio e desequilbrio gerados pelo acmulo desses resduos.

2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral Estudar a produo de biossurfactantes por bactrias e fungo atravs de cultivo em estado slido e submerso, a partir de subprodutos das indstrias de beneficiamento de trigo e arroz. 2.2 Objetivos especficos - Selecionar bactrias com potencial para produzir biossurfactante; - Comparar a produo de biossurfactantes por microrganismos diferentes, a bactria que se mostrou mais promissora na etapa de seleo, Corynebacterium aquaticum, e o fungo Aspergillus fumigatus, em biorreatores com e sem injeo de ar forada, atravs de cultivo em estado slido e submerso; - Verificar a viabilidade de utilizao de resduos agroindustriais na produo de biossurfactantes.

3 JUSTIFICATIVA As atividades agropecurias e de processamento de produtos agropecurios tm proporcionado srios problemas de poluio no solo e em guas superficiais e subterrneas. Como os resduos de atividades agroindustriais apresentam, em geral, alta concentrao de material orgnico, o seu lanamento em corpos hdricos pode proporcionar grande decrscimo na concentrao de oxignio dissolvido nesse meio (MATOS, 2005), levando ao desequilbrio da fauna e da flora. Milhes de toneladas de resduos so gerados a cada ano no mundo. Os custos para o tratamento desses resduos so altos, havendo a necessidade de uma melhor administrao atravs dos conceitos de reduzir, reusar e reciclar (MAKKAR & CAMEOTRA, 2002). O Brasil, por ser um pas de intensa atividade agrcola, produz grandes quantidades de resduos agroindustriais. A industrializao de alimentos gera resduos slidos e lquidos, o que faz necessria a busca de alternativas para diminuir os impactos causados por esses resduos ao meio ambiente. Em 2000, a demanda mundial por surfactantes era de aproximadamente US$ 9,4 bilhes por ano e esperava-se que essa demanda aumentasse a uma taxa de 35% ao ano. A maioria dos surfactantes em uso so derivados quimicamente do petrleo. Entretanto, o interesse por surfactantes microbiolgicos tem aumentado devido a sua diversidade, caractersticas ambientais favorveis, a possibilidade de produo atravs da fermentao e sua potencial aplicao em reas como a proteo ambiental, recuperao de resduos oleosos, cuidados sade e indstrias de processamento de alimentos (KIM et al., 2000). A maioria dos estudos na rea de produo de biossurfactantes tm sido apresentados em fermentao submersa, fazendo da fermentao em estado slido uma rea promissora de pesquisa. Os custos freqentemente limitam os processos biotecnolgicos. Em pases em desenvolvimento, onde a situao econmica muitas vezes produz dificuldades para manter-se ao nvel dos avanos biotecnolgicos, processos fermentativos utilizando substratos alternativos e de baixo custo, como os resduos agroindustriais, constituem uma oportunidade para o progresso na produo de compostos bioativos, alm de agregar valor a esses resduos e contribuir com o meio ambiente pela diminuio da poluio e desequilbrio gerados pelo seu acmulo. De acordo com CAMEOTRA & MAKKAR (1998), o sucesso da produo de biossurfactantes depende do desenvolvimento de processos mais baratos e do uso de matrias-primas de baixo custo, a qual conta com 10-30% do custo total.

No Brasil, a produo anual de trigo oscila entre 5 e 6 milhes de toneladas. O Rio Grande do Sul o segundo maior produtor nacional de trigo, perdendo somente para o Paran. Entre as safras de 1998-2003 houve significativa evoluo na produo, com um incremento de 345,2%. O estado produziu 36,4% do total produzido no pas de 2001 a 2003, o que corresponde a 1.532.659 toneladas (http://www.scp.rs.gov.br; http://www.cnpt.embrapa.br). O farelo de trigo um subproduto do processo de produo de farinha branca, sendo tradicionalmente usado na rao animal. Logo, a utilizao do farelo de trigo como substrato para produo de biossurfactante uma possibilidade atrativa, j que a matria-prima de fcil obteno e baixo custo, possibilitando a obteno de um produto de alto valor agregado. Os consumidores de alimentos mostram-se cada vez mais exigentes com relao a garantia da qualidade e a aquisio de um alimento seguro. Desta forma, a busca por alimentos naturais, livre de produtos qumicos, como aditivos sintticos ou agrotxicos tem se intensificado. Os aditivos qumicos podem ser cancergenos e/ou danosos sade, principalmente quando consumidos diria e freqentemente. Nesse contexto, a obteno de bioprodutos a partir de processos biotecnolgicos torna-se de extrema importncia, podendo-se incluir os biossurfactantes, menos txicos que os surfactantes sintticos. A utilizao do petrleo como combustvel e todas as etapas envolvidas no transporte, estocagem e distribuio do leo cru e seus derivados envolvem riscos de derrames acidentais, os quais tm sido um dos principais problemas ambientais nas ltimas dcadas (CRAPEZ et al., 2000). Estima-se que a cada ano 600.000 toneladas de petrleo bruto so derramadas em acidentes durante o transporte, rebentamentos de poos de petrleo, descargas ilegais de efluentes industriais e limpeza de tanques de navios no mar. O petrleo derramado flutua e alastra-se progressivamente, formando extensas manchas negras, denominadas mars negras, de efeitos altamente destruidores. Alm dos seus efeitos imediatos, bem evidentes, h tambm os efeitos a longo prazo, com repercusses no menos graves. Quando as mars negras atingem as zonas costeiras, colocam em risco a fauna e a flora pela intoxicao de peixes, moluscos e alguns mamferos, representando um perigo para o homem atravs da cadeia alimentar. H tambm prejuzos atividade piscatria e pelo forte impacto negativo na atividade turstica, j que os resduos petrolferos, de difcil remoo, impedem por muito tempo a utilizao das praias (COLLA & COSTA, 2003).

Exemplos de acidentes com petrleo so o derrame de 2x105 toneladas de leo cru pelo navio Amoco Cadiz ao longo da costa britnica, em 1978; o derrame de 4x105 toneladas de petrleo pelo navio Exxon Valdez em 1989, atingindo a costa do Alasca; o derrame de 4 milhes de litros de petrleo da Refinaria Getlio Vargas no municpio de Araucria, no Paran, em 2000; e o vazamento de 1,3 milhes de litros de combustvel em janeiro do mesmo ano, na Baa de Guanabara, Rio de Janeiro. Quando o leo difunde-se no meio ambiente, hidrocarbonetos de baixo peso molecular so volatilizados, enquanto que os componentes polares so dissolvidos na gua. Entretanto, grande parte dos hidrocarbonetos permanece na superfcie da gua ou aderido a partculas slidas devido a sua baixa solubilidade (KARANTH et al., 1999). A biodegradao de hidrocarbonetos um processo complexo que depende da natureza e quantidade presente do poluente. O crescimento de microrganismos em hidrocarbonetos representa problemas devido a insolubilidade desses compostos em gua. Porm, alguns microrganismos so capazes de emulsificar hidrocarbonetos em soluo pela produo de agentes de superfcie ativa, os biossurfactantes (BARATHI & VASUDEVAN, 2001). Biossurfactantes tm sido usados para remoo de leo de reas contaminadas por aumentar a biodegradao do leo pelo aumento da biodisponibilidade de compostos hidrofbicos (RON & ROSENBERG, 2002). Os surfactantes biolgicos mostram-se promissores para a indstria petroqumica, j que so menos txicos, biodegradveis e estveis em valores extremos de pH, temperatura e salinidade quando comparados aos surfactantes sintticos. A cidade do Rio Grande, localizada no sul do Rio Grande do Sul, destaca-se pela presena de um porto martimo com grande movimentao de carga e pela presena de indstrias de fertilizantes, pescado, leo de soja, refino de petrleo. O porto encontra-se no esturio da Lagoa dos Patos, o qual fica exposto a possveis derrames de leo, principalmente durante o transporte, armazenagem e transbordo. Essas evidncias tornam urgente o desenvolvimento de alternativas para diminuir impactos ambientais ocasionados por derrames de leos, como a produo de biossurfactantes a serem utilizados em processos de biorremediao. A importncia da produo de biossurfactantes a partir de resduos agroindustriais torna-se evidente no somente por diminuir os custos de produo de um produto de alto valor agregado e diminuir impactos ambientais ocasionados pelo acmulo desses resduos, mas tambm por contribuir com a indstria alimentcia e

petroqumica, refletindo no setor econmico, em questes ambientais e de sade pblica. Desde 1998, o Laboratrio de Engenharia Bioqumica da Fundao Universidade Federal do Rio Grande vem desenvolvendo pesquisas em fermentao em estado slido, incluindo a produo de biossurfactantes e sua utilizao em biorremediao de hidrocarbonetos, demonstrando a sua preocupao com a utilizao de resduos agroindustriais e a reduo de impactos ambientais. Foram estudados o enriquecimento protico do farelo de arroz em biorreatores tipo tambor rotativo e de coluna, a modelagem e simulao da transferncia de calor em fermentao em estado slido de farelo de arroz em fermentador de coluna, a produo de pectinase e amiloglicosidade e a otimizao da produo de fungos comestveis (SANTOS et al., 2001; GANDRA et al., 2000; LINDE, 2000; MORAES, 1999; HASAN, 1998; TREICHEL et al., 1998). As pesquisas na rea de produo de biossurfactante comearam com JUNIOR et al. (2003), que verificaram a capacidade dos fungos Aspergillus fumigatus e Phialomonium sp. de crescer na presena de compostos hidrofbicos tais como leo de soja, leo diesel, hexano e tolueno, produzindo biossurfactante. COSTA (2004) estudou a velocidade de crescimento radial de fungos filamentosos como critrio para a produo de biossurfactante utilizando diferentes fontes adicionais de carbono; alm disso, avaliou o efeito de fontes adicionais de carbono de origem fssil e no fssil, da aerao e da soluo de nutrientes na produo de biossurfactante. MARTINS (2005) produziu biossurfactante utilizando diferentes fungos filamentosos e avaliou sua utilizao na biorremediao in situ de solo aps derrame de leo diesel. CHANIN et al. (2005) produziram biossurfactante a partir do fungo Phialomonium sp. e avaliaram sua utilizao na biorremediao de solo aps derrame de leo de soja. CASTIGLIONI (2006) modelou, simulou e otimizou a produo de biossurfactante pelo fungo Aspergillus fumigatus atravs de fermentao em estado slido, verificando a influncia da aerao e do tempo de fermentao, utilizando como fontes adicionais de carbono leo diesel e leo de soja. CERQUEIRA (2007) verificou a estabilidade do biossurfactante produzido pelo fungo filamentoso Aspergillus fumigatus por fermentao em estado slido de farelo de trigo e arroz com relao ao pH, temperatura e salinidade. Alm disso, biorremediou solo contaminado com leo de pescado e tolueno.

4 REVISO BIBLIOGRFICA 4.1 Processos fermentativos Podemos descrever o processo fermentativo como um somatrio de etapas, onde o meio de cultura, convenientemente preparado para fornecer ao microrganismo responsvel pelo processo os nutrientes de que necessita, com freqncia esterilizado com o objetivo de eliminar microrganismos contaminantes indesejveis. No fermentador, esse meio recebe o inculo, suspenso do microrganismo capaz de garantir a fermentao do meio em condies econmicas. O processo de fermentao , ento, controlado (temperatura, pH, agitao, concentrao de nutrientes, entre outros) de modo a manter condies favorveis ao trabalho do microrganismo. Completado o processo, o meio fermentado encaminhado aos tratamentos finais, com vistas separao de produtos e de subprodutos, ao tratamento de resduos (BORZANI et al., 1975). Os processos fermentativos so comumente classificados quanto conduo do processo (descontnuos, semicontnuos ou contnuos), quanto ao modo de cultivo, (processos em estado slido ou submerso) e quanto ao suprimento de oxignio (processos aerados ou no aerados) (REGULY, 2000). 4.1.1 Processo fermentativo em estado slido De acordo com PANDEY et al. (2000), o processo fermentativo em estado slido pode ser definido como aquele que ocorre na ausncia ou prximo da ausncia de gua livre, empregando um substrato natural como fonte de carbono/energia. Entende-se por gua livre a no separao ou escorrimento da gua da matriz slida, que deve conter umidade suficiente, na forma absorvida ou complexada, permitindo o crescimento do microrganismo (COSTA, 1996). As principais vantagens do processo fermentativo em estado slido com relao ao processo fermentativo submerso so: maior produtividade; alta concentrao dos produtos finais; baixa demanda de gua e, portanto, menor probabilidade de contaminao; a possibilidade de utilizao de substratos baratos e de baixo custo, como os resduos agroindustriais (MITCHELL et al., 2000). Por sua vez, as desvantagens mais significativas so: os microrganismos utilizados so limitados queles que crescem em baixos nveis de umidade;

dificuldades para remoo do calor gerado pelo processo de respirao do microrganismo; dificuldade na medida e controle dos nveis de umidade, pH, oxignio e gs carbnico; escassez de dados de engenharia e de projetos para fermentadores; dificuldade do aumento de escala (MITCHELL et al., 2000; COSTA, 1996). 4.1.2 Processo fermentativo submerso O processo fermentativo submerso tem como caracterstica principal a utilizao de um meio de cultura lquido, com nutrientes solveis (ALONSO, 2001). Apresenta relativa facilidade de cultivo em grande escala, j que garante homogeneidade do meio e facilidade no controle dos parmetros de processo, principalmente se monitorados por sensores adequados (COUTO & SANROMN, 2006). No entanto, a maior probabilidade de contaminao, pela maior quantidade de gua, um inconveniente deste processo. Outra limitao est relacionada aos produtos extracelulares, obtidos consideravelmente diludos, sendo necessria uma etapa de concentrao mais trabalhosa na purificao (ALONSO, 2001). 4.2 Biossurfactantes A maioria dos surfactantes disponveis comercialmente so sintetizados a partir de derivados de petrleo. Entretanto, o crescimento da preocupao ambiental entre os consumidores, combinado com novas legislaes de controle do meio ambiente, levaram procura por surfactantes naturais como alternativa aos produtos existentes. Os surfactantes so molculas anfipticas constitudas de uma poro hidrofbica e uma poro hidroflica. A poro apolar freqentemente uma cadeia hidrocarbonatada, enquanto a poro polar pode ser inica (aninica ou catinica), no inica ou anfotrica (NITSCHKE & PASTORE, 2002; DESAY & BANAT, 1997). Os microrganismos degradadores de hidrocarbonetos podem produzir agentes de superfcie ativa, os biossurfactantes. Esses agentes so molculas pequenas de surfactantes que afetam a reduo das tenses superficial e interfacial, e macromolculas anfiflicas que estabilizam a emulso (BENTO et al., 2005). Monmeros de surfactantes formam estruturas esfricas ou lamelares com uma pseudofase orgnica no seu interior, de acordo com a Figura 1 (MULLIGAN et al., 2001; CHAMPION et al., 1995). Este fato coincide com a menor tenso superficial e interfacial atingida, como pode ser observado na Figura 2. A mnima concentrao em

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que isso ocorre chamada de concentrao micelar crtica (CMC) (MULLIGAN et al., 2001).

FIGURA 1 Estruturas bsicas formadas por biossurfactantes. Fonte: CHAMPION et al. (1995).

FIGURA 2 Diagrama esquemtico da variao da tenso superficial, interfacial e solubilidade em funo da concentrao de surfactante. Fonte: MULLIGAN et al. (2001). 4.2.1 Principais classes de biossurfactantes Os biossurfactantes so molculas complexas, compreendendo uma ampla variedade de estruturas qumicas como glicolipdios, lipopeptdios, cidos graxos, complexos polissacardio-protena, peptdios, fosfolipdios e lipdios neutros (BANAT et al., 2000). A poro apolar dos biossurfactantes geralmente um hidrocarboneto com um ou mais cidos graxos, os quais podem ser saturados ou insaturados e que tambm podem conter estruturas cclicas. A poro polar pode ser simples como uma

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carboxila ou funo hidrxida ou uma mistura complexa de fosfatos, carboidratos, aminocidos, entre outras (COOPER, 1986). Microrganismos sintetizam uma ampla variedade de bioemulsificantes de alta e baixa massa molecular. Os bioemulsificantes de alta massa molecular so polissacardios anfipticos, protenas, lipopolissacardios, lipoprotenas ou misturas complexas desses biopolmeros. Por sua vez, os bioemulsificantes de baixa massa molecular so geralmente glicolipdios como trealose lipdios, soforolipdios e ramnolipdios, ou lipopeptdios como a surfactina. Os bioemulsificantes de alta massa molecular so mais efetivos para estabilizar emulses leo em gua, enquanto que os de baixa massa molecular reduzem as tenses superficial e interfacial (ROSENBERG & RON, 1999). A Figura 3 apresenta as estruturas de alguns biossurfactantes. (a)

Mono-ramnolipdio

Di-ramnolipdio

(b)

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(c)

(d)

FIGURA 3 Estruturas qumicas de alguns biossurfactantes. (a) ramnolipdios, (b) soforolipdios, (c) lipopeptdio e (d) surfactina. Fontes: BOGNOLO (1999); SANDOVAL et al. (1999); CAMEOTRA & MAKKAR (1998); KOWALL et al. (1998); HEALY et al. (1996). 4.2.2 Propriedades dos biossurfactantes Apesar da diversidade de composio qumica e propriedades, algumas caractersticas caractersticas so comuns representam maioria dos biossurfactantes. Muitas dessas sobre os surfactantes convencionais vantagens

(NITSCHKE & PASTORE, 2002), tais como: - Atividade superficial e interfacial: os biossurfactantes so mais efetivos e eficientes na reduo das tenses superficial e interfacial do que surfactantes

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sintticos, pois propiciam menores tenses em menor concentrao de surfactante (BOGNOLO, 1999); - Tolerncia temperatura, fora inica e pH: alguns biossurfactantes e suas atividades superficiais no so afetados por temperaturas de at 90C. Biossurfactantes no so precipitados em solues salinas com concentrao de at 10%, enquanto 2-3% de sal suficiente para desativar surfactantes qumicos (BOGNOLO, 1999). As propriedades de superfcie ativa do biossurfactante produzido por Corynebacterium lepus foram verificadas por COOPER et al. (1981), em pH variando de 2 a 10. As tenses superficial e interfacial reduziram para valores em torno de 45 e 10 mN.m-1, respectivamente, para todos os pHs estudados; - Biodegradabilidade: diferente dos surfactantes qumicos, os biossurfactantes so facilmente degradveis na gua e no solo, o que os torna adequados para aplicaes como biorremediao e tratamento de resduos (BANAT et al., 2000); - Baixa toxicidade: a baixa toxicidade permite o uso em alimentos, cosmticos e produtos farmacuticos (NITSCHKE & PASTORE, 2002); - Substratos abundantes e de baixo custo: podem ser produzidos a partir de matrias-primas renovveis e de baixo custo, disponveis em grande quantidade (KOSARIC, 1992); - Concentrao micelar crtica (CMC): a CMC dos biossurfactantes geralmente varia de 1 a 200 mg.L-1 (MULLIGAN et al., 2001), sendo considerada pequena quando comparada com a de surfactantes qumicos. BOGNOLO (1999) reportou a CMC de surfactantes naturais (20 mg.L-1 para ramnolipdios e 11 mg.L-1 para surfactina) e sintticos (590 mg.L-1 para sulfato de alquilbenzeno linear e 2000-2900 mg.L-1 para sdio lauril sulfato). 4.2.3 Produo de biossurfactantes Os biossurfactantes so produzidos principalmente por microrganismos aerbios, em meio aquoso, a partir de uma fonte de carbono. Como exemplos tm-se os carboidratos, os hidrocarbonetos, os leos e gorduras ou misturas destes. Os emulsificantes so secretados extracelularmente ou fazem parte da membrana celular durante o crescimento do microrganismo, ajudando no transporte de substratos insolveis atravs desta (BOGNOLO, 1999). Embora a maioria dos organismos produtores de biossurfactantes sejam aerbios, alguns exemplos de produtores anaerbios existem. Bacillus licheniformis

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JF-2 um exemplo, o qual seria bem adaptado para estudos in situ para o aumento da recuperao melhorada de leo ou descontaminao de solos (MULLIGAN, 2005). Os biossurfactantes so produzidos por uma ampla variedade de bactrias, leveduras e fungos filamentosos (COSTA et al., 2006; KARANTH et al., 1999), e geralmente so liberados no meio de cultura na fase estacionria ou na fase exponencial (CAMEOTRA & MAKKAR, 1998). A Tabela 1 apresenta biossurfactantes produzidos por diferentes microrganismos. TABELA 1 Microrganismos produtores de biossurfactantes. Biossurfactante Glicolipdios Ramnolipdios Trealose lipdios Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas sp. Rhodococcus erythropolis Nocardia erythropolis Mycobacterium sp. Soforolipdios Torulopsis bombicola Torulopsis apicola Torulopsis petrophilum Lipopeptdios e lipoprotenas Lipopeptdio Viscosina Surfactina Subtilisina cidos graxos Lipdios neutros Fosfolipdios Surfactantes polimricos Emulsan Biodispersan Liposan
Fonte: DESAI & BANAT (1997).

Microrganismo

Bacillus licheniformis Pseudomonas fluorescens Bacillus subtilis Bacillus subtilis Corynebacterium lepus Nocardia erythropolis Thiobacillus thiooxidans Acinetobacter calcoaceticus Acinetobacter calcoaceticus Candida lipolytica

O aparecimento de bioemulsificantes ou compostos de superfcie ativa no meio de cultura ou unido s paredes celulares geralmente considerado um pr-requisito

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para as interaes iniciais entre os hidrocarbonetos e a clula microbiana, porque reduzem a tenso interfacial entre o leo e a fase aquosa, diminuindo o dimetro mdio das gotas de leo e propiciando o aumento da rea interfacial (HOMMEL, 1990 citado por MARCHI et al., 1997). A produo de biossurfactante, alm de induzida por hidrocarbonetos ou substratos insolveis em gua, pode ocorrer a partir de substratos solveis em gua, especialmente carboidratos (MULLIGAN, 2005; KARANTH et al., 1999; DESAI & BANAT, 1997). De acordo com DESAI & BANAT (1997), hidrocarbonetos e carboidratos esto envolvidos na sntese das pores hidrofbicas e hidroflicas, respectivamente, das molculas de biossurfactante. Os caminhos para a sntese desses dois grupos de precursores so diversos e utilizam grupos especficos de enzimas. Em muitos casos, as primeiras enzimas para a sntese desses precursores so enzimas regulatrias; portanto, apesar da diversidade, existem algumas caractersticas comuns da sua sntese e regulao. As seguintes possibilidades existem para a sntese das diferentes pores das molculas de biossurfactantes e seu acoplamento: (a) as pores hidrofbica e hidroflica so sintetizadas de forma independente; (b) a poro hidroflica sintetizada enquanto a sntese da poro hidrofbica induzida pelo substrato; (c) a poro hidrofbica sintetizada, enquanto a sntese da poro hidroflica dependente do substrato; e (d) a sntese de ambas as pores hidrofbica e hidroflica dependente do substrato. O cultivo submerso com bactrias predominante para a produo de biossurfactante. Porm, bactrias e leveduras podem crescer em substratos slidos em nveis de 40-70 % de umidade. Os fungos filamentosos tm recebido a maioria das atenes nas pesquisas utilizando processos fermentativos em estado slido, pois podem crescer na ausncia de gua livre (RAGHAVARAO et al., 2003; SCHMIDELL et al., 2001). CROSMAN et al. (2002) estudaram a produo de biossurfactante por Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511 utilizando hexadecano como fonte de carbono. O biossurfactante do tipo fosfolipdio produzido foi capaz de reduzir a tenso superficial para valores abaixo de 32 mN.m-1. Bacillus subtilis MTCC 2423 e Bacillus subtilis MTCC 1427 foram cultivados usando melao como fonte de carbono e incubados em condies termoflicas (45C). A produo de biossurfactante foi evidenciada pela diminuio da tenso superficial e foi alcanada por ambas as bactrias no final da fase estacionria. Como resultado do

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acmulo de biossurfactante, a tenso superficial do meio foi diminuda para 29 e 31 mN.m-1 por Bacillus subtilis MTCC 2423 e Bacillus subtilis MTCC 1427, respectivamente (MAKKAR & CAMEOTRA, 1998). Substratos de batata foram avaliados como fonte de carbono para a produo de surfactante por Bacillus subtilis ATCC 21332. Quatro meios de cultivo foram utilizados: meio de batata filtrado adicionado de soluo nutriente, meio de batata filtrado sem adio de soluo nutriente, meio de batata no filtrado sem adio de soluo nutriente e soluo nutriente somente. Tenses superficiais diminuram de 71,3 mN.m-1 para 28,3 mN.m-1 e 27,5 mN.m-1 quando foram usados o meio de batata no filtrado sem adio de soluo nutriente e o meio contendo somente soluo nutriente, respectivamente. Concentrao micelar crtica de 0,10 g.L-1 foi obtida de um extrato do meio de batata no filtrado (FOX & BALA, 2000). Poucos relatos foram encontrados empregando o cultivo em estado slido. MARTINS (2005) produziu biossurfactante de alta capacidade emulsificante atravs de fermentao em estado slido de farelo de arroz, utilizando os fungos Aspergillus fumigatus e Phialomonium sp. OHNO et al. (1995) estudaram o efeito da temperatura na produo de surfactina por Bacillus subtilis cultivado em meio slido a base de soja, encontrando como timo a temperatura de 37 C. 4.2.4 Estimativa da atividade biossurfactante Muitas espcies de microrganismos tm sido descritas como produtoras de agentes de superfcie ativa. A atividade superficial observada com uma substancial reduo da tenso superficial do meio de cultura, uma emulsificao do meio ou fenmenos relacionados, sendo que muitos tipos de biossurfactantes tm sido isolados e caracterizados (LAFRANCE & LAPOINTE, 1998). Por causa da presena de grupos hidroflicos e hidrofbicos na mesma molcula, surfactantes tendem a permanecer preferencialmente em interfaces entre fases fluidas, como leo/gua e ar/gua. A formao de um filme molecular ordenado na interface diminui a tenso interfacial e a tenso superficial, e responsvel pelas propriedades das molculas de surfactante (CAMEOTRA & MAKKAR, 1998). De acordo com BATISTA et al. (2006) as propriedades de superfcie ativa mais importantes avaliadas na procura por microrganismos produtores de biossurfactantes com potencial de aplicao industrial so a reduo da tenso superficial e a formao de emulso e capacidade de estabilizao. O critrio utilizado para selecionar

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produtores de biossurfactantes a habilidade de reduzir a tenso superficial abaixo de 40 mN.m-1, enquanto um critrio citado para a capacidade de estabilizao da emulso a habilidade de manter pelo menos 50% do volume da emulso original 24 h depois da formao. Segundo MULLIGAN (2005) um bom surfactante pode diminuir a tenso superficial da gua de 72 para 35 mN.m-1 e a tenso interfacial (tenso entre lquidos no polares e polares) da gua contra n-hexadecano de 40 para 1 mN.m-1. A capacidade dos biossurfactantes de formar emulses geralmente determinada pelo ndice de emulsificao. Para tal, so misturados meio fermentado e uma fase hidrfoba, seguindo-se agitao a alta velocidade e determinando a relao entre a altura da emulso central formada e a altura total aps 24 h de repouso. A relao entre as alturas multiplicada por 100, obtendo-se o ndice emulsificante em porcentagem (COSTA et al., 2006; PRUTHI & CAMEOTRA, 2003; COOPER & GOLDENBERG, 1987). Porm, convm levar em considerao dois tipos de emulses formadas: a gua em leo, que considera a emulso central, como na obteno do ndice emulsificante (BRODERICK & COONEY, 1982); e a leo em gua, na parte inferior, abaixo da emulso central, evidenciada pela mudana da absorbncia anteriormente a aps a agitao da mistura meio fermentado/fase hidrfoba (JOHNSON et al., 1992). A concentrao micelar crtica (CMC) de um biossurfactante critrio de avaliao de sua eficincia, sendo definida pela solubilidade de um surfactante em uma fase aquosa. A CMC obtida pela dissoluo de quantidades conhecidas do surfactante em gua, medindo a tenso superficial e/ou interfacial e plotando os valores de tenso em funo da concentrao de surfactante (FOX & BALA, 2000; DESAI & BANAT, 1997). Quanto menor a CMC, mais eficiente o biossurfactante produzido (BOGNOLO, 1999). O balano hidroflico lipoflico (BHL) um parmetro que descreve a contribuio relativa da poro hidroflica para a massa molecular da molcula de surfactante. Surfactantes com um BHL de 3 a 6 so lipoflicos e podem ser usados para formar emulses gua em leo, enquanto surfactantes com BHL variando de 10 a 18 so mais hidroflicos, e podem ser usados para formar emulses leo em gua. Os surfactantes que so mais efetivos para a limpeza de solos contaminados com leo usualmente tm BHL maior que 10 (VOLKERING et al., 1998).

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4.2.5 Fatores que afetam a produo de biossurfactante Estudos tm indicado que o meio e as condies de crescimento podem influenciar o tipo e o rendimento dos biossurfactantes produzidos. O crescimento celular e o acmulo de produtos metablicos so fortemente influenciados pelos constituintes do meio como a fonte de carbono, de nitrognio e de outros nutrientes. Fatores ambientais e condies de crescimento como o pH, temperatura, agitao e disponibilidade de oxignio tambm afetam a produo de biossurfactante (RODRIGUES et al., 2006b; DESAI & BANAT, 1997). A seguir, apresentam-se os principais fatores que influenciam a produo de biossurfactantes. 4.2.5.1 Fonte de carbono A fonte de carbono influencia a sntese do biossurfactante por induo ou represso. Em alguns casos a adio de substratos imiscveis ou miscveis em gua resulta na induo da produo de biossurfactante, porm, em outros, resulta em represso. As fontes de carbono utilizadas para a produo de biossurfactante podem ser divididas em trs categorias: carboidratos, hidrocarbonetos e leos vegetais (CAMEOTRA & MAKKAR, 1998; KIM et al., 1997). KIM et al. (2002) estudaram diferentes fontes de carbono para a produo de lipdio de manoseleritritol (MEL) por Candida sp. SY16. Glicose e n-hexadecano no estimularam a produo de biossurfactante. Porm, quando utilizou-se leo de soja como fonte de carbono, a tenso superficial do meio de cultura reduziu de 72 para 30 mN.m-1. leos de buriti (Mauritia flexuosa), cupuau (Theobroma grandiflora), maracuj (Passiflora alata), andiroba (Carapa guianensis), castanha do Par (Betholletia excelsa) e babassu (Orbinya sp.) foram avaliados como fonte de carbono para a produo
1

de

ramnolipdios

de

Pseudomonas

aeruginosa

LBI.

As

maiores

concentraes de ramnolipdios foram obtidas dos leos de castanha do Par (9,9 g.L) e do leo de maracuj (9,2 g.L-1). A tenso superficial variou de 29,8 a 31,5 mN.m-1, a CMC de 55 a 163 mg.L-1 e a atividade emulsificante foi maior contra tolueno (93-100 %) do que contra querosene (70-92 %) (COSTA et al., 2006). CASTIGLIONI (2006) cultivou o fungo Aspergillus fumigatus em meio slido para a produo de biossurfactante, sem e com fonte adicional de carbono (leo

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diesel). Os melhores resultados para atividade emulsificante foram encontrados nos cultivos na ausncia de fonte adicional de carbono. KIM et al. (1997) avaliaram a produo de biossurfactante por Bacillus subtilis C9 utilizando como fonte de carbono carboidrato (glicose), hidrocarboneto (hexadecano) e leo vegetal (leo de soja). Alto rendimento de biossurfactante foi obtido da cultura de Bacillus subtilis C9 usando glicose na concentrao de 40 g.L-1 como substrato. A tenso superficial foi reduzida de 72,8 para 28,2 mN.m-1 e foi possvel obter alta capacidade emulsificante. No meio contendo leo de soja, Bacillus subtilis C9 emulsificou hidrocarbonetos, mas reduziu pouco a tenso superficial (45,3 mN.m-1) quando comparada com o meio contendo glicose como fonte de carbono. No cultivo contendo hexadecano como fonte de carbono, houve inibio da produo de biossurfactante, pois a tenso superficial obtida foi alta (50,9 mN.m-1) e a atividade emulsificante foi baixa. MAKKAR & CAMEOTRA (1998) estudaram a produo de biossurfactante de Bacillus subtilis MTCC 1427 utilizando como fonte de carbono carboidratos (glicose, amido, sacarose, piruvato de sdio, acetato de sdio) e hidrocarbonetos (dodecano, hexadecano e pristano), na concentrao de 2% (v/v). As maiores redues na tenso superficial ocorreram quando as fontes de carbono foram glicose, sacarose, amido e piruvato de sdio. A bactria no foi capaz de crescer e produzir surfactante quando as fontes de carbono foram acetato de sdio e hidrocarbonetos. COSTA (2004) verificou a produo de biossurfactante pelo fungo filamentoso Aspergilllus fumigatus por fermentao em estado slido. Farelo de arroz desengordurado foi usado como fonte bsica de nutrientes, sendo enriquecido com fontes de carbono fsseis (ciclohexano, n-hexano e leo diesel) e no fsseis (glicerina e leo de soja). Melhores valores de atividade emulsificante foram encontrados quando foram utilizadas fontes de carbono fsseis nos cultivos. THAVASI et al. (2007) produziram e caracterizaram biossurfactante utilizando como microrganismo a bactria Corynebacterium kutscheri e como fonte de carbono leo lubrificante de motor ou leo de amendoim. A mxima concentrao de biossurfactante obtida foi de 6,4 mg.mL-1, utilizando leo de amendoim como fonte de carbono. O biossurfactante produzido foi caracterizado como glicolipopeptdio, e capaz de emulsificar leo lubrificante de motor, leo de amendoim, querosene, diesel, xileno, naftaleno e antraceno. A atividade emulsificante foi maior do que a encontrada quando utilizou-se Triton-X, um surfactante sinttico.

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4.2.5.2 Fonte de nitrognio Outros constituintes do meio, alm da fonte de carbono, tambm afetam a produo de biossurfactantes. H evidncias de que o nitrognio possui papel importante na produo de compostos de superfcie ativa por microrganismos (CAMEOTRA & MAKKAR, 1998). A produo de biossurfactante pode ocorrer ou ser estimulada pelo crescimento de clulas microbianas sob condies limite de crescimento. Pseudomonas aeruginosa apresentou maior produo de ramnolipdios quando a cultura alcanou a fase estacionria de crescimento devido a limitao de fonte de nitrognio (DESAI & DESAI, 1993, citados por RODRIGUES et al., 2006a). GUERRA-SANTOS et al. (1984), citados por DESAI & BANAT (1997), encontraram mxima produo de ramnolipdios depois da limitao de nitrognio, quando a razo de C:N passou de 16:1 para 18:1. Abaixo da razo C:N de 11:1 no houve produo de biossurfactante, pois a cultura no estava em condies limite de nitrognio. TURKOVSKAYA et al. (2001) avaliaram a produo de biossurfactante por Pseudomonas aeruginosa 50.3 utilizando as seguintes fontes de nitrognio na concentrao de 1g.L-1: KNO3, NH4Cl, NH4H2PO4 e NH4NO3. O glicerol foi utilizado como nica fonte de carbono. A mxima atividade emulsificante foi encontrada para os meios contendo KNO3, NH4Cl e NH4NO3. A mnima tenso superficial (25 mN.m-1) e a mxima biomassa celular foram observadas quando a fonte de nitrognio foi NH4Cl. 4.2.5.3 Fonte de outros nutrientes Os efeitos de alguns sais inorgnicos na produo de biossurfactante e crescimento celular de Bacillus subtilis C9 foram investigados. A adio de MnSO4 resultou em significante aumento da produo de biossurfactante e crescimento celular, enquanto CaCl2 e NaCl no apresentaram efeito algum. A maior concentrao de biossurfactante foi encontrada para a concentrao de 50 mg.L-1 de MnSO4.4H2O. A fonte de fosfato, suprida por K2HPO4 e NaH2PO4 na proporo em peso de 7:1, teve efeito diferente na produo de biossurfactante comparado com o crescimento celular. A mxima concentrao celular foi obtida quando 9 g.L-1 de fosfatos foram utilizados, enquanto que a maior concentrao de biossurfactante ocorreu quando utilizou-se 12 g.L-1 de fosfatos (KIM et al., 1997).

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A produo de surfactina por Bacillus subtilis foi estimulada pela adio de sais de ferro e mangans ao meio (COOPER et al., 1991, citados por CAMEOTRA & MAKKAR, 1998). Para o crescimento e produo de biossurfactante por Pseudomonas aeruginosa 50.3 houve a necessidade de ons de magnsio. Na sua ausncia, o crescimento foi baixo e no foi produzido biossurfactante. A concentrao tima de magnsio foi de 0,005-0,02 mg.L-1 (TURKOVSKAYA et al., 2001). 4.2.5.4 Fatores ambientais Fatores ambientais e condies de crescimento como a temperatura, agitao e disponibilidade de oxignio tambm afetam a produo de biossurfactante atravs do seu efeito no crescimento ou atividade celular (DESAI & BANAT, 1997). CHANIN et al. (2005) avaliaram o efeito da temperatura, pH e umidade do meio na produo de biossurfactante pelo fungo Phialomonium sp. em meio slido. As temperaturas de estudo foram 25, 30 e 35C. Os pHs utilizados foram 4,0, 4,5 e 5,0 e as umidades do meio 40, 50 e 60%. Melhores resultados foram encontrados na temperatura de 35C, pH 5,0 e umidade 60%. Durante estudo da produo de biossurfactante por Pseudomonas aeruginosa 50.3 em diferentes temperaturas, pH e agitao, TURKOVSKAYA et al. (2001) observaram que na ausncia de agitao, pouco biossurfactante foi sintetizado a temperatura ambiente, pois a tenso superficial do meio livre de clulas foi de 66,9 mN.m-1, no apresentando atividade emulsificante. Mantendo o meio sem agitao e aumentando a temperatura para 30C, a tenso superficial reduziu consideravelmente (37,4 mN.m-1), porm a atividade emulsificante foi baixa (10%). Entretanto, quando utilizou-se agitao em shaker a 160 rpm e temperaturas de 20 e 30C, o crescimento celular e rendimento do surfactante foram superiores, com reduo da tenso superficial para 25 mN.m-1, e atividade emulsificante de 60%. O timo pH para o crescimento do microrganismo e biossntese de surfactante foi de 7,0-8,0.

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4.2.6 Substratos renovveis e de baixo custo para a produo de biossurfactante Apesar de apresentarem diversas vantagens em relao aos surfactantes qumicos, o uso de biossurfactantes tem sido limitado devido ao alto custo de produo. Entretanto, biossurfactantes podem ser produzidos com alto rendimento por alguns microrganismos utilizando meios renovveis como fonte potencial de carbono, especialmente resduos agroindustriais (MANEERAT, 2005; NITSCHKE & PASTORE, 2002). Um alto custo de produo pode ser tolerado para biossurfactantes utilizados em pequeno volume em produtos cosmticos e farmacuticos. Porm, em aplicaes como a recuperao melhorada de leo, a qual requer altos volumes de surfactantes, os altos custos so incompatveis com o uso (MAKKAR & CAMEOTRA, 2002) KOSARIC et al. (1984) sugeriram quatro fatores que devem ser focados para a reduo dos custos de produo de biossurfactantes: os microrganismos (selecionados, adaptados ou modificados geneticamente para altos rendimentos de produtos); o processo (adaptado para baixos custos de operao); o substrato para crescimento microbiano (adaptado para baixo custo); e os bioprodutos do processo (obteno de altos rendimentos). A seleo de substratos adequados para a produo de biossurfactantes concentra maior nmero de pesquisas em produtos e resduos agroindustriais provenientes de regies tropicais. Isto inclui colheitas como mandioca, beterraba, soja, batata doce, batata, resduos como farelo e palha de trigo e arroz, casca de soja, milho e arroz, bagao de cana de acar; resduos de indstrias processadoras de caf, como polpa de caf, casca de caf, solos onde foram plantados cafeeiros; resduos de indstrias processadoras de frutas, como bagao de maa e uva, resduos do processamento de abacaxi e cenoura, casca de banana; resduos de moinhos processadores de leo, como torta de coco, torta de soja, torta de amendoim; e outros como serragem, sabugo de milho e razes de chicria (PANDEY et al., 2000). Outros substratos renovveis passveis de utilizao so os leos vegetais, resduos de destilarias e indstrias de laticnios (MAKKAR & CAMEOTRA, 2002). Se resduos industriais orgnicos so utilizados como substratos para a produo de biossurfactante, um benefcio duplo obtido: os resduos so tratados e um produto de elevado valor agregado obtido. Essa abordagem reduz o custo para o tratamento do resduo com o potencial de gerar lucro atravs da comercializao do biossurfactante (KOSARIC, 1992).

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Os biossurfactantes somente podem substituir os surfactantes sintticos se os custos da matria-prima e do processo so mnimos (MANEERAT, 2005). O rendimento de produo outro fator importante a ser considerado. Desenvolvimentos recentes na rea de otimizao das condies de fermentao tm resultado em significante aumento nos rendimentos de produo, fazendo os biossurfactantes mais atrativos comercialmente (DESAI & BANAT, 1997). Os custos no favorveis de produo de biossurfactantes podem ser revertidos se processos fermentativos forem desenvolvidos para promover altos rendimentos, utilizando-se meios de cultivo renovveis, principalmente resduos agroindstrias como fonte potencial de carbono. O trigo ocupa o primeiro lugar em volume dos cereais produzidos no mundo. No Brasil, cerca de 90% da produo ocorre no sul do pas (http://www.cnpt.embrapa.br). Na obteno da farinha de trigo, 28% do gro no aproveitado, originando o farelo de trigo (SOARES et al., 2004). Sendo assim, a utilizao deste resduo agroindustrial para a produo de biossurfactante torna-se uma alternativa atrativa. A Tabela 2 apresenta a composio centesimal em base seca do farelo de trigo. TABELA 2 Composio centesimal do farelo de trigo. Constituintes Lipdios Protenas Fibras Carboidratos digerveis Cinzas
Fonte: RAUPP et al. (2000).

Composio centesimal (%) 3,43 19,79 43,69 27,92 6,33

4.2.7 Parmetros cinticos para avaliao da produo de biossurfactantes Os parmetros cinticos para avaliao da produo de biossurfactantes so classificados conforme a seguir (RODRIGUES et al., 2006b; DESAI & BANAT, 1997): - Produo com crescimento associado: existem relaes entre o crescimento, a utilizao de substrato e a produo de biossurfactante (Figura 4a); - Produo em condies limitantes de crescimento: caracterizada por um ntido aumento na produo de biossurfactante como resultado da limitao de um ou mais componentes do meio (Figura 4b);

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- Produo associada com precursor de aumentao: alguns pesquisadores tm reportado que a adio de precursores ao meio de crescimento ocasiona mudanas qualitativas e quantitativas no produto. Por exemplo, a adio de compostos lipoflicos ao meio de cultura de Torulopsis bombicola resultou no aumento da produo de biossurfactante.

FIGURA 4 Ilustrao esquemtica mostrando diferentes tipos de cinticas de fermentao para a produo de biossurfactante. (a) Produo com crescimento associado e (b) produo em condies limitantes de crescimento. Fonte: DESAI & BANAT (1997). 4.2.8 Aplicaes dos biossurfactantes O potencial de aplicao dos biossurfactantes baseado em suas propriedades funcionais, que incluem: emulsificao, detergncia, capacidade espumante, solubilizao e disperso de fases (LIMA, 1996). Os biossurfactantes vm sendo testados em aplicaes ambientais como a biorremediao, disperso de efluentes oleosos, otimizao de recuperao de leos e transferncia de leo cru, e so potenciais candidatos a substituir surfactantes qumicos no futuro, especialmente em indstrias de alimentos, cosmtica e farmacutica, produtos de limpeza industriais e em produtos qumicos agroindustriais (MAKKAR & CAMEOTRA, 2002). 4.2.8.1 Usos relacionados a indstria petrolfera O principal uso dos biossurfactantes relaciona-se indstria petrolfera, devido ao aumento da solubilidade dos componentes do petrleo (LIMA, 1996).

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Resduos e fraes de leos pesados que sedimentam no fundo de tanques de estocagem so altamente viscosos e podem se tornar depsitos slidos que no so removidos atravs de bombeamento convencional. A remoo requer lavagem com solventes ou limpeza manual, ambas perigosas, demoradas e caras. Um processo alternativo de limpeza o uso de biossurfactantes, pois estes promovem a diminuio na viscosidade e a formao de emulses leo-gua, facilitando o bombeamento dos resduos e a recuperao do leo cru aps a quebra da emulso (BOGNOLO, 1999). Uma rea de potencial considervel para a aplicao de biossurfactantes o campo da recuperao melhorada de leo por microrganismos (Microbial Enhanced Oil Recovery - MEOR). Mtodos de recuperao melhorada de leo so criados para recuperar leo remanescente em reservatrios depois de procedimentos de recuperao primria e secundria. A MEOR uma importante tecnologia de recuperao terciria, que utiliza microrganismos e/ou seus metablitos para recuperao de leo residual. Na MEOR, microrganismos nos reservatrios so estimulados a produzir surfactantes, os quais auxiliam na reduo da tenso interfacial leo-reservatrio (BANAT et al., 2000). 4.2.8.2 Biorremediao Os principias mecanismos naturais de remoo de hidrocarbonetos de ambientes contaminados so a fotoxidao, evaporao e degradao microbiana, os quais podem levar anos para estabilizar o local contaminado (BOGNOLO, 1999). Alm disso, os mtodos fsicos comumente utilizados, como a remoo mecnica e extrao com solventes, geralmente no recuperam mais do que 10-15% do leo derramado. Logo, a biorremediao uma tecnologia emergente promissora para o tratamento de solos e guas contaminados com hidrocarbonetos (ZHU et al., 2004). Aps o acidente com o petroleiro Exxon Valdez em 1989, em que o leo derramado no mar atingiu 15% da costa do Alasca (Figura 5), os processos de degradao biolgica, chamados de biorremediao, receberam maior ateno. Tais processos surgiram a partir de estudos de decomposio de pesticidas em solos e, mais tarde, foram propostos como promissores para a recuperao de reas atingidas por derrames de leos (CRAPEZ et al., 2002). A biorremediao uma tecnologia que utiliza o metabolismo de microrganismos para eliminao mais rpida de poluentes presentes no meio ambiente ou sua reduo a nveis aceitveis (HUY et al., 1999). Os biossurfactantes

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vm sendo testados na biorremediao como uma alternativa eficiente no tratamento de regies contaminadas pela presena de petrleo e seus derivados (MARTINS et al., 2003), j que aumentam a rea interfacial leo/gua, acelerando a degradao de leos por microrganismos e melhorando a biorremediao de gua e solo (ROSENBERG & RON, 1999).

FIGURA

Derrame

de

leo

pelo

navio

Exxon

Valdez.

Fontes:

http://www.foilex.com/bilder/tcdae/exxonvaldez.gif;http://www.explorenorth.com/library/ maps/images/exxonvaldezmap-adn.gif A biorremediao envolve a acelerao de processos biodegradativos naturais em ambientes contaminados pela melhoria da disponibilidade de materiais (ex: nutrientes e oxignio), condies (ex: pH e umidade), e a predominncia de microrganismos. Desta maneira, a biorremediao usualmente consiste na aplicao de fertilizantes como nitrognio e fsforo, ajustando o pH e contedo de gua, se necessrio, fornecendo ar e freqentemente adicionando microrganismos. A adio de emulsificantes vantajosa quando o crescimento bacteriano lento (ex: a temperaturas baixas ou na presena de altas concentraes de poluentes) ou quando os poluentes consistem em compostos que so de difcil degradao, como os hidrocarbonetos aromticos policclicos (PAHs) (RON & ROSENBERG, 2002). A biodegradao de hidrocarbonetos pode ser representada por uma reao qumica onde os contaminantes, em presena de um aceptor de eltrons, nutrientes e microrganismos so transformados em gua e dixido de carbono. Os aceptores de eltrons, compostos que recebem eltrons e so, portanto, reduzidos, so principalmente o oxignio, nitrato, ferro frrico e sulfato (CORSEUIL & ALVAREZ, 1996, citados por FASANELLA, 2005).

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Os mecanismos pelos quais os biossurfactantes aumentam a remoo do leo de ambientes contaminados tm sido propostos por ocorrer em dois estgios: mobilizao e solubilizao (URUM & PEKDEMIR, 2004; VOLKERING et al., 1998). O mecanismo de mobilizao ocorre em concentrao abaixo da concentrao micelar crtica do surfactante. Fenmenos associados com esse mecanismo incluem a reduo das tenses superficial e interfacial e reduo do ngulo de contato. A concentraes abaixo da micelar crtica, os surfactantes reduzem as tenses superficial e interfacial entre ar/gua e leo/gua, respectivamente (Figura 6). Acima da concentrao micelar crtica dos surfactantes, a solubilidade do leo aumenta drasticamente devido a agregao das micelas de surfactantes. A poro hidrofbica das molculas de surfactante agrupam-se no interior da estrutura da micela com a poro hidroflica exposta a fase aquosa, no exterior. Conseqentemente, o interior da micela constitui um ambiente compatvel para molculas hidrofbicas orgnicas; o processo de incorporao dessas molculas na micela conhecido como solubilizao, e est representado na Figura 7.

FIGURA 6 Representao da reduo da tenso interfacial leo/gua pela presena de surfactante. Fonte: http://pcserver.iqm.unicamp.br

FIGURA 7 Representao da solubilizao de molculas hidrofbicas orgnicas. Fonte: IPIECA (2001).

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4.2.8.3 Indstria de alimentos Na indstria alimentcia, os biossurfactantes so empregados como

emulsificantes no processamento de matrias-primas. Compostos de superfcie ativa so utilizados em produtos de panificao e crneos, onde influenciam as caractersticas reolgicas da farinha ou emulsificam a gordura presente. Um bioemulsificante obtido da Candida utilis tem sido utilizado em molhos de saladas (MAKKAR & CAMEOTRA, 2002). 4.2.8.4 Remoo de metais A remoo de metais, que geralmente inclui a ao de cidos, lcalis, complexantes, solventes solveis em gua, pode ser realizada pela ao de biossurfactantes. Surfactina, ramnolipdios e soforolipdios foram capazes de remover cobre e zinco de um solo contaminado com hidrocarbonetos. Isto ocorre devido ao carter aninico desses surfactantes. A surfactina apresentou uma remoo de 70% de cobre e 50% de hidrocarbonetos, comparados com valores de 20 a 30% de remoo de cobre e hidrocarbonetos por um surfactante qumico (MULLIGAN et al., 1999). 4.2.8.5 Agentes teraputicos Falha na respirao em crianas pr-maturas causada pela deficincia de surfactante pumonar, um complexo fosfolipdio-protena (TAYLER et al., 1985, citados por MAKKAR & CAMEOTRA, 2002). O isolamento do gene da molcula de protena do surfactante e clonagem em bactria tornou possvel a produo para aplicao mdica (LANG et al., 1989, citados por MAKKAR & CAMEOTRA, 2002). Vrios ramnolipdios podem exibir efeitos antibacterianos e antivirais. Lipopeptdios podem atuar como antibiticos, antivirais e agentes antitumorais (CAMEOTRA & MAKKAR, 2004). A surfactina, um dos mais conhecidos biossurfactantes, possui vrias aplicaes farmacuticas como a inibio na formao de cogulos, atividade antifngica e antitumoral (BANAT et al., 2000).

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4.2.8.6 Usos na agricultura Os biossurfactantes so usados na agricultura especialmente em formulaes de herbicidas e pesticidas. Os compostos ativos destas formulaes so geralmente hidrofbicos, sendo necessrios agentes emulsificantes para dispers-los em solues aquosas. Um exemplo o uso do biossurfactante produzido por Bacillus para emulsificar pesticidas organofosforados imiscveis (PATEL & GOPINATHAN, 1986, citados por ROSENBERG & RON, 1999). 4.2.8.7 Indstria de materiais de higiene e cosmticos Os biossurfactantes so bastante atrativos nas indstrias de materiais de higiene e cosmticos. Um produto contendo 1 mol de soforolipdios e 12 moles de propileno glicol apresentou excelente compatibilidade com a pele, sendo utilizado como hidratante (DESAI & BANAT, 1997).

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5 DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO Para apresentao e compreenso dos resultados obtidos, o trabalho foi dividido em trs artigos: ARTIGO 1: Seleo de bactrias e avaliao cintica da produo de

biossurfactantes; ARTIGO 2: Biossurfactantes bacteriano e fngico: produo atravs de cultivo em estado slido utilizando resduos agroindustriais; ARTIGO 3: Produo de biossurfactantes bacteriano e fngico por cultivo submerso de farelo de trigo.

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5.1 SELEO DE BACTRIAS E AVALIAO CINTICA DA PRODUO DE BIOSSURFACTANTES

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SELEO DE BACTRIAS E AVALIAO CINTICA DA PRODUO DE BIOSSURFACTANTES Marta Heidtmann Pinto, Jorge Alberto Vieira Costa Laboratrio de Engenharia Bioqumica, Departamento de Qumica, Fundao Universidade Federal do Rio Grande (FURG), Caixa Postal 474, CEP 96201-900, Rio Grande, RS, Brasil, Telefone: +55(53)32328653, e-mail: dqmjorge@furg.br RESUMO Os compostos de origem microbiana que exibem atividade superficial e capacidade emulsificante so denominados biossurfactantes. Apresentam vantagens com relao aos surfactantes sintticos, como a biodegradabilidade e baixa toxicidade, podendo ser aplicados na indstria de alimentos, em produtos farmacuticos, cosmticos e na recuperao de petrleo. O objetivo do presente trabalho foi selecionar bactrias para produo de biossurfactante, avaliando a tenso superficial e a atividade emulsificante e estudando a cintica dos processos fermentativos. Foram utilizadas 4 culturas de bactrias: 1) cultura pura de Corynebacterium aquaticum, 2) cultura mista contendo Corynebacterium aquaticum e Bacillus sp., 3) cultura mista contendo Corynebacterium sp., Bacillus cereus e Bacillus mycoides e 4) cultura pura de Bacillus subtilis. A cultura pura de Corynebacterium aquaticum foi a que apresentou menor tenso superficial (28,8 mN.m-1) e maiores concentrao celular (1,98 g.L-1), velocidade instantnea de crescimento celular (0,042 g.L-1.h-1), produtividade com relao a reduo da tenso superficial (2,01 mN.m-1.h-1), produtividade com relao a atividade emulsificante leo em gua (2,65 UE.h-1) e produtividade com relao a atividade emulsificante gua em leo (0,40 UE.h-1). As maiores atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo no diferiram (p<0,05) para todas as culturas utilizadas. Os resultados mostraram o potencial da bactria Corynebacterium aquaticum na produo de biossurfactante, tanto pela reduo da tenso superficial e aumento da atividade emulsificante quanto pelos parmetros cinticos avaliados. Palavras-chave: atividade emulsificante, bioprocesso, tenso superficial.

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ABSTRACT Microbial origin compounds that exhibit surface activity and emulsifying capacity are named biosurfactants. They present advantages in relation to the synthetic surfactants, as the biodegradability and low toxicity, and can be applied in the food industry, in pharmaceutical products, cosmetics and in the petroleum recovery. This paper aimed at selecting bacteria for biosurfactant production, evaluating the surface tension and the emulsifying activity and studying the fermentation process kinetics. It was used 4 bacterial strains: 1) pure culture of Corynebacterium aquaticum, 2) mixed culture containing Corynebacterium aquaticum and Bacillus sp., 3) mixed culture containing Corynebacterium sp., Bacillus cereus and Bacillus mycoides and 4) pure culture of Bacillus subtilis. The pure culture of Corynebacterium aquaticum presented the smallest surface tension (28.8 mN.m-1) and highest cellular concentration (1.98 g.L-1), instantaneous growth rate (0.042 g.L-1.h-1), productivity with relation to the reduction of the surface tension (2.01 mN.m-1.h-1), productivity with relation to the emulsifying activity oil in water (2.65 UE.h-1) and productivity with relation to the emulsifying activity water in oil (0.40 UE.h-1). The highest emulsifying activities oil in water and water in oil didn't differ (p<0.05) for all the cultures used. The results showed the potential of the bacteria Corynebacterium aquaticum in the biosurfactant production, so much for the surface tension reduction and the emulsifying activity increase as for the kinetics parameters evaluation. Keywords: emulsifying activity, bioprocess, surface tension.

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1 INTRODUO Na nova era da industrializao global, em que vrias indstrias esto sendo direcionadas para tecnologias emergentes, a biotecnologia apresenta vrias oportunidades de pesquisa. Os surfactantes constituem uma importante classe de produtos qumicos muito utilizados na indstria moderna. Na dcada de 90, a produo mundial de surfactantes excedeu 3 milhes de toneladas por ano (valor estimado de US$ 4 bilhes), e esperava-se que aumentasse para mais de 4 milhes de toneladas no final do sculo (BANAT et al., 2000), o que evidencia o quo promissor torna-se esse mercado. A maioria dos surfactantes em uso so derivados quimicamente do petrleo. Entretanto, o interesse por surfactantes microbiolgicos tem aumentado nos ltimos anos devido a sua diversidade, caractersticas ambientais favorveis, possibilidade de produo atravs de fermentao e potencial aplicao em diversas reas do setor industrial (KIM et al., 2000). Os compostos de origem microbiana que exibem propriedades surfactantes, isto , diminuem a tenso superficial e possuem alta capacidade emulsificante, so denominados biossurfactantes, e consistem em produtos metablicos de microrganismos (CAMEOTRA & MAKKAR, 1998). So produzidos principalmente por bactrias isoladas do solo, da gua do mar, de sedimentos marinhos e de reas contaminadas por leos, embora possam ser produzidos por fungos e leveduras (BARROS et al., 2007; COSTA et al., 2006). As molculas de biossurfactantes apresentam uma poro hidrofbica e uma poro hidroflica. A poro apolar geralmente consiste de cadeias hidrocarbnicas com um ou mais cidos graxos, que podem ser saturados, insaturados, hidroxilados ou ramificados. J a poro polar pode ser um ster, hidrxido, fosfato, grupos carboxlicos, carboidratos, aminocidos ou peptdios (BOGNOLO, 1999; DESAI & BANAT, 1997). Os surfactantes de origem microbiana so diferenciados por sua natureza bioqumica e pela espcie microbiana produtora. As principais classes incluem glicolipdios, lipopeptdeos e lipoprotenas, fosfolipdios, cidos graxos e surfactantes polimricos. Devido a presena de grupos polares e apolares na mesma molcula, tendem a se distribuir na interface entre fases fluidas com diferentes graus de polaridade, como ar/gua e leo/gua, reduzindo as tenses superficial e interfacial,

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respectivamente, e conferindo capacidade de detergncia, emulsificao, solubilizao e disperso de fases (DESAI & BANAT, 1997). Os biossurfactantes vm sendo testados em aplicaes ambientais como a biorremediao, disperso de efluentes oleosos, otimizao da recuperao de leos e transferncia de leo cru. So compostos que podem substituir os surfactantes qumicos no futuro, especialmente em indstrias de alimentos, cosmtica e farmacutica, produtos de limpeza industriais, produtos qumicos agroindustriais e em processos de biorremediao, j que so biodegradveis, possuem baixa toxicidade e apresentam estabilidade em valores extremos de pH, temperatura e salinidade (CHEN et al., 2007; MAKKAR & CAMEOTRA, 2002). A produo de bioemulsificantes ou compostos de superfcie ativa geralmente ocorre no meio de cultura ou aderido s paredes celulares (MARCHI et al., 1997). De acordo com BATISTA et al. (2006), as propriedades de superfcie ativa mais importantes avaliadas na procura por microrganismos produtores de biossurfactantes com potencial para aplicao industrial so a reduo da tenso superficial, a formao de emulso e capacidade de estabilizao. Assim como a sntese de uma substncia qumica, orgnica ou inorgnica, envolve o conhecimento das reaes que a compe, da velocidade destas reaes, dos fatores que as influenciam, ou seja, envolve o conhecimento da cintica das reaes envolvidas, a formao de produtos obtidos por fermentao tambm est condicionada ao conhecimento da cintica do processo fermentativo (REGULY, 2000). Nesse contexto, o presente trabalho teve por objetivo selecionar bactrias com potencial para produo de biossurfactante, baseando-se na reduo da tenso superficial e aumento da atividade emulsificante, junto com a avaliao cintica dos processos fermentativos.

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2 MATERIAL E MTODOS 2.1 Microrganismos Foram utilizadas 4 culturas de bactrias cedidas pelo Laboratrio de Microbiologia de Alimentos da Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas (FEA/UNICAMP): 1) cultura pura de Corynebacterium aquaticum, 2) cultura mista contendo Corynebacterium aquaticum e Bacillus sp., 3) cultura mista contendo Corynebacterium sp., Bacillus cereus e Bacillus mycoides e 4) cultura pura de Bacillus subtilis. As culturas foram isoladas de efluentes provenientes da lavagem de caminhes transportadores de combustveis, exceto a ltima. 2.2 Manuteno e propagao dos inculos para a fermentao As culturas foram mantidas sob refrigerao, em tubos de ensaio contendo gar nutriente, formulado conforme a seguir (g.L-1): extrato de carne, 1,0; extrato de levedura, 2,0; peptona, 5,0; NaCl, 5,0; e gar-gar, 15,0. A propagao dos inculos foi realizada em frascos Erlenmeyer contendo gar nutriente, incubados por 48 h a 30C. Aps, foi realizada raspagem da superfcie do gar com meio nutriente, o qual difere do gar nutriente pela ausncia de gar-gar. Ao atingir a densidade tica 0,8-0,9 ( = 600 nm), as suspenses foram utilizadas como inculo, sendo adicionadas ao meio de cultura na concentrao de 2% (v/v) (MAKKAR & CAMEOTRA, 1998). 2.3 Meio de cultura As culturas de bactrias cresceram em meio de cultura contendo glicose (40,0 g.L-1), NH4NO3 (50,0 mM), Na2HPO4 (3,0 mM), KH2PO4 (3,0 mM), CaCl2 (7,0 M), MgSO4.7H2O (0,8 mM), EDTA sdico (4,0 M), e FeSO4.7H2O (2,0 mM) (YEH et al., 2005; WEI et al., 2004). 2.4 Cultivos Os cultivos foram realizados em frascos Erlenmeyer de 1000 mL por 72 h (FOX & BALA, 2000), a 200 rpm (YEH et al., 2005; WEI et al., 2003), 30C (NITSCHKE &

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PASTORE, 2006; ROCHA et al., 2006) e o pH inicial foi fixado em 6,0 (NITSCHKE & PASTORE, 2006). 2.5 Determinaes analticas 2.5.1 Biomassa A concentrao celular foi determinada gravimetricamente aps filtrao do meio de cultura em membrana de acetato celulose com porosidade 0,45 m, seguindo-se secagem em estufa a 80C at peso constante (THAVASI et al., 2007). O sobrenadante obtido foi utilizado para posteriores determinaes analticas, realizadas em triplicata, a cada 12 h do processo fermentativo. 2.5.2 pH O pH foi determinado atravs de leitura direta em pHmetro digital (Quimis HI 8314, Brasil), utilizando eletrodo de vidro. 2.5.3 Estimativa da atividade biossurfactante A estimativa da atividade biossurfactante foi realizada por 2 mtodos diferentes: a medida da tenso superficial e atravs da atividade emulsificante. 2.5.3.1 Tenso superficial A tenso superficial foi determinada em tensimetro (Kruss Processor Tensiometer K-6, Alemanha), no meio fermentado contendo, ou no, as clulas de microrganismo (anteriormente e aps a filtrao realizada no item 2.5.1) (COSTA et al., 2006; RODRIGUES et al., 2006) (ANEXO 9.1). 2.5.3.2 Atividade emulsificante As atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo foram determinadas utilizando-se 3,5 mL de amostra diluda e 2,0 mL de leo de soja. A mistura foi agitada em agitador tipo vrtex (Phoenix AP56, Brasil) a 700 rpm por 1 min.

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Aps 60 min de repouso foi lida a absorbncia do meio emulsificado leo/gua em espectrofotmetro (Femto 700 Plus, Brasil) a 610 nm (JOHNSON et al., 1992), calculando-se a atividade emulsificante leo em gua atravs da Equao 1. Aps 24 h de repouso foi realizada leitura da altura da emulso gua/leo formada e da altura total (altura da emulso mais altura da camada remanescente de leo) (BRODERICK & COONEY, 1982), obtendo-se a atividade emulsificante gua em leo de acordo com a Equao 2.

AE o / a = ( Abs amostra Absbranco ) D AE a / o = (E amostra E branco ) D

Onde: AEo/a = atividade emulsificante leo em gua (UE); AEa/o = atividade emulsificante gua em leo (UE); Absamostra = absorbncia da emulso leo/gua; Absbranco = absorbncia da amostra diluda;

(1)

(2)

Eamostra = relao centesimal entre a altura da emulso gua/leo e a altura total utilizando amostra; Ebranco = relao centesimal entre a altura da emulso gua/leo e a altura total utilizando gua; D = diluio da amostra em gua. A atividade emulsificante leo em gua foi definida como a quantidade de biossurfactante necessria para aumentar a absorbncia em 1,0 a 610 nm, e a atividade emulsificante gua em leo como a quantidade de biossurfactante necessria para manter a emulso estvel por 24 h (MARTINS, 2005). 2.6 Avaliao de parmetros cinticos Os parmetros cinticos velocidade instantnea mxima de crescimento celular (rX) e de formao de produto (rP), velocidade especfica mxima de crescimento celular ( X), tempo de gerao (tg) e a produtividade mxima em produto (PP) durante os cultivos foram determinados atravs das Equaes 3, 4, 5, 6 e 7 (SCHMIDELL et al., 2001).

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rX =

dX dt 1 dX X dt

(3)

X =

(4)

tg =

ln 2

mx
dP dt
P P0 t

(5)

rP =

(6)

PP =

(7)

Onde: rX = velocidade instantnea de crescimento celular (gcl.L-1.h-1); X = velocidade especfica de crescimento celular (h-1); X = concentrao celular (gcl.L-1); tg = tempo de gerao (h); mx = velocidade especfica mxima de crescimento celular (h-1); rP = velocidade instantnea de formao de produto (gprod.L-1.h-1); PP = produtividade em produto (gprod.L-1.h-1); P = concentrao de produto no tempo t (gprod.L-1); P0 = concentrao de produto no incio da fermentao (gprod.L-1); t = tempo de cultivo (h). Como a produo de biossurfactante foi verificada atravs de mtodos indiretos, a concentrao de produto foi expressa em unidade de tenso superficial (mN.m-1) ou de atividade emulsificante (UE).

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2.7 Anlise estatstica Os experimentos com as diferentes culturas de bactrias foram realizados em duplicata. Os resultados obtidos foram tratados por anlise de varincia (ANOVA) das duplicatas dos experimentos, a um nvel de significncia de 5%, atravs do teste de comparao de mdias de Tukey. Foram analisadas diferenas entre os valores das tenses superficiais do meio fermentado na presena e na ausncia das clulas de microrganismo, nos diferentes tempos de amostragem dos cultivos, a fim de verificar se a produo de biossurfactante foi extracelular e aderida parede celular, ou somente extracelular. A bactria com potencial para produzir biossurfactante foi selecionada comparando os menores valores das tenses superficiais e os maiores valores das atividades emulsificantes encontrados em cada experimento, bem como pela avaliao dos parmetros cinticos. 3 RESULTADOS E DISCUSSO Os resultados mdios encontrados para as tenses superficiais do meio fermentado na presena ou ausncia das clulas de microrganismos e para o crescimento celular nos diferentes experimentos so mostrados na Figura 1. A nica cultura que apresentou diferena significativa (p<0,05) entre os valores de tenso superficial no meio com e sem clulas de bactria, em um mesmo tempo de cultivo, foi a cultura pura de Corynebacterium aquaticum, nos tempos 24 e 36 h. Este fato indica provvel produo de biossurfactante aderido parede celular por essa bactria, alm de extracelular. Para as demais culturas, em um mesmo tempo de cultivo, no houve diferena significativa (p>0,05) entre as tenses superficiais, o que indica produo extracelular de biossurfactante. Segundo DESAI & BANAT (1997), os biossurfactantes podem ser liberados extracelularmente no meio de cultura ou aderidos clula do microrganismo. BATISTA et al. (2006) isolaram bactrias de locais contaminados com petrleo e verificaram que 8 dos 17 isolados foram capazes de reduzir a tenso superficial para valores abaixo de 40 mN.m-1; dessas 8, somente 5 foram capazes de reduzir a tenso superficial do sobrenadante livre de clulas, o que indicou que as outras 3 produziram biossurfactante somente aderido ou como parte da parede celular. Para um dos isolados, a tenso superficial do meio na presena de clulas foi 33,4 2,0 mN.m-1 e a

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tenso do sobrenadante livre de clulas foi 42,3 9,93 mN.m-1, valores prximos ao encontrado no presente trabalho para a bactria Corynebacterium aquaticum. A maior concentrao celular foi obtida no cultivo da bactria Corynebacterium aquaticum (1,98 g.L-1), seguida pelos cultivos da cultura mista de Corynebacterium sp., Bacillus cereus e Bacillus mycoides (1,23 g.L-1), cultura pura de Bacillus subtilis (0,96 g.L-1) e cultura mista de Corynebacterium aquaticum e Bacillus sp. (0,48 g.L-1). O pH diminuiu ao longo das fermentaes, indicando a produo de metablitos cidos pelas culturas de bactrias utilizadas (ANEXO 9.3). (a)
Biomassa (g.L -1) 70 TS (mN.m -1) 60 50 40 30 0 12 24 36 48 60 72 Tempo (h) TS (mN.m -1) 2,0 1,6 1,2 0,8 0,4 70 60 50 40 30 0 12 24 36 48 60 72 Tempo (h)

(b)
Biomassa (g.L -1) 2,0 1,6 1,2 0,8 0,4

(c)
Biomassa (g.L -1) 70 TS (mN.m -1) 60 50 40 TS (mN.m -1) 2,0 1,6 1,2 0,8 70 60 50 40 30

(d)
Biomassa (g.L -1) 2,0 1,6 1,2 0,8 0,4 0 12 24 36 48 60 72 Tempo (h)

0,4 30 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 0 12 24 36 48 60 72 Tempo (h)

FIGURA 1 Biomassa de bactrias e tenses superficiais (TS) antes e aps filtrao do meio fermentado. (a) Cultura pura de Corynebacterium aquaticum, (b) cultura mista de Corynebacterium aquaticum e Bacillus sp., (c) cultura mista de Corynebacterium sp., Bacillus cereus e Bacillus mycoides e (d) cultura pura de Bacillus subtilis. Biomassa, tenso superficial do meio de cultura na presena das clulas de microrganismos e tenso superficial do meio de cultura na ausncia das clulas de microrganismos. Alm de reduzir tenses superficiais e interfaciais, os biossurfactantes usualmente exibem capacidade emulsificante (KARANTH et al., 1999). A Figura 2 mostra o comportamento mdio das atividades emulsificantes leo em gua e gua

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em leo ao longo do tempo de fermentao para cada cultura. Maiores atividades emulsificantes, tanto leo em gua quanto gua em leo, foram obtidas em 60 ou 72 h de cultivo. (a)
200 AEo/a (UE) 120 80 40 0 0 12 24 36 48 60 72 AEa/o (UE) 160 30 24 18 12 6 0 0 12 24 36 48 60 72

(b)

Tempo (h)

Tempo (h)

FIGURA 2 Atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo durante os cultivos com diferentes culturas de bactrias. (a) Atividade emulsificante leo em gua (AEo/a) e (b) atividade emulsificante gua em leo (AEa/o). Cultura pura de Corynebacterium aquaticum, cultura mista de Corynebacterium aquaticum e Bacillus sp., cultura mista de Corynebacterium sp., Bacillus cereus e Bacillus mycoides e de Bacillus subtilis. Um dos critrios adotados para selecionar uma entre as quatro culturas utilizadas foi a comparao dos menores valores das tenses superficiais e dos maiores valores de atividades emulsificantes obtidos para as diferentes culturas, o que pode ser observado na Tabela 1. A menor tenso superficial foi encontrada para a bactria Corynebacterium aquaticum (28,8 mN.m-1), no meio de cultura contendo clulas de microrganismo, diferindo significativamente (p<0,05) das tenses encontradas para as demais culturas. Com relao as menores tenses do meio de cultura filtrado, a cultura de Corynebacterium aquaticum diferiu significativamente somente da cultura de Bacillus subtillis (p<0,05). As maiores atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo no diferiram para todas as culturas (p>0,05). cultura pura

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TABELA 1 Valores mnimos das tenses superficiais e valores mximos das atividades emulsificantes durante os cultivos das culturas pura de Corynebacterium aquaticum (Cultura 1), mista de Corynebacterium aquaticum e Bacillus sp. (Cultura 2), mista de Corynebacterium sp., Bacillus cereus e Bacillus mycoides (Cultura 3) e pura de Bacillus subtilis (Cultura 4). Cultura 1 2 3 4 TS pre cl (mN.m ) 28,8 0,3a 48,4 0,4b 54,8 1,1c 58,7 1,9c
-1

TS

aus cl -1

AEo/a (UE) 160,34 11,13a 156,19 13,72a 132,71 10,90a 145,21 0,15a

AEa/o (UE) 24,84 2,47a 20,50 1,90a 17,91 0,54a 23,47 1,69a

(mN.m ) 42,3 2,1a 50,3 2,1ab 53,2 5,8ab 56,7 2,6b

TS pre cl = tenso superficial do meio fermentado na presena das clulas de microrganismos; TS aus cl = tenso superficial do meio fermentado na ausncia das clulas de microrganismos; AEo/a = atividade emulsificante leo em gua; AEa/o = atividade emulsificante gua em leo. Letras iguais correspondem aos valores que no apresentaram diferena significativa (nvel de significncia de 5%) para cada resposta estudada.

Assim, as culturas de bactrias utilizadas foram capazes de produzir biossurfactante, reduzindo a tenso superficial do meio e levando ao aumento da atividade emulsificante. Porm, a cultura pura de Corynebacterium aquaticum destacou-se dentre as estudadas pela tenso superficial do meio fermentado na presena de clulas da bactria. De acordo com BATISTA et al. (2006), o critrio utilizado para selecionar microrganismos produtores de biossurfactante a habilidade em reduzir a tenso superficial abaixo de 40 mN.m-1, enquanto um critrio citado para a capacidade de estabilizao da emulso a habilidade em manter pelo menos 50 % do volume da emulso original 24 h depois da sua formao. Os gneros de bactrias utilizados no presente trabalho (Corynebacterium e Bacillus) tm sido reportados na literatura como produtores de biossurfactante. CROSMAN et al. (2002) estudaram o aumento da produo de biossurfactante por Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511 utilizando hexadecano como substrato. O biossurfactante do tipo fosfolipdio produzido foi capaz de reduzir a tenso superficial para valores abaixo de 32 mN.m-1. Em estudo realizado por COOPER & GOLDENBERG (1987), duas espcies de bactrias do gnero Bacillus foram testadas para a produo de biossurfactante. A bactria Bacillus cereus foi capaz de reduzir a tenso superficial do meio para 28 mN.m-1 e apresentar ndice emulsificante em torno de 60%, tanto no meio na presena quanto na ausncia das clulas do microrganismo, o que indicou produo extracelular de biossurfactante. J a bactria Bacillus sp. IAF

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343 no ocasionou aprecivel reduo da tenso superficial, porm o ndice emulsificante ficou em torno de 60%, tanto no meio na presena quanto na ausncia das clulas da bactria. Quando utilizou-se as culturas mista de Corynebacterium aquaticum e Bacillus sp., mista de Corynebacterium sp., Bacillus cereus e Bacillus mycoides e pura de Bacillus subtilis, as tenses superficiais reduziram e se mantiveram praticamente constantes (Figura 1) e as atividades emulsificantes aumentaram (Figura 2) ao longo do tempo de cultivo. J para a cultura pura de Corynebacyerium aquaticum, apesar das atividades emulsificantes terem aumentado durante o cultivo, menores tenses superficiais do meio na presena das clulas de bactria foram encontradas entre 12 e 48 h, verificando-se significante aumento (p<0,05) aps esse intervalo de tempo. No meio na ausncia de clulas, as menores tenses foram atingidas a partir de 12 h de cultivo, no havendo aumento significativo (p>0,05) aps esse tempo. No cultivo da bactria Corynebacterium aquaticum verificou-se que a tenso superficial diminuiu rapidamente at 12 h de cultivo, enquanto o crescimento celular foi baixo. RODRIGUES et al. (2006) encontraram comportamento semelhante ao avaliar a produo de biossurfactante por culturas de Lactobacillus. A reduo da tenso superficial ocorreu principalmente nas primeiras 4 h de cultivo, quando o crescimento do microrganismo era quase inexistente e o consumo de substrato era baixo. A maior concentrao celular foi encontrada para a cultura pura de Corynebacterium aquaticum (1,98 g.L-1), e a menor para a cultura mista de Corynebacterium aquaticum e Bacillus sp. (0,48 g.L-1) (Figura 1 e Tabela 2). Alm disso, a menor tenso superficial do meio na presena de clulas de microrganismo diferiu para essas duas culturas, o que pode ser observado na Tabela 1 (p<0,05). Essas evidncias indicam que no houve simbiose entre as bactrias Corynebacterium aquaticum e Bacillus sp. Por outro lado, a tenso superficial do meio na presena de clulas da cultura mista de Corynebacterium aquaticum e Bacillus sp. foi menor, em mdia, do que a encontrada para as culturas mista de Corynebacterium sp., Bacillus cereus e Bacillus mycoides e pura de Bacillus subtilis (Tabela 1). Observa-se que, embora as culturas mista de Corynebacterium aquaticum e Bacillus sp. e pura de Bacillus subtilis tenham permanecido em fase estacionria aproximadamente de 24 a 60 h de cultivo, houve aumento no crescimento celular de 60 para 72 h. Para a cultura de Corynebacterium aquaticum e Bacillus sp., este aumento de biomassa esteve associado a produo de biossurfactante, j que a atividade emulsificante leo em gua aumentou, e a atividade emulsificante gua em

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leo permaneceu constante nesse experimento. Para a cultura de Bacillus subtilis, o mesmo no pode ser afirmado, pois ambas atividades emulsificantes, leo em gua e gua em leo diminuram no final do cultivo (Figuras 1 e 2). Apesar da cultura mista de Corynebacterium sp., Bacillus cereus e Bacillus mycoides ter apresentado a segunda maior concentrao celular (1,23 g.L-1) dentre as culturas utilizadas, indicando adaptao das bactrias para crescerem juntas, a reduo da tenso superficial no foi satisfatria. A menor tenso superficial encontrada no meio na presena de clulas (54,8 mN.m-1) foi maior do que a encontrada para as culturas pura de Corynebacterium aquaticum e mista de Corynebacterium aquaticum e Bacillus sp. (Tabela 1). As culturas pura de Corynebacterium aquaticum, mista de Corynebacterium aquaticum e Bacillus sp. e mista de Corynebacterium sp., Bacillus cereus e Bacillus mycoides foram isoladas da gua de lavagem de caminhes transportadores de combustveis, porm a cultura pura de Bacillus subtilis no o foi. Os microrganismos produtores de biossurfactantes geralmente so isolados de locais contaminados com hidrocarbonetos, em que as condies selecionam microrganismos com habilidade de utilizar fontes hidrofbicas de carbono. Entretanto, existem relatos de produtores isolados de locais no contaminados, o que pode ocorrer devido a outros papis dos biossurfactantes, como biocidas, fungicidas e transportadores de molculas de nutrientes. JENNINGS & TANNER (2000) isolaram bactrias de solos contaminados e no contaminados com hidrocarbonetos e verificaram que bactrias produtoras de biossurfactantes foram encontradas, em maior parte, em solos no expostos a contaminao por hidrocarbonetos. Dentre os gneros encontrados predominaram Bacillus e Pseudomonas. A produo de biossurfactante pode ser induzida por hidrocarbonetos ou substratos insolveis em gua. Porm, os biossurfactantes tambm podem ser produzidos a partir de substratos solveis em gua, especialmente carboidratos (MULLIGAN, 2005; KARANTH et al., 1999; DESAI & BANAT, 1997). Segundo DESAI & BANAT (1997), hidrocarbonetos e carboidratos esto envolvidos na sntese das pores hidrofbicas e hidroflicas, respectivamente, das molculas de biossurfactante. As seguintes possibilidades existem para a sntese das diferentes pores das molculas de biossurfactantes e seu acoplamento: (a) as pores hidrofbica e hidroflica so sintetizadas de forma independente; (b) a poro hidroflica sintetizada enquanto a sntese da poro hidrofbica induzida pelo substrato; (c) a poro hidrofbica sintetizada, enquanto a sntese da poro

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hidroflica dependente do substrato; e (d) a sntese de ambas pores hidrofbica e hidroflica dependente do substrato. Como as culturas pura de Corynebacterium aquaticum, mista de Corynebacterium aquaticum e Bacillus sp. e mista de Corynebacterium sp., Bacillus cereus e Bacillus mycoides utilizadas no presente trabalho foram isoladas de ambientes contendo hidrocarbonetos e cultivadas em meio contendo carboidrato (glicose) como fonte de carbono, a sntese das pores hidrofbica e hidroflica das molculas de biossurfactante pode ter ocorrido de diferentes maneiras: de forma independente; quando na presena de hidrocarbonetos, a sntese da poro hidrofbica pode ter sido induzida pelo substrato; e quando na presena de glicose, a sntese da poro hidroflica pode ter sido substrato dependente. A bactria Bacillus subtilis uma das mais citadas na literatura por produzir o biossurfactante conhecido como surfactina e reduzir consideravelmente a tenso superficial. Provavelmente, a cultura utilizada neste trabalho, isolada de local no contaminado com leos, no apresentou reduo da tenso superficial comparvel encontrada na literatura por no conseguir sintetizar de forma independente as pores hidrofbicas e hidroflicas das molculas de biossurfactante ou, ainda, pela sntese da poro hidrofbica ser dependente do substrato, sendo necessria a presena de fonte de carbono hidrofbica no meio. A maioria dos biossurfactantes so liberados no meio de cultura na fase exponencial ou na fase estacionria do crescimento microbiano (CAMEOTRA & MAKKAR, 1998). Quando utilizou-se as culturas pura de Corynebacterium aquaticum e mista de Corynebacterium sp., Bacillus cereus e Bacillus mycoides, biossurfactantes foram liberados no meio de cultura na fase exponencial e estacionria de crescimento. J para as culturas mista de Corynebacterium aquaticum e Bacillus sp. e pura de Bacillus subtillis, a maioria dos biossurfactantes foram liberados na fase estacionria (Figuras 1 e 2). A Tabela 2 apresenta os parmetros cinticos avaliados durante a produo de biossurfactante por diferentes culturas de bactrias. Com exceo das velocidades instantneas mximas de formao de produto para as atividades emulsificantes, da velocidade especfica mxima de crescimento celular e do tempo de gerao, os maiores parmetros cinticos foram encontrados para a cultura de Corynebacterium aquaticum.

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TABELA

Parmetros

cinticos

determinados

para

as

culturas

pura

de

Corynebacterium aquaticum (Cultura 1), mista de Corynebacterium aquaticum e Bacillus sp. (Cultura 2), mista de Corynebacterium sp., Bacillus cereus e Bacillus mycoides (Cultura 3) e pura de Bacillus subtilis (Cultura 4). Parmetro cintico Xmx (gcl.L ) rX (gcl.L-1.h-1) mx (h ) tg (h) rP - TS pre cl (mN.m .h ) rP - TS aus cl (mN.m .h ) rP - AEo/a (UE. h ) rP - AEa/o (UE. h ) PP - TS PP - TS
pre cl aus cl -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1

Cultura 1 1,98 0,042 0,043 16,1 1,36 1,10 4,45 0,80

-1

2 0,48 0,003 0,010 69,3 0,45 0,39 4,15 0,71 0,31 0,73 2,19 0,33

3 1,23 0,026 0,037 18,7 0,35 0,30 3,40 0,39 0,24 0,30 1,11 0,25

4 0,96 0,007 0,063 11,0 0,21 0,37 5,93 0,83 0,12 0,49 2,40 0,38

(mN.m .h ) (mN.m .h )
-1 -1 -1

-1

2,01 1,89 2,65 0,40

PP - AEo/a (UE. h-1) PP - AEa/o (UE. h )

Xmx = concentrao celular mxima; rX = velocidade instantnea mxima de crescimento celular; mx = velocidade especfica mxima de crescimento celular; tg = tempo de gerao; rP = velocidade instantnea mxima de formao de produto; PP = produtividade mxima em produto; TS pre cl = tenso superficial do meio fermentado na presena das clulas de microrganismo; TS aus cl = tenso superficial do meio fermentado na ausncia das clulas de microrganismo; AEo/a = atividade emulsificante leo em gua; AEa/o = atividade emulsificante gua em leo.

Na fase exponencial, a velocidade especfica de crescimento mxima e constante (SCHMIDELL et al., 2001). A maior velocidade especfica de crescimento celular (0,063 h-1) foi encontrada no cultivo da bactria Bacillus subtilis. A cultura mista de Corynebacterium aquaticum e Bacillus sp. foi a que apresentou menor velocidade especfica de crescimento celular (0,010 h-1). Alm disso, essa cultura foi a que propiciou menor concentrao celular (0,48 g.L-1) e maior tempo de gerao (69,3 h). A concentrao celular mxima foi atingida pela cultura de Corynebacterium aquaticum (1,98 g.L-1). MAKKAR & CAMEOTRA (1997) estudaram fontes de carbono solveis (carboidratos) e insolveis (hidrocarbonetos) em gua na produo de biossurfactante por Bacillus subtilis. Quando a glicose foi utilizada como fonte de carbono, a biomassa atingida foi 1,85 g.L-1, valor prximo ao encontrado no presente trabalho para a bactria Corynebacterium aquaticum.

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As maiores velocidades instantneas de crescimento celular foram, em ordem descrescente: 0,042 g.L-1.h-1 (Corynebacterium aquaticum); 0,026 g.L-1.h-1 (Corynebacterium sp., Bacillus cereus e Bacillus mycoides); 0,007 g.L-1.h-1 (Bacillus subtilis) e 0,003 g.L-1.h-1 (Corynebacterium aquaticum e Bacillus sp.). A mesma ordem decrescente, com relao as culturas, foi encontrada para a concentrao celular mxima. As maiores produtividades com relao a reduo das tenses superficiais do meio fermentado na presena ou ausncia das clulas de bactria foram 2,01 mN.m1

.h-1 e 1,89 mN.m-1.h-1, respectivamente, obtidas para a bactria Corynebacterium

aquaticum. J com relao as atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo, as produtividades nos cultivos de Corynebacterium aquaticum (2,65 UE. h-1 e 0,40 UE. h-1, respectivamente) e de Bacillus subtilis (2,40 UE. h-1 e 0,38 UE. h-1, respectivamente) foram prximas. Alm disso, as maiores velocidades instantneas de formao de produto relacionadas as atividades emulsificantes leo em gua (5,93 UE.h-1) e gua em leo (0,83 UE.h-1) tambm foram obtidas a partir da cultura de Bacillus subtilis, o que sugere que, apesar desta bactria no ter sido eficiente na reduo da tenso superficial, foi capaz de promover a formao de emulses comparveis as obtidas no cultivo de Corynebacterium aquaticum. 4 CONCLUSES A bactria Corynebacterium aquaticum apresentou diferena significativa (p<0,05) entre os valores de tenso superficial do meio fermentado com e sem clulas de microrganismos, nos tempos 24 e 36 h, o que indica provvel produo de biossurfactante aderido parede celular por essa bactria, alm de extracelular. Para as demais culturas, em um mesmo tempo de fermentao, no houve diferena significativa (p>0,05) entre as tenses superficiais, o que indica produo extracelular de biossurfactante. A cultura pura de Corynebacterium aquaticum foi a que apresentou menor tenso superficial (28,8 mN.m-1), no meio de cultura na presena de clulas de microrganismos, diferindo (p<0,05) das demais culturas utilizadas. As maiores atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo no diferiram para todas as culturas (p>0,05). A maior concentrao celular (1,98 g.L-1), velocidade instantnea de crescimento celular (0,042 g.L-1.h-1), produtividade com relao a reduo da tenso

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superficial (2,01 mN.m-1.h-1), produtividade com relao a atividade emulsificante leo em gua (2,65 UE.h-1) e produtividade com relao a atividade emulsificante gua em leo (0,40 UE.h-1) foram obtidas no cultivo de Corynebacterium aquaticum. Os resultados mostraram a potencialidade da bactria Corynebacterium aquaticum na produo de biossurfactante, tanto pela reduo da tenso superficial e aumento da atividade emulsificante quanto pelos parmetros cinticos avaliados, podendo o biossurfactante produzido por essa bactria ser utilizado tanto na emulso de alimentos, aps purificao e testes de toxicidade, como em processos de biorremedio. 5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS BANAT, I.N.; MAKKAR, R.S.; CAMEOTRA, S.S. Potential commercial applications of microbial surfactants. Applied Microbiology and Biotechnology. 53, 495-508, 2000. BARROS, F.F.C.; QUADROS, C.P.; JNIOR, M.R.M.; PASTORE, G.M. Surfactina: propriedades qumicas, tecnolgicas e funcionais para aplicaes em alimentos. Qumica Nova. 30, 2, 409-414, 2007. BATISTA, S.B.; MOUNTEER, A.H.; AMORIM, F.R.; TTOLA, M.R. Isolation and characterization of biosurfactant/bioemulsifier-producing bacteria from petroleum contaminated sites. Bioresource Technology. 97, 868-875, 2006. BOGNOLO, G. Biosurfactants as emulsifying agents for hydrocarbons. Colloids and Surfaces. 152, 41-52, 1999. BRODERICK, L.S.; COONEY, J.J. Emulsification of hydrocarbons by bacteria from freshwater ecosystems. Developments in Industrial Microbiology. 23, 425-434, 1982. CAMEOTRA, S.S.; MAKKAR, R.S. Synthesis of biosurfactants in extreme conditions. Applied Microbiology and Biotechnology. 50, 520-529, 1998.

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5.2 BIOSSURFACTANTES BACTERIANO E FNGICO: PRODUO ATRAVS DE CULTIVO EM ESTADO SLIDO UTILIZANDO RESDUOS AGROINDUSTRIAIS

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BIOSSURFACTANTES BACTERIANO E FNGICO: PRODUO ATRAVS DE CULTIVO EM ESTADO SLIDO UTILIZANDO RESDUOS AGROINDUSTRIAIS Marta Heidtmann Pinto, Jorge Alberto Vieira Costa Laboratrio de Engenharia Bioqumica, Departamento de Qumica, Fundao Universidade Federal do Rio Grande (FURG), Caixa Postal 474, CEP 96201-900, Rio Grande, RS, Brasil, Telefone: +55(53)32328653, e-mail: dqmjorge@furg.br RESUMO Os biossurfactantes so molculas anfipticas, com uma poro hidrofbica e uma poro hidroflica. Caracterizam-se por reduzir tenses superficial e interfacial e por possuir propriedades de emulsificao. Os substratos mais pesquisados para produo de biossurfactantes so resduos agroindustriais provenientes de regies tropicais, o que favorece o Brasil para produo deste bioproduto. O objetivo deste trabalho foi comparar a produo de biossurfactante bacteriano e fngico em diferentes tipos de biorreatores (biorreator de coluna e frasco Erlenmeyer) atravs de cultivo em estado slido, utilizando os resduos agroindustriais farelo de trigo e casca de arroz. O biossurfactante bacteriano foi capaz de reduzir tenses, alm de apresentar capacidade de formar emulses, enquanto o biossurfactante fngico foi mais eficaz na formao das emulses. O biossurfactante sintetizado no biorreator de coluna foi mais eficiente do que o produzido no frasco Erlenmeyer para reduzir a tenso interfacial e promover a formao de emulso gua em leo. As menores tenses superficiais foram encontradas no cultivo de Corynebacterium aquaticum em biorreator de coluna (33,1 mN.m-1) e frasco Erlenmeyer (31,3 mN.m-1). A menor tenso interfacial foi 6,2 mN.m-1, obtida em cultivo bacteriano em biorreator de coluna. Os cultivos em estado slido com o fungo Aspergillus fumigatus em biorreator de coluna e frasco Erlenmeyer foram os que apresentaram maiores atividades emulsificantes leo em gua (291,8 UE e 327,9 UE, respectivamente). A atividade emulsificante gua em leo foi incrementada nos cultivos de Aspergillus fumigatus e pela utilizao do biorreator tipo coluna de leito fixo, atingindo 60,4 UE. Palavras-chave: casca de arroz, farelo de trigo, surfactantes naturais.

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ABSTRACT Biosurfactants are amphipathic molecules with a hydrophobic and a hydrophilic moiety. They are characterized by reducing surface and interfacial tensions and for possessing emulsification properties. The substrates more researched for biosurfactants production are agroindustrial wastes from tropical areas, what favors Brazil for the production of this bioproduct. This paper aimed at comparing the production of bacterial and fungic biosurfactant in different bioreactor types (column bioreactor and Erlenmeyer flask) through solid-state cultivation, using the agroindustrial wastes wheat bran and rice rind. The bacterial biosurfactant was able to reduce tensions, besides presenting capacity to form emulsions, while the fungic biosurfactant was more effective in the emulsions formation. The biosurfactant synthesized in column bioreactor was more efficient than that produced in Erlenmeyer flask to reduce the interfacial tension and to promote the emulsion formation water in oil. The smallest surface tensions were found in the cultivation of Corynebacterium aquaticum in column bioreactor (33.1 mN.m-1) and Erlenmeyer flask (31.3 mN.m-1). The smallest interfacial tension was 6.2 mN.m-1, obtained in bacterial cultivation in column bioreactor. The cultivations in solid-state with the fungus Aspergillus fumigatus in column bioreactor and Erlenmeyer flask were the ones that presented the largest emulsifying activities oil in water (291.8 UE and 327.9 UE, respectively). The emulsifying activity water in oil was increased in the cultivations of Aspergillus fumigatus and by the use of the bioreactor type column of fixed bed, reaching 60.4 UE. Keywords: rice rind, wheat bran, natural surfactants.

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1 INTRODUO Biossurfactantes so compostos de superfcie ativa, produzidos na superfcie da clula microbiana ou excretado atravs da parede celular, que reduzem tenses superficiais e interfaciais. Os biossurfactantes e bioemulsificantes possuem propriedades de emulsificao (DYKE et al., 1991). Apresentam vantagens frente aos surfactantes sintticos, como a biodegradabilidade, baixa toxicidade e estabilidade em valores extremos de pH, temperatura e salinidade (MAKKAR & CAMEOTRA, 2002). O cultivo submerso com bactrias predominante para a produo de biossurfactante. Porm, bactrias e leveduras podem crescer em substratos slidos em nveis de 40-70% de umidade. Os fungos filamentosos tm sido amplamente pesquisados em cultivos em estado slido para produo de bioprodutos em geral, pois podem crescer na ausncia de gua livre (RAGHAVARAO et al., 2003; SCHMIDELL et al., 2001). Segundo PANDEY (1992), a seleo adequada do microrganismo um dos critrios mais importantes em se tratando de fermentao em estado slido. Um outro item a ser analisado refere-se escolha do fermentador (SCHMIDELL et al., 2001). PANDEY (1991) apresenta os principais tipos de biorreatores usados em fermentao em estado slido, enfatizando os fermentadores de bandeja, de tambor e de coluna. Os surfactantes naturais somente podem substituir os surfactantes sintticos se os custos da matria-prima e do processo forem mnimos (MANEERAT, 2005). Desta forma, os custos no favorveis de produo de biossurfactantes podem ser revertidos se processos fermentativos forem desenvolvidos para promover altos rendimentos, utilizando-se meios de cultivo renovveis, principalmente resduos agroindstriais como fonte potencial de carbono. Nesse contexto, a fermentao em estado slido torna-se uma rea promissora de pesquisa. Em pases em desenvolvimento, onde a situao econmica muitas vezes produz dificuldades para manter-se ao nvel dos avanos biotecnolgicos, processos fermentativos utilizando substratos alternativos e de baixo custo, como os resduos agroindustriais, constituem uma oportunidade para o progresso na produo de compostos bioativos, alm de agregar valor a esses resduos. A seleo de substratos adequados para a produo de biossurfactantes concentra maior nmero de pesquisas em produtos e resduos agroindustriais provenientes de regies tropicais, o que favorece o Brasil para a produo deste

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bioproduto. Os resduos que tm sido usados para produo de biossurfactantes em processos fermentativos em estado slido so o farelo e palha de trigo e arroz, casca de soja, bagao de cana-de-acar, resduos de indstrias processadoras de caf, resduos de indstrias processadoras de frutas e outros como serragem, sabugo de milho e razes de chicria (PANDEY et al., 2000). O farelo de trigo comumente utilizado como substrato tanto em fermentaes em estado slido utilizando fungos quanto bactrias como microrganismo (OHNO et al., 1995). O objetivo deste trabalho foi comparar a produo de biossurfactante bacteriano e fngico em diferentes tipos de biorreatores atravs de fermentao em estado slido, utilizando resduos agroindustriais como substrato. 2 MATERIAL E MTODOS 2.1 Microrganismos Os microrganismos utilizados foram a bactria Corynebacterium aquaticum e o fungo filamentoso Aspergillus fumigatus, ambos cedidos pelo Laboratrio de Microbiologia de Alimentos da Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas (FEA/UNICAMP). 2.2 Manuteno e propagao dos inculos para a fermentao 2.2.1 Inculo bacteriano A cultura de Corynebacterium aquaticum foi mantida a 4C, em tubos de ensaio contendo gar nutriente, formulado conforme a seguir (g.L-1): extrato de carne, 1,0; extrato de levedura, 2,0; peptona, 5,0; NaCl, 5,0; e gar-gar, 15,0. A propagao do inculo foi realizada em frascos Erlenmeyer contendo gar nutriente, incubados por 48 h a 30C. Aps este perodo, foi realizada raspagem da superfcie do gar com meio nutriente, o qual difere do gar nutriente pela ausncia de gar-gar. Ao atingir-se densidade tica 0,8-0,9 ( = 600 nm), a suspenso foi utilizada como inculo, sendo adicionada ao meio de cultivo na concentrao de 2% com relao a massa de meio (MAKKAR & CAMEOTRA, 1998).

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2.2.2 Inculo fngico A manuteno do inculo do fungo Aspergillus fumigatus ocorreu em tubos de ensaio inclinados com gar batata-dextrose (PDA), 0,5% (p/v) de gar-gar e 1% (v/v) de glicerina, a 4C. A propagao do inculo foi realizada em frascos Roux (tambm preparados com gar batata-dextrose (PDA), 0,5% (p/v) de gar-gar e 1% (v/v) de glicerina) atravs da tcnica de espalhamento em superfcie. Os frascos foram incubados a 30C por 7 dias visando o recobrimento completo da superfcie e a esporulao dos microrganismos. Posteriormente, foi realizada a raspagem dos esporos com Tween 80 0,2% (v/v). A suspenso obtida foi filtrada em gaze estril, seguindo-se a contagem de esporos em cmara de Neubauer a fim de calcular o volume de suspenso necessrio para obter uma concentrao inicial de 4x106 esporos.g-1 (MARTINS, 2005). 2.3 Cultivo em estado slido Os cultivos em estado slido foram realizados em biorreatores de coluna (50 mm de dimetro x 250 mm de altura) e em frascos Erlenmeyer (2 L). Os biorreatores de coluna eram providos de encamisamento, a fim de manter a temperatura constante. A aerao foi realizada atravs de ar comprimido. Antes de entrar no fermentador, o ar foi filtrado em l de vidro. Em seguida, a vazo foi controlada por rotmetros (ColeParmer Instrument Company, USA) previamente calibrados, e o ar foi umidificado passando por coluna contendo gua estril, seguido por outra coluna vazia para eliminao de gotas, para finalmente entrar no biorreator de coluna. O meio fermentativo foi composto por casca de arroz (suporte inerte) e farelo de trigo nas propores de 15 e 85%, respectivamente. O farelo foi peneirado e recolhidas as partculas com granulometria entre 0,85 e 1,18 mm. Com a finalidade de complementar o meio fermentativo, foi adicionada soluo nutriente mistura casca de arroz e farelo de trigo. Para os cultivos bacterianos, a soluo nutriente foi composta por (mM): NH4NO3, 50,0; Na2HPO4, 3,0; KH2PO4, 3,0; CaCl2, 0,007; MgSO4.7H2O, 0,8; EDTA sdico, 0,004; e FeSO4.7H2O, 2,0 (YEH et al., 2005; WEI et al., 2004); e para os cultivos fngicos por (g.L-1): MgSO4.7H2O, 0,5; NaNO3, 3,0; KH2PO4, 1,0; extrato de levedura, 1,0; e peptona, 0,3 (COSTA, 2004). O pH inicial foi fixado em 6,0 (NITSCHKE & PASTORE, 2006) e a umidade em 65% (MARTINS et al., 2007) para os cultivos com a bactria; e pH 4,5 (COSTA, 2004)

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e umidade de 50% (COSTA, 1996) para os cultivos com o fungo. Para ambos os cultivos a temperatura foi 30C (NITSCHKE & PASTORE, 2006; COSTA, 1996), a aerao 90 mL.g-1.h-1 nos cultivos em biorreatores de coluna (CASTIGLIONI, 2006), e o tempo de cultivo 144 h (HASAN, 1998). A Figura 1 apresenta esquema do cultivo em estado slido em biorreator de coluna.

FIGURA 1 Esquema de cultivo em estado slido em biorreator de coluna. Fonte: COSTA (1996). 2.4 Extrao do biossurfactante A extrao do biossurfactante do meio fermentativo foi realizada com gua na proporo 1:5 (uma parte de soluto para cinco partes de solvente) aquecida a 50C para os cultivos bacterianos (MARTINS et al., 2007), e a 90C para os cultivos fngicos (MARTINS, 2005). Aps a adio do solvente, a amostra foi submetida a agitao em shaker (B. Braun Certomat BS-1, Alemanha) a 160 rpm e 50C por 30 min. Prosseguiu-se filtrao e centrifugao da amostra a 7000 rpm por 15 min. O

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extrato obtido foi utilizado para determinao das tenses superficial e interfacial, e atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo. 2.5 Determinaes analticas As anlises foram realizadas em triplicata, a cada 24 h do processo fermentativo. 2.5.1 Biomassa O crescimento bacteriano durante os cultivos foi acompanhado utilizando-se a microtcnica do Nmero Mais Provvel (NMP), adaptada de BRADDOCK & CATTERALL (1999), e tabelas de NMP (APHA, 1995). Como forma indireta de quantificar o crescimento celular do fungo Aspergillus fumigatus foi utilizada a dosagem de glicosamina (AIDOO et al., 1981) (ANEXO 9.4). A fim de estabelecer uma correlao entre o contedo de glicosamina e a biomassa fngica, foi realizada fermentao submersa do fungo Aspergillus fumigatus em meio Sabouraud (LARONE, 1987) por 48 h, tempo correspondente ao final da fase exponencial de crescimento do microrganismo. Aps, determinou-se o teor de glicosamina de diferentes concentraes celulares do fungo e obteve-se, por regresso linear, a relao entre a massa seca do fungo e o contedo de glicosamina, que foi utilizada, posteriormente, na determinao da massa celular obtida nos cultivos em estado slido (ANEXO 9.5). 2.5.2 Umidade O teor de umidade das amostras fermentadas foi determinado segundo metodologia da AOAC (1995), baseada na perda de peso aps secagem em estufa a 105C at peso constante. 2.5.3 pH A determinao do pH foi realizada atravs de leitura em pHmetro digital (Quimis HI 8314, Brasil) aps suspenso de 1 g de amostra fermentada seca em 9 mL de gua destilada (MARTINS, 2005).

61

2.5.4 Estimativa da atividade biossurfactante A estimativa da atividade biossurfactante foi realizada por diferentes mtodos: a medida das tenses superficial e interfacial e atravs das atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo. 2.5.4.1 Tenses superficial e interfacial As tenses superficial e interfacial foram determinadas em tensimetro (Kruss Processor Tensiometer K-6, Alemanha) usando o mtodo do anel (ANEXO 9.1). A tenso superfacial foi medida com a amostra em contato com o ar, e a tenso interfacial com a amostra em contado com hexadecano (COSTA et al., 2006; RODRIGUES et al., 2006). 2.5.4.2 Atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo A atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo foram determinadas utilizando-se 3,5 mL de amostra diluda e 2,0 mL de leo de soja. A mistura foi agitada em agitador tipo vortex (Phoenix AP56, Brasil) a 700 rpm por 1 min. Aps 60 min de repouso foi lida a absorbncia do meio emulsificado leo/gua em espectrofotmetro (Femto 700 Plus, Brasil) a 610 nm (JOHNSON et al., 1992), calculando-se a atividade emulsificante leo em gua atravs da Equao 1. Aps 24 h de repouso foi realizada leitura da altura da emulso gua/leo formada e da altura total (altura da emulso mais altura da camada remanescente de leo) (BRODERICK & COONEY, 1982), obtendo-se a atividade emulsificante gua em leo de acordo com a Equao 2.

AEo / a = ( Absamostra Absbranco ) D

AEa / o = (E amostra Ebranco ) D
Onde: AEo/a = atividade emulsificante leo em gua (UE); AEa/o = atividade emulsificante gua em leo (UE); Absamostra = absorbncia da emulso leo/gua;

(1)

(2)

62

Absbranco = absorbncia da amostra diluda; Eamostra = relao centesimal entre a altura da emulso gua/leo e a altura total utilizando amostra; Ebranco = relao centesimal entre a altura da emulso gua/leo e a altura total utilizando gua; D = diluio da amostra em gua. A atividade emulsificante leo em gua foi definida como a quantidade de biossurfactante necessria para aumentar a absorbncia em 1,0 a 610 nm, e a atividade emulsificante gua em leo como a quantidade de biossurfactante necessria para manter a emulso estvel por 24 h (MARTINS, 2005). 2.6 Produtividade As produtividades mximas com relao as tenses superficial e interfacial e as atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo foram calculadas de acordo com a Equao 3 (SCHMIDELL et al., 2001).

PP =

P P0 t

(3)

Onde: PP = produtividade em produto (gprod.L-1.h-1); P = concentrao de produto no tempo t (gprod.L-1); P0 = concentrao de produto no incio da fermentao (gprod.L-1); t = tempo de cultivo (h). Como a produo de biossurfactante foi verificada atravs de mtodos indiretos, a concentrao de produto foi expressa em unidade de tenso (mN.m-1) ou de atividade emulsificante (UE). 2.7 Anlise estatstica Os cultivos foram realizados conforme planejamento experimental fatorial completo 22, em duplicata. As variveis estudadas foram o microrganismo (bactria Corynebacterium aquaticum ou fungo Aspergillus fumigatus) e o biorreator (de coluna

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ou frasco Erlenmeyer). As respostas foram as menores tenses superficiais e interfaciais, maiores atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo e produtividades mximas em cada experimento. Os resultados foram tratados por anlise de varincia (ANOVA), a um nvel de significncia de 5%. A Tabela 1 apresenta os nveis reais e codificados das variveis estudadas nos cultivos. TABELA 1 Variveis do planejamento experimental fatorial completo 22 e seus respectivos nveis reais e codificados. Ensaio 1 2 3 4 Microrganismo Corynebacterium aquaticum (-1) Aspergillus fumigatus (+1) Corynebacterium aquaticum (-1) Aspergillus fumigatus (+1) Biorreator biorreator de coluna (-1) biorreator de coluna (-1) frasco Erlenmeyer (+1) frasco Erlenmeyer (+1)

3 RESULTADOS E DISCUSSO A bactria Corynebacterium aquaticum apresentou maior concentrao na presena de aerao, no biorreator de coluna. De 24 a 48 h de cultivo h um pico de crescimento, seguido de queda at 72 h, quando o crescimento volta a ocorrer, como pode ser observado na Figura 2a. De acordo com VEENANADIG et al. (2000), a transferncia de oxignio aumenta com o aumento da aerao, resultando em uma fermentao eficiente, aumentando a produo de biossurfactante e, portanto, favorecendo a reduo da tenso superficial. Por outro lado, altas aeraes em biorreatores de coluna podem diminuir a umidade tima do substrato slido. Nos cultivos com a bactria Corynebacterium aquaticum, o problema de reduo da umidade no foi evidenciado, j que tanto em biorreator de coluna quanto em frasco Erlenmeyer, a umidade nos diferentes tempos de cultivo foi praticamente igual, exceto em 144 h, quando a umidade na coluna (67,7%) foi inferior a encontrada no Erlenmeyer (74,8%) (Figura 3). O menor crescimento de bactrias no Erlenmeyer em comparao coluna pode ser explicado pela dificuldade da penetrao de oxignio no meio no Erlenmeyer, de forma que a transferncia de oxignio ocorre, em maior parte, na superfcie que est em contato com o ar, diferentemente do biorreator de coluna, em que o ar

64

forado a passar por todo o substrato, havendo maior rea para transferncia do oxignio. As bactrias do gnero Corynebacterium so parasitas obrigatrios das membranas mucosas e pele de mamferos, embora possam ser, ocasionalmente, encontradas em outras fontes. Podem apresentar clulas retas ou levemente curvadas, arranjadas sozinhas ou em pares, freqentemente no formato V, ou em vrias clulas paralelas. So anaerbias facultativas e comumente requerem meios ricos nutricionalmente (HOLT et al., 1994). Estas evidncias explicam o alto crescimento da bactria Corynebacterium aquaticum em meio slido encontrado neste estudo, j que a mistura farelo de trigo e casca de arroz suplementada com soluo nutriente propicia um meio altamente nutritivo. Apesar do gnero ser anaerbio facultativo, observou-se que a espcie estudada se desenvolve melhor quando o cultivo slido aerado. Clulas levemente curvadas ou unidas no formato V podem ter facilitado a aderncia, bastante visvel, nas partculas slidas do meio. A aerao forada utilizada para remoo de calor do biorreator, e tambm para suprir a demanda de oxignio e remoo de gs carbnico. HASAN et al. (1998) modelaram e simularam a transferncia de calor em fermentao semi-slida de farelo de arroz, utilizando como microrganismo o fungo Aspergillus niger NRRL 3122. Em seu estudo, verificaram que uma alta vazo de ar (150 mL.g-1.h-1) praticamente eliminaria o problema de remoo de calor, mantendo o meio em nveis baixos de temperatura, porm faria com que a produo de biomassa fosse menor. Essa diminuio da concentrao de biomassa foi atribuda abraso e ruptura do miclio e secagem do meio slido a nveis desfavorveis de umidade a altas vazes de ar, mesmo com o uso de ar saturado. Os efeitos do contedo de gua nos cultivos em estado slido tm sido amplamente descritos. A elevada umidade causa a compactao do substrato, diminuindo sua porosidade, e diminui a difuso do oxignio e as trocas gasosas, alm de aumentar o risco de contaminao. Baixos teores de umidade levam, por sua vez, a uma diminuio do crescimento, diminuio das trocas metablicas e gradativa reduo na produo (SANTIN, 1993). Analisando a Figura 2b, observa-se que o fungo Aspergillus fumigatus apresentou maior crescimento no biorreator de coluna de 24 a 72 h de cultivo. Porm, aps este perodo, o microrganismo continua a crescer no Erlenmeyer, entrando em fase estacionria no biorreator de coluna. Os resultados indicam que a vazo de ar utilizada nos fermentadores de coluna (90 mL.g-1.h-1) foi alta, causando diminuio do

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teor de umidade e possvel quebra do miclio aps 72 h de fermentao, fazendo com que o fungo Aspergillus fumigatus entrasse em fase estacionria e, posteriormente, em fase de morte celular, fato este que coincide com queda brusca da umidade, passando de 59,0% em 120 h de cultivo para 37,2% em 144 h (Figura 3). Ao correlacionar o contedo de glicosamina e biomassa seca, obtida a partir do cultivo lquido do fungo Aspergillus fumigatus, obteve-se a equao da reta y = 0,105x +0,002 (r2 = 0,989), onde y o contedo de glicosamina (mg.mL-1) e x a biomassa seca (mg.mL-1). As mximas concentraes celulares foram 202,33 mg.gms-1 na coluna e 260,61 mg.gms-1 no Erlenmeyer (Figura 2b). Os valores obtidos neste trabalho foram superiores aos obtidos por PALMA (2003) ao cultivar o fungo Thermoascus aurantiacus em meio slido, que encontrou concentrao celular mxima de 132,25 mg.gms-1. A Figura 3 mostra o gradativo aumento do teor de umidade aps o incio das fermentaes com o fungo Aspergillus fumigatus e com a bactria Corynebacterium aquaticum. Ao final das fermentaes, a umidade diminui nos biorreatores de coluna, mantendo-se constante nos frascos Erlenmeyer. O aumento da umidade ocorre devido a diminuio na quantidade de matria slida (substrato) e produo de gua metablica pela oxidao de carboidratos (RAIMBAULT & ALAZARD, 1980), enquanto que a reduo ao final do processo em biorreatores de coluna indica que o sistema de saturao de ar no foi capaz de repor a quantidade de gua evaporada na vazo de ar utilizada (COSTA, 1996). O pH variou de 4,31 a 4,95 nos cultivos fngicos, e de 5,94 a 6,25 nos cultivos bacterianos (ANEXO 9.6). Variaes no pH resultam do consumo do substrato e/ou produo de metablitos (MAUREL et al., 2003).

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(a)
Biomassa bacteriana (NMP.g-1)
5x10 19 5x10 17 5x10 15 5x10 13 5x10
11 9

(b)
300 Biomassa fngica (mg.gms-1) 250 200 150 100 50 0 0 24 48 72 96 120 144

5x10

5x10 7

24

48

72

96

120 144

Tempo (h)

Tempo (h)

FIGURA 2 Crescimento dos microrganismos durante os cultivos. (a) Biomassa bacteriana e (b) biomassa fngica. Corynebacterium aquaticum/biorreator de coluna, Corynebacterium aquaticum/frasco Erlenmeyer, Aspergillus fumigatus/biorreator de coluna e Aspergillus fumigatus/frasco Erlenmeyer.

80 Umidade (%) 70 60 50 40 0 24 48 72 Tempo (h) 96 120 144

FIGURA 3 Umidade ao longo dos processos fermentativos. Corynebacterium aquaticum/biorreator de coluna, Corynebacterium aquaticum/frasco Erlenmeyer, Aspergillus Erlenmeyer. Os microrganismos sintetizam uma ampla variedade de bioemulsificantes de alta e baixa massa molecular. Os bioemulsificantes de alta massa molecular so polissacardios anfipticos, protenas, lipopolissacardios, lipoprotenas ou misturas complexas desses biopolmeros. Por sua vez, os bioemulsificantes de baixa massa molecular (biossurfactantes) so geralmente glicolipdios como trealose lipdios, soforolipdios e ramnolipdios, ou lipopeptdios como a surfactina. Os bioemulsificantes de alta massa molecular so mais efetivos para estabilizar emulses leo em gua, enquanto que os de baixa massa molecular reduzem as tenses superficial e fumigatus/biorreator de coluna e

Aspergillus

fumigatus/frasco

67

interfacial (ROSENBERG & RON, 1999). Biossurfactantes geralmente exibem capacidade emulsificante, mas bioemulsificantes no necessariamente reduzem a tenso superficial (KARANTH et al., 1999). Os bioemulsificantes de alta massa molecular mais citados na literatura so os produzidos por diferentes espcies do gnero Acinetobacter, como o alasan, um complexo polissacardio-protena produzido por Acinetobacter radioresistens KA53 (TOREN et al., 2002). Por outro lado, os bioemulsificantes de baixa massa molecular mais citados so a surfactina, um lipopeptdio produzido por Bacillus subtilis (YEH et al., 2006) e os ramnolipdios produzidos por Pseudomonas aeruginosa (ROCHA et al., 2007). O comportamento das tenses superficial e interfacial e das atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo durante os processos fermentativos pode ser observado nas Figuras 4 e 5, respectivamente. As tenses superficiais e interfaciais reduziram nos cultivos com a bactria Corynebacterium aquaticum, tornando-se praticamente constantes aps 48 h de fermentao. Porm, quando o microrganismo foi o fungo Aspergillus fumigatus, as tenses reduziram nas primeiras 24 h de cultivo, aumentando a partir deste tempo, fato este que pode ter ocorrido devido a produo de metablitos capazes de destruir as molculas de baixa massa molecular de biossurfactantes ou, ainda, pelo consumo dessas molculas pelo fungo, j que so compostos orgnicos (Figura 4). As atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo comearam a aumentar a partir de 24 h nos cultivos bacterianos e a partir de 48-72 h nos cultivos fngicos, ficando evidente aumento gradual nos cultivos de Corynebacterium aquaticum e exponencial nos cultivos de Aspergillus fumigatus (Figura 5). Desta forma, verificou-se que o biossurfactante bacteriano foi capaz de reduzir tenses superficiais e interfaciais, alm de formar emulses leo em gua e gua em leo, enquanto o biossurfactante fngico foi mais eficaz na formao das emulses. As redues nas tenses e aumento das atividades emulsificantes no ocorreram paralelamente. Enquanto as tenses reduziram, as atividades emulsificantes permaneceram praticamente constantes, aumentando somente depois, quando as tenses se tornaram constantes nos cultivos bacterianos e aumentaram nos cultivos fngicos. Este fato pode ser explicado atravs do conceito de concentrao micelar crtica (CMC), a concentrao de surfactante em que h a associao das molculas anfipticas na forma de micelas, e as tenses superficial e interfacial se tornam constantes, mesmo com o aumento da concentrao de

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biossurfactante (MULLIGAN, 2005). Desta forma, a concentrao de biossurfactante pode estar aumentando no meio, o que leva ao aumento das atividades emulsificantes, enquanto as tenses permanecem constantes nos cultivos bacterianos (Figuras 4 e 5). Em estudo realizado por TURKOVSKAYA et al. (2001) a respeito da produo de biossurfactante por Pseudomonas aeruginosa, a tenso superficial se tornou constante aps 48 h de fermentao (25 mN.m-1), porm a atividade emulsificante continuou a aumentar at 96 h (60%), quando tornou-se estvel. A maior reduo na tenso superficial ocorreu nas primeiras 24 h de cultivo, enquanto a atividade emulsificante permaneceu constante e prxima de zero. MAKKAR & CAMEOTRA (1998) avaliaram a produo de biossurfactante por uma cultura mesoflica de Bacillus subtilis utilizando sacarose como fonte de carbono. A tenso superficial reduziu para valores menores que 30 mN.m-1 em 24 h de cultivo, enquanto a maior concentrao de biossurfactante, em torno de 1 g.L-1, foi atingida em 96 h de fermentao. A bactria Corynebacterium aquaticum foi capaz de reduzir tenses, alm de formar emulses. Logo, as molculas anfipticas produzidas foram, provavelmente, de baixa massa molecular. Por outro lado, o fungo Aspergillus fumigatus mostrou-se mais eficaz na formao de emulses, o que evidencia a produo, em maior parte, de molculas anfipticas de alta massa molecular, embora este microrganismo possa ter produzido molculas de baixa massa molecular, destrudas ou consumidas aps 24 h de cultivo (Figuras 4 e 5). Ao relacionar a reduo das tenses e aumento das atividades emulsificantes com o crescimento dos microrganismos, observa-se que a menor concentrao de bactrias no Erlenmeyer a partir de 72 h de cultivo (Figura 2) reflete em menores atividades emulsificantes nesse biorreator em comparao coluna (Figura 5). Alm disso, aps 48 h a tenso interfacial na coluna continuou a diminuir, embora a baixas taxas, j que a bactria continuou a se desenvolver. O mesmo no pde ser observado no Erlenmeyer, onde a tenso interfacial permaneceu constante (Figura 4) e a concentrao celular diminuiu (Figura 2). A partir 96 h de fermentao, a biomassa de Aspergillus fumigatus no Erlenmeyer ultrapassou a encontrada na coluna (Figura 2), o que coincidiu com aumento acelerado das atividades emulsificantes no Erlenmeyer, chegando a ultrapassar a atividade emulsificante leo em gua encontrada na coluna no final dos cultivos (Figura 5). As molculas anfipticas de alta massa molecular foram liberadas pelo fungo na fase estacionria de crescimento, j

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que o aumento acelerado das atividades emulsificantes na coluna ocorre de 72 a 120 h, e no Erlenmeyer de 96 a 144 h (Figura 5), coincidindo com os intervalos de tempo em que o fungo encontrou-se em fase estacionria de crescimento nesses dois biorreatores (Figura 2).

(a)
60 55 TS (mN.m-1) 50 45 40 35 30 0 24 48 72 Tempo (h) 96 120 144 TI (mN.m-1) 24 20 16 12 8 4 0 24 48

(b)

72 Tempo (h)

96

120

144

FIGURA 4 Tenses superficial e interfacial ao longo dos processos fermentativos. (a) Tenses superficiais (TS) e (b) tenses interfaciais (TI). Corynebacterium aquaticum/biorreator de coluna, Corynebacterium aquaticum/frasco Erlenmeyer, Aspergillus Erlenmeyer. (a)
350 300 AEo/a (UE)

fumigatus/biorreator

de

coluna e

Aspergillus

fumigatus/frasco

(b)
70 60 AEa/o (UE) 50 40 30 20 10 0

250 200 150 100 50 0 0 24 48 72 Tempo (h) 96 120 144

24

48

72 Tempo (h)

96

120

144

FIGURA 5 Atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo durante os cultivos. (a) Atividade emulsificante leo em gua (AEo/a) e (b) atividade emulsificante gua em leo (AEa/o). Corynebacterium aquaticum/biorreator de coluna, Corynebacterium aquaticum/frasco Erlenmeyer, Aspergillus fumigatus/biorreator de coluna e Aspergillus fumigatus/frasco Erlenmeyer.

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Os menores valores de tenses superficial e interfacial e maiores valores de atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo obtidos durante os processos fermentativos, bem como as produtividades mximas para cada determinao analtica esto apresentados nas Tabelas 2 e 4, respectivamente. Atravs da anlise de varincia, foram calculados os efeitos das variveis estudas sobre as respostas obtidas (Tabelas 3 e 5). A varivel microrganismo apresentou significncia estatstica sobre todas as respostas estudadas (p<0,05). A bactria Corynebacterium aquaticum mostrou-se mais eficiente na reduo das tenses do que o fungo Aspergillus fumigatus. Por outro lado, o fungo apresentou melhores resultados com relao as atividades emulsificantes. O tipo de biorreator influenciou as respostas tenso interfacial, atividade emulsificante gua em leo e produtividades correspondentes (p<0,05). Em biorreator de coluna foram obtidas, em mdia, menores tenses interfaciais e maiores atividades emulsificantes gua em leo do que em Erlenmeyer (Tabelas 3 e 5). As menores tenses superficiais e maiores produtividades com relao reduo das tenses superficiais foram encontradas nos cultivos de Corynebacterium aquaticum em biorreator de coluna (33,1 mN.m-1 e 0,40 mN.m-1.h-1, respectivamente) e em frasco Erlenmeyer (31,3 mN.m-1 e 0,38 mN.m-1.h-1, respectivamente). Independente do tipo de biorreator utilizado, a tenso superficial foi, em mdia, 7,7 mN.m-1 menor e a produtividade relativa a tenso superficial 0,21 mN.m-1.h-1 maior nos cultivos bacterianos do que nos cultivos fngicos (p<0,05) (Tabelas 2 e 3). A menor tenso interfacial e maior produtividade com relao reduo da tenso interfacial foram 6,2 mN.m-1 e 0,23 mN.m-1.h-1, respectivamente, obtidas no cultivo de Corynebacterium aquaticum em biorreator de coluna. O efeito do microrganismo utilizado na reduo da tenso interfacial e aumento da produtividade sugere uma relao com o tipo de biorreator utilizado. Nos cultivos com a bactria Corynebacterium aquaticum encontrou-se, em mdia, menores tenses interfaciais e maiores produtividades relativas reduo dessa tenso do que nos cultivos fngicos, de forma que esse efeito foi mais pronunciado no biorreator de coluna para a resposta tenso interfacial e no Erlenmeyer para a resposta produtividade (Tabelas 2 e 3).

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TABELA 2 Resultados das menores tenses superficiais e interfaciais e produtividades mximas para os experimentos do planejamento fatorial completo 22. Ensaio 1 2 3 4 Mo C. aquaticum A. fumigatus C. aquaticum A. fumigatus BR C C E E TS (mN.m ) 33,1 0,4 39,8 0,7 31,3 0,7 39,8 0,0
-1

ProdTS (mN.m .h ) 0,40 0,01 0,17 0,05 0,38 0,01 0,19 0,03
-1 -1

TI (mN.m ) 6,2 0,28 16,0 0,28 10,1 0,11 16,6 0,39

-1

ProdTI (mN.m-1.h-1) 0,23 0,02 0,13 0,00 0,22 0,02 0,08 0,00

Mo = microrganismo; BR = biorreator; C = biorreator de coluna; E = frasco Erlenmeyer; TS = tenso superficial; TI = tenso interfacial; Prod = produtividade.

TABELA 3 Efeitos e nveis de significncia para as respostas tenso superficial, tenso interfacial e respectivas produtividades. TS (mN.m-1) Efeito (1) Mo (2) BR 1x2 7,7 -0,9 0,9 p < 0,01 0,071 0,071 ProdTS (mN.m-1.h-1) Efeito -0,21 0,00 0,02 p < 0,01 0,912 0,459 Efeito 8,1 2,3 -1,7 TI (mN.m-1) p < 0,01 < 0,01 < 0,01 ProdTI (mN.m-1.h-1) Efeito -0,12 -0,03 -0,02 p < 0,01 0,013 0,047

Mo = microrganismo; BR = biorreator; TS = tenso superficial; TI = tenso interfacial; Prod = produtividade; p = significncia estatstica.

Os cultivos em estado slido com o fungo Aspergillus fumigatus em biorreator de coluna e em frasco Erlenmeyer foram os que apresentaram maiores atividades emulsificantes leo em gua (291,8 UE; 327,9 UE) e produtividades relativas a esta resposta (1,99 UE.h-1; 2,24 UE.h-1). Nos cultivos bacterianos, em mdia, maiores atividades emulficantes leo em gua e produtividades correspondentes foram encontradas em biorreator de coluna, enquanto nos cultivos fngicos os maiores valores foram verificados no Erlenmeyer (Tabelas 4 e 5). A atividade emulsificante gua em leo e produtividade correspondente foram maiores, em mdia, nos cultivos de Aspergillus fumigatus e pela utilizao do biorreator tipo coluna de leito fixo (p<0,05), atingindo-se atividade emulsificante gua em leo de 60,4 UE e produtividade relativa a esta resposta de 0,53 UE.h-1 no cultivo do fungo em biorreator de coluna. (Tabelas 4 e 5).

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TABELA 4 Resultados das maiores atividades emulsificantes leo/gua e gua/leo e produtividades mximas para os experimentos do planejamento fatorial completo 22. Ensaio 1 2 3 4 Mo C. aquaticum A. fumigatus C. aquaticum A. fumigatus BR C C E E AEo/a (UE) 209,4 0,5 291,8 8,0 157,3 0,9 327,9 2,7 Prodo/a (UE.h-1) 1,92 0,09 1,99 0,06 1,58 0,01 2,24 0,02 AEa/o (UE) 60,8 0,2 60,4 2,5 49,0 0,8 57,5 0,0 Proda/o (UE.h-1) 0,39 0,00 0,53 0,03 0,35 0,00 0,43 0,00

Mo = microrganismo; BR = biorreator; C = biorreator de coluna; E = frasco Erlenmeyer; AE = atividade emulsificante; o/a = leo em gua; a/o = gua em leo; Prod = produtividade.

TABELA 5 Efeitos e nveis de significncia para as respostas atividade emulsificante leo em gua, atividade emulsificante gua em leo e respectivas produtividades. AEo/a (UE) Efeito (1) Mo (2) BR 1x2 126,5 -8,0 44,1 p < 0,01 0,058 < 0,01 Prodo/a (UE.h-1) Efeito 0,36 -0,04 0,29 p < 0,01 0,377 < 0,01 4,1 -7,4 4,4 AEa/o (UE) Efeito p 0,011 < 0,01 < 0,01 Proda/o (UE.h-1) Efeito 0,11 -0,07 -0,03 p < 0,01 < 0,01 0,056

Mo = microrganismo; BR = biorreator; AE = atividade emulsificante; o/a = leo em gua; a/o = gua em leo; Prod = produtividade; p = significncia estatstica.

Nos cultivos com a bactria Corynebacterium aquaticum, a partir de 48 h, a tenso interfacial continuou a reduzir no biorreator de coluna em comparao ao frasco Erlenmeyer (Figura 4). A atividade emulsificante leo em gua aumentou de forma similar na coluna e no Erlenmeyer at 96 h, porm, aps este tempo, diminuiu rapidamente no Erlenmeyer, permanecendo praticamente constante na coluna (Figura 5). Comportamento semelhante foi encontrado por VEENANADIG et al. (2000) ao estudar a produo de biossurfactante por Bacillus subtilis atravs de fermentao em estado slido utilizando farelo de trigo como substrato. No cultivo em Erlenmeyer, a tenso superficial reduziu e se tornou constante, passando de 54 mN.m-1 para 34 mN.m-1, enquanto que no biorreator de coluna, a tenso reduziu at o final do cultivo, atingindo 24 mN.m-1. A produo de emulsificante no frasco Erlenmeyer diminuiu bruscamente aps atingir seu mximo. J no biorreator de coluna, a atividade emulsificante aumentou e permaneceu constante, para depois diminuir.

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CERQUEIRA (2007) verificou que o farelo de trigo apresentou melhores resultados relativos produo de biossurfactante pelo fungo Aspergillus fumigatus do que o farelo de arroz, o que foi atribudo ao fato de as partculas de trigo apresentarem menor tendncia a aderirem umas as outras, facilitando o acesso do microrganismo ao substrato. As fermentaes foram realizadas em biorreatores de coluna. Os menores valores de tenso superficial e interfacial foram 36,2 mN.m-1 e 15,5 mN.m-1, respectivamente, e as maiores atividades emulsificantes, tanto leo em gua quanto gua em leo, foram obtidas em 144 h de fermentao, resultados comparveis aos obtidos neste estudo ao cultivar o fungo Aspergillus fumigatus. 4 CONCLUSES O microrganismo a ser utilizado para a produo de biossurfactante depender da sua aplicao, j que o biossurfactante produzido pela bactria Corynebacterium aquaticum foi capaz de reduzir tenses superficiais e interfaciais, alm de formar emulses leo em gua e gua em leo, enquanto o biossurfactante produzido pelo fungo Aspergillus fumigatus foi mais eficaz na formao das emulses. O biossurfactante sintetizado no biorreator de coluna foi mais eficiente do que o produzido no frasco Erlenmeyer para reduzir a tenso interfacial e para promover a formao de emulses gua em leo. As menores tenses superficiais foram encontradas no cultivo de Corynebacterium aquaticum em biorreator de coluna (33,1 mN.m-1) e em Erlenmeyer (31,3 mN.m-1). A menor tenso interfacial foi 6,2 mN.m-1, obtida em cultivo bacteriano em biorreator de coluna. Os cultivos em estado slido com o fungo Aspergillus fumigatus em biorreator de coluna e Erlenmeyer foram os que apresentaram maiores atividades emulsificantes leo em gua (291,8 UE e 327,9 UE, respectivamente). A atividade emulsificante gua em leo foi incrementada no cultivo de Aspergillus fumigatus e pela utilizao do biorreator tipo coluna de leito fixo, atingindo 60,4 UE. A literatura no apresenta relatos de produo de biossurfactante por bactrias do gnero Corynebacterium atravs de fermentao em estado slido, o que torna este trabalho de extrema relevncia. Alm disso, a converso de resduos agroindustriais mediante processos biotecnolgicos permite o desenvolvimento de tecnologia e cincia em pases em desenvolvimento. Os resultados evidenciaram a viabilidade de produo de biossurfactante a partir de resduos agroindustriais, obtendo-se um bioproduto de alto valor agregado a partir de substratos de baixo custo,

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alm de contribuir com o meio ambiente pela diminuio da poluio e desequilbrio gerados pelo acmulo desses resduos. 5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS AIDOO, K.E.; HENDRY, R.; WOOD, B.J.B. Estimation of fungal growth in a solid-state fermentation system. Applied Microbiology and Biotechnology. 12, 6-9, 1981. APHA (American Public Health Association). Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water. 19th ed. APHA, Washington D.C., 1995. AOAC. Official Methods of Analysis of International. 16th Edition, Arlington, Virginia, USA, 1995. BRADDOCK, J.F.; CATTERALL, P.H. A simple method for enumerating gasoline and diesel-degrading microorganisms. Bioremediation Journal. 3, 81-84, 1999. BRODERICK, L.S.; COONEY, J.J. Emulsification of hydrocarbons by bacteria from freshwater ecosystems. Developments in Industrial Microbiology. 23, 425-434, 1982. CASTIGLIONI, G.L. Modelagem e simulao da produo de biossurfactante e lpase por fermentao em estado slido. Dissertao de mestrado em Engenharia e Cincia de Alimentos Fundao Universidade Federal do Rio Grande. Rio GrandeRS, 2006. CERQUEIRA, V.S. Produo de biossurfactante e lipase por Aspergillus fumigatus cultivado em estado slido e avaliao da biorremediao em derrames de leos e derivados. Dissertao de mestrado em Engenharia e Cincia de Alimentos Fundao Universidade Federal do Rio Grande. Rio Grande-RS, 2007. COSTA, E. Produo e avaliao das propriedades de biossurfactante produzido em fermentao fngica em estado slido. Dissertao de mestrado em Engenharia e Cincia de Alimentos Fundao Universidade Federal do Rio Grande. Rio Grande-RS, 2004.

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5.3 PRODUO DE BIOSSURFACTANTES BACTERIANO E FNGICO POR CULTIVO SUBMERSO DE FARELO DE TRIGO

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PRODUO DE BIOSSURFACTANTES BACTERIANO E FNGICO POR CULTIVO SUBMERSO DE FARELO DE TRIGO Marta Heidtmann Pinto, Jorge Alberto Vieira Costa Laboratrio de Engenharia Bioqumica, Departamento de Qumica, Fundao Universidade Federal do Rio Grande (FURG), Caixa Postal 474, CEP 96201-900, Rio Grande, RS, Brasil, Telefone: +55(53)32328653, e-mail: dqmjorge@furg.br RESUMO Os surfactantes exibem propriedades como formao de micelas, de macro e microemulses, solubilidade e detergncia devido a presena de grupos hidrofbicos e hidroflicos em sua estrutura molecular, podendo ser aplicados em uma vasta gama de setores industriais. Quando produzidos por microrganismos, so chamados biossurfactantes. A utilizao de resduos agroindustriais para a produo de biossurfactantes reflete em economia na obteno de um produto de alto valor agregado, alm de contribuir com o meio ambiente devido a reduo da poluio pela emisso desses resduos em corpos dgua, o que causa o consumo de oxignio dissolvido pelos microrganismos, levando ao desequilbrio da fauna e flora aqutica. O presente trabalho teve por objetivo comparar a produo de biossurfactante bacteriano e fngico em diferentes tipos de biorreatores (biorreator de mistura e frasco Erlenmeyer) atravs de cultivo submerso de farelo de trigo. O fungo Aspergillus fumigatus no mostrou-se apto a produzir biossurfactante. Por outro lado, foi possvel constatar a viabilidade da produo de biossurfactante pela bactria Corynebacterium aquaticum, capaz de reduzir tenses e aumentar atividades emulsificantes ao longo dos cultivos. As menores tenses superficiais foram encontradas no cultivo de Corynebacterium aquaticum em biorreator de mistura (28,6 mN.m-1) e em Erlenmeyer (29,1 mN.m-1). As menores tenses interfaciais foram obtidas nos cultivos bacterianos (3,0 mN.m-1). A maior atividade emulsificante leo em gua foi 232,0 UE, obtida no cultivo com a bactria Corynebacterium aquaticum em biorreator de mistura. Os cultivos bacterianos em biorreator de mistura e Erlenmeyer apresentaram maiores atividades emulsificantes gua em leo (37,9 UE e 36,1 UE, respectivamente). Palavras-chave: Aspergillus fumigatus, Corynebacterium aquaticum, surfactantes naturais.

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ABSTRACT The surfactants exhibit properties as micelles, macro and micro emulsions, solubility and detergency formation because of the presence of hydrophobic and hydrophilic groups in their molecular structure, and can be applied in a vast range of industrial sectors. When they are produced by microorganisms, they are called biosurfactants. The use of agroindustrial residues for biosurfactants production reflects in economy in the obtaining of a product of high joined value, besides contributing with the environment due the reduction of the pollution for the emission of those residues in bodies of water, what causes the consumption of dissolved oxygen by microorganisms, taking to the unbalance of the aquatic fauna and flora. This paper aimed at comparing bacterial and fungic biosurfactant production in different bioreactor types (mixture bioreactor and Erlenmeyer flask) through wheat bran submerged cultivation. The fungus Aspergillus fumigatus was not able to produce biosurfactant. On the other hand, it was possible to verify the viability of biosurfactant production by the bacteria Corynebacterium aquaticum, capable to reduce tensions and to increase emulsifying activities along the cultivations. The smallest superficial tensions were found in the cultivation of Corynebacterium aquaticum in mixture bioreactor (28.6 mN.m-1) and in Erlenmeyer (29.1 mN.m-1). The smallest interfacial tensions were obtained in the bacterial cultivations (3.0 mN.m-1). The largest emulsifying activity oil in water was 232.0 UE, obtained in the cultivation with the bacteria Corynebacterium aquaticum in mixture bioreactor. The bacterial cultivations in mixture bioreactor and Erlenmeyer presented larger emulsifying activities water in oil (37.9 UE and 36.1 UE, respectively). Keywords: Aspergillus fumigatus, Corynebacterium aquaticum, natural surfactants.

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1 INTRODUO Os surfactantes so molculas anfipticas com uma poro hidrofbica e uma poro hidroflica, podendo ser sintticos, obtidos a partir de snteses qumicas, ou biossurfactantes, produzidos por microrganismos (COLLA & COSTA, 2003). Com relao aos surfactantes qumicos, os biossurfactantes so biodegradveis e menos txicos e, portanto, menos prejudiciais ao meio ambiente. Podem ser produzidos a partir de vrios substratos, incluindo resduos industriais (TURKOVSKAYA et al., 2001). A importncia comercial dos surfactantes torna-se evidente a partir da tendncia do mercado, que vem aumentando a produo em decorrncia da diversidade de aplicaes industriais. Podem ser utilizados como emulsificantes, solubilizantes, umectantes e detergentes em indstrias como a alimentcia, petroqumica, farmacutica e biomdica (GOUVEIA et al., 2003; MAKKAR & CAMEOTRA, 2002; DESAI & BANAT, 1997). Os surfactantes naturais so produzidos por uma ampla variedade de bactrias, leveduras e fungos filamentosos (KARANTH et al., 1999). Embora a maioria dos estudos de produo de biossurfactantes sejam realizados pelo cultivo submerso de bactrias (VEENANADIG et al., 2000), existem relatos de cultivos fngicos em meio lquido (REICHE & LEMOS, 2005; CAMARGO-DE-MORAIS et al., 2003; SPOECKNER et al., 1999). De acordo com NITSCHKE & PASTORE (2002), nos pases industrializados 70-75% dos surfactantes consumidos so de origem petroqumica, enquanto que nos pases em desenvolvimento os compostos de origem natural predominam. Entretanto, nos pases industrializados existe uma tendncia para a substituio dos surfactantes sintticos pelos naturais. Esta tendncia movida pela necessidade de substituio de compostos no biodegradveis e pelo aumento da especificidade dos produtos, alm da depleo dos recursos de leos requerida para a produo dos surfactantes sintticos (TURKOVSKAYA et al., 2001). Apesar do interesse por surfactantes naturais estar aumentando, esses compostos ainda no competem economicamente com os surfactantes qumicos. Para reduzir os custos de produo de biossurfactantes, necessrio o desenvolvimento de processos fermentativos com altos rendimentos em produto e o uso de substratos de baixo custo, como os resduos agroindustriais (NITSCHKE et al., 2004). Alguns substratos renovveis passveis de utilizao so os leos vegetais, resduos de

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destilarias e indstrias de gros e cereais, (MAKKAR & CAMEOTRA, 2002), suco de caj (ROCHA et al., 2007), resduo lquido de mandioca (NITSCHKE & PASTORE, 2006) e efluente lquido e slido de batata (FOX & BALA, 2000). A escolha de substratos de baixo custo importante para a economia do processo, j que a matria-prima responsvel por 10-30% do custo total da produo de biossurfactates (MAKKAR & CAMEOTRA, 1998). Se resduos industriais orgnicos so utilizados como substratos para a produo de biossurfactante, um benefcio duplo obtido: os resduos so tratados e um produto de elevado valor agregado obtido. Essa abordagem reduz o custo para o tratamento do resduo com o potencial de gerar lucro atravs da comercializao do biossurfactante (KOSARIC, 1992). O objetivo do presente trabalho foi comparar a produo de biossurfactantes bacteriano e fngico em diferentes tipos de biorreatores atravs de fermentao submersa de farelo de trigo. 2 MATERIAL E MTODOS 2.1 Microrganismos Os microrganismos utilizados foram a bactria Corynebacterium aquaticum e o fungo filamentoso Aspergillus fumigatus, ambos cedidos pelo Laboratrio de Microbiologia de Alimentos da Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas (FEA/UNICAMP). 2.2 Manuteno e propagao dos inculos para a fermentao 2.2.1 Inculo bacteriano A cultura de Corynebacterium aquaticum foi mantida a 4C, em tubos de ensaio contendo gar nutriente, formulado conforme a seguir (g.L-1): extrato de carne, 1,0; extrato de levedura, 2,0; peptona, 5,0; NaCl, 5,0; e gar-gar, 15,0. A propagao do inculo foi realizada em frascos Erlenmeyer contendo gar nutriente, incubados por 48 h a 30C. Aps este perodo, foi realizada raspagem da superfcie do gar com meio nutriente, o qual difere do gar nutriente pela ausncia de gar-gar. Ao atingir-se densidade tica 0,8-0,9 ( = 600 nm), a suspenso foi

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utilizada como inculo, sendo adicionada ao meio de cultivo na concentrao de 2% (v/v) (MAKKAR & CAMEOTRA, 1998). 2.2.2 Inculo fngico A manuteno do inculo do fungo Aspergillus fumigatus ocorreu em tubos de ensaio inclinados com gar batata-dextrose (PDA), 0,5% (p/v) de gar-gar e 1% (v/v) de glicerina, a 4C. A propagao do inculo foi realizada em frascos Roux (tambm preparados com gar batata-dextrose (PDA), 0,5% (p/v) de gar-gar e 1% (v/v) de glicerina) atravs da tcnica de espalhamento em superfcie. Os frascos foram incubados a 30C por 7 dias visando o recobrimento completo da superfcie e a esporulao dos microrganismos. Posteriormente, foi realizada a raspagem dos esporos com Tween 80 0,2% (v/v). A suspenso obtida foi filtrada em gaze estril, seguindo-se a contagem de esporos em cmara de Neubauer a fim de calcular o volume de suspenso necessrio para obter uma concentrao inicial de 4x106 esporos.mL-1 (MARTINS, 2005). 2.3 Cultivo submerso Os cultivos foram realizados em biorreator de mistura (Biostat B, B. Braun Biotech International, Alemanha) e em frasco Erlenmeyer (ambos com capacidade de 2 L). O biorreator de mistura era provido de encamisamento, a fim de manter a temperatura constante. Alm da agitao, foi utilizada aerao forada neste biorreator, de forma que antes de entrar no biorreator, o ar foi filtrado em l de vidro e a vazo controlada por rotmetro. J no erlenmeyer, utilizou-se somente a agitao. O meio fermentativo foi composto por um extrato de farelo de trigo (fonte de carbono) adicionado de nutrientes. A obteno do extrato de farelo de trigo foi realizada atravs do procedimento proposto por COSTA (1996) (ANEXO 9.8). Para os cultivos bacterianos, os nutrientes adicionados e suas concentraes foram (mM): NH4NO3, 50,0; Na2HPO4, 3,0; KH2PO4, 3,0; CaCl2, 0,007; MgSO4.7H2O, 0,8; EDTA sdico, 0,004; e FeSO4.7H2O, 2,0 (YEH et al., 2005; WEI et al., 2004); e para os cultivos fngicos (g.L-1): MgSO4.7H2O, 0,5; NaNO3, 3,0; KH2PO4, 1,0; extrato de levedura, 1,0; e peptona, 0,3 (COSTA, 2004). Nos cultivos bacterianos, o pH inicial foi 6,0 (NITSCHKE & PASTORE, 2006) e a agitao 200 rpm (YEH et al., 2005). No biorreator de mistura a aerao foi mantida

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em 1 vvm (MAKKAR & CAMEOTRA, 2001). J nos cultivos fngicos, o pH inicial foi 4,5 (COSTA, 2004) e a agitao 150 rpm (PAPAGIANNI et al., 2001). No biorreator de mistura a aerao foi mantida em 0,5 vvm (COSTA, 1996). Para ambos os cultivos a temperatura foi 30C (NITSCHKE & PASTORE, 2006; REICHE & LEMOS, 2005) e o tempo de fermentao 72 h (PAPAGIANNI et al., 2001; FOX & BALA, 2000). Ao trmino dos cultivos, o meio fermentado foi centrifugado a 7000 rpm por 15 min, e o sobrenadante obtido utilizado para posteriores determinaes analticas, realizadas em triplicata, a cada 12 h do processo fermentativo. 2.4 Determinaes analticas 2.4.1 Biomassa O crescimento bacteriano durante os cultivos foi acompanhado utilizando-se a microtcnica do Nmero Mais Provvel (NMP), adaptada de BRADDOCK & CATTERALL (1999), e tabelas de NMP (APHA, 1995). O crescimento celular do fungo Aspergillus fumigatus foi acompanhado utilizando a dosagem de glicosamina, segundo AIDOO et al. (1981) (ANEXO 9.4). A fim de estabelecer uma correlao entre o contedo de glicosamina e a biomassa fngica, foi realizada fermentao submersa do fungo Aspergillus fumigatus em meio Sabouraud (LARONE, 1987) por 48 h, tempo correspondente ao final da fase exponencial de crescimento do microrganismo. Aps, determinou-se o teor de glicosamina de diferentes concentraes celulares do fungo e obteve-se, por regresso linear, a relao entre a massa seca do fungo e o contedo de glicosamina, que foi utilizada, posteriormente, na determinao da massa celular obtida nos cultivos submersos (ANEXO 9.5). 2.4.2 Oxignio dissolvido e velocidade de consumo de oxignio No biorreator de mistura foi possvel acompanhar o comportamento do oxignio dissolvido, bem como calcular o coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (Equao 1) (ANEXO 9.9) e a velocidade de consumo de oxignio pelas clulas de microrganismos ao longo dos cultivos (Equao 2) (ANEXO 9.10) (SCHMIDELL et al., 2001).

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C ln 1 C S

= K L a t

(1)

QO 2 X = K L a (Cs C )
Onde:

(2)

C = concentrao de oxignio em diferentes instantes de tempo durante o cultivo (mg.L-1); Cs = concentrao de oxignio na saturao (mg.L-1); KLa = coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (h-1); t = instantes de tempo em que a concentrao de oxignio foi medida (h); QO2X = velocidade de consumo de oxignio pelas clulas (mg.L-1.h-1). 2.4.3 pH O pH foi determinado atravs de leitura direta em pHmetro digital (Quimis HI 8314), utilizando eletrodo de vidro. 2.4.4 Estimativa da atividade biossurfactante A estimativa da atividade biossurfactante foi realizada por diferentes mtodos: a medida das tenses superficial e interfacial e atravs das atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo. 2.4.4.1 Tenses superficial e interfacial As tenses superficial e interfacial foram determinadas em tensimetro (Kruss Processor Tensiometer K-6, Alemanha) usando o mtodo do anel (ANEXO 9.1). A tenso superfacial foi medida com a amostra em contato com o ar, e a tenso interfacial com a amostra em contato com hexadecano (COSTA et al., 2006; RODRIGUES et al., 2006a).

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2.4.4.2 Atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo A atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo foram determinadas utilizando-se 3,5 mL de amostra diluda e 2,0 mL de leo de soja. A mistura foi agitada em agitador tipo vortex (Phoenix AP56, Brasil) a 700 rpm por 1 min. Aps 60 min de repouso foi lida a absorbncia do meio emulsificado leo/gua em espectrofotmetro (Femto 700 Plus, Brasil) a 610 nm (JOHNSON et al., 1992), calculando-se a atividade emulsificante leo em gua atravs da Equao 3. Aps 24 h de repouso foi realizada leitura da altura da emulso gua/leo formada e da altura total (altura da emulso mais altura da camada remanescente de leo) (BRODERICK & COONEY, 1982), obtendo-se a atividade emulsificante gua em leo de acordo com a Equao 4.

AE o / a = ( Absamostra Absbranco ) D

(3)

AEa / o = (E amostra Ebranco ) D

Onde: AEo/a = atividade emulsificante leo em gua (UE); AEa/o = atividade emulsificante gua em leo (UE); Absamostra = absorbncia da emulso leo/gua; Absbranco = absorbncia da amostra diluda;

(4)

Eamostra = relao centesimal entre a altura da emulso gua/leo e a altura total utilizando amostra; Ebranco = relao centesimal entre a altura da emulso gua/leo e a altura total utilizando gua; D = diluio da amostra em gua. A atividade emulsificante leo em gua foi definida como a quantidade de biossurfactante necessria para aumentar a absorbncia em 1,0 a 610 nm, e a atividade emulsificante gua em leo como a quantidade de biossurfactante necessria para manter a emulso estvel por 24 h (MARTINS, 2005).

88

2.5 Produtividade As produtividades mximas com relao as tenses superficial e interfacial e as atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo foram calculadas de acordo com a Equao 5 (SCHMIDELL et al., 2001).

PP =

P P0 t

(5)

Onde: PP = produtividade em produto (gprod.L-1.h-1); P = concentrao de produto no tempo t (gprod.L-1); P0 = concentrao de produto no incio da fermentao (gprod.L-1); t = tempo de cultivo (h). Como a produo de biossurfactante foi verificada atravs de mtodos indiretos, a concentrao de produto foi expressa em unidade de tenso (mN.m-1) ou de atividade emulsificante (UE). 2.6 Anlise estatstica As fermentaes foram realizadas conforme planejamento experimental fatorial completo 22, em duplicata. As variveis estudadas foram o microrganismo (bactria Corynebacterium aquaticum ou fungo Aspergillus fumigatus) e o biorreator (de mistura ou frasco Erlenmeyer). As respostas foram as menores tenses superficiais e interfaciais, maiores atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo e produtividades mximas em cada experimento. Os resultados foram tratados por anlise de varincia (ANOVA), a um nvel de significncia de 5%. A Tabela 1 apresenta os nveis reais e codificados das variveis estudadas nos cultivos.

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TABELA 1 Variveis do planejamento experimental fatorial completo 22 e seus respectivos nveis reais e codificados. Ensaio 1 2 3 4 Microrganismo Corynebacterium aquaticum (-1) Aspergillus fumigatus (+1) Corynebacterium aquaticum (-1) Aspergillus fumigatus (+1) Biorreator biorreator de mistura (-1) biorreator de mistura (-1) frasco Erlenmeyer (+1) frasco Erlenmeyer (+1)

3 RESULTADOS E DISCUSSO O crescimento dos microrganismos durante os cultivos pode ser observado na Figura 1. A Figura 2 mostra o comportamento do oxignio dissolvido e da velocidade de consumo de oxignio pelas clulas nos ensaios em biorreator de mistura. Na Figura 1a, verifica-se que a biomassa bacteriana no biorreator de mistura e em Erlenmeyer foi semelhante ao longo do processo fermentativo, com crescimento levemente superior no biorreator de mistura de 12 a 48 h, o que pode estar associado a presena de aerao neste biorreator, alm da agitao. No cultivo da bactria Corynebacterium aquaticum em biorreator de mistura, o oxignio dissolvido no meio diminuiu rapidamente de 6 a 12 h de cultivo, permenecendo prximo de zero de 12-48 h, intervalos de tempo estes que coincidem com aumento exponencial do crescimento bacteriano neste biorreator (Figuras 1 e 2). YEH et al. (2006), estudando a produo de surfactina por Bacillus subtilis em agitao de 300 rpm e aerao de 1,5 vvm, verificaram que o oxignio dissolvido diminuiu de 70 para 2% no incio do crescimento celular, mantendo-se prximo de zero de 20 60 h de cultivo, durante a fase exponencial de crescimento. A biomassa de fungos (Figura 1b) foi semelhante nos diferentes biorreatores utilizados at 48 h de cultivo, e superior em 60 e 72 h no biorreator de mistura, onde atingiu 15,54 mg.mL-1. No frasco erlenmeyer, a mxima biomassa obtida foi 11,20 mg.mL-1, resultado semelhante ao encontrado por PAPAGIANNI et al. (2001) ao cultivar o fungo Aspergillus niger em meio lquido sinttico a 150 rpm (10,00 g.L-1). A concentrao de oxignio dissolvido permaneceu em torno de zero durante grande parte do processo fermentativo (12-48 h), coincidindo com a fase exponencial de crescimento do microrganismo (Figuras 1 e 2). No obstante a concentrao do oxignio dissolvido tenha permanecido em torno de zero de 12-48 h em ambos os

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cultivos, a velocidade mxima de consumo de oxignio foi maior no cultivo bacteriano (187,65 mg.L-1.h-1) do que no fngico (155,09 mg.L-1.h-1). O pH variou de 3,69 a 6,31 nos cultivos fngicos, e de 5,78 a 8,03 nos cultivos bacterianos (ANEXO 9.7). Variaes no pH resultam do consumo do substrato e/ou produo de metablitos (MAUREL et al., 2003). (a)
Biomassa bacteriana (NMP.mL -1) Biomassa fngica (mg.mL -1)
5x10 11 5x10 10 5x10 9 5x10 8 5x10 7

(b)
16 12 8 4 0 12 24 36 Tempo (h) 48 60 72

12

24

36

48

60

72

Tempo (h)

FIGURA 1 Crescimento dos microrganismos durante os cultivos. (a) Biomassa bacteriana e (b) biomassa fngica. Corynebacterium aquaticum/biorreator de mistura, Aspergillus fumigatus/biorreator de mistura, Corynebacterium aquaticum/frasco Erlenmeyer e Aspergillus fumigatus/frasco Erlenmeyer. (a)
8 7 6 5 4 3 2 1 0 O2 dissolvido (mg.L ) O2 dissolvido (mg.L ) QO2X (mg.L .h ) 210 180 150 120 90 60 30 0 0 12 24 36 48 60 72 8 7 6 5 4 3 2 1 0
-1 -1 -1

(b)
QO2X (mg.L .h ) 210 180 150 120 90 60 30 0 0 12 24 36 48 60 72
-1 -1

Tempo (h)

-1

Tempo (h)

FIGURA 2 Oxignio dissolvido e velocidade de consumo de oxignio nos ensaios em biorreator de mistura. (a) Corynebacterium aquaticum/biorreator de mistura e (b) Aspergillus fumigatus/biorreator de mistura. e oxignio dissolvido, e de consumo de oxignio. As tenses superficial e interfacial e as atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo determinadas durante os cultivos encontram-se nas Figuras 3 e 4, respectivamente. Verifica-se que as tenses diminuiram e as atividades emulsificantes velocidade

91

aumentaram nos cultivos bacterianos, porm permaneceram praticamente constantes nos cultivos fngicos, demonstrando a habilidade da bactria Corynebacterium aquaticum em produzir biossurfactante. Nos processos fermentativos com a bactria, as tenses diminuiram drasticamente de 0-12 h de cultivo, tornando-se constantes logo em seguida. Este intervalo de tempo coincide com aumento acelerado do crescimento e com a reduo do oxignio dissolvido no biorreator de mistura para valores prximos de zero. As atividades emulsificantes aumentaram at 60 h, diminuindo ou permanecendo praticamente constantes em 72 h. As redues das tenses e o aumento das atividades emulsificantes nos cultivos bacterianos no ocorreram concomitantemente. Enquanto as tenses reduziram, as atividades emulsificantes permaneceram praticamente constantes, aumentando somente depois, quando as tenses se tornaram constantes. Este fato pode ser explicado atravs do conceito de concentrao micelar crtica (CMC), a concentrao de surfactante em que h a associao das molculas anfipticas na forma de micelas, e as tenses superficial e interfacial se tornam constantes, mesmo com o aumento da concentrao de biossurfactante (MULLIGAN, 2005). Desta forma, a concentrao de biossurfactante pode estar aumentando no meio, o que leva ao aumento das atividades emulsificantes nos cultivos bacterianos, enquanto as tenses permanecem constantes (Figuras 3 e 4). PRUTHI & CAMEOTRA (2003) avaliaram a produo de biossurfactante por Pseudomonas putida. A tenso superficial diminuiu at 48 h de fermentao, atingindo 30,6 mN.m-1 e permanecendo constante logo aps, enquanto a atividade emulsificante e a concentrao de biossurfactante continuaram a aumentar, atingindo seus mximos em 72 h de cultivo (42% e 6,28 g.L-1, respectivamente). NITSCHKE & PASTORE (2006), estudando a produo de biossurfactante por Bacillus subtilis em resduo lquido de mandioca, encontraram tenso superficial mnima de 26,6 mN.m-1 em 12 h de cultivo. Aps, a tenso superficial permaneceu constante, porm, a concentrao de biossurfactante continuou a aumentar at 48 h de fermentao, atingindo 3,0 g.L-1.

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(a)
55 50 TS (mN.m ) 45 40 35 30 25 0 12 24 36 Tempo (h) 48 60 72 TI (mN.m-1)
-1

(b)
20 16 12 8 4 0 12 24 36 Tempo (h) 48 60 72

FIGURA 3 Tenses superficial e interfacial ao longo do tempo de cultivo. (a) Tenses superficiais (TS) e (b) tenses interfaciais (TI). Corynebacterium aquaticum/biorreator de mistura, Aspergillus fumigatus/biorreator de mistura, Corynebacterium aquaticum/frasco Erlenmeyer e Aspergillus fumigatus/frasco Erlenmeyer.

(a)
250 200 150 100 50 0 0 12 24 36 Tempo (h) 48 60 72 AEa/o (UE) AEo/a (UE) 40 30 20 10 0

(b)

12

24

36 Tempo (h)

48

60

72

FIGURA 4 Atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo durante os cultivos. (a) Atividade emulsificante leo em gua (AEo/a) e (b) atividade emulsificante gua em leo (AEa/o). Corynebacterium aquaticum/biorreator de mistura, Aspergillus fumigatus/biorreator de mistura, Corynebacterium aquaticum/frasco Erlenmeyer e Aspergillus fumigatus/frasco Erlenmeyer. As menores tenses superficial e interfacial e as maiores atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo encontradas ao longo dos processos fermentativos, bem como as produtividades mximas para cada resposta analisada esto apresentadas nas Tabelas 2 e 4, respectivamente. Os efeitos das variveis

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estudadas sobre as repostas obtidas foram calculados por anlise de varincia e encontram-se nas Tabelas 3 e 5. Verificou-se que a varivel microrganismo apresentou significncia estatstica sobre todas as respostas estudadas (p<0,05). Os cultivos com a bactria Corynebacterium aquaticum apresentaram menores tenses e maiores atividades emulsificantes do que os cultivos com o fungo Aspergillus fumigatus. Por sua vez, a mudana de um biorreator para outro influenciou somente a atividade emulsificante leo em gua e produtividade correspondente (p<0,05). Em biorreator de mistura obteve-se, em mdia, maiores atividades emulsificantes leo em gua do que em Erlenmeyer (Tabelas 3 e 5). As menores tenses superficiais e maiores produtividades relativas reduo desta tenso foram encontradas nos cultivos de Corynebacterium aquaticum em biorreator de mistura (28,6 mN.m-1 e 1,78 mN.m-1.h-1, respectivamente) e em frasco erlenmeyer (29,1 mN.m-1 e 1,81 mN.m-1.h-1, respectivamente). A tenso superficial foi, em mdia, 18,9 mN.m-1 menor, e a produtividade relativa a essa resposta 1,70 mN.m1

.h-1 maior nos cultivos bacterianos (p<0,05), independente do fermentador utilizado As menores tenses interfaciais foram obtidas nos cultivos de Corynebacterium

(p>0,05) (Tabelas 2 e 3). aquaticum em biorreator de mistura e em frasco Erlenmeyer (3,0 mN.m-1). A produtividade relativa reduo da tenso interfacial apresentou valores mximos de 1,29 mN.m-1.h-1 e 1,18 mN.m-1.h-1. Nos cultivos bacterianos, a tenso interfacial foi, em mdia, 13,5 mN.m-1 menor, e a produtividade relativa a essa resposta 1,23 mN.m1

.h-1 maior do que nos cultivos fngicos (p<0,05), tanto em biorreator de mistura quanto

em Erlenmeyer (p>0,05) (Tabelas 2 e 3). TABELA 2 Resultados das menores tenses superficiais e interfaciais e produtividades mximas para os experimentos do planejamento fatorial completo 22. Ensaio 1 2 3 4 Mo C. aquaticum A. fumigatus C. aquaticum A. fumigatus BR Bi Bi E E TS (mN.m ) 28,6 1,1 47,3 1,9 29,1 0,4 48,3 1,6
-1

ProdTS (mN.m .h ) 1,78 0,17 0,11 0,06 1,81 0,02 0,09 0,05
-1 -1

TI (mN.m ) 3,0 0,5 16,6 0,0 3,0 0,1 16,3 0,4

-1

ProdTI (mN.m-1.h-1) 1,29 0,04 0,00 0,00 1,18 0,01 0,01 0,02

Mo = microrganismo; BR = biorreator; Bi = biorreator de mistura; E = frasco Erlenmeyer; TS = tenso superficial; TI = tenso interfacial; Prod = produtividade.

94

TABELA 3 Efeitos e nveis de significncia para as respostas tenso superficial, tenso interfacial e respectivas produtividades. TS (mN.m ) Efeito (1) Mo (2) BR 1x2 18,9 0,8 0,3 p < 0,01 0,469 0,791
-1

ProdTS (mN.m .h ) Efeito -1,70 0,01 -0,03 p < 0,01 0,916 0,701
-1 -1

TI (mN.m ) Efeito 13,5 -0,2 -0,1 p < 0,01 0,475 0,604

-1

ProdTI (mN.m-1.h-1) Efeito -1,23 -0,05 0,06 p < 0,01 0,054 0,027

Mo = microrganismo; BR = biorreator; TS = tenso superficial; TI = tenso interfacial; Prod = produtividade; p = significncia estatstica.

As

maiores

atividade

emulsificante
-1

leo

em

gua

produtividade

correspondente foram 232,0 UE e 3,83 UE.h , respectivamente, obtidas no cultivo de Corynebacterium aquaticum em biorreator de mistura. O efeito do microrganismo utilizado no aumento da atividade emulsificante leo em gua e produtividade relativa a essa resposta sugere uma relao com o tipo de biorreator utilizado. Nos cultivos bacterianos encontrou-se, em mdia, maiores atividades emulsificantes leo em gua e produtividades correspondentes do que nos cultivos fngicos, sendo que esse efeito foi mais pronunciado no biorreator de mistura do que no Erlenmeyer (Tabelas 4 e 5). Nos cultivos com a bactria Corynebacterium aquaticum em biorreator de mistura e frasco Erlenmeyer encontrou-se as maiores atividades emulsificantes gua em leo (37,9 UE e 36,1 UE) e produtividades relativas a essa resposta (0,62 UE.h-1 e 0,58 UE.h-1) do que nos cultivos com o fungo Aspergillus fumigatus, de forma que esse efeito foi mais pronunciado no biorreator de mistura do que no Erlenmeyer (Tabelas 4 e 5). TABELA 4 Resultados das maiores atividades emulsificantes leo/gua e gua/leo e produtividades mximas para os experimentos do planejamento fatorial completo 22. Ensaio 1 2 3 4 Mo C. aquaticum A. fumigatus C. aquaticum A. fumigatus BR Bi Bi E E AEo/a (UE) 232,0 13,7 19,4 0,3 171,2 3,9 15,3 0,5 Prodo/a (UE.h ) 3,83 0,22 0,32 0,09 2,56 0,12 0,24 0,01
-1

AEa/o (UE) 37,9 2,4 5,7 0,1 36,1 0,6 8,8 0,1

Proda/o (UE.h-1) 0,62 0,04 0,12 0,01 0,58 0,01 0,22 0,00

Mo = microrganismo; BR = biorreator; Bi = biorreator de mistura; E = frasco Erlenmeyer; AE = atividade emulsificante; o/a = leo em gua; a/o = gua em leo; Prod = produtividade.

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TABELA 5 Efeitos e nveis de significncia para as respostas atividade emulsificante leo em gua, atividade emulsificante gua em leo e respectivas produtividades. AEo/a (UE) Efeito (1) Mo (2) BR 1x2 -184,2 -32,4 28,4 p < 0,01 < 0,01 < 0,01 Prodo/a (UE.h-1) Efeito -2,92 -0,68 0,59 p < 0,01 < 0,01 < 0,01 -29,7 0,6 2,4 AEa/o (UE) Efeito p < 0,01 0,511 0,049 Proda/o (UE.h-1) Efeito -0,43 0,04 0,07 p < 0,01 0,052 < 0,01

Mo = microrganismo; BR = biorreator; AE = atividade emulsificante; o/a = leo em gua; a/o = gua em leo; Prod = produtividade; p = significncia estatstica.

Os microrganismos utilizados neste trabalho foram previamente selecionados como produtores de biossurfactante. A bactria Corynebacterium aquaticum produziu biossurfactante em meio lquido sinttico, apresentando reduo da tenso superficial e aumento da atividade emulsificante durante o cultivo (dados no mostrados). A produo de biossurfactante pelo fungo Aspergillus fumigatus foi comparada com outros fungos atravs da velocidade de crescimento radial em placas de petri contendo meio nutriente adicionado de 2% de gar-gar e 1,5% de glicerina (meio slido) (JUNIOR et al., 2003). O cultivo submerso com bactrias predominante para a produo de biossurfactante. As bactrias mais citadas na literatura so Bacillus subtilis e Pseudomonas aeruginosa. Alm dessas, bactrias do gnero Corynebacterium tm sido reportadas como potenciais produtoras de biossurfactante. COOPER et al. (1979), estudando a produo de biossurfactante por Corynebacterium lepus em meio lquido sinttico adicionado de querosene, verificaram comportamento semelhante ao encontrado no presente trabalho para a bactria Corynebacterium aquaticum com relao a tenso superficial, j que a mesma diminuiu para cerca de 30 mN.m-1 anteriormente a 20 h de fermentao e permaneceu constante at o final do cultivo. CROSMAN et al. (2002) estudaram a produo de biossurfactante por Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511 utilizando hexadecano como substrato. O biossurfactante do tipo fosfolipdio produzido foi capaz de reduzir a tenso superficial para valores abaixo de 32 mN.m-1 e atingiu concentrao de 2,7 g.L-1. A produo de biossurfactante a partir de melao, soro de leite, gua residual de farinha de mandioca e meio de cultura sinttico foi avaliada por NITSCHKE et al. (2004). Quando a gua residual de farinha de mandioca foi utilizada, obtiveram a

96

maior porcentagem de reduo da tenso superficial (42%), que passou de 46,7 mN.m-1 para valores em torno de 26,0 mN.m-1. A habilidade da bactria Pseudomonas aeruginosa em produzir biossurfactante em suco de caju adicionado ou no de peptona e em meio mineral foi investigada por ROCHA et al. (2007). Melhor resultado foi encontrado quando o meio utilizado foi suco de caju adicionado de peptona, em que a tenso superficial baixou de 50,0 para 29,5 mN.m-1 (41%). Resultado superior foi encontrado no presente trabalho para a bactria Corynebacterium aquaticum, a qual chegou a apresentar reduo da tenso superficial de 51,1 para 29,1 mN.m-1 (43%). O fungo Aspergillus fumigatus no propiciou resultados satisfatrios de produo de biossurfactante em meio lquido, de forma que todas as produtividades obtidas nos cultivos (Tabelas 2 e 4) apresentaram valores prximos de zero. Todavia, existem relatos na literatura, embora poucos, do cultivo submerso de fungos para a produo de biossurfactante (CAMARGO-DE-MORAIS et al., 2003; SPOECKNER et al., 1999). O fungo Aspergillus fumigatus utlizado no presente trabalho produz biossurfactante de alta capacidade emulsificante em meio slido (CERQUEIRA, 2007; CASTIGLIONI, 2006; MARTINS, 2005; COSTA, 2004; JUNIOR et al., 2003). REICHE & LEMOS (2005) avaliaram a produo de biossurfactante pelo fungo Aspergillus fumigatus atravs de fermentao submersa de diferentes meios de cultivo. As tenses superficiais medidas ao trmino das fermentaes variaram de 36,5 a 60,6 mN.m-1. Desta maneira, inferiram que os constituintes do meio de cultivo influenciam a produo de biossurfactante. A manipulao de fatores nutricionais vem sendo pesquisada por diversos autores (RODRIGUES et al., 2006b; YEH et al., 2005; PRUTHI & CAMEOTRA, 2003). Alm da alta atividade de gua e da composio do meio nutriente, outro fator que pode ter influenciado as baixas produtividades relativas a produo de biossurfactante pelo fungo Aspergillus fumigatus neste trabalho a agitao (PAPAGIANNI et al., 2001). A agitao influencia a morfologia dos fungos em cultivos submersos, que por sua vez afeta a produo de metablitos. As foras hidrodinmicas devido a agitao podem desfavorecer e formao de pellets, favorecendo a forma filamentosa do fungo. A formao de pellets miceliais freqentemente considerada como um pr-requisito para o sucesso da produo de metablitos microbianos. Porm, em alguns casos, a morfologia filamentosa a que conduz produo tima de metablitos (PAPAGIANNI et al., 2001). No presente trabalho, verificou-se o desenvolvimento do fungo Arpergillus fumigatus na forma de

97

filamentos, indicando que a agitao utilizada (150 rpm) foi alta, o que pode ter desfavorecido a produo de biossurfactantes. A tecnologia dos processos submersos aerados inclui uma tcnica muito utilizada em escala de laboratrio: os cultivos em frascos agitados. A finalidade da agitao em cultivos aerados suprir oxignio e coloc-lo em contato com as clulas em crescimento, alm de facilitar as trocar metablicas entre as clulas e o meio. A agitao mecnica ou borbulhamento de ar, ou ainda, ambas as formas, so mais aplicadas a processos submersos industriais (REGULY, 2000). Nos cultivos bacterianos e fngicos, as nicas respostas que foram influenciadas pelo biorreator foram a atividade emulsificante leo em gua e a sua respectiva produtividade (p<0,05), o que indica que estudos de produo de biossurfactante em escala de laboratrio em Erlenmeyer e biorreator de mistura no se afastam demasiadamente, sugerindo ainda que o aumento de escala pode proporcionar resultados semelhantes aos encontrados em pequena escala, j que o volume de meio utilizado no Erlenmeyer (600 mL) foi inferior ao utilizado no biorreator de mistura (1600 mL). 4 CONCLUSES O fungo Aspergillus fumigatus no mostrou-se apto a produzir biossurfactante atravs de fermentao submersa de farelo de trigo. Por outro lado, foi possvel constatar a viabilidade da produo de biossurfactante pela bactria Corynebacterium aquaticum, capaz de reduzir tenses e aumentar atividades emulsificantes ao longo dos processos fermentativos. As menores tenses superficiais foram encontradas
-1

no

cultivo

de

Corynebacterium aquaticum em biorreator de mistura (28,6 mN.m ) e em Erlenmeyer (29,1 mN.m-1). As menores tenses interfaciais foram obtidas nos cultivos bacterianos (3,0 mN.m-1). A maior atividade emulsificante leo em gua foi obtida no cultivo com a bactria Corynebacterium aquaticum em biorreator de mistura (232,0 UE). Os cultivos bacterianos em biorreator de mistura e Erlenmeyer apresentaram maiores atividades emulsificantes gua em leo (37,9 UE e 36,1 UE, respectivamente). Os resultados obtidos evidenciaram a possibilidade de produo de biossurfactante pela bactria Corynebacterium aquaticum a partir de farelo de trigo. Desta maneira, possvel reduzir custos de produo utilizando resduos agroindustriais, obtendo um produto de alto valor agregado, alm de contribuir com o meio ambiente devido a reduo da poluio pela emisso desses resduos em corpos

98

dgua, o que causa o consumo de oxignio dissolvido pelos microrganismos em seus processos metablicos de utilizao e estabilizao da matria orgnica, levando ao desequilbrio da fauna e flora aqutica. 5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS AIDOO, K.E.; HENDRY, R.; WOOD, B.J.B. Estimation of fungal growth in a solid-state fermentation system. Applied Microbiology and Biotechnology. 12, 6-9, 1981. APHA (American Public Health Association). Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water. 19th ed. APHA, Washington D.C., 1995. BRADDOCK, J.F.; CATTERALL, P.H. A simple method for enumerating gasoline and diesel-degrading microorganisms. Bioremediation Journal. 3, 81-84, 1999. BRODERICK, L.S.; COONEY, J.J. Emulsification of hydrocarbons by bacteria from freshwater ecosystems. Developments in Industrial Microbiology. 23, 425-434, 1982. CAMARGO-DE-MORAIS, M.M.; RAMOS, S.A.F.; PIMENTEL, M.C.B.; MORAIS JR, M.A.; LIMA FILHO, J.L. Production of an extracellular polysaccharide with emulsifier properties by Penicillium citrinum. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 19, 191-194, 2003. CASTIGLIONI, G.L. Modelagem e simulao da produo de biossurfactante e lpase por fermentao em estado slido. Dissertao de mestrado em Engenharia e Cincia de Alimentos Fundao Universidade Federal do Rio Grande. Rio GrandeRS, 2006. CERQUEIRA, V.S. Produo de biossurfactante e lipase por Aspergillus fumigatus cultivado em estado slido e avaliao da biorremediao em derrames de leos e derivados. Dissertao de mestrado em Engenharia e Cincia de Alimentos Fundao Universidade Federal do Rio Grande. Rio Grande-RS, 2007.

99

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6 CONCLUSES GERAIS A bactria Corynebacterium aquaticum foi selecionada como produtora de biossurfactante, uma vez que apresentou menor tenso superficial (28,8 mN.m-1), maior concentrao celular (1,98 g.L-1), velocidade instantnea de crescimento celular (0,042 g.L-1.h-1), produtividade com relao a reduo da tenso superficial (2,01 mN.m-1.h-1), produtividade com relao a atividade emulsificante leo em gua (2,65 UE.h-1) e produtividade com relao a atividade emulsificante gua em leo (0,40 UE.h-1) com relao a outras culturas de bactrias utilizadas. Nos cultivos em estado slido verificou-se que o biossurfactante bacteriano foi capaz de reduzir tenses superficiais e interfaciais, alm de formar emulses leo em gua e gua em leo, enquanto o biossurfactante fngico foi mais eficaz na formao das emulses. As menores tenses superficiais foram encontradas em cultivos bacterianos em biorreator de coluna (33,1 mN.m-1) e em Erlenmeyer (31,3 mN.m-1). A menor tenso interfacial (6,2 mN.m-1) foi obtida no cultivo bacteriano em biorreator de coluna. Por outro lado, o fungo apresentou melhores resultados com relao a atividade emulsificante leo em gua, 291,8 UE em biorreator de coluna e 327,9 UE no frasco Erlenmeyer. A atividade emulsificante gua em leo foi, em mdia, maior nos cultivos com o fungo Aspergillus fumigatus, atingindo 60,4 UE em biorreator de coluna. O fungo Aspergillus fumigatus no mostrou-se apto a produzir biossurfactante atravs de fermentao submersa de farelo de trigo. Por outro lado, a bactria Corynebacterium aquaticum produziu biossurfactante capaz de reduzir tenses e aumentar atividades emulsificantes ao longo dos cultivos. As menores tenses superficiais foram encontradas no cultivo de Corynebacterium aquaticum em biorreator de mistura (28,6 mN.m-1) e em Erlenmeyer (29,1 mN.m-1). As menores tenses interfaciais foram obtidas nos cultivos bacterianos (3,0 mN.m-1). A maior atividade emulsificante leo em gua foi 232,0 UE, obtida no cultivo com a bactria Corynebacterium aquaticum em biorreator de mistura. Os cultivos bacterianos em biorreator de mistura e Erlenmeyer apresentaram maiores atividades emulsificantes gua em leo (37,9 UE e 36,1 UE, respectivamente). Logo, foi possvel constatar a viabilidade da produo de biossurfactante pela bactria Corynebacterium aquaticum, capaz de reduzir tenses e promover emulses tanto em meio slido quanto em meio lquido. O fungo Aspergillus fumigatus mostrouse eficaz na produo de biossurfactante com alta capacidade emulsificante em meio

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slido. O microrganismo a ser utilizado depender da aplicao desejada para o biossurfactante. Em processos de biorremediao em que o solo revolvido periodicamente, a utilizao do biossurfactante bacteriano seria interessante, j que auxiliaria na emulso do contaminante, alm da reduo da tenso na interface leo/gua. Porm, se a finalidade for promover a emulso em alimentos, a utilizao do biossurfactante fngico seria a recomendada, aps purificao e testes de toxicidade. A converso de resduos agroindustriais mediante processos biotecnolgicos permite o desenvolvimento de tecnologia e cincia em pases em desenvolvimento. Os resultados mostraram a possibilidade de produo de biossurfactante a partir de resduos agroindustriais, o que torna o processo mais econmico, obtendo-se um bioproduto de valor agregado a partir de substratos de baixo custo, alm de contribuir com o meio ambiente pela diminuio da poluio e desequilbrio gerados pelo acmulo desses resduos.

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7 SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS Como sugestes para trabalhos futuros, prope-se: - otimizar a produo de biossurfactante pela bactria Corynebacterium aquaticum em meio slido e lquido e pelo fungo Aspergillus fumigatus em meio slido; - avaliar o influncia do pH, temperatura, agitao, aerao, umidade, granulometria biossurfactante; - estudar os componentes da soluo nutriente utilizada nos cultivo, bem como as concentraes ideais; - testar a produo de biossurfactante em condies limitadas de nitrognio; - estudar a adio de fontes hidrofbicas de carbono na produo de biossurfactante; - estudar a extrao do biossurfactante do meio slido testando diferentes agitaes, temperaturas, tempos, propores meio fermentado:solvente e pHs; - estudar a purificao do biossurfactante; - estudar o aumento de escala para a produo de biossurfactante; avaliar a biorremediao de ambientes contaminados com hidrocarbonetos/leos utilizando o biossurfactante bacteriano; - verificar o potencial de utilizao dos biossurfactantes produzidos no tratamento de efluentes industriais. da partcula e concentrao celular inicial na produo de

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9 ANEXOS 9.1 Mtodo do anel para medida das tenses superficial e interfacial Tensimetros determinam tenses superficiais e interfaciais com a ajuda de um anel suspenso de uma balana precisa. Nesse mtodo, um recipiente contendo a amostra a ser analisada levantado at que o contato da amostra com a superfcie do anel seja registrado. A amostra ento abaixada, de maneira que o filme lquido produzido abaixo do anel alongado. Como o filme lquido estendido, uma fora mxima experimentada e medida, obtendo-se as tenses superficial ou interfacial (RODRIGUES et al., 2006a). 9.2 Acompanhamento das tenses superficiais do meio fermentado na presena e na ausncia das clulas de bactria durante os cultivos - Artigo 1 TABELA 1 Tenses superficiais do meio fermentado na presena e na ausncia das clulas de bactria para os experimentos 1 e 2. Tempo (h) 0 12 24 36 48 60 72 Experimento 1 TS pre cl (mN.m ) 63,0 0,42e 35,7 0,14abc 28,8 0,28a 31,6 1,20 ab 39,3 5,94 abcd 43,8 4,60cd 47,5 2,33 cd
-1

Experimento 2 TS pre cl (mN.m ) 64,3 2,83de 64,4 4,17de 56,2 2,69 abcd 54,0 2,76abc 55,6 5,02 abcd 60,8 0,99cde 48,4 0,42a
-1

TS aus cl (mN.m ) 70,2 0,01e 43,1 0,28bcd 42,3 2,12bcd 49,8 5,02d 48,9 4,38d 48,8 0,14d 42,7 3,61bcd
-1

TS

aus cl

(mN.m-1) 70,2 0,01e 58,9 3,18bcd 61,5 1,70 cde 60,9 0,42 cde 62,0 0,85 cde 59,9 1,77bcd 50,3 2,12ab

TS pre cl = tenso superficial do meio fermentado na presena das clulas de microrganismo; TS aus cl = tenso superficial do meio fermentado na ausncia das clulas de microrganismo. Letras iguais correspondem aos valores de tenso superficial que no apresentaram diferena significativa (nvel de significncia de 5%) para cada experimento.

122

TABELA 2 Tenses superficiais do meio fermentado na presena e na ausncia das clulas de bactria para os experimentos 3 e 4. Tempo (h) 0 12 24 36 48 60 72 Experimento 3 TS pre cl (mN.m ) 70,2 0,0e 70,1 0,3e 63,6 2,6bcde 56,4 1,2abc 64,2 2,0cde 63,2 3,0bcde 54,8 1,1ab
-1

Experimento 4 TS pre cl (mN.m ) 70,0 0,0cd 69,2 1,0cd 67,0 1,2bcd 64,9 3,3abcd 66,1 0,3bcd 66,2 0,6bcd 58,7 1,9ab
-1

TS aus cl (mN.m ) 70,2 0,0e 66,4 0,8de 61,2 0,6 abcde 62,0 0,8 abcde 57,2 4,0abcd 58,1 1,6 abcd 53,2 5,8a
-1

TS aus cl (mN.m-1) 70,2 0,0d 64,0 3,3abcd 59,2 5,2ab 63,3 0,3abcd 60,1 3,3ab 60,9 0,3abc 56,7 2,6a

TS pre cl = tenso superficial do meio fermentado na presena das clulas de microrganismo; TS aus cl = tenso superficial do meio fermentado na ausncia das clulas de microrganismo. Letras iguais correspondem aos valores de tenso superficial que no apresentaram diferena significativa (nvel de significncia de 5%) para cada experimento.

9.3 Acompanhamento do pH durante os processos fermentativos - Artigo 1

6,4 6,0 5,6 5,2 4,8 4,4 4,0

pH

12

24

36

48

60

72

Tempo (h)

FIGURA 1 Comportamento do pH durante os cultivos do Artigo 1. Cultura pura de Corynebacterium aquaticum, cultura mista de Corynebacterium aquaticum e Bacillus sp., cultura mista de Corynebacterium sp., Bacillus cereus e Bacillus mycoides e cultura pura de Bacillus subtilis. 9.4 Metodologia para determinao do teor de glicosamina - Artigos 2 e 3 Para determinar o teor de glicosamina durante os cultivos com o fungo Aspergillus fumigatus, adicionou-se 5 mL de HCl 6 M 0,5 g ou mL de amostra, colocando a mistura em banho de gua fervente por 2 h. Em seguida, a amostra foi

123

resfriada e filtrada. Do sobrenadante, transferiu-se 1 mL para balo de 25 mL, adicionando uma gota de soluo alcolica de fenolftalena 0,5% (p/v). Prosseguiu-se neutralizao com soluo de NaOH 3 N, at que a mistura atingisse a colorao rosa. Logo aps, procedeu-se a titulao reversa com soluo de KHSO4 1% (p/v), at que a colorao rosa desaparecesse. O volume do balo foi ento completado com gua destilada. Aps a etapa de extrao descrita acima, transferiu-se 1 mL da soluo do balo para tubo de ensaio, adicionou-se 1 mL de soluo de acetil acetona em Na2CO3 0,5 N e colocou-se a mistura em banho de gua fervente por 20 min. Aps o resfriamento das amostras, adicionou-se 6 mL de etanol e, em seguida, 1 mL de reagente de Erlich. Os tubos foram incubados a 65C por 10 min, resfriados, e a absorbncia lida em espectrofotmetro (Femto 700 Plus, Brasil) a 530 nm. O branco foi preparado adicionando-se gua no lugar da amostra. A curva padro foi construda entre as concentraes de 0,01 a 0,20 g.L-1 de glicosamina em gua (AIDDO et al., 1981). Para o preparo da soluo de acetil acetona em Na2CO3 0,5 N, misturou-se 1 mL de acetil acetona em 50 mL de soluo de Na2CO3 0,5 N. Obs: Esta soluo no deve ser estocada, deve ser preparada na hora da anlise. Para preparar o reagente de Erlich, dissolveu-se 2,67 g de DAB (pdimetilaminobenzaldedo) em um volume de aproximadamente 30 mL de etanol/cido clordrico 1:1. Aps a dissoluo, completou-se o volume do balo com gua destilada. 9.5 Correlao entre o contedo de glicosamina e a biomassa fngica - Artigos 2 e3 A fim de estabelecer uma correlao entre o contedo de glicosamina e a biomassa fngica, foi realizada fermentao submersa do fungo Aspergillus fumigatus em meio Sabouraud (LARONE, 1987) contendo (g.L-1): peptona de casena, 5,0; peptona de carne, 5,0; e glicose, 20,0. O cultivo foi realizado em frasco Erlenmeyer de 2 L, em temperatura de 30C e agitao de 150 rpm (REICHE & LEMOS, 2005; PAPAGIANNI et al., 2001). A concentrao celular inicial foi 4x106 esporos.mL-1. Inicialmente, verificou-se o tempo de fermentao correspondente ao final da fase exponencial de crescimento do microrganismo. Aps, foi realizada fermentao at este tempo, filtrando-se diferentes volumes de meio fermentado vcuo. A biomassa obtida foi seca em estufa a 50C at peso constante, e utilizada para verificao do

124

teor de glicosamina. Os valores obtidos foram utilizados para determinao, por regresso linear, da relao entre a massa seca do fungo e o contedo de glicosamina, que foi utilizada na determinao da massa celular obtida nos cultivos. 9.6 Acompanhamento do pH durante os processos fermentativos - Artigo 2
6,4 6,0 5,6 pH 5,2 4,8 4,4 4,0 0 24 48 72 Tempo (h) 96 120 144

FIGURA 2 pH ao longo dos processos fermentativos do Artigo 2. Corynebacterium aquaticum/biorreator de coluna, Aspergillus fumigatus/biorreator de coluna, Corynebacterium aquaticum/frasco Erlenmeyer e Aspergillus fumigatus /frasco Erlenmeyer. 9.7 Acompanhamento do pH durante os processos fermentativos - Artigo 3

8 7 pH 6 5 4 0 12 24 36 Tempo (h) 48 60 72

FIGURA 3 pH ao longo dos processos fermentativos do Artigo 3. Corynebacterium aquaticum/biorreator de mistura, Aspergillus fumigatus/biorreator de mistura, Corynebacterium aquaticum/frasco Erlenmeyer e Aspergillus fumigatus/frasco Erlenmeyer.

125

9.8 Procedimento para obteno do extrato de farelo de trigo - Artigo 3 Misturou-se farelo de trigo e gua destilada na proporo 1:10 (1 g de soluto para 10 mL de solvente). A mistura foi aquecida at 85C, sendo mantido o processo de dextrinizao nesta temperatura por 1 h. Em seguida aqueceu-se a mistura at a ebulio, mantendo nesta condio por 10 min. Aps esfriar, a suspenso foi centrifugada a 7000 rpm por 30 min, obtendo-se o extrato de farelo de trigo (COSTA, 1996). 9.9 Determinao do coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio Artigo 3 A metodologia utilizada consiste em calibrar um eletrodo especfico para medida da concentrao de oxignio em 100% (saturao) e, aps, borbulhar nitrognio no lquido a fim de eliminar todo oxignio dissolvido, at que a sonda indique o valor zero. A seguir, inicia-se a agitao e a aerao nas condies em que se pretende obter o valor do coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio, passando-se a registrar o sinal da sonda, que ir aumentar de zero at 100%. A partir dos dados experimentais obtm-se uma reta cujo coeficiente angular fornece o valor do coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (SCHMIDELL et al., 2001). 9.10 Determinao da velocidade de consumo de oxignio pelas clulas - Artigo 3 A velocidade de consumo de oxignio pelas clulas ao longo do tempo de cultivo foi calculada conhecendo-se os valores de oxignio dissolvido durante os cultivos, a concentrao de oxignio na saturao e o valor do coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (SCHMIDELL et al., 2001).

126

9.11 Fotos dos experimentos e determinaes analticas (a) (b)

FIGURA 4 Cultivos bacterianos em estado slido. (a) Biorreator de coluna e (b) frasco Erlenmeyer.

FIGURA 5 Microtcnica do Nmero mais Provvel (NMP) para acompanhamento do crescimento de bactrias.

127

(a)

(b)

FIGURA 6 Cultivos fngicos em estado slido. (a) Biorreator de coluna e (b) frasco Erlenmeyer.

FIGURA 7 Determinao do teor de glicosamina para acompanhamento do crescimento de fungos.

(a)

(b)

FIGURA 8 Cultivos bacterianos em meio lquido. (a) Biorreator de mistura e (b) frasco Erlenmeyer.

128

(a)

(b)

FIGURA 9 Cultivos fngicos em meio lquido. (a) Biorreator de mistura e (b) frasco Erlenmeyer. (a) (b)

FIGURA 10 Medida das tenses superficial e interfacial. (a) Tenso superficial e (b) tenso interfacial.

FIGURA 11 Determinao da tenso superficial de extratos fngicos.

129

FIGURA 12 Determinao das atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo.

FIGURA 13 Representao esquemtica do ensaio de atividade emulsificante gua em leo. Fonte: CHANIN et al. (2005).