RV13

REVISTA CIENTFICA ELETRNICA DE MEDICINA VETERINRIA ISSN: 1679-7353
Ano IX Nmero 16 Janeiro de 2011 Peridicos Semestral
PRINCIPAIS MTODOS DIAGNSTICOS BACTERIANOS REVISO DE LITERATURA
PEREIRA, Rose Elisabeth Peres PETRECHEN, Guilherme Grande
Laboratrio de Patologia Veterinria e Ornitopatologia da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia de Gara FAMED, Gara, So Paulo, Brasil
Revista Cientfica Eletrnica de Medicina Veterinria uma publicao semestral da Faculdade de Medicina veterinria e Zootecnia de Gara FAMED/FAEF e Editora FAEF, mantidas pela Associao Cultural e Educacional de Gara ACEG. CEP: 17400-000 Gara/SP Tel.: (0**14) 3407-8000 www.revista.inf.br www.editorafaef.com.br www.faef.edu.br.

RESUMO O presente trabalho teve como objetivo realizar uma reviso de literatura dos principais mtodos diagnsticos bacterianos em Medicina Veterinria. As enfermidades causadas por estes microrganismos atingem todas as espcies e raas animais, em qualquer idade e so responsveis pelos principais surtos de ETA (Enfermidades transmitidas por alimentos) em humanos que anualmente causam enormes prejuzos em todo mundo e possuem, na grande maioria das vezes, os animais como reservatrios ou portadores. Para que ocorra um efetivo tratamento e controle imprescindvel o conhecimento do agente etiolgico bem como o melhor medicamento a ser utilizado. Palavras-chaves: bactrias, enfermidades bacterianas, Salmonella, toxinfees
alimentares, zoonose.
ABSTRACT This study aimed to perform a literature review of major bacterial diagnostic methods in veterinary medicine. Illnesses caused by these microorganisms affect all species and breeds at any age and are responsible for major outbreaks of foodborne illness in humans that cause huge losses each year worldwide and have, in most cases, animals as reservoirs or carriers. For the occurrence of an effective treatment and control is essential to know the etiologic agent as well as the best drug to be used. Keywords: bacterial, bacterial disease Salmonella, foodborne illness, zoonosis
1.INTRODUO
O diagnstico de doenas bacterianas pode ser realizado por diversos procedimentos. O diagnstico definitivo realizado pelo isolamento e identificao do agente bacteriano a partir de materiais clnicos colhidos adequadamente do stio de infeco, conhecido normalmente como exame bacteriolgico ou cultura (MARTINEZ; TADEI, 2005). Um histrico clnico completo, incluindo idade, sexo, espcie, nmero de animais afetados e tratamento realizado devem acompanhar os espcimes, junto com a suspeita do diagnstico clnico. Na ausncia destas informaes, procedimentos importantes para deteco de patgenos podem no ser realizados (QUINN et al., 2005).

A preciso e a validade dos resultados de exames laboratoriais so amplamente influenciados pelos cuidados na seleo, colheita e no envio das amostras para o laboratrio. As amostras devem, de preferncia, ser obtidas de animais vivos antes da administrao de antibioticoterapia. Amostras de animais mortos devero ser colhidas o quanto antes, se possvel, sem alteraes autolticas ou putrefativas. Quando houver locais onde provavelmente haja contaminao por mais de um patgenos, os espcimes devem ser colhidos mediante procedimentos que minimizem a contaminao e em dias quentes, se faz necessrio a refrigerao (QUINN et al., 2005). O diagnstico bacteriano rpido e eficiente necessrio, j que as enfermidades infecciosas dos animais e as zoonoses, em particular as de natureza epizotica, esto adquirindo uma importncia econmica e social cada vez maior nos sistemas agrcolas e comerciais dos pases industrializados e em desenvolvimento. Algumas enfermidades infecciosas emergentes podem ultrapassar rapidamente a esfera local e passar dos animais s pessoas (OIE, 2003). Estima-se que h 33 milhes de casos de Salmonella em humanos todo ano (MEAD et al, 1999). A incidncia de surtos de Salmonella Enteriditis (SE) em humanos tem aumentado nos ltimos anos em pases como Estados Unidos, Gr-Bretanha e outros pases da Europa (BARROW, 1993, TAUXE, 1997). Na Inglaterra e Pas de Gales, a carne de frango foi responsvel por surtos e casos espordicos e por aproximadamente 30.000 casos/ano de toxinfeco alimentar em humanos (WARD; THRELFALL, 1997). Na Frana h mais de 16.000 pessoas afetadas todo ano desde 1989 (TOURON et al., 2005). No Brasil, os surtos de SE no homem tem aumentado a partir de 1993 (SILVA, 1995; TAUNAY et al., 1996; LIRIO et al., 1998) e grande parte deles tem sido relacionada ao consumo de ovos ou prato preparados com ovos (BARROW 1993; TAUXE, 1997). O presente trabalho tem como objetivo realizar uma reviso de literatura dos mtodos diagnsticos bacterianos mais relevantes para que se proceda um efetivo tratamento e controle das enfermidades causadas por estes microrganismos.

2. REVISO DE LITERATURA
A presena de bactrias patognicas pode ser confirmada pelo exame de esfregaos corados, pelas caractersticas culturas e bioqumicas e pela deteco realizada com mtodos imunolgicos e moleculares (MURRAY et al., 1999).
2.1
Exame de esfregaos corados A maioria das observaes iniciais dos microrganismos feita com preparaes
coradas. Material celular e microrganismos so frequentemente transparentes e podem ser mais bem distinguidos pelo uso de corantes. A visualizao direta de amostras clnicas em diversas montagens a fresco, entre lminas e lamnulas, d informaes da composio celular, morfologia do microrganismo e motilidade. As amostras podem ser observadas por microscpio de luz direta, de contraste de fase ou de campo escuro (MARTINEZ; TADEI, 2005; TORTORA et al., 2003). Existem dois mtodos gerais utilizados para preparar espcimes microbiolgicos para observaes por meio de microscpio luminoso. Um utiliza uma suspenso de microrganismos vivos em uma gota ou uma camada lquida. No outro uma camada fina do espcime seca e corada, assim o microrganismos ficam fixados superfcie e apresentam-se corados para facilitar a visualizao (PELCZAR JR et al., 2004).
2.1.1 Colorao de Gram A colorao de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista dinamarqus Hans Christian Gram. Ela um dos procedimentos mais teis, pois classifica as bactrias em dois grandes grupos: gram-positivas e gram-negativas (TORTORA et al., 2003). o mtodo de colorao diferencial mais utilizado em exames diretos ao microscpio de amostras clnicas e de colnias bacterianas devido ao seu largo espectro de colorao. Este espectro inclui praticamente todas as bactrias, muitos fungos e parasitas, tais como Trichomonas, Strongyloides e cistos de vrios protozorios. As excees significantes incluem Treponema, Mycoplasma, Chlamydia e Rickettsia que so pequenos demais para visualizao em microscopia ptica de luz direta ou que perderam a parede (MARTINEZ; TADEI, 2005).

Neste procedimento um esfregao fixado pelo calor recoberto com um corante bsico prpura, usualmente a violeta genciana que impregna todas as clulas, esta a colorao primria. Aps um curto perodo, o corante prpura lavado e o esfregao coberto com iodo, quando o iodo lavado, ambas bactrias gram-positivas e gramnegativas aparecem na cor violeta. A seguir a lmina lavada com lcool ou uma soluo de lcool-acetona, esta a soluo descolorante. O lcool lavado e a lmina ento corada com um corante bsico vermelho, como a fucsina e o esfregao lavado novamente (TORTORA et al., 2003). Os microrganismos gram-positivos so aqueles que retm o corante cristal violeta devido ao aumento na quantidade de cido teiico e a diminuio da permeabilidade na parede celular aos solventes orgnicos, por conterem menos lipdeos na parede celular. A parede das bactrias gram-negativas apresenta grande quantidade de lipdeos, que aumenta a permeabilidade aos solventes orgnicos, permitindo a descolorao. Estes microrganismos perdem, portanto, o cristal violeta, corando-se com o corante de fundo, como a fucsina (MARTINEZ; TADEI, 2005, QUINN et al., 2005).
2.1.1.1 Colorao cido-Resistente Certos microrganismos possuem na sua parede cidos graxos de cadeia longa (cido miclico), que conferem impermeabilidade ao cristal violeta e a outros corantes bsicos. Calor ou detergentes devem ser usados para permitir a entrada de corantes primrios nestas bactrias. Uma vez dentro das clulas bacterianas, o corante no eliminado mesmo com solvente lcool-cido. A colorao lcool-cido diferencia grupos especficos de bactrias como Mycobacterium, Rhodococcus, Nocardia, Tsukamurella, Gordona, Legionella micdadei, alm de corar oocistos de
Cryptosporidium, Isospora, Sarcocystis e Cyclospora. o mtodo mais utilizado para a pesquisa de micobactrias, sendo que a colorao de Ziehl-Neelsen o nico recurso disponvel para o diagnstico da hansenase (MARTINEZ; TADEI, 2005). A Coxiella burnetti, espcies de Brucella e clamdias podem ser demonstradas em esfregaos usando a colorao de Ziehl-Neelsen modificada (QUINN et al., 2005).

2.2
Caractersticas culturais e bioqumicas A seleo de meios de cultura, de condies atmosfricas e de outros fatores
essenciais para o isolamento so determinados pela suspeita de um patgeno bacteriano. O isolamento de rotina de muitos patgenos envolve inoculao em placas de garsangue e gar MacConkey, seguidos de incubao por 24 a 48 horas. A temperatura e a atmosfera (atm) de incubao so fatores determinantes para que se tenha sucesso no isolamento e identificao do microrganismo. Geralmente a temperatura de incubao utilizada para a maioria dos microrganismos gira em torno de 36 a 37 C. Quanto a atm, algumas bactrias exigem 5 ou 10% de CO2 no ar, outras so microaerfilas ou anaerbias estritas (MARTINEZ; TADEI, 2005). gar nutriente um meio bsico que supre os nutrientes essenciais ao crescimento de bactrias no-fastidiosas. Contudo no indicado para o isolamento primrio de bactrias patognicas fastidiosas. O gar-sangue, que favorece o crescimento de muitos patgenos, apropriado para o isolamento primrio de rotina. Meios seletivos podem ser usados para microrganismos especficos (QUINN et al., 2005). Os mtodos de isolamento das bactrias envolvidas em infeces no sofreram alteraes. Meios de culturas seletivos e enriquecidos mais utilizados so o gar-sangue, gar chocolate, gar MacConkey, gar SS (Salmonella-Shigella), gar Hektoen, caldos BHI (Brain Heart Infusion), tioglicolato, rappaport, selenito entre outros. Mais recentemente foram introduzidos meios de cultura cromognicos. Estes meios so compostos por substratos enzimticos sintticos (reagentes cromognicos) que se ligam aos acares utilizados pelas bactrias durante seu crescimento. Quando a bactria utiliza um ou mais carboidratos, os reagentes cromognicos so liberados e se precipitam no meio de cultura, permitindo a colorao diferenciada. So utilizados amplamente em anlises clnicas, de alimentos e ambiental. Permitem diferenciao entre espcies de Candida, Listeria, alm de diferenciao entre colnias de E. coli e outros coliformes. Tambm permitem a identificao de colnias de bactrias de grampositivas como, por exemplo, Staphylococcus aureus e Enterococcus e de bactrias patognicas como Salmonella Typhi e E. coli O157:H7 (MARTINEZ; TADEI, 2005). Nascimento et al., (2000) verificaram que no h diferenas estatsticas na deteco em Salmonella em carcaas de frango quando se utilizam os caldos de

enriquecimento Rapapport-novobiocina (RVN), selenito-cistinanovobiocina (SCN) e tetrationato-novobiocina (TN) e os meios de plaqueamento gar Hektoen (HE), gar Salmonella-Shigella (SS), gar verde brilhante (VB) e gar xilose lisina desoxicolato (XLD). Quanto ao exame de fezes, o caldo TN mostrou-se superior aos demais, no havendo diferenas de resultado para os meios de plaqueamento. Os resultados sugerem que a utilizao de mais de um meio de enriquecimento e de plaqueamento poderia aumentar as chances de isolamento das bactrias. As placas devem ser inoculadas usando-se a tcnica de esgotamento por estrias que facilita o crescimento de colnias isoladas. Esse um passo essencial para identificar patgenos em espcimes clnicos que podem conter espcimes
contaminantes. As caractersticas morfolgicas e os testes bioqumicos permitem a identificao presuntiva de um patgeno bacteriano. Testes adicionais podem ser usados para auxiliar na identificao de microrganismos especficos (QUINN et al., 2005).
2.3
ELISA Um teste com grande sensibilidade o mtodo de imunolgico de suporte
slido, o mais utilizado o ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay). O agente bacteriano se presente no espcime se liga ao anticorpo especfico e pode ser demonstrado por um anticorpo marcado por uma enzima. Tcnicas que usam reaes imunes podem ser associadas a outros mtodos para melhorar a deteco dos patgenos. Pode ser usado para bactrias como E. coli e outros membros da famlia Enterobacteriaceae como Listeria monocytogenes, Pasteurella multocida e
Actinobacillus pleuropneumoniae (QUINN et al., 2005).
2.4
PCR A PCR (Reao em Cadeia Polimerase) uma tcnica de amplificao in vitro
que pode, em questes de horas, amplificar seqncias especficas de DNA. A importncia deste procedimento est em sua habilidade de amplificar DNA intacto ou fragmentado por meio de uma simples reao qumica em tubo de ensaio, tornou-se possvel a clonagem de seqncias de tamanhos que variam entre 500 e 2000 pares de base (bp) de forma rpida e sem a necessidade de uma clula viva (EISENSTEIN, 1990).

A PCR baseada num ciclo repetitivo de trs reaes que ocorrem em diferentes temperaturas de incubao, em um mesmo tubo e na presena de reagente termoestveis. Em adio seqncia especfica de DNA a ser amplificada, os reagentes so dois pequenos oligonucleotdeos iniciadores, denominados primers, sintetizados para serem complementares as seqncias conhecidas do DNA-alvo, grande quantidade dos quatro desoxirribonucleosdeos trifosfatados (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) e a enzima termo-estvel Taq DNA-polimerase, isolada de bactria termoflica (EISENSTEIN, 1990). Malorny et al. (2003) ao analisarem a acurcia do mtodo de PCR na deteco de Salmonella sp. em 435 amostras de suabes de carcaas sunas e de frangos verificaram, que a acurcia para sensibilidade e especificidade foi de 97,5%. Portanto trata-se de um mtodo diagnstico seguro e importante para a deteco desta bactria que se constitui o maior patgeno responsvel pelos caos de infeco alimentar em humanos em todo o mundo (HUMPREY, 2000).
2.4.1 Multiplex PCR O mtodo multiplex PCR foi desenvolvido para detectar simultaneamente Salmonella spp., Listeria monocytogenes, e Escherichia coli O157:H7 em amostras de carne. A sensibilidade na deteco de DNA desse mtodo foi de 10 3 UFC/mL para cada patgeno. Quando este protocolo foi utilizado na deteco de cada uma das bactrias patognicas em amostras de suno "spiked", uma clula/25g de amostra inoculada pde ser detectada dentro de 30 horas. Nas amostras de carne naturalmente contaminadas, Salmonella spp., L. monocytogenes, e E. coli O157:H7.foram detectadas no mesmo perodo de tempo. Excelente concordncia foi obtida entre os resultados de PCR e o mtodo de cultura convencional, sugerindo que o PCR um mtodo confivel e til para analise rpida de produtos derivados de carne contaminados por Salmonella spp, L. monocytogenes, e E. coli O157:H7 (KAWASAKI, 2005). Cortez et al. (2006) identificaram salmonelas em frangos abatidos por multiplexPCR usando trs primers invA, pefA e sefA seqncias de gene para diagnosticar Salmonella spp, S.Typhimurium e S. Enteritidis respectivamente. Foi detectado Salmonella spp em 10% (29/288) das amostras, entretanto os sorotipos Enteritidis e Typhimurium foram identificados em 62% das amostras. Os resultados indicam a

necessidade de melhorar a higiene e os padres sanitrios em linhas de abate de frangos, alm da educao em alimentao.
2.4.2 Nested PCR Nesta tcnica, duas amplificaes so realizadas, a primeira etapa de amplificao realizada com um par de iniciadores, por 20 a 30 ciclos e o produto desta reao transferido para outro tubo, onde uma segunda amplificao ser realizada, tendo como molde o DNA amplificado na primeira. Porm, na segunda amplificao, os iniciadores utilizados iro anelar-se em uma regio mais interna do fragmento amplificado na primeira reao, permitindo desta forma, uma maior especificidade da reao (MARTINEZ; TADEI, 2005).
2.4.3 PCR em tempo real Este procedimento compreende uma amplificao convencional de DNA, porm a deteco do resultado feita ao longo de ciclos de amplificaes. Para que isso ocorra, adicionada na reao brometo de etdio ou alguma outra molcula fluorescente (SYBR Green, por exemplo), que a medida que o DNA vai sendo amplificado, vai-se intercalando na dupla fita, resultando num aumento da fluorescncia, a qual detectada por uma luz UV acoplada ao termociclador (MARTINEZ; TADEI, 2005). Atualmente, esta tcnica tem sido largamente para o diagnstico da salmonelose e campilobacteriose em produtos e subprodutos de frangos (WOLFFS et al., 2007).
2.5
Soroaglutinao Rpida (SAR) A prova de soroaglutinao rpida (SAR) indicada para a deteco de
anticorpos contra Salmonella Pullorum (SP) e Salmonella Gallinarum (SG) e algumas espcies de micoplasma, mas no detecta anticorpos contra as salmonelas paratifides. Mesmo para SP, a sorologia no um mtodo eficiente para o diagnstico da doena, porque quando a infeco ocorre precocemente, anticorpos circulantes no aparecem at 20 a 40 dias aps a infeco e, mesmo num perodo de 100 dias ps-infeco pode-se no observar a produo de anticorpos. Portanto para fins de diagnstico preciso, devese efetuar o isolamento da bactria, a sua identificao e classificao em espcies (ITO et al., 2004).

3. CONCLUSO Conclui-se que existem diversos mtodos diagnsticos bacterianos e estes so imprescindveis para o rpido, correto e eficiente diagnstico, controle, preveno e tratamento das enfermidades causadas por estes agentes.
4. REFERNCIAS
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Actinobacillus pleuropneumoniae (QUINN et al., 2005).

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