UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN

MRIO SRGIO PIANTAVINI

DESENVOLVIMENTO E VALIDAO DE UM MTODO ESPECTROFOTOMTRICO PARA A QUANTIFICAO DE CIDO KJICO POR COMPLEXAO COM ALUMNIO E CARACTERIZAO DO COMPLEXO

CURITIBA 2010

MRIO SRGIO PIANTAVINI

DESENVOLVIMENTO E VALIDAO DE UM MTODO ESPECTROFOTOMTRICO PARA A QUANTIFICAO DE CIDO KJICO POR COMPLEXAO COM ALUMNIO E CARACTERIZAO DO COMPLEXO

Dissertao apresentada ao Curso de PsGraduao em Cincias Farmacuticas, Setor de Cincias da Sade, Universidade Federal do Paran, como requisito parcial obteno do ttulo de Mestre em Cincias Farmacuticas

Orientador: Prof. Dr. Roberto Pontarolo Co-orientadora: Prof. Dra. ngela Cristina Leal Badar Trindade

CURITIBA 2010

Termo de aprovao

Dedico este trabalho Deus e Aos meus pais Srgio e Maria Aparecida s minhas avs (in memoriam) e todos os familiares pela educao, formao e amor que sempre me deram em todas as fases da vida E amigos que de muitas formas me incentivaram e ajudaram para que fosse possvel a concretizao deste trabalho.

AGRADECIMENTOS

Diversas espcies de aves migram ou se deslocam regularmente de uma regio para outra, de acordo com a mudana das estaes. Na antiguidade os gregos conheciam esse procedimento das aves em busca de clima favorvel para sua sobrevivncia, tanto que as tinham como smbolo da amizade e da fidelidade porque elas voltavam anualmente para ocupar o mesmo ninho. Inspirado por elas o filsofo grego Aristteles (384-322 a,C.) cunhou a frase uma andorinha s no faz primavera, ou no faz vero. Dentre as possveis interpretaes pode-se entender que as aes praticadas por um nico indivduo podem no ser suficientes para solucionar todos os problemas ou o problema de todos. Entretanto na coletividade encontramos pontos como a pluralidade de pensamentos, a complementaridade, a reciprocidade e outros valores que nos tornam muito mais fortes e resistentes. Na prpria natureza encontramos exemplos disso como na revoada dos gansos ou na resistncia ao frio dos pingins. A todos que participaram ativamente dessa jornada deixo meus agradecimentos, mas alguns em especial que de fato fizeram valer o ideal da amizade e coletividade. Em primeiro lugar a Deus por tudo que nos proporciona diariamente. Aos meus pais e minha famlia o meu muito obrigado pelas lies que ainda me do, pelo carinho e amor que necessito para continuar em frente. minha namorada Elaine, que meu porto seguro para enfrentar todas as tormentas, por ser minha essncia, pela compreenso e amor que um privilgio que usufruo com imensa alegria. Ao Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas e ao Departamento de Farmcia da UFPR que possibilitou o desenvolvimento deste trabalho, em especial ao Centro de Estudos em Biofarmcia e seus colaboradores em nome da Dra. Francinete R.C. pela parceria. Ao departamento de Qumica da UFPR pela disponibilidade de uso do infravermelho e ao mesmo tempo colaborao da doutoranda Gilclia A. Cordeiro pelo auxlio imprescindvel. Ao departamento de

Bioqumica pelo uso do RMN. farmacutica Dagmar da farmcia de manipulao DAGFARMA pela colaborao, amizade e oportunidade. Ao professor Dr. Roberto Pontarolo falta-me lxico para expressar em singelas linhas o desafio que foi chegar at aqui desde o primeiro dia h anos em busca de um mero estgio em laboratrio at o dia de colher os louros e ser reconhecido como Mestre. Simples demais seriam as palavras neste momento, mas fica aqui o sentimento de um privilegiado por ter sido realmente orientado por quem, de fato, uma pessoa que por conhecimento adquirido e experincia de vida pode ser considerado um espelho ou um norte a ser seguido, um legtimo professor. Muito obrigado por tudo. Ao professor Dr. Alan G. Gonalves pela valiosa contribuio, dedicando seu tempo a longas discusses e diversos trabalhos prticos para me ajudar a ficar na crista da onda. professora Dra. ngela C. L. B. Trindade pelo companheirismo e por importantes auxlios em momentos decisivos nesse trem de trabalho. Ao professor Dr. Cassyano J. Correr pela sempre disposta ajuda nos quatro cantos do laboratrio. professora Mrcia Olandoski que foi estatisticamente significante com os resultados deste trabalho. professora Dra. Ana L. R. Merc pela disposio, pacincia e complexos ensinamentos por todo esse tempo de parceria. Ao professor Dr. Paulo Roberto Janissek pela disposio e colaborao de grande importncia e relevncia. A todos os amigos mais antigos, os do mestrado e em especial aos do laboratrio (Rafael V., Jocy D. C., Andreia e Consuelo pela amizade, Luana L. pela parceria em infinitos projetos, Astrid W. pelas palavras e sinceras atitudes de ajuda em todos os momentos dentro e fora do laboratrio Vielen Dank/ Grazie Mille). A todos digo que no consigo expressar tudo o que desejo, pois h sentimentos que a linguagem no expressa e emoes que as palavras no sabem traduzir.

"BOM MESMO IR LUTA COM DETERMINAO, ABRAAR A VIDA E VIVER COM PAIXO, PERDER COM CLASSE E VIVER COM OUSADIA, POIS O TRIUNFO PERTENCE A QUEM SE ATREVE, E A VIDA MUITO BELA PARA SER INSIGNIFICANTE." (Charles Chaplin)

RESUMO

O cido kjico (AK, 5-hidroxi-2-hidroximetil-4-pirona) um cido orgnico, comumente produzido por cepas de Aspergillus sp. Isolado pela primeira vez por Saito (1907), nome e a estrutura foram definidos por Jabuta em 1924. Tem diversas aplicaes, dentre as quais as mais importantes so: na indstria alimentcia como antioxidante; na sade pblica em tratamento de doenas como a -talassemia e o diabetes; na indstria cosmtica como clareador, pois inibe a sntese da melanina. No presente trabalho foi desenvolvido e validado um mtodo espectrofotomtrico na regio do UV. Tomou-se por base a capacidade do analito de formar complexo com ctions metlicos, neste caso escolhido o Al3+, por no apresentar propriedade paramagntica, j que esta poderia interferir na anlise do complexo por RMN. O solvente que se mostrou mais apropriado foi o metanol, pois permitiu um deslocamento batocrmico maior alm de solubilizar facilmente o analito e seu complexo, tambm produziu soluo lmpida do produto formulado creme cosmtico, facilitando assim a anlise. O complexo formado AK-Al3+ foi analisado por espectroscopia eletrnica, IV, titulao potenciomtrica e RMN 13C. Pelos espectros de UV verificou-se um deslocamento batocrmico quando se adiciona alumnio em meio cido soluo de AK. Pela titulao potenciomtrica constatou-se que, apesar de se ter duas aparentes inflexes, o clculo da segunda derivada confirmou que o AK sofre apenas uma ionizao com um valor de pKa= 7,68+-0,02. Pela adio de Al3+ h formao de complexos, dependentes do pH e da proporo molar AK:Al 3+. A comparao de espectros no IV do AK, no complexado e complexado, em diferentes valores de pH, permitiu correlacionar as modificaes na absoro dos picos referentes aos grupamentos enlico (3200 e 1350 cm-1) e carbonlico (1768 e 1700 cm-1). Os dados dos deslocamentos qumicos dos carbonos permitiram concluir que, na variao para pH alcalino, a blindagem do C-2 e desblindagem de C-4 e C-5 ocorrem pelo rearranjo da molcula. Comparando os deslocamentos entre os carbonos do AK no complexado e complexado em meio cido (pH 4) verificou-se que apenas C-3 se blinda, enquanto que C-2, C-4 e C-5 se desblindam. A partir desses resultados foi possvel sugerir que a estruturas do AK dependem do pH e da proporo molar AK/Al3+ no meio, e confirmam a sada do hidrognio da hidroxila enlica e da complexao do alumnio entre a carbonila e o grupo enol do AK. O mtodo espectrofotomtrico desenvolvido com base na complexao do AK:Al3+, mostrou um desempenho muito bom na validao. Foi linear no intervalo de entre 550 g/mL de AK (r= 0,9998), seletivo, sensvel (LD= 0,15 g/mL e LQ= 0,46 g/mL), preciso (DPR de 0,402%, 1,284 e 1,192 para 10, 15 e 20 g/mL na repetitividade; DPR de 2,171, 0,976 e 0,440 10, 15 e 20 g/mL na preciso intermediria ), exato ( 100%) e robusto (para pequenas varias no pH, temperatura e tempo de leitura). O mtodo espectrofotomtrico na regio do UV com adio de alumnio foi adequado para a quantificao de cido kjico em matria-prima e em creme cosmtico com ou sem adio de hidroquinona. uma opo vivel para laboratrios analticos, sendo um mtodo simples, rpido e econmico. Palavras- chave: cido kjico, alumnio, espectrofotometria, validao de mtodo analtico, complexometria

ABSTRACT Kojic acid (KA, 5-Hydroxy-2-(hydroxymethyl)-4H-pyran-4-one), is an organic acid, commonly produced by species of Aspergillus sp. It had been first isolated by Saito (1907) and its name and structure were defined in 1924 by Jabuta. KA has several applications, among them, the most important are: in the food industry as antioxidant; public health in the treatment of diseases such as -thalassemia and diabetes; in cosmetic industry as bleaching agent, since it inhibits the melanin synthesis. The present work developed and validated a spectrophotometric method in the UV region by AK-Al complexation. The method was based on the ability of the analyte to form complexes with metal ions and for this work Al3+ was chosen, because it does not show paramagnetic property, whereas this could interfere with the RMN analysis of complex. The solvent methanol was more appropriate to the analysis, since it allowed a greater bathochromic displacement and generate a clear solution of cosmetic cream, improving the extraction of analyte. The AK-Al3+ complex was analyzed by UV, IR, potentiometric titration and NMR 13C. By UV spectra a bathochromic shift was verified by adding aluminium in KA acidic solution. Was found by potentiometric titration that despite having two apparent shifts, the second derivative calculated confirmed that the KA has only one ionization, pKa= 7,68+-0,02. Adding aluminium there is complex formation, pH and molar dependent. The comparison of complexed (AK/Al3+) and non-complexed KA IR spectra , at different pH, allowed to correlate the changes in peaks absorption related to enolic (3200 e 1350 cm-1) and carbonyl (1768 e 1700 cm-1) groups. The carbon chemical shifts in non-complexed KA allowed to conclude that, varying the pH to an alkaline range, the C-2 shield and C-4 and C-5 deshielded occur by molecule rearrangement. By comparison of the chemical shifts of carbons in complexed and non-complexed KA (pH 4), only C-3 proved to be shielded, whereas C-2, C-4 and C5 proved to be deshielded. From these results it was possible to suggest that the KA structures depend on the pH and molar ratio and to confirm the hydrogen output of the enolic hydroxyl and aluminum complexation between the carbonyl and enolic KA group. The complexes suggested by the potentiometric titration and infrared spectroscopy are consistent with the chemical shifts observed in the obtained NMR spectra. The results obtained by these techniques provided evidence of possible structures of KA in different pH and of the complex AK-Al. The data confirm the hydrogen output from enolic hydroxyl. The spectrophotometric method developed based on the complexation AK:Al 3+, showed a good performance in the validation. This method yields linearity in the range of 5 and 50 g/mL of KA (r= 0.9998), selectivity, sensibility (DL= 0,15 g/mL and QL= 0,46 g/mL) precision (RSD 0,402%, 1,284 and 1,192% for 10, 15 and 20 g/mL on repeatability; RSD 2,171, 0,976 and 0,440 for 10, 15 and 20 g/mL for intermediate precision), accuracy (recovery near 100%) and robustness (varying pH, temperature and time). The spectrophometric UV method with the addition of aluminium is suitable for the quantification of kojic acid raw material and cosmetic cream with or without hydroquinone. Additionally the method takes advantage of simple and accessible reagents and equipment, while having a low operating cost. Key-words: kojic acid, aluminum, spectrophotometry, validation of analytic method, complexometry

LISTA DE FIGURAS FIGURA 01 Camadas e componentes da pele ..................................................... 20 FIGURA 02 Estrutura do tegumento ..................................................................... 21 FIGURA 03 Arquitetura da pele clara e escura ..................................................... 24 FIGURA 04 Forma simplificada da formao da melanina.................................... 25 FIGURA 05 Melanognese com diferentes passos regulatrios ........................... 26 FIGURA 06 Hiperpigmentao da pele pela estimulao da radiao solar ......... 29 FIGURA 07 Ilustrao esquemtica das possveis abordagens para interferir . com a via melanognica .................................................................... 30 FIGURA 08 Estrutura da hidroquinona .................................................................. 31 FIGURA 09 Estrutura qumica do cido kjico ...................................................... 32 FIGURA 10 Possvel biossntese do cido kjico a partir da glucose ................... 32 FIGURA 11 Possveis reaes na biossntese do cido kjico ............................. 33 FIGURA 12 biossntese do cido kjico a partir da gluconolactona ...................... 33 FIGURA 13 Modelo do complexo cido kjico-cobre ............................................ 35 FIGURA 14 Regies do espectro eletromagntico................................................ 38 FIGURA 15 Estruturas esquemticas da ligao do alumnio com citrato ............ 41 FIGURA 16 Ciclo de vida de um mtodo de anlise ............................................. 47 FIGURA 17 Frmula da exatido .......................................................................... 50 FIGURA 18 Frmula do desvio padro relativo ..................................................... 52 FIGURA 19 Possvel estrutura quelante do AK com um on metlico ................... 72 FIGURA 20 Espectros de UV das solues aquosa e metanlica de AK .......................(15 g/mL) ......................................................................................... 74 FIGURA 21 Espectro de UV da soluo aquosa de AK (15 g/mL) acidificada .......................(pH 2,8) e alcalinizada (pH 10,5) de AK (15 g/mL) .......................... 74 FIGURA 22 Espectro de UV da soluo metanlica de AK (15 g/mL) acidificada .......................(pH 1,2) e alcalinizada (pH 9,5) de AK (15 g/mL) ............................ 74 FIGURA 23 Espectros de UV de solues metanlicas contendo AK .......................0,1-50 g/mL e soluo cida de cloreto de alumnio ....................... 76 FIGURA 24 Representao grfica dos coeficientes de correlao versus .......................comprimento de onda do conjunto de solues metanlicas deAK .......................0,1-50 g/mL em soluo cida de cloreto de alumnio 0,2% ........... 76 FIGURA 25 Regio de maior (A) e menor (B) probabilidade de estar envolvida .......................na ligao AK com ons metlicos ..................................................... 77 FIGURA 26 Espectro de UV da soluo aquosa e metanlica de AK (15 g/mL) .......................com soluo cida de AlCl3 0,2% ..................................................... 78 FIGURA 27 Estruturas qumicas do metilparabeno (A) e propilparabeno (B) ...... 79 FIGURA 28 Espectro de UV de solues metanlicas com AK (15 g/mL), creme .......................lanette contendo AK 2% em associao ou no com HQ 4% e .......................somente creme lanette, todos com adio de AlCl3 0,2% ................. 80 FIGURA 29 Espectro de UV da soluo metanlica do AK (15 g/mL) com cloreto .......................de alumnio.em comparao com espectros de absoro da .......................hidroquinona e nipazol em metanol .................................................. 81 FIGURA 30 Grfico da absorbncia das solues na variao molar de AK .......................(15 g/mL) com cloreto de alumnio (0,2%) em 305 nm .................... 82 FIGURA 31 Espectros de UV de solues metanlicas com AK e AlCl3 em ......................diferentes relaes molares................................................................ 83 FIGURA 32 Resultado da avaliao da linearidade do mtodo espectrofotomtrico .......................de AK com AlCl3 de 5-50 g/mL em 305 nm no meio metanlico ..... 84

FIGURA 33 Resultado da avaliao da linearidade do mtodo espectrofotomtrico .......................de AK com AlCl3 de 10-20 g/mL em 305 nm no meio metanlico ... 84 FIGURA 34 Resultado da avaliao da linearidade do mtodo espectrofotomtrico .......................pela recuperao de AK em creme Lanette com AlCl3 de 5-30 g/mL .......................em 305 nm no meio metanlico......................................................... 85 FIGURA 35 Resultado da avaliao da linearidade do mtodo espectrofotomtrico .......................pela recuperao de AK em presena de hidroquinona em creme .......................Lanette com AlCl3 de 5-30 g/mL em 320 nm no meio metanlico ... 85 FIGURA 36 Representao da hipottica dissociao do cido kjico ................. 98 FIGURA 37 Estruturas da coordenao do AK com magnsio ............................. 98 FIGURA 38 Curva de titulao do cido kjico no complexado ........................ 100 FIGURA 39 Espectros de UV do cido kjico no complexado em soluo .......................aquosa (15 g/mL) na variao de pH de 2,0 a 12,0 e identificao .......................dos pontos isosbsticos ................................................................. 101 FIGURA 40 Espectros de UV do cido kjico no complexado em soluo .......................aquosa (15 g/mL) na variao de pH de 2,0 a 12,0 e identificao .......................dos pH no = 270 nm depois do primeiro ponto isosbstico .......... 101 FIGURA 41 Espectros de UV do cido kjico no complexado em soluo .......................aquosa (15 g/mL) na variao de pH de 2,0 a 12,0 e identificao .......................dos pH no = 315 nm depois do segundo ponto isosbstico .......... 102 FIGURA 42 Grfico da segunda derivada da titulao potenciomtrica do AK .......................no complexado ............................................................................ 103 FIGURA 43 Estrutura do cido kjico com os carbonos assinalados .................. 103 FIGURA 44 Diagrama de especiao do AK no complexado em meio aquoso 104 FIGURA 45 Curva de titulao na proporo AK 1:1 Alumnio em meio aquoso 105 FIGURA 46 Espectros de UV do cido kjico 1:1 alumnio em soluo aquosa .......................(15 g/mL) na variao de pH de 2,0 a 12,0 e identificao dos .......................pontos isosbsticos ........................................................................ 106 FIGURA 47 Diagrama de especiao da proporo AK 1:1 Alumnio ................ 107 FIGURA 48 Curvas de titulao do AK no complexado (0,1 mmol) e nas e nas .......................propores AK 1:0,5 Al e AK 1:1 Al em soluo aquosa ................. 111 FIGURA 49 Reaes graduais de hidrlise do complexo Fe(III) 1:1 AK ............. 112 FIGURA 50 Reaes graduais de hidrlise do complexo Fe(III) 2:1 AK ............. 112 FIGURA 51 Espectros de absoro do AK matria-prima em comparao com .......................o AK padro na regio do infravermelho ......................................... 115 FIGURA 52 Espectros de absoro do cido kjico padro e a partir de solues .......................pH 9 e 14 na regio do infravermelho ............................................ 116 FIGURA 53 Espectros de absoro do complexo cido kjico / alumnio a partir de .......................solues nos pH 1, 11 e 14 na regio do infravermelho .................. 117 FIGURA 54 Espectros de absoro do cido kjico puro em comparao com o ........................complexo AK/Alumnio a partir de solues nos pH 1, 11 e 14 na ........................regio do infravermelho ................................................................. 119 FIGURA 55 Espectros de absoro do cido kjico pH 14 em comparao com o ........................complexo AK/Alumnio pH 14 na regio do infravermelho ............ 119 FIGURA 56 Possveis estruturas de ressonncia do cido kjico ...................... 121 FIGURA 57 Possvel estrutura de ressonncia do cido kjico complexado ...... 121 FIGURA 58 Espectros de RMN e os dados obtidos em pH 4, 7 e 11 do AK no .......................complexado ..................................................................................... 122 FIGURA 59 Estruturas hipotticas da ressonncia do AK na forma cida (A) e .......................bsica (B) ........................................................................................ 123

FIGURA 60 Estruturas hipotticas de uma das representaes do cido kjico .......................complexado em pH 4....................................................................... 125 FIGURA 61 Estrutura qumica do AK com os assinalamentos por RMN 13C em .......................Me2SO-d6 ........................................................................................ 125 LISTA DE QUADROS QUADRO 01 Regies do UV e IV do espectro eletromagntico ........................... 39 QUADRO 02 Classificao dos mtodos analticos de acordo com a finalidade .. 47 QUADRO 03 Ensaios necessrios para a validao de mtodos analticos de. .........................acordo com a finalidade .................................................................. 48 LISTA DE TABELAS TABELA 01 Relaes molares entre o cido kjico e o alumnio .......................... 70 TABELA 02 Valores de concentrao de AK e erro relativo na avaliao da .......................repetitividade ..................................................................................... 87 TABELA 03 Valores de concentrao de AK e erro relativo na avaliao da ........................preciso.intermediria ...................................................................... 88 TABELA 04 Valores de concentrao de AK no ensaio de recuperao em ........................creme lanette e erro relativo ............................................................. 89 TABELA 05 Valores de concentrao de AK em presena de hidroquinona no ........................ensaio de recuperao em creme lanette e erro relativo .................. 90 TABELA 06 Valores de concentrao de AK no ensaio de recuperao em ........................creme no inico e erro relativo ....................................................... 91 TABELA 07 Valores de concentrao de AK em presena de hidroquinona no ........................ensaio de recuperao em creme no inico e erro relativo ............ 91 TABELA 08 Resultado do ensaio de robustez pela avaliao do tempo ............... 93 TABELA 09 Resultado do ensaio de robustez pela avaliao da temperatura .... 94 TABELA 10 Resultado do ensaio de robustez pela avaliao do pH .................... 95 TABELA 11 Comparao entre as solues de AK puro e complexado com ........................alumnio para os valores de absorbncia em comprimentos de ........................onda e diferentes valores de pH ..................................................... 108 TABELA 12 Constantes do do cido kjico em meio aquoso em vrias ........................propores molares com alumnio .................................................. 109 TABELA 13 Picos mais significativos no espectro de infravermelho da variao ........................de pH do cido kjico puro e do complexo AK/Alumnio ................ 120 TABELA 14 Picos significantes no espectro de infravermelho de alguns quelatos ........................de cido kjico ................................................................................ 120 TABELA 15 Valores dos deslocamentos qumicos dos carbonos do cido kjico ........................no complexado em diversos pH ................................................... 123 TABELA 16 Comparao dos deslocamentos qumicos dos carbonos do AK pela ........................variao de pH ............................................................................... 123 TABELA 17 Valores dos deslocamentos qumicos dos carbonos do cido kjico ........................complexado com alumnio em pH 2 e 4 ......................................... 124 TABELA 18 Comparao dos deslocamentos qumicos dos carboos do AK puro ........................e complexado com alumnio em pH 4 ............................................ 124 TABELA 19 Comparao dos dados de assinalamentos dos carbonos do AK por .......................RMN 13C da literatura e dos obtidos no presente trabalho .............. 126

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AK ANVISA CV COSY DEPT DP DPR DPR% FDA HMBC HPLC HQ ICH IUPAC INMETRO ML RMN R r2 ROS USP UV/Vis

- cido Kjico - Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria - Coeficiente de variao - Espectroscopia de correlao - Reforo por transferncia de polarizao sem distoro - Desvio padro - Desvio padro relativo - Desvio padro relativo percentual - Food and drug administration - Experimento de correlao para ligaes heteronucleares mltiplas - Cromatografia Lquida de Alta Presso ou Eficincia - Hidroquinona - International Conference on Harmonisation - International Union of Pure and Applied Chemistry - Instituto Nacional de Metrologia, Normalizao e Qualidade Industrial - Metal-ligante - Ressonncia magntica nuclear - Coeficiente de correlao - Coeficiente de determinao - Espcies reativas de oxignio - United States Pharmacopeia - Ultravioleta-visvel

SUMRIO

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................ 10 LISTA DE QUADROS .............................................................................................. 12 LISTA DE TABELAS ............................................................................................... 12 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .................................................................. 13 1. INTRODUO ....................................................................................... 17 2. REVISO BIBLIOGRFICA .................................................................. 20 2.1 PELE ...................................................................................................... 20 2.1.1 Epiderme ................................................................................................ 21 2.1.2 Derme..................................................................................................... 22 2.1.3 Melancito .............................................................................................. 23 2.1.4 Melanina ................................................................................................. 24 2.1.5 Eumelanina e feomelanina .................................................................... 25 2.1.6 Tirosina .................................................................................................. 27 2.1.7 Tirosinases ............................................................................................ 27 2.2 PIGMENTAO DA PELE .................................................................... 28 2.3 HIPERPIGMENTAO DA PELE ......................................................... 28 2.4 TRATAMENTO ...................................................................................... 29 2.4.1 cido Kjico ........................................................................................... 32 2.5 TCNICAS ANALTICAS PARA QUANTIFICAO DE AK .................. 36 2.5.1 Espectroscopia eletrnica ...................................................................... 38 2.5.1.1 Complexometria ..................................................................................... 40 2.5.2 Espectroscopia no infravermelho ........................................................... 42 2.5.3 Espectroscopia de ressonncia magntica nuclear................................ 43 2.5.4 Titulao potenciomtrica ....................................................................... 44 2.6 VALIDAO ........................................................................................... 45 2.6.1 Seletividade / especificidade ................................................................. 48 2.6.2 Linearidade e intervalo .......................................................................... 49 2.6.3 Exatido ................................................................................................ 50 2.6.4 Preciso ................................................................................................ 51 2.6.4.1 Repetitividade ........................................................................................ 52 2.6.4.2 Preciso intermediria ........................................................................... 52 2.6.4.3 Reprodutibilidade ................................................................................... 52 2.6.5 Robustez ............................................................................................... 53 2.6.6 Sensibilidade ......................................................................................... 53 3. OBJETIVOS ........................................................................................... 55 3.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................. 55 3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS .................................................................. 55 4. MATERIAL E MTODOS ....................................................................... 57 4.1 DESENHO EXPERIMENTAL ................................................................. 57 4.2 MATERIAL ............................................................................................. 57 4.2.1 Materiais e reagentes ............................................................................. 57 4.2.2 Equipamentos......................................................................................... 58 4.3 MTODOS ............................................................................................. 58 4.3.1 Desenvolvimento do mtodo .................................................................. 58 4.3.1.1 Escolha do solvente e influncia do pH .................................................. 59 4.3.1.2 Avaliao da seletividade ....................................................................... 59 4.3.1.3 Influncia da proporo AK e AlCl3 na intensidade de absoro ........... 60

4.4 4.4.1 4.4.2 4.4.3 4.4.3.1 4.4.3.2 4.4.4 4.4.5 4.4.5.1 4.4.5.2 4.4.5.3 4.4.5.4 4.5 4.5.1 4.5.2 4.5.3 4.5 5. 5.1 5.2 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.3 5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.3.3.1 5.3.3.2 5.3.4 5.3.5 5.3.5.1 5.3.5.2 5.3.5.3 5.3.5.4 5.4 5.4.1 5.4.2 5.4.3 6.

VALIDAO ........................................................................................... 61 Linearidade e intervalo ........................................................................... 61 Sensibilidade .......................................................................................... 62 Preciso ................................................................................................. 62 Repetitividade ......................................................................................... 62 Preciso intermediria ............................................................................ 62 Exatido ................................................................................................. 63 Robustez ................................................................................................ 63 Influncia do tempo de leitura na intensidade de absoro .................... 64 Influncia da temperatura na intensidade de absoro .......................... 64 Influncia do pH na intensidade de absoro ......................................... 64 Influncia da concentrao do metal na intensidade de absoro ......... 65 ESTUDO DO COMPLEXO ..................................................................... 65 Espectroscopia no infravermelho (IV)..................................................... 65 Ressonncia magntica nuclear............................................................. 65 Titulao Potenciomtrica ...................................................................... 66 ANLISE ESTATSTICA ........................................................................ 67 RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................. 72 CONSIDERAES TERICAS ............................................................. 72 DESENVOLVIMENTO DO MTODO..................................................... 73 Escolha do solvente e influncia do pH .................................................. 73 Seleo do comprimento de onda .......................................................... 75 Avaliao da seletividade ....................................................................... 76 A proporo molar AK e alumnio ........................................................... 82 VALIDAO ........................................................................................... 83 Linearidade e intervalo ........................................................................... 84 Sensibilidade .......................................................................................... 86 Preciso ................................................................................................. 87 Repetitividade ......................................................................................... 87 Preciso intermediria ............................................................................ 88 Exatido ................................................................................................. 89 Robustez ................................................................................................ 92 Influncia do tempo de leitura na intensidade de absoro .................... 92 Influncia da temperatura na intensidade de absoro .......................... 94 Influncia do pH na intensidade de absoro ......................................... 95 Influncia da concentrao do metal na intensidade de absoro ......... 96 ESTUDO DO COMPLEXO ..................................................................... 97 Titulao potenciomtrica e espectroscopia no ultravioleta ................... 97 Espectroscopia no infravermelho ......................................................... 112 Ressonncia magntica nuclear........................................................... 122 CONCLUSO ...................................................................................... 128 REFERNCIAS .................................................................................... 131

Introduo

17

1.

INTRODUO

No mundo contemporneo a preocupao com a aparncia fsica se intensificou, muito em busca de uma aceitao e valorizao pelos diversos contextos sociais. Parte disso potencializado pela necessidade de adequao aos padres e modelos de comportamento valorizados pela sociedade. Qualquer detalhe esttico que esteja fora do padronizado pode ser sinnimo de rejeio. Segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica (IBGE), a proporo de idosos, no Brasil, vem se elevando e com o passar da idade comeam a ocorrer , em maior proporo, problemas como a disfuno das camadas da pele, somados a outros fatores como os genticos, ambientais, climticos . As manchas que ocorrem na pele, dentre elas principalmente as que ocorrem na face, podem gerar problemas relacionados ao bem-estar dos indivduos, quando estes se apresentam perante a sociedade. Segundo RUIZ-MALDONADO;OROZCO-COVARRUBIAS (1997) mesmo uma alterao mnima da pigmentao da pele pode resultar num interesse esttico maior, com implicaes psicolgicas. Corroborando com essa idia, ISHIKAWA (2007) afirma que uma hiperpigmentao indesejada pode tambm produzir um significante stress psicolgico. Alm do lado pessoal, h dados de estudos econmicos dentro do nosso pas em que se constata que num universo de 57343 consultas pesquisadas, os transtornos da pigmentao somaram 4822 casos, o que corresponde a 8,4% das principais causas de consultas registradas (PENNA; RAMOS; CAF, 2006) e isto representa um custo significativo ao sistema de sade nacional. As hiperpigmentaes so, em geral, distrbios caracterizados pelo aumento de melanina e outros pigmentantes na pele (SATO et al., 2007). O tratamento se faz basicamente com o uso de agentes clareadores qumicos, como por exemplo, o cido kjico (AK). Ele comumente usado na indstria de cosmticos devido s suas propriedades de absoro de radicais livres e inibio da produo de melanina (ZBOROWSKI; GRYBOS; PRONIEWICZ, 2003), A atividade clareadora pode ser devido a uma lenta e reversvel inibio competitiva da tirosinase (NOHYNEK et al., 2004), principal grupo de enzimas responsvel pela converso da tirosina em melanina.

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Segundo BRENNER (2008), a modificao da pigmentao da pele desperta grande interesse farmacutico e como acredita CURTO et al (1999) h uma demanda no mercado global que tem se desenvolvido recentemente para agentes clareadores da pele como produtos cosmticos da vaidade. Sob esse contexto h uma preocupao da indstria farmacutica em atender esse grupo de pessoas que so acometidas por distrbios de pele como as hiperpigmentaes do tipo melnica. Com o crescimento dessa demanda, h a necessidade de se verificar a qualidade das matrias-primas e dos produtos. E com isso so constantes os desafios da tecnologia analtica que precisa disponibilizar mtodos confiveis, de baixo custo, simples e acessveis aos diferentes segmentos do mercado. Para o cido kjico, no foi encontrado nenhum mtodo de quantificao e anlise descrito na literatura oficial (farmacopias). Entretanto, na literatura cientfica encontram-se descritos alguns mtodos de quantificao propostos por

cromatografia lquida de alta eficincia (LIN; WU; HUANG, 2007), eletroforese capilar (LIN; YANG; WU, 2007) e espectroscopia eletrnica (GOMARA et al., 2004), sendo os dois primeiros aplicados a produtos em associaes e o ltimo aplicado somente para a matria-prima. Os mtodos por HPLC e Eletroforese no so mtodos simples e no so de fcil aquisio para as farmcias de manipulao - que so grandes produtoras destes produtos despigmentantes - o que se constitui numa dificuldade para que estes estabelecimentos realizem o controle de qualidade destes produtos. A falta de qualidade destes produtos pode trazer problemas como ineficincia do tratamento; podendo tambm ocorrer agravamento do seu problema de sade ou a gerao de um novo, ou prolongar o tempo de tratamento caso a concentrao seja diferente da declarada ou recomendada. O controle de qualidade da matria-prima ou dos produtos tornou-se uma ferramenta imprescindvel na indstria qumica, alimentcia e farmacutica. O processo de validao o mecanismo utilizado para garantir maior confiabilidade nos resultados. No presente trabalho foi desenvolvido e validado um mtodo por espectroscopia no UV para quantificao do analito na matria-prima e creme cosmtico. A presente pesquisa visa contribuir com o avano da tecnologia analtica, disponibilizando um mtodo para quantificar AK na rotina do controle de qualidade, mtodo esse que minimize os custos e o tempo da anlise.

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Reviso Bibliogrfica

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2.

REVISO BIBLIOGRFICA

2.1.

PELE

As camadas da pele so representadas pela epiderme, derme e hipoderme. Esta consiste em tecido gorduroso que conecta a derme aos componentes esquelticos subjacentes (COSTIN; HEARING, 2007) como representada na figura 1. Na estrutura A pode-se observar as trs diferentes camadas e seus componentes. Na estrutura B esto representadas quatro camadas da epiderme: estrato basal, espinhoso, granuloso e crneo. Pode-se tambm observar as formas dos melancitos bem como dos queratincitos.

FIGURA 1 CAMADAS E COMPONENTES DA PELE FONTE: ADAPTADA DE COSTIN; HEARING, 2007

Na figura 2 pode-se observar a diviso estrutural da epiderme e derme com seus corpos funcionais.

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FIGURA 2 ESTRUTURA DO TEGUMENTO FONTE: BEAR; CONNORS; PARADISO, 2002

2.1.1 Epiderme

A epiderme a camada mais externa, de epitlio estratificado desprovido de sangue ou nervos. um epitlio escamoso estratificado queratinizado

(MAKRANTONAKI; ZOUBOULIS, 2007; POWELL, 2007). Compreende camadas de clulas estreitamente empacotadas produzidas pela diviso celular da camada celular basal (POWELL, 2007). composta de vrias populaes celulares distintas: queratincitos e melancitos so os constituintes principais, dos quais o primeiro compreende cerca de 95% (COSTIN; HEARING, 2007; MAKRANTONAKI; ZOUBOULIS, 2007) da epiderme. Melancitos correspondem de 1 a 2% da

epiderme (MAKRANTONAKI; ZOUBOULIS, 2007). Os queratincitos sintetizam queratina, a principal protena estrutural da epiderme (POWELL, 2007) e, tambm, citocinas, que so mediadores qumicos secretados por clulas ativadas que afetam outras clulas. A produo de citocinas estimulada pela injria, incluindo aquela causada por radiao UV (POWELL, 2007). A sua funo principal proteger o corpo de estmulos prejudiciais do meio ambiente e diminuir a perda de fluidos (MAKRANTONAKI; ZOUBOULIS, 2007).

22

Pode-se dividir a epiderme em quatro ou cinco camadas ou estratos: estrato germinativo, espinhoso, granuloso, lcido (no qual o queratincito gradualmente migra para a superfcie num processo chamado descamao) e estrato crneo (MAKRANTONAKI; ZOUBOULIS, 2007) como representa a figura 1-B. Estrato basal tambm conhecido como estrato germinativo, uma camada simples de clulas unidas a uma membrana no celular que separa a epiderme da derme. Consiste na sua maior parte de queratincitos e no mnimo dois tipos diferentes de clulas derivadas das cristas neurais - clulas Merkel e os melancitos (COSTIN; HEARING, 2007) O prximo nvel na epiderme a camada espinhosa, assim chamada por causa das clulas que esto unidas coesivamente por desmossomos que se assemelham a espinhos em microscopia (POWELL, 2007). Ele contm

queratincitos polidricos irregulares com capacidade limitada para a diviso celular (COSTIN; HEARING, 2007). Estrato granuloso contm queratincitos achatados, polidricos e sem diviso produzindo grnulos de protenas chamadas de queratohialinas. (COSTIN; HEARING, 2007). Como o queratincito se move para cima, comea a fazer parte da camada granular, duas ou trs camadas de clulas planas contendo muitos grnulos. Estes so lisossomos que contm enzimas hidrolticas que destroem o ncleo e outras organelas, resultando na morte celular (POWELL, 2007). Estrato crneo a camada mais superior da epiderme e consiste em clulas achatadas, mortas, sem ncleo e com grossas membranas celulares que se aderem umas s outras. Gradualmente essas clulas so substitudas por clulas subjacentes. A camada crnea uma efetiva barreira para a maioria dos microrganismos, qumicos e fludos, embora seja permevel a algumas substncias (COSTIN; HEARING, 2007; POWELL, 2007).

2.1. 2

Derme

A derme uma camada de tecido conectivo (COSTIN; HEARING, 2007; MAKRANTONAKI; ZOUBOULIS, 2007) epiderme. Situa-se abaixo da mesma e suporta-a estruturalmente e na sua nutrio. O componente principal o fibroblasto e o colgeno que ele produz. Essa camada assume a importante funo de

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termorregulao e suportar a rede vascular para suprir a epiderme com nutrientes (MAKRANTONAKI; ZOUBOULIS, 2007).

2.1.3 Melancito

Melancitos so inicialmente derivados da crista neural (DEL MARMOL et al., 1993; STULBERG; CLARK; TOVEY, 2003; SLOMINSKI et al., 2004) e durante o desenvolvimento embrionrio (HEARING; TSUKAMOTO, 1991; TSATMALI;

ANCANS; THODY, 2002), melanoblastos migram para a ectoderme (POWELL, 2007), epiderme (TAYLOR, 2002) ou lugares apropriados (YAMAGUCHI;

BRENNER; HEARING, 2007). Uma vez que eles alcanaram o destino final se diferenciam em melancitos, os quais no sexto ms de vida fetal, aproximadamente, esto prontos e estabelecidos nas junes dermal-epidermal (COSTIN; HEARING, 2007). So capazes de produzir melanina e distribu-la atravs de seus dendritos para os queratincitos ao redor, por isso funcionam como componentes chave na pigmentao (TSATMALI; ANCANS; THODY, 2002). Melancitos epidermais proliferam-se lentamente e so bem resistentes a apoptose (YAMAGUCHI; BRENNER; HEARING, 2007). Queratincitos e melancitos formam uma unidade funcional conhecida como melanina epidrmica. Interagem intimamente para produzir e distribuir melanina na pele humana durante o processo de pigmentao, de tal modo que enquanto os queratincitos produzem fatores parcrinos que afetam a proliferao dos melancitos, dendritos e sntese de melanina, os melancitos controlam a sntese de melanina e a transferem para um queratincito adjacente (AHN et al., 2003). YAMAGUCHI (2007) afirmou que os melancitos epidermais e queratincitos basais podem ocorrer numa proporo de cerca de 1:10 e a distribuio de melanina que eles produzem pode ser visualizada na figura 3. Atravs desta tambm pode-se notar tambm o grau de penetrao da radiao UV em indivduos de pele clara e escura, sendo que nos primeiros maior pelo menor nmero de pigmentos responsveis pela absoro dessa radiao. Nos negros a radiao UV atinge no mximo o estrato espinhoso, enquanto que nos brancos atravessa a membrana basal da epiderme e atinge a derme.

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FIGURA 3 - ARQUITETURA DA PELE CLARA E ESCURA SC: Estrato crneo; G: Estrato granuloso; S: Estrato espinhoso; B: Estrato basal; BM: Membrana basal; D: Derme; K: queratincitos; M: Melancitos; F: fibroblasto (ovalado) FONTE: ADAPTADA DE YAMAGUCHI; BRENNER; HEARING (2007)

2.1.4 Melanina

A melanina um biopolmero (HEARING; TSUKAMOTO, 1991; COSTIN; HEARING, 2007; HERRLING; JUNG; FUCHS, 2008) nitrogenado (JONES et al., 2002) fenlico (CHOI et al., 2006; PLONKA; GRABACKA, 2006), granular extremamente insolvel (SCHMIDT; KRIEN; RGNIER, 1996), produzido por clulas dentrticas especializadas, melancitos - que esto localizadas primariamente na pele, bulbo capilar e olhos (HEARING; TSUKAMOTO, 1991) - atravs de uma via enzimtica (STURM; TEASDALE; BOX, 2001) como est sucintamente representada na figura 4. Essa via envolve uma srie de eventos celulares complexos (ARCANS et al., 2001). Dentro dos melancitos a melanina est ligada a uma protena matriz para formar melanossomos (WILKINSON; MOORE 1990). Uma vez produzida, os melanossomos so transferidos at os queratincitos adjacentes (TSATMALI; ANCANS; THODY, 2002; HOOGDUIJN et al., 2004). So polinions com um relativo alto teor de carga negativa por apresentar grupo carboxil e o-semiquinonas (FELIX et al., 1978) e so molculas de alto peso molecular, formada pela polimerizao oxidativa de compostos fenlicos (FOGARTY; TOBIN, 1996), se concentra nos melanossomos (JONES, 2002) e amplamente distribuda na natureza (CHOI et al., 2006). Ela encontrada em bactrias, fungos, plantas e animais (MOMTAZ; LALL; BASSON, 2008). A produo parece ser controlada por fatores relacionados presena ou falta de luz. Fatores relacionados luminosidade incluem epinefrina,

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noraepinefrina e melatonina. Os outros fatores com a falta de luminosidade incluem estimulao do hormnio melanoctico, andrgeno e estrgeno (ABDEL-WANIS; NAWAHARA, 2003). O estmulo melanognico atravs do hormnio estimulante de melancito (MSH) (HEARING; TSUKAMOTO, 1991).

FIGURA 4 - FORMA SIMPLIFICADA DA FORMAO DA MELANINA FONTE: ADAPTADO DE FRIEDMAN (1996)

Ela atua como um filtro fotoprotetor tico e qumico, o qual reduz a penetrao de todos os comprimentos de luz at tecidos subepidermais (JABLONSKI; CHAPLIN, 2000). Uma das principais funes biolgicas a fotoproteo via absoro ptica e espalhamento da radiao UV (SCHMIDT; KRIEN; RGNIER, 1996), sendo um mecanismo de defesa primrio (KANG et al., 2009). A existncia de melanina na pele altamente correlacionada com a preveno de radicais livres / ROS (espcies reativas de oxignio) gerados pela radiao UV. Especialmente na pele, a melanina assegura a proteo natural eliminando esses radicais livres gerados (HERRLING; JUNG; FUCHS, 2008). Alm desse possvel papel ela pode atuar como um sequestrante de agentes citotxicos como os ons metlicos, uma vez que estes tm propriedades catinicas e se ligariam por interao inica (LARSSON, 2006). A melanina um dos fatores mais importantes na determinao da colorao da pele (SAKUMA et al., 1999). O acmulo de certos agentes qumicos no tecido com pigmentao, devido a afinidade melanina, possivelmente o mecanismo de reteno mais pronunciado do corpo (LARSSON, 2006).

2.1.5 Eumelanina e feomelanina

Em humanos, melanina classificada em dois tipos gerais: eumelanina um biopolmero nitrogenado polimorfo preto ou marrom e altamente associado a protenas atravs de ligaes covalentes (SLOMINSKI et al., 2004); A feomelanina

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vermelha ou amarela, colorida pela polimerizao incorporada de precursores de conjugados de cistena (NAITO et al., 2007) e fortemente ligada a protenas, o que indica que ela ocorre como uma cromoprotena com alta variabilidade no nmero de em nitrognio e enxofre (SLOMINSKI et al., 2004). J BRENNER (2008) considera que h trs tipos de melanina: feomelanina (vermelha/amarela) e dois tipos de eumelanina. A pele humana contm uma mistura dos trs tipos, mas as propores variam enormemente e determinam a cor da pele. Ainda de acordo com BRENNER (2008), dentro dos melanosomos, no mnimo trs enzimas so indispensveis para a sntese dos diferentes tipos de melanina: - Tirosinase (TYR), Eumelanina 5,6-dihidroxiindole (DHI) e Protena TirosinaseRELATED 1 (TYRP1). Segundo PROTA (2001) alm do modo da polimerizao do DHI e o seu derivado 2-carboxil, DHICA, e os fatores controlando o modelo de rearranjo do dopacromo, os principais destaques deste esquema incluem o papel da peroxidase na polimerizao do DHI e os efeitos regulatrios de ons metlicos e, diferentes estgios da melanognese, nomeadas como ativao da tirosinase, rearranjo de dopacromo e polimerizao do DHI. O esquema pode ser visualizado pela figura 5.

FIGURA 5 - MELANOGNESE COM OS DIFERENTES PASSOS REGULATRIOS FONTE: PROTA (2001)

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2.1.6 Tirosina

Tirosina no permeia livremente atravs dos lipdios biliares e o mecanismo para o transporte do substrato inicial para a melanognese para o seu compartimento cataltico desconhecido (STURM; TEASDALE; BOX, 2001). Estudos indicam que h dois stios catalticos diferentes para tirosina e dopa (HEARING; EKEL, 1976) e um aumento na concentrao intracelular de ambos resulta no aumento da melanognese.

2.1.7 Tirosinases

Tirosinases ou polifenoloxidases so protenas amplamente distribudas na escala filogentica e responsvel pela melanizao nos animais e escurecimento das plantas (CABANES; CHAZARRA; GARCIACARMONA, 1994) e frutas (HYUN et al., 2008). So enzimas do tipo monooxigenase (STURM; TEASDALE; BOX, 2001) que pertencem a uma famlia de protenas que tem o centro cataltico formado por cobre (MATOBA et al., 2006) e catalisam a orto-hidroxilao dos monofenis e a subseqente oxidao dos produtos difenlicos em correspondentes quinonas (TEPPER; BUBACCO; CANTERS, 2002). Ela contribui direcionando a formao de pigmentos nos corpos dos mamferos tanto quanto nas plantas, microrganismos e fungos (MOMTAZ; LALL; BASSON, 2008). uma enzima limitante para a melanognese (HEARING; TSUKAMOTO, 1991; TSATMALI; ANCANS; THODY, 2002) na converso de tirosina em dopaquinona (AHN et al., 2003). Ela crtica na formao dos dois subtipos de melanina (TAYLOR, 2002) e a leso chave em muitos tipos de albinismo (HEARING; TSUKAMOTO, 1991). Inibidores das tirosinases so agentes qumicos capazes de reduzir reaes enzimticas, como a melanizao da pele humana e escurecimento dos alimentos. O controle da sua atividade importante na preveno da sntese de melanina no escurecimento de alimentos (QIU et al., 2009). Compostos naturais como vitamina C e AK so inibidores representativos da supresso melanognica (UM et al., 2003). Ela tambm pode ser inibida por aldedos aromticos e cidos aromticos (QIU et al., 2009). Por isso, grande o interesse por molculas que tenham a propriedade da inibio da tirosinase para campos como a cosmtica e agricultura.

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ons metlicos tm trs modelos principais de participao nos processos biocatalticos: orientao adequada do substrato alvo no estado de transio; mediao nas reaes de reduo/oxidao; estabilizao eletrosttica ou blindamento de cargas negativas (STENSON; CIOFFI, 2007). 2.2 PIGMENTAO DA PELE

Os pigmentos visveis so sintetizados pelos melancitos. Durante o desenvolvimento embrionrio as clulas melanocticas precursoras (melanoblasto) migram das cristas neurais para a pele, olhos e ento so diretamente responsveis pelas caractersticas de cor (STURM; TEASDALE; BOX, 2001). A pigmentao da pele considerada o sinal universal de juventude e beleza (RESZKO; BERSON; LUPO, 2009). resultado da sntese e distribuio de melanina (NAITO et al., 2007), comeando pela oxidao da tirosina em dopaquinona catalisada pela tirosinase (CHOI et al., 2006). O tamanho e o nmero das organelas so importantes na determinao da pigmentao. Melanossomos na pele de negros so maiores que seus homlogos na pele de brancos e esto armazenados como simples unidades em vez de grupos. Isto tem o efeito de retardar a degradao nos queratincitos e contribui para um maior nvel de pigmentao da pele (TSATMALI; ANCANS; THODY, 2002). Melancitos escuros exibem uma taxa de sntese de aproximadamente trs vezes mais melanina que os melancitos de caucasianos (SCHMIDT; KRIEN; RGNIER, 1996).

2.3

HIPERPIGMENTAO DA PELE

RUIZ-MALDONADO (1997) afirmou que embora hiperpigmentao seja um termo frequentemente usado como um sinnimo para hipermelanose, esta se refere a um aumento relacionado melanina e aquela a um aumento da pigmentao sem qualquer controle. O acmulo excessivo de pigmentao epidermal pode causar vrias desordens de hiperpigmentao (KANG et al., 2009). Vrios so os fatores que podem desencadear processos de

hiperpigmentao da pele, como por exemplo: Pinealectomia (ABDEL-WANIS; NAWAHARA, 2003); durante terapia antimalrica ( reportada entre 10-25% dos

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pacientes) (SELVAAG, 1996); Sob o estmulo de hormnios, irritao, ou idiopaticamente em algumas desordens, hiperplasia dos melancitos (STULBERG; CLARK; TOVEY, 2003); em resposta exposio ao sol (STULBERG; CLARK; TOVEY, 2003; COSTIN; HEARING, 2007; BRENNER; HEARING, 2008), como pode ser observado na figura 6; inflamaes da pele tais como eczema, dermatite de contato alrgico e irritante (HALDER; RICHARDS, 2004); psorase, queimadura, radioterapia, etc (RUIZ-MALDONADO; OROZCO-COVARRUBIAS, 1997); uma ampla variedade de frmacos como antibiticos e quimioterpicos (BRENNER; HEARING, 2008). Pigmentaes epidermais devido queimaduras solares, sardas, manchas senis so consideradas como causadas por um desequilbrio entre a sntese e excreo de melanina, resultando em um aumento anormal (SAKUMA et al., 1999).

FIGURA 6 HIPERPIGMENTAO DA PELE PELA ESTIMULAO DA RADIAO SOLAR FONTE: ASTISTRY (2009)

2.4

TRATAMENTO

O despigmentante ideal deveria ter um efeito clareador potente, rpido e seletivo sobre os melancitos hiperativados, no ocasionar a curto ou a longo prazo efeitos colaterais e remover permanentemente o pigmento indesejado, agindo em um ou mais passos no processo de pigmentao (BRIGANTI; CAMERA; PICARDO, 2003). Podem-se ter diversos mecanismos para despigmentao da pele como, por exemplo: destruir seletivamente os melancitos; inibir a formao de melanossomas e alterar sua estrutura; inibir a biossntese da tirosina; inibir a formao da melanina; interferir com a transferncia de melanossomas; ter um efeito qumico sobre a melanina ou aumentar a degradao de melanossomas em queratincitos (WILKINSON; MOORE 1990; PANDYA; GUEVARA, 2000). A figura 7 apresenta de

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forma resumida as principais abordagens para se interferir na via melanognica antes, durante e depois da sntese da melanina. A despigmentao pode ser obtida regulando (I) a transcrio e atividade da tirosinase, protena relacionada a tirosinase-1 (TRP-1), protena relacionada a tirosinase-2 (TRP-2), e/ou peroxidase; (II) conduo e distribuio dos melanossomos nos queratincitos e ( III) degradao da melanina e melanossomo e o retrocesso de queratincitos pigmentados.

FIGURA 7 ILUSTRAO ESQUEMTICA DAS POSSVEIS ABORDAGENS PARA INTERFERIR COM A VIA MELANOGNICA. Tyr: TIROSINASE; M: MELANOSSOMOS; ROS: ESPCIES REATIVAS DE OXIGNIO FONTE: ADAPTADO DE BRIGANTI; CAMERA; PICARDO (2003)

Como resultado do papel chave desenvolvido pela tirosinase na biossntese da melanina, a maior parte dos agentes clareadores atuam especificadamente para reduzir a funo dessa enzima por vrios mecanismos: ( I) interferncia com a transcrio e/ou glicosilao, (II) inibio por diferentes modalidades, ( III) reduo dos produtos e (IV) controle ps-transcrio (BRIGANTI; CAMERA; PICARDO, 2003). O tratamento de desordens da hiperpigmentao pode ser um longo processo e o impacto psicossocial destas desordens deve ser levada em considerao (HALDER; RICHARDS, 2004). A durao do tratamento pode variar de individuo para indivduo, sendo em geral alguns meses, evitando-se passar de dois anos (KATSAMBAS; STRATIGOS, 2001). Esse longo perodo freqentemente insatisfatrio (COTOLLESSA et al., 2001). O sucesso do tratamento depende tambm da complacncia do paciente ao aderir a todas as proposies e ao evitar possveis problemas gerados pela exposio ao sol.

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KATSAMBAS (2001) definiu uma srie de parmetros que so de grande relevncia para a eficcia do tratamento, como por exemplo: antes do incio do tratamento os pacientes devem ser informados de que ele tem a finalidade de melhorar a pigmentao em vez de resolver completamente a causa. Isto pelo fato de que os resultados podem no ser permanentes; a localizao da disfuno tambm um fator importante, uma vez que a histologia do mesmo pode levar a diferentes caminhos. Atualmente, h trs categorias de agentes de clareamento: compostos fenlicos, no fenlicos e frmulas combinadas. Dentro da classe dos compostos fenlicos o mais importante agente a hidroquinona (HQ) figura 8. considerada o padro ouro no tratamento das hiperpigmentaes nos ltimos 50 anos (HALDER; RICHARDS, 2004). Ela inibe a converso de dopa em melanina inibindo a enzima tirosinase. Esta etapa se d durante a sntese da melanina (BRIGANTI; CAMERA; PICARDO, 2003). A eficcia depende de vrios fatores como a concentrao, estabilidade qumica e o veculo usado. Em formulaes de concentraes 4-5% so consideradas bem efetivas.

FIGURA 8 ESTRUTURA DA HIDROQUINONA FONTE: THE INDEX MERCK (1983)

O maior exemplo dos compostos no fenlicos o cido azelaico, que ocorre naturalmente como um composto saturado, dicarboxlico com nove carbonos (HALDER; RICHARDS, 2004). Pode oxidar cidos graxos insaturados em cidos dicarboxlicos, os quais competitivamente inibem a tirosinase (BRIGANTI; CAMERA; PICARDO, 2003; HALDER; RICHARDS, 2004). Agentes de clareamento podem ser combinados com superficiais ou mdioprofundos peels qumicos, cido gliclico ou peels de cido tricloroactico 30%. Hidroquinona ou combinaes da mesma, tretinona e um corticosteride tpico pode ser usado antes e/ou depois do peel para aumentar a resposta teraputica e diminuir o risco de hiperpigmentao ps-inflamatria (KATSAMBAS; STRATIGOS, 2001). cido azelaico ou cido kjico, agentes qumicos de peeling, e lasers tambm tem sido muito utilizados (PANDYA; GUEVARA, 2000).

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2.4.1 Acido kjico O cido kjico (5-hidroxi-2-hidroximetil-4-pirona) figura 9 - um cido orgnico (TAKAMIZAWA et al., 1996) do metabolismo secundrio dos fungos. comumente produzido por cepas de Aspergillus (GOULD, 1938), Acetobacter e Penicillium (TAMURA et al., 2006) em um processo aerbio de uma ampla gama de fontes de carbono, pela converso de glucose por meio de reaes enzimticas em vrias etapas (MOHAMAD; ARIFF, 2007). Foi isolado pela primeira vez de uma cepa de Aspergillus em 1907 por Saito (GOMES et al., 2001) e a estrutura do AK, que est representada na figura 9, foi definida por Yabuta em 1924 (ICHIMOTO; TATSUMI, 1964). O nome do cido tem origem na palavra koji que significa cultura, pois ele foi extrado pela primeira vez de culturas de arroz.

FIGURA 9 ESTRUTURA QUMICA DO CIDO KJICO FONTE: THE MERCK INDEX (1983)

Compostos heterocclicos de seis membros contendo oxignio constituem uma importante classe de produtos naturais biologicamente ativos e sintticos, desempenhando um papel fundamental na qumica bioinorgnica (FARARD et al., 2009). De acordo com BENTLEY (2006), a principal via biosinttica a converso de glucose em AK, sem a quebra do anel piranosdico ou da cadeia carbnica (ARNSTEIN; BENTLEY, 1956), como pode ser visualizado na figura 10.

FIGURA 10 - POSSVEL BIOSSNTESE DO ACIDO KJICO A PARTIR DA GLUCOSE FONTE: BENTLEY (2006)

A reao inicial seria por uma oxidao como uma desidratao entre as estruturas II e III com a remoo de dois tomos de hidrognio do carbono 3 da glucopiranose sob influncia de uma oxidase e transformando-se em 3-cetoglucose

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(III). De acordo com ARNSTEIN e BENTLEY (1953) esse tipo de oxidao ocorre frequentemente no metabolismo de fungos e bactrias. Segue-se pela perda de duas molculas de gua at AK (IV), como est representado na figura 11.

FIGURA 11 - POSSVEIS REAES NA BIOSNTESE DO AK FONTE: ARNSTEIN; BENTLEY (1953a)

Uma outra possibilidade de biossntese a partir da molcula de gluconolactona (V) ser a precursora, demonstrada na figura 12. Se a oxidao at cido 3-cetogluconico lactona ocorrer duas rotas so possveis: (a:) reduo a 3cetoglucose (III) seguida da perda de duas molculas de gua; (b) perda de uma molcula de gua gera (VII) seguido da reduo do grupo carbonila (VIII) e perda de uma segunda molcula de gua at AK (IV).

FIGURA 12 - BIOSNTESE DO AK A PARTIR DA GLUCONOLACTONA FONTE: ARNSTEIN; BENTLEY (1953a)

Uma terceira pode envolver a incorporao de tomos de carbono predominantemente os tomos de carbono 4, 5 e 6 do AK quando pequenas molculas so adicionadas durante a fermentao da glucose (ARNSTEIN; BENTLEY, 1953b). Vrios tipos de fontes de carbono como a sucrose e a frutose hidrolisadas podem ser utilizadas por A. flavus para a biotransformao at AK (MOHAMAD; ARIFF, 2007). Vrias fontes podem ser usadas na biossntese do AK por espcies de Aspergillus. Entre elas a D-xylose e D-ribose so as que deram os melhores rendimentos, L-arabinose menos efetiva e D-arabinose, D-lyxose e L-xylose so

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fontes de carbono muito pobres para a produo de AK. A.flavus no sintetizou AK de L-lyxose ou L-ribose (ARNSTEIN; BENTLEY, 1956). O AK tem formula molecular C6H6O4 e peso molecular de 142,11 g/mol (BURDOCK; SONI; CARABIN, 2001). Esse cido apresenta-se como um p cristalino branco amarelado (THE MERCK INDEX, 1983). Ele cristaliza como

agulhas prismticas com acetona, etanol, ter ou metanol e acetato de etila. A faixa de fuso 153154C e tem pKa prximo de 7,90 (THE MERCK INDEX, 1983) 7,88 (MCBRYDE; ATKINSON, 1961). Atravs de dados experimentais percebeu-se que medida que a temperatura aumenta os valores de pKa diminuem (7.75, 7.68, 7.62 e 7.55) (SALLAM; HAGGAG; MASOUD, 1990). O AK altamente solvel em gua, metanol, acetona e moderadamente solvel em ter, acetato de etila, clorofrmio e piridina (BURDOCK; SONI; CARABIN, 2001) (THE MERCK INDEX, 1983). Para mamferos, a dose letal de aproximadamente 1g/kg (BRTKO et al., 2004). conhecido por formar fortes quelatos com ons metlicos (BATTAINI et al., 2000) como o cobre (NAITO et al., 2007), ferro (MCBRYDE; ATKINSON, 1961) e compostos organometlicos (SYNYTSYA et al., 2007). usado analiticamente para deteco e quantificao de nveis muito baixos de ferro pela sua alta afinidade pelo metal (STENSON; CIOFFI, 2007). Possui atividade bacteriosttica leve (BRTKO et al., 2004). Baseado nisto, ele tem sido usado como aditivo alimentcio na preveno do escurecimento enzimtico (TAMURA et al., 2006) como citado anteriormente. A preveno do escurecimento enzimtico pode ocorrer de forma direta pela mudana no cobre do stio cataltico da enzima e indireta atravs de reaes com intermedirios, prevenindo uma adicional mudana da quinona em pigmentos escuros (FRIEDMAN, 1996). Ele permitido como aditivo no Japo e adicionado a alimentos como um antioxidante. Usado na produo de inmeros alimentos incluindo miso (pasta de soja) shoyu (molho de soja) e sake. Tambm utilizado na produo de fermentados como o amazake, shouchu (licor destilado) e mirin (tempero alcolico) (BURDOCK; SONI; CARABIN, 2001). Intoxicao pelo consumo de alimentos contendo AK no tem sido reportadas (BRTKO et al., 2004). Devido as suas propriedades bioqumicas, gneros

alimentcios que o contm so considerados como produtos mais seguros (EMAMI et al., 2007). relatado uma srie de outros usos tais como precursor de potenciadores de sabor, antioxidante (TAKAMIZAWA et al., 1996), efeitos

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antinflamatrios (BRTKO et al., 2004). Ele tambm utilizado na sade pblica no tratamento de doenas. Como as relacionadas sobrecarga de ferro como a talassemia (STENSON, 2007) em que o AK quela os ons ferro que, neste tipo de doena, esto em excesso no organismo. Tambm no tratamento do diabetes no qual o AK quela o vandio e a estrutura resultante mimetiza a ao da insulina DABROS, 2007). AK comumente usado na indstria de cosmticos devido s suas propriedades de absoro de radicais livres (MITANI et al., 2001) e inibio da produo de melanina (ZBOROWSKI; GRYBOS; PRONIEWICZ, 2003). A atividade clareadora pode ser devido a uma lenta e reversvel inibio competitiva da tirosinase (NOHYNEK et al., 2004), durante a sntese da melanina (BRIGANTI; CAMERA; PICARDO, 2003), principalmente devido atividade quelante do cobre (LIM, 2001), cofator essencial para a atividade da enzima. Devido ao seu conhecido mecanismo de inibio da tirosina um componente essencial para a downregulation da hiperpigmentao da pele (AHN et al., 2003). Os limites mximos de concentrao de AK em cremes 2% e hidroquinona acima de 5% podem causar efeitos colaterais severos como dermatite, eritema e hiperpigmentao (LIN; YANG; WU, 2007; YANG; ZHANG, 2007). O modelo de como poderia ser o complexo formado entre o AK e o cobre, que no permitiria a ativao das tirosinases, est representado na figura 13.

FIGURA 13 - MODELO DO COMPLEXO AK-COBRE FONTE: TEPPER; BUBACCO; CANTERS (2002)

O mecanismo inibitrio do AK sobre polifenol oxidase segue atravs das seguintes aes: interferindo com a captao de O 2 requerido para a reao enzimtica; pela reduo de compostos quinona para difenis para prevenir a formao da melanina via polimerizao e pela combinao das duas aes acima (CHEN; WEI; MARSHALL, 2001). De acordo com KANG et al (2009) em clulas B16F10 de melanomas de camundongos o AK inibiu em 15,8% a produo de melanina a 200 g/ml e 31,1% a 400 g/ml e aproximadamente 80% de sobrevivncia das mesmas clulas. LIM

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(2001) em um estudo com mulheres chinesas que apresentavam melasma na face mostrou que houve uma melhora em 60,0% daquelas que usaram gel com AK (2%), hidroquinona (2%) e cido gliclico (10%) enquanto que entre aquelas que usaram apenas hidroquinona (2%) e cido gliclico (10%) a melhora ocorreu em 47,5%. Melancitos tratados com AK se tornam no dendrticos com uma diminuio da quantidade de melanina (BRTKO et al., 2004). Comparativamente com a hidroquinona, que prescrio de rotina, o AK tem a vantagem de ser farmaceuticamente mais estvel (BURDOCK; SONI; CARABIN, 2001). Tem-se encontrado tambm que o AK confere um impacto significante na fisiologia de queratincitos normais como uma supresso da sntese e secreo de citocinas (AHN et al., 2003). As radiaes solares UVB (280-320 nm) e particularmente UVA (320-400 nm) tm a capacidade de gerar espcies qumicas reativas como os radicais livres nas clulas. Esses tm se mostrado estar envolvidos em diversos efeitos biolgicos na pele como o eritema, envelhecimento da pele etc (JUNG et al., 2008). De acordo com os resultados obtidos por GOMES et al (2001) o AK tem uma atividade antioxidante eficiente contra trs espcies reativas de oxignio (OH, O 2- e 1O2). Deste modo ele poderia ser utilizado em produtos cosmticos, bloqueando a ao e os efeitos colaterais de muitas espcies reativas de oxignio produzidas.

2.5

TCNICAS ANALTICAS PARA QUANTIFICAO DE CIDO KJICO

A concentrao de uma amostra no uma grandeza fsica observvel e num processo analtico ela sempre obtida de forma indireta, a partir de medidas de outras grandezas como absoro ou emisso de luz e condutividade (PIMENTEL; NETO, 1996). Deste modo necessrio que se disponha de mtodos e aparelhos adequados para a identificao e quantificao do analito em harmonia com a sua real concentrao. Uma das ferramentas mais importantes no controle de qualidade fsico-qumico a utilizao de equipamentos que envolvem a mensurao de um ou mais analitos de forma simultnea. A seleo e desenvolvimento de mtodos de anlises tem tradicionalmente sido assunto de importncia para analistas que trabalham em laboratrios analticos (WOOD, 1999). Cada aparelho tem seu princpio terico bsico e relacionando isto as tcnicas so desenvolvidas, aperfeioadas e validadas.

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As tcnicas e os mtodos de determinao e/ou quantificao de AK so bastante variadas, como por exemplo: cromatografia gasosa baseada em derivados silyl para separao e quantificao de AK (OWENS; WELTY; LUCAS, 1970); cromatografia em camada delgada (SCOTT; LAWRENCE; WALBEEK, 1970); determinao espectrofotomtrica com sulfato de ferro ( III) (KAWATE; KOIKE;

FUKUO, 1972); cromatografia lquida de alta eficincia (QURESHI; PRENTICE; BURGER, 1979); determinao de AK em meio fermentativo pelo mtodo stopped flow e espectrofotometria (TANIGAKI; OBATA; TOKUYAMA, 1980); cromatografia lquida de alta eficincia em fase reversa (FRISVAD, 1987); cromatografia gasosa usando capilar de slica fundida (GOTO; MATSUI; KITSUWA, 1990); coluna cromatogrfica Bio Gel P-2 (KARITA et al., 1991); mtodo enzimtico para a determinao de AK que apesar de ser muito sensitivo e especfico pode ser mais oneroso que os demais mtodos por causa da pureza das enzimas (STREFFER et al., 1998); determinao do analito por HPLC-UV acoplado com fluorescncia pela formao de um caracterstico amarelo esverdeado brilhante (ZERINGUEJR et al., 1999); Em 2004, GOMARA et al. desenvolveram e validaram um mtodo de anlise direta atravs de espectroscopia UV; CORRER et al. (2005) desenvolveram uma tcnica para determinao de AK em produtos farmacuticos utilizando-se de uma ferramenta analtica calibrao multivariada e espectroscopia no UV; No ano seguinte duas novas tcnicas foram publicadas com a mesma finalidade das outras anteriores. Em uma delas, YANG; ZHANG (2007) investigaram o comportamento voltimtrico do AK por PVP/ABPE e desenvolveram um mtodo para quantificao. LIN; WU; HUANG,(2007) combinaram um HPLC com microdilise online para determinao simultnea de ascorbil, AK e niacinamida em cosmticos clareadores. J em 2007, (BUBACCO et al., 2007) usaram absoro por raio-x; LIN; YANG; WU (2007) otimizaram um sistema para anlise de AK, arbutin e hidroquinona simultaneamente atravs da eletroforese capilar eletrocintica micelar; SYNYTSYA et al (2007) complexaram AK com ferro III para quantificao em UV-Vis e conjugados com chitosana por RMN de H1; mtodo por LC/TOF-MS com confirmao dos dados tambm por UV e tempo de reteno no cromatgrafo lquido (SENYUVA; GILBERT; OZTURKOGLU, 2008). Cada aparelho e tcnica usada como HPLC, eletroforese capilar, UV-VIS e seus mtodos tem recursos especiais e deficincias, os quais devem ser considerados (BRUCE; MINKKINEN; RIEKKOLA, 1998).

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2.5.1 Espectroscopia eletrnica

A radiao numa faixa de comprimento de onda de 2-800 nm passada atravs de uma soluo do composto. Os eltrons das ligaes so excitados e ocupam um estado quntico superior, absorvendo um pouco de energia que passa pela soluo (WATSON, 1999). A absoro depende da estrutura eletrnica da molcula (SILVERSTEIN; BASSLER; MORRILL, 1994) e do comprimento de onda da radiao (SOLOMONS, 1996). As transies dos eltrons podem ocorrer a partir de um entre vrios estados de vibrao e de rotao de um nvel de energia eletrnica para um entre diversos estados de vibrao ou de rotao do nvel mais elevado (SOLOMONS, 1996). A transio de um eltron entre diferentes nveis energticos chamado de transio eletrnica e o processo de absoro chamado absoro eletrnica (SKOOG et al., 2000). O termo cromforo usado para descrever qualquer estrutura caracterstica o qual leva a absoro na regio do UV-Vis e inclui grupos nos quais as transies *, n * e n * so possveis (FURNISS et al., 1989). A conjugao n leva a um deslocamento da absoro para comprimento de ondas maiores chamado efeito batocrmico e inversamente para menores como efeito hipsocrmico. Quando h um aumento na intensidade o efeito denominado hipercrmico e quando ela diminui hipocrmico (HESSE; MEIER; ZEEH, 2008; FURNISS et al., 1989). As regies do espectro

eletromagntico podem ser visualizados na figura 14 e, em especial, do ultravioleta e infravermelho no quadro 1.

FIGURA 14 REGIES DO ESPECTRO ELETROMAGNTICO FONTE: HOLLAS (2004)

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REGIO ESPECTRAL Ultravioleta Ultravioleta visvel Infravermelho Infravermelho distante

COMPRIMENTO DE ONDA 2 400 nm 400 800 nm 0,75 2,5 m 2,5 m 1 mm DO ULTRAVIOLETA

FREQNCIA EM NMERO DE ONDA -1 (cm ) 5000000 - 50000 50000 25000 13333 - 400 400 10 E INFRAVERMELHO DO ESPECTRO

QUADRO 1 REGIES ELETROMAGNTICO FONTE: SKOOG et al., 2000

Um dos grupos de maior interesse o dos hidrocarbonetos insaturados, uma vez que eles apresentam hibridao sp2. H uma ligao dos eltrons p do carbono perpendiculares ao plano das ligaes . Neste caso, os eltrons ligantes tm uma fora de ligao menor e podem passar para nveis de energia superiores, orbitais antiligantes, sem se dar uma completa ruptura da molcula. Assim, verifica-se a absoro da radiao na regio do ultravioleta, atribudo a transies dos eltrons de orbitais ligantes para antiligantes transies ( - *). No estado * a ligao no existe e a molcula s tem ligaes simples para se manter como um todo. Estas transies correspondem a absores na regio de 200-700 nm (GONALVES, 1990). Como ponto forte a espectroscopia no UV fcil de usar, relativamente barata e oferece uma boa preciso para mensuraes quantitativas (WATSON, 1999). uma das ferramentas mais poderosas e amplamente usada em anlises quantitativas (SKOOG et al., 2000). Como limitao, moderadamente seletiva, dependendo do cromforo, e no muito aplicvel para misturas de analitos (WATSON, 1999). Entretanto, o mesmo ponto pode ser visto no mbito de que grupos caractersticos podem ser reconhecidos em molculas bastante complexas (SILVERSTEIN; BASSLER; MORRILL, 1994). Em 2004, GOMARA et al publicaram um artigo que teve por objetivo desenvolver e validar um mtodo de quantificao por espectroscopia eletrnica direta e sem a complexao com alumnio do AK. Usando um meio aquoso, e comprimento de onda mximo de 269 nm, ela determinou para o mtodo: intervalo, linearidade, robustez, exatido e preciso. O mtodo que foi desenvolvido limitado apenas para a matria-prima, sendo invivel para produto. Isso se d uma vez que na regio do comprimento de onda de quantificao do AK (269 nm) outras

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molculas que esto presentes nos cremes como conservantes (nipagin nipazol) contm cromforos que absorvem na mesma regio. Em 2007 (OLIVEIRA et al., 2007) desenvolveram um mtodo para quantificar AK em estudos de permeao i n vitro com soluo salina de cloreto de sdio 0,9% (m/v) no comprimento de onda 268 nm. cido kjico tambm pode ser determinado por colorimetria na reao com cloreto frrico em gua (MORTON et al., 1945) e de acordo com MOSS e MELLON (1941) em pH 5-6 na proporo de 1 ferro para 3 AK. Colorao vermelha escura observada quando as solues de ferro ( III) e AK so misturadas na faixa de pH 2-3 (MURAKAMI, 1962b).

2.5.1.1

Complexometria

Compostos de coordenao incluem compostos com um tomo metlico ou on e um ou mais ligantes (tomos, ons ou molculas) que formalmente doam eltrons para o metal. Esses compostos tambm so conhecidos como Complexos (MIESSLER; TARR, 2003). O estudo moderno dos compostos de coordenao se iniciou com Alfred Werner e Sophus Mads Jorgensen, sendo que pode-se concluir que Werner estava certo e Jorgensen estava errado na interpretao das evidncias experimentais que eles tinham (HUHEEY; KEITER; KEITER, 1993). Werner foi capaz de explicar a natureza das ligaes nos complexos e concluiu que nesses compostos o metal apresenta dois tipos de valncia: primrias, que seria o nmero de cargas no on complexo; e secundrias, que seria igual ao nmero de tomos ligantes coordenados ao metal (LEE, 1996). H trs teorias que explicam as ligaes entre metal e os ligantes nos complexos, todas formuladas na dcada de 30: teoria da ligao de valncia, teoria do campo cristalino e teoria dos orbitais moleculares (LEE, 1996). Baseado na estrutura do gs nobre possvel prever a estequiometria da maioria dos complexos de ligantes -cido. O nmero de eltrons de valncia do tomo metlico adicionado ao nmero de pares de eltrons , contribudos pelos ligantes, deve ser igual ao nmero de eltrons do tomo de gs nobre que sucede ao metal (COTTON; WILKINSON, 1978). A determinao de constantes de estabilidade por titulaes potenciomtricas com alumnio um mtodo poderoso para definir a identidade e distribuio dos

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complexos metal-ligante pela investigao da especiao em sistemas aquosos (JORDAN et al., 1996). Os elementos do grupo III formam complexos com muito maior facilidade do que os elementos do bloco s, pois apresentam menor tamanho e carga maior. Os compostos de alumnio apresentam como aspecto incomum as estruturas dimerizadas e parecem incluir ligaes tricentradas envolvendo orbitais hbridos sp3 no Al e C nas pontes Al-C-Al (LEE, 1980). Os elementos trivalentes formam complexos com a coordenao 4, 5 ou 6 catinicos como o [Al(H 2O)6]3+ , neutros ou aninicos (COTTON; WILKINSON, 1978). A quelao com ons metlicos desempenha um papel central na homeostase da atividade enzimtica, no qual mais de um tero de todas as enzimas conhecidas requerem a presena de ons metlicos da atividade cataltica (STENSON; CIOFFI, 2007). especiao do Al
3+

Conhecimento da

em solues aquosas importante para uma ampla gama de

reas de pesquisa como a de cosmticos (FOURNIER; SHAFRAN; PERRY, 2008). Em solues aquosas, por exemplo, com citrato o alumnio capaz de fazer seis ligaes, entre molculas de gua e do prprio citrato ou apenas entre oxignios do mesmo como pode ser visualizado na figura 15.

FIGURA 15 - ESTRUTURAS ESQUEMTICAS DA LIGAO DO ALUMNIO COM CITRATO FONTE: ADAPTADO DE KUAN et al. (2005)

A molcula do cloreto de alumnio, em soluo, devido grande energia de hidratao liberada supera a elevada energia de ionizao e os ons metlicos existem num estado hidratado. Estes apresentam seis molculas de gua firmemente ligadas formando uma estrutura octadrica. Em soluo cida o potencial de reduo de Al3+ at Al0 -1.66 e, em soluo bsica, -2.31 (LEE, 1980). A estrutura do on aluminato varia de acordo com o pH, de 8 a 12 os ons polimerizam atravs de pontes de OH e cada tomo de alumnio possui coordenao oito (COTTON; WILKINSON, 1978; LEE, 1980).

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O interesse nos complexos metlicos com o ligante AK tem sido estimulado por fatores como: espera-se que os complexos possuam uma atividade antibitica de amplo espectro e pela alta estabilidade dos complexos (BHATIA; KAUSHIK; SODHI, 1988).

2.5.2.

Espectroscopia no infravermelho

A radiao infravermelha no tem energia suficiente para provocar excitaes dos eltrons, mas faz com que os tomos, ou grupo de tomos, dos compostos orgnicos vibrem com maior rapidez e com maior amplitude em torno das ligaes covalentes que os unem. Estas vibraes so quantizadas e, quando ocorrem, os compostos absorvem energia IV em certas regies do espectro (SOLOMONS, 1996). Apesar da energia no ser suficiente a radiao pode induzir transies em estados vibracionais e rotacionais associados com o estado eletrnico fundamental das molculas (SKOOG et al., 2000). A intensidade das bandas de absoro depende da magnitude da carga na oscilao do momento dipolo da ligao durante a transio e tambm diretamente proporcional ao nmero de ligaes para aquela absoro particular. (FURNISS et al., 1989). O IV est inserido no espectro eletromagntico entre as regies do visvel e das microondas e pode ser dividida em infravermelho prximo (14290 cm -1 4000 cm-1), mdio (4000 cm-1 700 cm-1) e infravermelho distante (700 cm-1 200 cm-1) (SILVERSTEIN; BASSLER; MORRILL, 1979). A regio mais importante para a qumica orgnica compreendida entre 4000 e 660 cm -1 (FURNISS et al., 1989). Na regio do infravermelho, a absoro da radiao pode dar informaes sobre a identidade dos compostos na presena ou ausncia de grupos funcionais e estrutura das molculas. Com exceo de molculas diatmicas homonucleares, todas as outras absorvem radiao infravermelha. Por isso, um dos mtodos espectroscpicos de mais ampla aplicao (SKOOG et al., 2000). adequado para usos em linha, prxima de uma aplicao universal, pois qualquer molcula contm ligaes C-H, N-H, S-H ou O-H (PASQUINI, 2003). H dois tipos principais de vibraes moleculares: estiramento axial e deformao angular. Os estiramentos axiais podem ser simtricos ou assimtricos. Deformaes angulares podem ser simtricas no plano (tesoura), assimtrica no plano (balana), simtrica fora do plano (toro) e assimtrica fora do plano (abano) (FURNISS et al., 1989).

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O principal uso do infravermelho para molculas como complexos metlicos fornecer um mtodo rpido para determinao da formao do complexo. Em alguns casos, informaes estruturais especficas podem ser obtidas (JORDAN et al., 1996). A tcnica tem sido amplamente utilizada como um meio direto e rpido para identificar produtos pela indstria farmacutica (PASQUINI, 2003). Uma interpretao completa de um espectro , muitas vezes, difcil e complexa, pois a maioria dos compostos orgnicos tem um nmero muito grande de movimentos de flexo e alongamento. Entretanto no h a necessidade da elucidao completa do espectro, mas da identificao mnima de grupos funcionais. Se por um lado essa complexidade um ponto negativo, ela tambm tem um ponto positivo quando dois espectros so quase que perfeitamente superponveis a chance de elas terem sido geradas por amostras de uma mesma substncia muito grande. O mtodo experimental mais utilizado para analisar carbonila e complexos metlicos espectroscopia no infravermelho. A utilidade da freqncia de estiramento da carbonila se d pela sensitividade desta absoro em relao populao de eltrons dos orbitais CO antiligantes (HUHEEY; KEITER; KEITER, 1993). Infravermelho pode ser til em dois aspectos: o nmero de bandas de IV depende da simetria molecular e a determinando se capaz de decidir ou reduzir o nmero de possibilidades entre as alternativas geomtricas; a posio das bandas de IV podem indicar a funo do ligante e pode descrever o meio em que est o eltron do metal (MIESSLER; TARR, 2003). Tem sido amplamente usada em anlises qualitativas e quantitativas, sendo importante para a avaliao de matriasprimas e produtos (STUART, 2004). uma tcnica analtica que pode ser

quantitativa, rpida, no destrutiva e praticamente no exige a utilizao de reagentes e solventes.

2.5.3.

Espectroscopia de ressonncia magntica nuclear

Sob condies apropriadas em um campo magntico, uma amostra pode absorver radiao eletromagntica na regio de rdio-frequncia em freqncias definidas pelas caractersticas do analito (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2005). Os ncleos de certos elementos e istopos comportam-se como se fossem

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ims girando em torno de um eixo. Quando se coloca um composto contendo tomos de 1H ou de

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C num campo magntico muito forte e simultaneamente se

irradia o composto com energia eletromagntica, os ncleos podem absorver energia que quantizada (SOLOMONS, 1996). A nuvem eletrnica que circunda o ncleo tambm tem carga, movimento e, portanto, momento magntico. O campo magntico gerado pelos eltrons altera o campo magntico no microambiente ao redor do ncleo (LAMBERT; MAZZOLA, 2003). A absoro funo de determinados ncleos da molcula. Por conveno, freqncia e, portanto, a fora do campo magntico aumenta da esquerda para direita. Movimentos da esquerda para direita so denominados para campo alto (mais blindadas) e da direita para esquerda de movimentos para campo baixo (desblindadas) (FURNISS et al., 1989). Um registro grfico das freqncias dos picos de absoro contra suas intensidades constitui-se em um espectro de RMN (SILVERSTEIN; BASSLER; MORRILL, 1979). A tcnica somente aplicvel aos ncleos que possuem nmero de quantum spin (I) maior que zero (FURNISS et al., 1989). Ressonncia magntica nuclear um mtodo poderoso para se estudar complexos com Al 3+ em soluo. Alm disso, espectros com 1H e
13

C podem ser obtidos de um modo relativamente simples

(JORDAN et al., 1996). Uma evoluo importante na deteco de sinais fracos a RMN com Transformada de Fourier (FT) (SILVERSTEIN; BASSLER; MORRILL, 1979). RMN uma ferramenta valiosa na caracterizao de complexos organometlicos (MIESSLER; TARR, 2003).

2.5.4

Titulao potenciomtrica

Potenciometria uma tcnica comum para determinar as constantes de estabilidade por causa da simplicidade dos aparatos experimentais e a facilidade com o qual o sistema pode ser automatizado (JORDAN et al., 1996). Embora os resultados da titulao potenciomtrica no possam fornecer uma compreenso da estrutura do complexo, verificando as constantes de ligao as quais mostram a fora de interao entre um ligante e um on metlico, um pode inferir qual o stio bsico mais provvel para interagir com o cido de Lewis; a especiao de acordo com a carga nos valores de pH podem ser calculados (MERC et al., 2002). O mecanismo dominante para a reao de primeira hidrlise do Al3+ uma troca rpida e direta de H+ entre adjacentes H2O / H+ e H2O / OH-; p

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segundo e terceiro passos da hidrlise so tambm rpidos, porque o mecanismo de troca do H+ deveria acontecer nessas reaes tambm. Deste modo, sob a maioria das condies as espcies Al3+, Al(OH)2+ e Al(OH)2+ se interconvertem rapidamente e esto equilbrio dinmico entre eles(FAUST et al., 1995). O pH de uma soluo de um cido poliprtico submetida a uma titulao pode ser estimado em qualquer ponto considerando as espcies primrias em soluo e o equilbrio de transferncia de prton que determina o pH (ATKINS; JONES, 2001). Um melhor entendimento da bioqumica do alumnio requer um aumento do conhecimento do equilbrio do complexo do on Al3+ com ligantes. Para isto absolutamente necessrio construir modelos de especiao (VENTURINI-SORIANO; BERTHON, 1998).

2.6

VALIDAO

Atualmente no h uma gama muito ampla de tcnicas simples de quantificao de AK em preparaes farmacuticas. Sendo assim faz-se necessrio o estudo e a conseqente validao de mais mtodos que quantifiquem esse analito. Em indstrias, tais como a farmacutica, qumica e alimentcia, os mtodos analticos so os olhos e os ouvidos para todos os materiais produzi dos e usados (BOULANGER et al., 2007). A escolha de uma metodologia analtica adequada de fundamental importncia para o procedimento do controle de qualidade de uma substncia ativa ou forma farmacutica (VALENTINI; SOMMER; MATIOLI, 2007). O desenvolvimento de um mtodo analtico, a adaptao ou implementao de mtodo conhecido, envolve processo de avaliao que estime sua eficincia na rotina do laboratrio (BRITO et al., 2003). Esse processo denomina-se validao. A validao confere ao processo maior confiabilidade e aceitao dos resultados. feita para assegurar que a metodologia analtica seja exata, especfica, reprodutvel e robusta sobre um intervalo especificado em que o analito ser analisado (SHABIR, 2003). uma parte inevitvel no desenvolvimento de mtodos farmacopeicos ou procedimentos analticos de controle de qualidade (GRDINIC; VUKOVIC, 2004). A ANVISA (2003) preconiza que o objetivo de uma validao demonstrar que o mtodo apropriado para a finalidade pretendida, ou seja, a determinao qualitativa, semi ou quantitativa. Atravs do fornecimento de evidncia objetiva, comprova que os requisitos para uma aplicao ou uso especficos pretendidos foram atendidos (INMETRO, 2003). O processo visa dar aos

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laboratrios e aos rgos regulatrios uma garantia que cada mensurao que ser feita posteriormente ser prxima o suficiente ao valor verdadeiro ou no mnimo que a diferena estar abaixo do limite aceitvel (HUBERT et al., 2004). Validar um resultado fazer com que todos os procedimentos at chegar ao resultado final sejam aceitos como corretos. A validao de um mtodo analtico no significa que este possa ser aplicado sem restries para diferentes medicamentos com o mesmo princpio ativo, uma vez que os resultados so influenciados por inmeros fatores como a estrutura qumica, diferenas entre as frmulas de um laboratrio para outro (VALENTINI; SOMMER; MATIOLI, 2007). Usar testes estatsticos adequados para cada parmetro faz com que as tomadas de deciso sejam menos subjetivas e, conseqentemente, deixa o mtodo mais fcil de ser explicado e de ser implementado. O INMETRO (2003) sugere uma srie de elementos e pontos chave que podem ser relevantes durante o processo de desenvolvimento analtico. O planejamento e execuo da validao pode ser feito com a seguinte seqncia: Definir a aplicao, objetivo e escopo do mtodo; Definir os parmetros de desempenho e critrios de aceitao; Desenvolver um procedimento operacional para validao; Definir os experimentos de validao; Verificar se as caractersticas de desempenho do equipamento esto compatveis com o exigido pelo mtodo em estudo; Qualificar os materiais, por exemplo, padres e reagentes; Executar os experimentos preliminares de validao; Ajustar os parmetros do mtodo e/ou critrios de aceitao, se necessrio; Executar experimentos completos de validao; Preparar um procedimento operacional para execuo do mtodo, na rotina; Definir critrios de revalidao (por exemplo, mudanas de pessoal, condies ambientais, equipamentos, periodicidade), e definir tipo e freqncia de verificaes de controle da qualidade analtica para a rotina. Os processos de validao so dinmicos e nesse contexto tm-se as etapas do ciclo (que aparecem dentro dos retngulos) e as ferramentas principais ou tcnicas (que esto nas elipses) da figura 16 (FEINBERG, 2007).

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FIGURA 16 - CICLO DE VIDA DE UM MTODO DE ANLISE FONTE: ADAPTADO DE FEINBERG (2007)

Os mtodos analticos podem ser classificados de acordo com a finalidade como est descrito no Quadro 2:
CATEGORIA I II III FINALIDADE DO TESTE Testes quantitativos para a determinao do princpio ativo em produtos farmacuticos ou matriasprimas Testes quantitativos ou ensaio limite para a determinao de impurezas e produtos de degradao em produtos farmacuticos e matrias-primas Testes de performance (por exemplo: dissoluo, liberao do ativo)

IV Testes de identificao QUADRO 2 CLASSIFICAO DOS MTODOS ANALTICOS DE ACORDO COM A FINALIDADE FONTE: ANVISA (2003)

Os parmetros a serem analisados em um mtodo a ser validado so: especificidade e seletividade, linearidade, intervalo, preciso, sensibilidade (limite de deteco), limite de quantificao, exatido e robustez. Cada categoria descrita no quadro 2 exige um determinado conjunto de testes, conforme relacionados no Quadro 3:

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PARMETRO Especificidade Linearidade Intervalo Repetibilidade Preciso Intermediria Limite de deteco Limite quantificao Exatido Robustez de

CATEGORIA I Sim Sim Sim Sim ** No No Sim Sim

CATEGORIA II QUANTITATIVO ENSAIO LIMITE Sim Sim Sim Sim ** No Sim Sim Sim Sim No * No No Sim No * Sim

CATEGORIA III * * * Sim ** * * * No

CATEGORIA IV Sim No No No No No No No No

* Pode ser necessrio, dependendo da natureza do teste especfico. ** Se houver comprovao da reprodutibilidade no necessria a Preciso Intermediria. QUADRO 3 ENSAIOS NECESSRIOS PARA A VALIDAO DE MTODOS ANALTICOS DE ACORDO COM A SUA FINALIDADE FONTE: ANVISA (2003)

Como a proposta do mtodo desse trabalho quantificar princpio ativo em produtos farmacuticos e matria-prima, os parmetros analisados foram: intervalo, linearidade, preciso, seletividade, exatido e robustez.

2.6.1

Seletividade / especificidade

A especificidade e a seletividade esto relacionadas ao evento da deteco (INMETRO, 2003). A seletividade a capacidade que um mtodo possui de medir exatamente um composto em presena de outros componentes tais como impurezas, produtos de degradao e componentes da matriz (ANVISA, 2003). Para mtodos cromatogrficos, sero especficos aquele que mensurarem com exatido o analito na presena de todos os outros componentes potenciais da amostra (SHABIR, 2003). Mensuraes espectromtricas como UV-VIS tendem a serem seletivas, pois no distinguem muito bem compostos que tenham cromforos semelhantes (PERSSON; VESSMAN, 1998). Seletividade tem sua origem em seligo, que em latim significa escolher ou selecionar. Seletivo algo que tende a escolha com cuidado e seletividade o estado ou qualidade de ser escolhido (PERSSON; VESSMAN, 2001). A seletividade garante que o pico de resposta seja exclusivamente do composto de

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interesse (PHARMACOPEIA, 1999). Em procedimentos analticos os mtodos para detectar qualitativamente so seletivos e os que mensurarem quantitativamente sero especficos (VESSMAN, 1996),porm poucos mtodos so realmente especficos (PERSSON; VESSMAN, 1998). Entretanto os termos tem sido usados indistintamente ou com diferentes interpretaes (INMETRO, 2003) e para o termo especificidade o mesmo significado de seletividade tem sido freqentemente utilizado (RIBANI et al., 2004), embora no senso restrito no seja correto (PETERS; DRUMMER; MUSSHOFF, 2006) por terem significados diferentes (ROZET et al., 2007). Esse problema poderia ser evitado caso se utilizasse apenas o termo seletividade -como sugere a IUPAC- uma vez que so diminutos os mtodos que respondem apenas uma substncia.

2.6.2

Linearidade e intervalo

A linearidade de um procedimento analtico a habilidade para obter resultados dos testes os quais so diretamente proporcionais concentrao (valor) do analito na amostra dentro de um intervalo especificado (ICH, 2005; INMETRO, 2003; ANVISA, 2003). Essa relao matemtica, muitas vezes, pode ser expressa como uma equao de reta chamada de curva analtica (RIBANI et al., 2004). Ela se aplica aos resultados (concentrao) e no s respostas (sinal) (HUBERT; NGUYEN-HUU; BOULANGER; CHAPUZET; COHEN et al., 2007). Deve ser avaliado entre a faixa do procedimento analtico. Pode ser demonstrado diretamente na substncia (pela diluio de uma soluo padro estoque) e/ou pesagens separadas de misturas sintticas dos componentes do produto, usando o procedimento proposto (ICH, 2005) Deve ser avaliada pela inspeo visual do contexto de sinais como uma funo da concentrao do analito. Se h uma relao linear, ela dever ser investigada por mtodos estatsticos apropriados, por exemplo, pelo clculo de uma regresso linear (ICH, 2005). Para estabelecer a linearidade, um mnimo de 5 concentraes recomendada (ICH, 2005). A equao da reta que relaciona as duas variveis : y = ax + b

y = resposta medida (absorbncia); x = concentrao; a = inclinao da curva de calibrao = sensibilidade; b = interseo com o eixo y, quando x=0.

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O coeficiente de correlao linear (r) freqentemente usado para indicar o quanto pode ser considerada adequada a reta como modelo matemtico. Um valor maior que 0,90 , usualmente, requerido. Quanto mais se aproximar de 1,0 o coeficiente menor ser a disperso do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regresso estimados (RIBANI et al., 2004). O mtodo pode ser considerado como livre de tendncias (unbiased) se o corredor de confiana da reta de regresso linear contiver a origem (INMETRO, 2003). O critrio mnimo aceitvel do coeficiente de correlao (r) deve ser = 0,99 (ANVISA, 2003). Intervalo a faixa entre a maior e a menor concentrao (valor) do analito na amostra para o qual tem sido demonstrado que o procedimento analtico tem um nvel adequado de preciso, exatido e linearidade (ICH, 2005; SHABIR, 2003). normalmente derivado dos estudos de linearidade. estabelecido pela confirmao de que o procedimento analtico proporciona um grau de aceitabilidade da linearidade, exatido e preciso dentro dos extremos da faixa especificada. Geralmente vai de 80 a 120% da concentrao teste (ICH, 2005; ANVISA, 2003).

2.6.3

Exatido

Expressa a proximidade da concordncia entre o valor no qual cada um aceito como um valor convencional verdadeiro ou um valor referencia aceito e o valor encontrado (SHABIR, 2003; HUBERT; NGUYEN-HUU; BOULANGER; CHAPUZET; CHIAP et al., 2007). chamada, s vezes, de veracidade (ICH, 2005). Pode ser feita pela comparao dos resultados do procedimento analtico com aqueles de um segundo procedimento bem caracterizado (ICH, 2005; ANVISA, 2003). A exatido do mtodo deve ser determinada aps o estabelecimento da linearidade, do intervalo linear e da especificidade do mesmo, sendo verificada a partir de, no mnimo, 9 (nove) determinaes contemplando o intervalo linear do procedimento, ou seja, 3 (trs) concentraes, baixa, mdia e alta, com 3 (trs) rplicas cada. A exatido expressa pela relao entre a concentrao mdia determinada experimentalmente e a concentrao terica correspondente:

FIGURA 17 Frmula da exatido

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Quando aplicada a uma srie de resultados de ensaio, implica numa combinao de componentes de erros aleatrios e sistemticos (tendncia) (INMETRO, 2003). Na avaliao da exatido utilizando um material de referncia pode-se usar testes estatsticos como o erro relativo, teste de hipteses, entre outros. Caso no seja alcanado resultados satisfatrios deve ser feita uma investigao para averiguar as possveis causas, reavaliar o ensaio e efetuar aes corretivas.

2.6.4

Preciso

A preciso de um procedimento analtico expressa a proximidade de concordncia (grau de disperso) entre a srie de leituras obtidas de mltiplas amostras da mesma amostra homognea sob condies prescritas (ICH, 2005)(INMETRO, 2003). a parte mais importante de qualquer validao de mtodo analtico (WALFISH, 2006). Deve ser investigada usando amostras autenticas e homogneas. Entretanto, se no possvel obter uma amostra homognea, ela deve ser investigada usando amostras preparadas artificialmente ou uma amostra soluo (ICH, 2005). A preciso pode ser considerada em trs nveis: repetitividade, preciso intermediria e reprodutibilidade (ICH, 2005). Repetitividade e reprodutibilidade so geralmente dependentes da concentrao do analito e devem ser determinadas para um nmero diferente de concentraes. Neste caso o desvio padro relativo pode ser til, uma vez que foi normalizado com base na concentrao e deste modo ele praticamente constante ao longo da faixa de interesse (INMETRO, 2003).

2.6.4.1

Repetitividade

o grau de concordncia entre os resultados de medies sucessivas de um mesmo mensurando, efetuadas sob as mesmas condies de medio, chamadas de condies de repetitividade: mesmo procedimento de medio; mesmo observador; mesmo instrumento usado sob mesmas condies; mesmo local, e repeties em curto espao de tempo (INMETRO, 2003). Deve ser realizada com um mnimo de 9 determinaes cobrindo a faixa especificada (80,100 e 120%) para o procedimento ou 6 determinaes da

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concentrao teste (100%) (INMETRO, 2003; ANVISA, 2003). O termo repetitividade adotado pelo Vocabulrio Internacional de Metrologia (INMETRO, 2000). Por outro lado, a ANVISA (2003) utiliza o mesmo conceito para o termo repetibilidade.

2.6.4.2

Preciso intermediria

A preciso intermediria refere-se preciso avaliada sobre a mesma amostra, amostras idnticas ou padres, utilizando o mesmo mtodo, no mesmo laboratrio ou em laboratrios diferentes, mas definindo exatamente quais as condies a variar (uma ou mais), tais como: diferentes analistas; diferentes equipamentos; diferentes tempos. O objetivo da validao da preciso intermediria verificar que no mesmo laboratrio o mtodo fornecer os mesmos resultados. Esta medida de preciso reconhecida como a mais representativa da variabilidade dos resultados em um laboratrio e mais aconselhvel de usar. Para determinar a preciso intermediria de um mtodo, efetuam-se n medies em replicata, ou em ensaio nico, sobre a amostra, nas condies pr-definidas, pois existem vrios mtodos de estudar este tipo de preciso. (INMETRO, 2003).

2.6.4.3

Reprodutibilidade

Concordncia entre os resultados obtidos em laboratrios diferentes. Refere-se aos resultados de colaborao entre laboratrios e deve ser considerada em situaes como a padronizao de procedimentos analticos a serem includos, por exemplo, em farmacopias (ANVISA, 2003; ICH, 2005). A ICH e a ANVISA sugere um mnimo de nove determinaes de um mnimo de trs nveis de concentraes, de acordo com o intervalo especificado, ou um mnimo de seis determinaes para uma nica concentrao teste. A preciso pode ser expressa como desvio padro relativo (DPR) ou coeficiente de variao (CV%), segundo a frmula: DPR = (DP x 100) CMD
FIGURA 18 FRMULA DO DESVIO PADRO RELATIVO

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Em que, DP o desvio padro e CMD, a concentrao mdia determinada. O valor mximo aceitvel deve ser definido de acordo com a metodologia empregada, a concentrao do analito na amostra, o tipo da matriz e a finalidade do mtodo, no se admitindo valores superiores a 5% (ANVISA, 2003).

2.6.5

Robustez

uma medida da capacidade dos resultados continuarem inalterados, por pouco, frente a variaes deliberadas nos parmetros do mtodo e proporciona uma indicao da confiabilidade durante usos normais (ICH, 2005). Ela descrita como a estabilidade do mtodo (BRUCE; MINKKINEN; RIEKKOLA, 1998). Mede a sensibilidade que este apresenta face a pequenas variaes. Um mtodo diz-se robusto se revelar praticamente insensvel a pequenas variaes que possam ocorrer quando esse est sendo executado (INMETRO, 2003).

2.6.6

Sensibilidade

A sensibilidade definida como a capacidade de um mtodo em distinguir, com determinado nvel de segurana, duas concentraes prximas (ICH, 2005). A sensibilidade foi verificada atravs dos limites de deteco e quantificao. O limite de deteco (LD) de um procedimento analtico a menor quantidade do analito numa amostra a qual pode ser detectada, mas no necessariamente quantificada como um valor exato (FDA, 1995), sob as condies experimentais estabelecidas (ANVISA, 2003). Ele calculado pelo desvio padro do intercepto com o eixo Y (a partir de trs curvas analticas) multiplicado por trs e dividido pela inclinao da curva analtica. O limite de quantificao (LQ) de um procedimento analtico individual a menor quantidade do analito na amostra que pode ser determinado com adequada preciso e exatido (FDA, 1995). Ele calculado pelo desvio padro do intercepto com o eixo Y (a partir de trs curvas analticas) multiplicado por dez e dividido pela inclinao da curva analtica.

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Objetivos

55

3.

OBJETIVOS

3.1

OBJETIVO GERAL

Desenvolver e validar um mtodo para a quantificao de cido kjico matria-prima e produto por espectrofotometria no ultravioleta.

3.2

OBJETIVOS ESPECFICOS

- Desenvolver um mtodo para a quantificao do cido kjico em matriaprima e em cremes, por espectrofotometria no ultravioleta, tendo por base as propriedades quelantes do analito com ons metlicos (Alumnio); - Validar o mtodo desenvolvido segundo normas nacionais e internacionais; - Testar o mtodo desenvolvido em preparaes magistrais contendo o cido kjico em associao com a hidroquinona; - Quantificar cido kjico e a hidroquinona na mesma anlise; - Elucidar o tipo de complexo formado entre o cido kjico e o alumnio

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Material e Mtodos

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4.

MATERIAL E MTODOS

4.1

DESENHO EXPERIMENTAL

A pesquisa foi dividida basicamente em duas etapas. A primeira etapa compreendeu o desenvolvimento e validao de um mtodo espectrofotomtrico (UV) para a quantificao de cido kjico em matria-prima e em creme cosmtico. No desenvolvimento foram testados diferentes solventes para definir o mais adequado, o comprimento de onda, a absortividade molar, bem como a necessidade de otimizao do mtodo. A validao foi realizada baseada na Resoluo - RE n 899, de 29 de maio de 2003, farmacopia americana (USP, 2005) e da Conferncia Internacional de Harmonizao (ICH, 2005) nos parmetros: linearidade,

sensibilidade, repetitividade, preciso intermediria, exatido e robustez. Na segunda etapa procurou-se elucidar o tipo de complexo formado entre AK e AlCl 3. Para essas anlises foram utilizadas algumas ferramentas como a espectrometria no UV-Vis, titulao potenciomtrica, infravermelho e ressonncia magntica nuclear.

4.2

MATERIAL

4.2.1 Materiais e reagentes

- cido kjico padro Sigma Aldrich Chem. Co. (98,0%) - cido kjico matria-prima Via Farma (100.5%) - lcool metlico P.A. (FMAIA) - gua ultrapura e deuterada - brometo de potssio (KBr) P.A. - cloreto de alumnio soluo 0,2% (LABSYNTH) e padro 1000mg/l (MERCK) - cloreto de sdio (NaCl) P.A. - cloreto de potssio P.A. - creme Lanette (DAGFARMA) - chemynol (0,3 %), imidazoli (0,6 %), propilenoglicol (0,5 %), lanette N (16,0 %), vaselina lquida (5,0%), BHT cristal (0,05 %), nipazol (0,1 %), glicerina branca bidestilada (5,0 %), EDTA (0,1%), nipagin (0,2%), silicone voltil (2,0 %) e gua purificada qsp.

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- creme Lanette AK 2% (DAGFARMA), AK 2% e HQ 4 %(DAGFARMA) - creme no inico (DAGFARMA) - chemynol (0,3 %), silicone dc 9040 (1,0 %), imidazoli (0,6 %), propilenoglicol (0,5 %), chembase NF (18,0 %), BHT cristal (0,1 %), nipazol (0,05 %), glicerina branca bidestilada (5,0 %), EDTA (0,2%), nipagin (0,15%), silicone voltil (1,0 %) e gua purificada qsp. - creme no inico AK 2% (DAGFARMA), AK 2% e HQ 4 % (DAGFARMA) - cubetas de quartzo com caminho ptico de 1 cm - papel filtro quantitativo (FRAMEX; J.PROLAB)

4.2.2 Equipamentos

- aparelho de ponto de fuso (BUCHI SMP-20) - balana analtica (METTLER TOLEDO EXCELENCE PLUS) - espectrofotmetro UV-Vis (AGILENT 8453E) Equipamento 1 - espectrofotmetro UV-Vis (SHIMADZU 1601PC) Equipamento 2 - aparelho de ressonncia magntica nuclear (BRUKER Avance DRX 400) - espectrmetro infravermelho (BOMEM MB 100) - espectrmetro de absoro atmica AA-220 FS Varian - potencimetro digital (HANNA HI 4521) - titulador automtico Titrando 805E (METROHM)

4.3

MTODOS

4.3.1 Desenvolvimento do mtodo

O cido kjico um frmaco que apresenta um cromforo caracterstico e possui intensa absoro na regio do ultravioleta. Deste modo torna-se vivel o desenvolvimento de um mtodo por espectrofotometria nessa regio para a quantificao do mesmo. Inicialmente foram testados os solventes gua e metanol e diferentes valores de pH, verificada a necessidade de filtrao principalmente para o produto e o processo mais adequado, verificao de outras substncias presentes na formulao e que tambm podem absorver na mesma regio do espectro, como

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melhorar a seletividade, seleo do melhor comprimento de onda e validao do mtodo.

4.3.1.1

Escolha do solvente e influncia do pH

Para este ensaio foram preparadas solues-me de cido kjico, a primeira em gua (1500 g/mL) e a segunda em metanol (1500 g/mL). A p artir da soluome aquosa de cido kjico foram preparadas trs solues. A primeira contendo AK 15 g/mL; a segunda AK 15 g/mL em meio acidificado (HCL 0,1M); a terceira AK 15 g/mL em meio alcalinizado (NaOH 0,1M). Procedeu -se da mesma forma para a soluo metanlica. Dessas solues foram obtidos os espectros de absoro na regio de 200-400 nm foram obtidos em espectrofotmetro UV-Vis Agilent 8453E, com cubeta de quartzo, espessura de 1,0 cm, temperatura de 20C.

4.3.1.2

Avaliao da seletividade

O mtodo foi desenvolvido com o propsito de ser utilizado para quantificar cido kjico em cremes cosmticos. Estes cremes geralmente contm conservantes, sendo tambm comuns a associao do AK com a hidroquinona. Desta forma, a possvel interferncia destes componentes foi avaliada. Para avaliar a interferncia destes componentes foram preparadas solues aquosa e metanlica dos componentes da formulao (nipagin , nipazol, hidroquinona e da base que era creme no inico ou Lanette obtidas comercialmente). Para o nipagin e nipazol a concentrao final foi de 10 g/ml. Para a hidroquinona a concentrao final foi de 20 g/ml e para a base 1 mg/mL. Para os conservantes tambm foram preparadas solues cidas e bsicas. Para melhorar a seletividade de mtodos espectrofotomtricos, em geral, deve-se deslocar a banda de absoro do analito de interesse para comprimentos de onda de maiores valores, onde poucas molculas absorvem. Tomando por base as caractersticas quelantes do analito, uma possibilidade foi a de utilizao de um ction metlico trivalente (Al3+), tendo em vista que os complexos em geral promovem um deslocamento batocrmico. Para a formao do complexo uma soluo cida (HCl 0,1M) de cloreto de alumnio 0,2% (p/V) foi adicionada, em

60

excesso na proporo molar, soluo de AK (20 g/ml) tanto em meio aquoso quanto metanlico. Para a seleo do comprimento foram preparadas solues de cido kjico na concentrao de 15 g/ml, em soluo aquosa, metanlica e com soluo cida de cloreto de alumnio, e os espectros das solues foram obtidos na regio de 200 400 nm A seleo do melhor comprimento de onda foram feitas levando-se em considerao a intensidade da absoro e a regio do espectro mais seletiva dentre as bandas de absoro. Outro recurso utilizado foi avaliao do coeficiente de correlao. Para esta anlise foram preparadas vrias solues de AK em soluo cida de cloreto de alumnio em concentraes variando de 0,1 a 50 g/ml. Em seguida foram obtidos os espectros das solues na regio de 200 400 nm. A partir do conjunto de espectros foram obtidas as curvas analticas para os vrios comprimentos de onda do espectro (200 400 nm) e calculados os coeficientes de determinao. Os valores de coeficiente de determinao foram representados graficamente versus comprimento de onda, para avaliar a regio de melhor proporcionalidade.

4.3.1.3

Influncia da proporo AK e AlCl3 na intensidade de absoro

Para esta anlise foram preparadas solues de cido kjico (15 g/ml) e soluo cida (HCl 0,1M) de cloreto de alumnio 0,2% p/v. Em seguida foram misturadas de tal forma que a concentrao de AK foi mantida fixa em 15 g/ml, e a concentrao da soluo cida de cloreto de alumnio variou, de tal forma a se obter 28 solues em que o AK e o AlCl3 encontravam se em propores molares (mol de AK / mol de AlCl3) de 1:0 at 1: 136 (tabela 1). 4.4 VALIDAO

O mtodo espectromtrico envolvendo a complexao do AK com cloreto de alumnio em meio metanlico uma vez desenvolvido foi validado tomando por base os parmetros preconizados pela farmacopia americana (USP, 2005), RDC 899 (ANVISA, 2003) e da Conferncia Internacional de Harmonizao (ICH, 2005).

61

4.4.1 Linearidade e intervalo

Para a determinao da linearidade foi preparada uma soluo-me com concentrao de 2000 g/ml e a partir desta foram feitas diluies em bales

volumtricos de 10 mL para se obter solues de concentraes que variaram de 1100 g/mL (1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 e 100 g/mL). Em cada sistema foi adicionado 1,5 mL de soluo cida (HCl 0,1M) de cloreto de alumnio 0,2% (p/V) e o volume completado para 10 ml com metanol. As absorbncias foram determinadas em = 305 nm. O ensaio foi realizado em triplicata. Os grficos foram traados correlacionando-se as concentraes s respectivas absorbncias. Foram determinados a equao da reta e o coeficiente de determinao. A partir do grfico da linearidade foi tambm definido o intervalo, e a concentrao de trabalho. O intervalo foi definido a partir do ensaio da linearidade, e considerando a concentrao de trabalho, 20,0% da concentrao terica teste recomendada para determinao quantitativa de matria-prima e produto acabado. Para a construo da curva padro foram realizadas trs pesagens para preparar trs solues padro de 2000 g/mL. A partir destas solues foram preparadas solues de diferentes concentraes de AK (5, 10, 15, 20 e 25 g/mL) e adio de 1,5 mL de soluo cida (HCl 0,1 M) de cloreto de alumnio 0,2% (p/V), sendo o volume completado para 10 mL com metanol. As leituras de absorbncia foram realizadas = 305 nm, em triplicata, com um total de nove mensuraes, calculado o DPR%, determinada a equao de reta e o coeficiente de correlao. Procedeu-se o ensaio de linearidade utilizando a mesma metodologia com a recuperao de AK na presena ou ausncia de hidroquinona em creme Lanette, na faixa de 5-30 g/mL. Para a avaliao da linearidade procedeu-se o teste de Kolmogorov-Smirnov para verificar a normalidade, a comparao de varincias atravs do clculo da razo entre as mdias quadrticas da regresso e mdias quadrticas dos resduos com comparao com o valor da distribuio F tabelado para um grau de confiana de 95% com 1 e 8 graus de liberdade.

62

4.4.2 Sensibilidade

A sensibilidade foi avaliada atravs dos limites de deteco e quantificao. O limite de deteco foi calculado pelo desvio padro do intercepto com o eixo Y (a partir de trs curvas analticas) multiplicado por trs e dividido pela inclinao da curva analtica. O limite de quantificao foi calculado pelo desvio padro do intercepto com o eixo Y (a partir de trs curvas analticas) multiplicado por dez e dividido pela inclinao da curva analtica.

4.4.3 Preciso

A preciso foi obtida atravs da avaliao da proximidade dos resultados obtidos a partir de uma srie de mensuraes de uma mesma amostra. Ela avaliada estatisticamente pelo clculo do desvio padro relativo ou coeficiente de variao e erro relativo. Ela foi mensurada atravs da anlise dos parmetros repetitividade (intra-dia) e preciso intermediria (inter-dias).

4.4.3.1

Repetitividade

A repetitividade foi avaliada em trs nveis de concentrao (n= 18). Foram preparadas trs solues-me de concentraes iguais a 2000 g/mL e partir destas foram feitas diluies para se obter solues de cido kjico de diferentes concentraes (10, 15 e 20 g/mL). Em cada sistema foi adicionado 1,5 mL de soluo cida (HCl 0,1 M) de cloreto de alumnio 0,2% (p/V), e o volume completado para 10 mL com metanol. As leituras das absorbncias foram feitas a 305 nm e calculado o DPR. Para cada concentrao tambm foi calculado o erro relativo e o valor de p pelo teste t para amostras independentes. As so lues foram preparadas no mesmo dia, pelo mesmo analista e com o mesmo equipamento.

4.4.3.2

Preciso intermediria

Para a anlise da preciso intermediria foram preparadas solues-me de 2000 g/mL de cido kjico e diludas nas concentraes 10, 15, e 20 g/mL, com trs leituras para cada ponto. A cada sistema foi adicionado 1,5 mL de soluo cida

63

(HCl 0,1 M) de cloreto de alumnio 0,2% (p/V) e o volume completado para 10 mL com metanol. As leituras das absorbncias foram feitas no comprimento de onda 305 nm. As anlises foram feitas em dias consecutivos por analistas diferentes e usando equipamentos diferentes. Para cada concentrao tambm foi calculado o DPR, erro relativo e o valor de p pelo teste t para amostras independentes.

4.4.4

Exatido

A exatido foi determinada atravs do ensaio de recuperao. 375 mg de base (creme lanette ou no inico) foram incorporadas quantidades conhecidas de cido kjico e, em seguida, diluiu-se adequadamente com metanol e filtrado. Alquotas adequadas do filtrado foram transferidas para bales volumtricos de 10 ml, aos quais foi adicionado 1,5 mL de soluo cida de cloreto de alumnio 0,2% (p/V) e completado com metanol para o volume de 10 mL, de tal forma a obter solues contendo concentraes de 10, 15 e 20 g/mL em cido kjico . Procedeuse da mesma forma com as amostras em que foram incorporados em associao de cido kjico (2%) e hidroquinona (4%), obtendo-se solues contendo 10, 15 e 20 g/mL em cido kjico e 20, 30 e 40 g/mL em hidroquinona. A concentrao dos analitos foi determinada atravs da leitura por espectrofotometria no UV nos comprimentos de onda de 305, 315 e 320 nm e as porcentagens de recuperao foram calculadas pelo mtodo, considerando os diferentes comprimentos de onda. Para cada concentrao tambm foi calculado o DPR, erro relativo e o valor de p pelo teste t para amostras independentes.

4.4.5

Robustez

O ensaio de robustez tem por objetivo avaliar a capacidade do mtodo de no ser afetado por pequenas e deliberadas variaes, fornecendo um indicativo de confiana para o uso do mtodo. Na avaliao da robustez foram testados os seguintes parmetros: influncia da concentrao do on metlico, do tempo de leitura e da temperatura na intensidade de absorbncia.

64

4.4.5.1

Influncia do tempo de leitura na intensidade de absoro

Foram preparadas solues-me de cido kjico 1000 g/mL, em triplicata, e diludas em balo volumtrico at 15 g/mL. Cada balo continha 1,5 mL de soluo cida (HCl 0,1 M) de cloreto de alumnio 0,2% (p/V) e 150 L da soluo -me (1000 g/mL) e completadas com metanol para 10 mL. As leituras das absorbncias foram feitas em 305 nm em temperatura controlada de 20C, nos tempos zero, 24 e 72 horas. Para cada grupo de resultados foram calculados o DPR, o erro relativo e valor de p pelo teste t para amostras pareadas.

4.4.5.2

Influncia da temperatura na intensidade de absoro

Foram preparadas solues-me de cido kjico 1000 g/mL, em triplicata, e diludas em balo volumtrico at 15 g/mL. Cada balo continha 1,5 mL de soluo cida (HCl 0,1 M) de cloreto de alumnio 0,2% (p/V) e 150 L da soluo -me (1000 g/mL)e completadas com metanol para 10 mL. As leituras das absorbncias foram feitas em 305 nm nas temperaturas 5C, 20C e 30C, aps permanecerem por quatro horas nessas condies. Para cada grupo de resultados foram calculados o DPR, o erro relativo e valor de p pelo teste t para amostras pareadas.

4.4.5.3

Influncia do pH na intensidade de absoro

Foi preparada soluo-me de cido kjico 1500 g/mL e diluda para 150 g/mL. Em balo de 10,0 mL foram preparadas nove solues, sendo que em cada balo continha 1,0 mL da soluo diluda, 1,5 mL de soluo cida (HCl 0,1 M) de cloreto de alumnio 0,2% (p/V) e pH ajustados com KOH para pH 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 11 e 14 e completadas com metanol para 10 mL. As leituras das absorbncias foram feitas em 305 nm em temperatura controlada de 20C. Para cada grupo de resultados foram calculados o DPR, o erro relativo e valor de p pe lo teste t para amostras pareadas.

65

4.4.5.4

Influncia da concentrao do metal na intensidade de absoro

Foram preparadas solues de cido kjico (15 g/mL), variando a concentrao de cloreto de alumnio a fim de que houvesse diferentes relaes molares entre os reagentes. As propores avaliadas de AK : Al3+ foram de 1 : 0 at 1 : 136.

4.5

ESTUDO DO COMPLEXO

4.5.1 Espectroscopia no Infravermelho (IV) Os espectros de absoro no IV foram obtidos no espectrofotmetro FTIR MB 100 BOMEM e detector DTGS no Departamento de Qumica da UFPR. Foram obtidos espectros do padro, e de liofilizados de solues aquosas de cido kjico em pH 9 e 14 e de solues aquosas de cido kjico com cloreto de alumnio em pH 1, 11 e 14. Solues de cido kjico (15 g/mL) com valores de pH 9 e 14, e solues de cido kjico com alumnio com valores de pH de 1, 11 e 14 foram liofilizadas. O ajuste de pH para a faixa bsica foi feito com KOH. Para pH 1, no houve ajuste. O padro do analito foi verificado em amostra slida, sem a utilizao da liofilizao. Todas as amostras foram preparadas em pastilha de KBr. Os espectros foram adquiridos com resoluo igual a quatro, o nmero de scans igual a 64, no modo transmitncia e tendo como branco o ar. Os espectros foram processados considerando a faixa espectral do infravermelho mdio (4000 a 400 cm-1).

4.5.2

Ressonncia magntica nuclear (RMN)

Os espectros de ressonncia magntica nuclear foram obtidos em espectrofotmetro BRUKER Avance DRX 400 operando na freqncia base de 400,13 MHz e 100,63 MHz para os ncleos de
1 13

H e

C, respectivamente,

experimento este realizado no Departamento de Bioqumica da UFPR. Foram obtidos espectros do padro em soluo aquosa (15 mg/mL) em pH 4, 7, 9, 11 e 14,

66

de solues de cido kjico complexado com alumnio na proporo AK 1:1 Al 3+ em pH 2 e 4. Os espectros de RMN
13

C DEPT foram obtidos em um z de 135, no qual

CH e CH3 ocorrem em fase positiva em relao linha de base e CH 2 em fase negativa. As amostras foram solubilizadas em solventes deuterados (D 2O e CD3OD) e colocadas em tubos de 5 mm de dimetro para anlise a 25C. Algumas amostras tiveram seus assinalamentos determinados com auxlio dos experimentos

bidimensionais COSY e HMBC, sendo estes realizados de acordo com parmetros indicados no Manual Bruker. Os deslocamentos qumicos expressos em ppm foram determinados utilizando-se: - padres internos: Me4Si (0.00 ppm para 1H e 30, 20 ppm, 1H e 13C respectivamente) - sinal central dos solventes deuterados: CD3OD (3,31 ppm e 49,15 ppm, 1H e
13 13

C) ou acetona (2,23 ppm e

C respectivamente).

4.5.3

Titulao potenciomtrica

As titulaes potenciomtricas foram conduzidas com o mtodo desenvolvido no laboratrio de equilbrio qumico (LEQ-UFPR) de acordo com MARTELL e MOTEKAITIS (1988) (MERCE et al., 1998) Todos os ensaios foram realizados em triplicata em atmosfera inerte de N2 (White-Martins, Brasil), gs previamente purificado em dois frascos de limpeza contendo solues de KOH 1 e 0,1 M (Merck, Brasil), em recipiente fechado e mantido a 25,00,1C (Banho termostatizado MQBTC 99-20, Microqumica, Brasil) contendo quantidades exatas de cido kjico (0,1 mmol, 98.0%, Sigma Aldrich), 372,7 mg de KCl p.a. para ajuste da fora inica ( 0,100 mol/L) e dissolvidos em 50,00 mL de gua purificada ou com adio de 10,00, 5,00 ou 3,00 mL de soluo de cloreto de alumnio 0.01 mol/L em cido ntrico 0.13 mol/L (padro Merck). A pureza do AK foi determinada nos prprios ensaios de titulao potenciomtrica e a soluo de AlCl3 foi padronizado por EAA espectroscopia de absoro atmica, aparelho modelo AA-220 FS Varian com sips (diluio automtica); Lmpada de Al ctodo oco com corrente de 10mA; comprimento de onda da leitura: 237,3 nm com abertura de fenda (slit width) de 0,5 nm. Como condies experimentais teve-se

67

leitura em triplicata com desvio padro mximo de 1%, chama xido nitroso (9,11 mL/min.) com acetileno (7,04 mL/min.) em modo de absorbncia. A concentrao de acido inorgnico forte [(H+)] foi determinada por titulao do tipo Grans Plot de acordo com MARTELL e MOTEKAITIS (1988). A bureta utilizada foi a de pisto, automtica, preciso 0.01 mL - (Metrohm 809 Titrando software TIAMO verso 1.2.1, Sua), para a adio da soluo titulante (KOH padro, Merck, Brasil, 0.1 M). Os valores de pH foram mensurados diretamente com eletrodos de vidro e Ag/AgCl de referncia, calibrados diariamente com 3 solues tampo (4,01 , 7,00 e 9,00). A faixa d pH medido foi de 1,8 a 11,5. A formao do complexo foi descrito de acordo com a teoria cido-base (PEARSON, 1963) no qual o cido (alumnio) um aceptor de par de eltrons doados pela base que o AK quando a hidroxila de C-5 est desprotonada. O software Hyperquad foi utilizado para calcular as constantes de protonao e as constantes de formao global para as espcies complexadas encontradas em porcentagem superior a 10% de todas as espcies metlicas presentes no equilbrio. O modelo matemtico leva em considerao dados de pH das titulaes potenciomtricas, as constantes de hidrlise para Al3+ (BAES e MESMER, 1976) e a quantidade, em milimols, de cido kjico, de Al3+ e de H+ em todos os sistemas. Os clculos foram realizados at a melhor curva simulada coincidir com a experimental. O programa HYSS (ALDERIGH, 1999) calculou o diagrama de distribuio das espcies usando como entrada, os dados calculados previamente pelo HYPERQUAD com o menor desvio padro possvel obtido. 4. 6 ANLISE ESTATSTICA

Para a anlise estatstica foram utilizados os parmetros desvio padro relativo, erro relativo, test t de Student, teste exato de Fisher, teste de Levene, Tuckey, LSD, ANOVA one way e coeficiente de Pearson.. O teste t de Student permite verificar se dois conjuntos de dados so estatisticamente equivalentes, utilizando, para tanto, as mdias e os desvios padro dos resultados obtidos para cada mtodo. O nvel de significncia foi definido como = 0,05 e determinado o valor de p. Foram ento formuladas a hiptese nula (H 0) e alternativa (H1):

68

- hiptese nula (H0): Estabelece a ausncia de diferena entre os parmetros, ou seja, no h diferena entre os grupos. As mdias dos valores da amostra padro so iguais aos valores experimentais das variaes propostas pearaensaio de robustez. - hiptese alternativa (H1): as mdias dos valores da amostra padro so diferentes dos valores experimentais das variaes propostas pelo ensaio de robustez Se pelo teste de hipteses se verificar que a diferena observada grande demais para ser explicada somente por uma varivel aleatria acaso afirma-se que a diferena estatisticamente significativa. O p a probabilidade exata de se cometer o erro tipo I rejeita Ho quando Ho verdadeira; expressa a probabilidade de que a diferena to grande quanto a observada na amostra ocorre somente por acaso; em duas populaes p a probabilidade de errar ao se a firmar que a diferena existe. p < 0,05: rejeita a hiptese nula (valores so estatisticamente diferentes) p > 0,05: no rejeita a hiptese nula (valores so estatisticamente iguais) Caso o valor de p seja maior que 0,05 a hiptese nula no rejeitada e isso no implica em dizer que ela aceita, uma vez que o nmero limitado de observaes pode no ser uma evidncia suficiente para que ela seja rejeitada. O teste exato de Fisher um teste de significncia estatstica utilizados na anlise de tabelas de contingncia no qual os tamanhos de amostra so pequenas. Se h associaes no randmicas entre duas variveis. O teste de Levene um teste no paramtrico usado para testar a homogeneidade das varincias O teste de Tuckey usado para comparao mltipla, quando se deseja comparar todos os pares de mdias adotando um nico nvel de confiana. O teste LSD (Least Square difference) um indicador de diferenas significativas. Qualquer diferena entre mdias superior a LSD indica que a diferena significativa. ANOVA (Anlise de Varincia com um fator) testa se os grupos so bem modelados por distribuies normais de igual varincia, comparamos as mdias entre os grupos. O coeficiente de correlao de Pearson uma medida do grau de relao linear entre duas variveis quantitativas. Este coeficiente varia entre os valores -1 e

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1. O valor 0 (zero) significa que no h relao linear, o valor 1 indica uma relao linear perfeita e o valor -1 tambm indica uma relao linear perfeita mas inversa, ou seja quando uma das variveis aumenta a outra diminui. Quanto mais prximo estiver de 1 ou -1, mais forte a associao linear entre as duas variveis.

70

71

Resultados e discusso

72

5.

RESULTADOS E DISCUSSO

5.1

CONSIDERAES TERICAS

O AK um cido orgnico fraco, pois possui pKa prximo a 7,9. Na molcula so identificadas as funes lcool, cetona enol e ter. O cido kjico possui duas hidroxilas uma alcolica e outra enlica - e uma carbonila que so estruturas capazes de formar ligaes do tipo pontes de hidrognio, conferindo assim a ele a possibilidade de ser solvel em solventes como gua e metanol. A hidroxila enlica e a carbonila, grupos eletronegativos, encontram-se em carbonos vicinais, conferindo a esta regio a possibilidade de ser a regio quelante dos ons metlicos. Na figura 19 so destacadas algumas das vrias possibilidades diferentes de complexao atravs dessa regio.

on metlico

FIGURA 19 - POSSVEIS ESTRUTURA SQUELANTES DO AK COM ON METLICO FONTE: O AUTOR (2009)

Verifica-se que h insaturaes alternadas e pares de eltrons no ligantes, caracterizando assim um cromforo que absorve na regio do ultravioleta (200-400 nm) do espectro eletromagntico, justificando assim o desenvolvimento de um mtodo por espectrometria nessa regio. Mtodos que se utilizam desta propriedade so chamados espectrofotomtricos e preconizam a necessidade de caractersticas fundamentais intrnsecas ou adquiridas pela molcula, como a presena de um ou mais cromforos. Partindo-se deste princpio foi possvel o desenvolvimento e validao de um mtodo para quantificao desse analito.

73

5.2

DESENVOLVIMENTO DO MTODO

O desenvolvimento do mtodo uma etapa de grande importncia na qual se define o conjunto de parmetros que devem ser otimizados para o funcionamento do mtodo. A seqncia bsica do desenvolvimento de mtodos analticos de quantificao utilizando a espectrofotometria no ultravioleta passa pela anlise de diversos parmetros, tais como: escolha do solvente, seleo do melhor comprimento de onda, definio da concentrao de trabalho mais adequada para o analito, avaliao de possveis interferentes (seletividade), influncia do pH, preparo da amostra, entre outros.

5.2.1 Escolha do solvente e influncia do pH

A primeira etapa de desenvolvimento foi verificar o melhor solvente e a influncia exercida pelo potencial hidrogeninico sobre o sistema. O solvente de escolha deve ser capaz de solubilizar o soluto: no deve absorver na mesma regio que o analito e, se possvel, deve ser de baixo custo e no poluente. A alta solubilidade do AK em metanol e gua e o fato destes no apresentarem absoro na regio do UV, fez destes possveis solventes de escolha. Quando se comparam os espectros de varredura obtidos para soluo aquosa e soluo metanlica de AK (15 g/ml) observa-se que so muito semelhantes (figura 20), evidenciando duas bandas de absoro de forte intensidade, com mximos em = 215 nm e 269 nm. Observa-se que o AK apresenta uma absortividade molar em 269 nm a 20C maior em soluo aquosa (= 8235) que em soluo metanlica (= 6899) sendo mais intensa no espectro aquoso Isto significa que no meio aquoso a sensibilidade maior.

74

FIGURA 20 - ESPECTROS DE UV DAS SOLUES AQUOSA E METANLICA DE AK (15 g/ml). FONTE: O AUTOR (2008)

Foi tambm avaliada a influncia do pH no perfil espectral em solues de mesma concentrao de AK (15 g/ml), tanto em meio aquoso cido e alcalino (figura 21), quanto em meio metanlico cido e alcalino (figura 22).

FIGURA 21 - ESPECTRO DE UV DA SOLUO AQUOSA DE AK (15 g/ml), ACIDIFICADA (pH 2,8) E ALCALINIZADA (pH 10,6) DE AK (15 g/ml) FONTE: O AUTOR (2008)

FIGURA 22 - ESPECTRO DE UV DA SOLUO METANLICA DE AK (15 g/ml), ACIDIFICADA (pH 1,2) E ALCALINIZADA (pH 9,5) DE AK (15 g/ml) FONTE: O AUTOR (2008)

75

Pode-se verificar que as solues aquosas e metanlicas de AK, com ou sem adio de cido clordrico, geram espectros que se sobrepem com absoro mxima em 269 nm. Quando o meio se torna bsico, pela adio de hidrxido de sdio, a ionizao muda o arranjo eletrnico e, conseqentemente, o cromforo. Como resultado, h um deslocamento do tipo batocrmico, ou seja, para comprimentos de onda maiores (de = 269 nm para = 315 nm) e hipocrmico (diminuio da intensidade da absoro). Pelos espectros obtidos nos diferentes meios e pHs, os dois solventes demonstram ser adequados para o desenvolvimento do mtodo por UV.

5.2.2

Seleo do comprimento de onda

A seleo do comprimento de onda foi feita atravs do espectro de varredura e a anlise dos picos de absoro mxima do analito. As absores mximas ocorreram em 215 nm e 269 nm como pode ser observado na figura 23. O mx de trabalho deve ser preferencialmente maior que 220 nm e no apresentar problemas de linearidade. A ampla maioria dos compostos que absorvem na regio do ultravioleta o fazem prximo a 200 nm. Cromforos mais especficos podem ser obtidos por alteraes no pH, reaes de derivatizao, complexao, entre outros. Neste caso observou-se que o analito poderia complexar com ctions metlicos o que, teoricamente, poderia levar a um deslocamento batocrmico e, assim, dar mais seletividade ao mtodo. Uma vez verificada e confirmada essa possibilidade foram feitas solues com AK e cloreto de alumnio e avaliada a linearidade. A partir de 17 amostras com concentraes variando de 0,1 a 50 g/mL foram obtidas as curvas analticas para os vrios comprimentos de onda do espectro de 200 400 nm (figura 23) e calculados os coeficientes de correlao para as retas obtidas nos diferentes comprimentos de onda na regio de 200 400 nm. Os valores de r foram representados graficamente versus comprimento de onda, para avaliar a regio de melhor proporcionalidade (figura 23). No intervalo entre 273 nm e 329 nm os valores de r obtidos esto acima de 0,999 (figura 24). Logo, possvel utilizar a regio no intervalo de 305 nm e 320 nm.

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4,00

3,00

Absorbncia

2,00

1,00

0,00 200

250

300

350

400

Comprimento de onda (nm)

FIGURA 23 - ESPECTROS DE UV DE SOLUES METANLICAS CONTENDO AK 0,1-50 g/ml E SOLUO CIDA DE CLORETO DE ALUMNIO 0,2% FONTE: O AUTOR (2008)

FIGURA 24 REPRESENTAO GRFICA DOS COEFICIENTES DE CORRELAO VERSUS COMPRIMENTOS DE ONDA DO CONJUNTO DE SOLUOES METANLICAS DE AK 0,1-50 g/ml EM SOLUO CIDA DE CLORETO DE ALUMNIO 0,2% FONTE: O AUTOR (2008)

5.2.3 Avaliao da seletividade

Em tcnicas que envolvem a espectroscopia no UV o parmetro mais comumente otimizado o comprimento de onda. Isto se d pelo fato de que uma infinidade de molculas absorvemem comprimentos de onda prximos aos 200 nm e, por isso, deve-se tentar ao mximo criar mecanismos para que o analito de interesse absorva em comprimentos de onda maiores, fora dessa regio. Para melhorar a seletividade, em geral, deve-se deslocar a absoro para comprimentos de onda onde um nmero menor de molculas absorve, ou seja, mais para o visvel. Um dos recursos para um deslocamento batocrmico a formao de complexos que absorvem de modo diferente do analito individualmente. Em 1976 Kotani et al. estudaram a atividade do AK como bacteriosttico e, concomitantemente, o potencial quelante do mesmo com ons cobre e cdmio. Tendo em vista esta

77

propriedade quelante do analito, utilizou-se cloreto de alumnio para obter um complexo que promovesse um deslocamento do tipo batocrmico e, assim, aumentar a seletividade do mtodo. Com dois grupos muito eletronegativos em carbonos vicinais e uma das hidroxilas ao lado de um oxignio de carbonila, confere-se a esta regio da molcula de AK a possibilidade de quelar ons metlicos, como est circundado na figura 25A. Na poro inferior da molcula tem-se um carbono ligado hidroxila alcolica, que do tipo sp3 e, por isso, tem rotao livre, fazendo com que a hidroxila possa estar espacialmente muito prxima do oxignio da ligao ter (figura 25-B). Essa regio, tambm muito eletronegativa, se assemelha muito com a poro superior da molcula, fazendo com que tambm seja teoricamente possvel a complexao atravs dessa poro. Em estudos preliminares de ressonncia magntica nuclear verificou-se que a regio em que h modificao no deslocamento qumico dos carbonos e em que deve ocorrer preferencialmente a ligao a que se visualiza na regio circundada na figura 25-A.

(A)

(B)

FIGURA 25 REGIO DE MAIOR (A) E MENOR (B) PROBABILIDADE DE ESTAR ENVOLVIDA NA LIGAO DO AK COM ONS METLICOS FONTE: O AUTOR (2009)

As coordenaes do AK com o alumnio podem ser mais estveis em meio metanlico que em meio aquoso, no qual as molculas de gua poderiam estar competindo com o AK na formao do aquo-complexo. Quando se comparam os espectros das solues de AK (15 g/mL) em soluo cida de AlCl3 0,2%, tanto em meio aquoso (pH 1,0) quanto em meio metanlico (pH 1,7), figura 26, observa-se que o complexo em meio metanlico apresenta um mximo de absoro em comprimento de onda maior (= 305 nm) que em meio aquoso (= 298 nm).

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FIGURA 26 - ESPECTRO DE UV DA SOLUO AQUOSA E METANLICA DE AK (15 g/ml) COM SOLUO CIDA DE AlCl3, 0,2% FONTE: O AUTOR (2008)

Essas bandas de absoro intensa em 298 nm (gua) e 305 nm (metanol) no existem no espectro de soluo aquosa ou metanlica do AK sem cloreto de alumnio sendo, portanto, um indicativo da formao do complexo AK-Al. No meio aquoso a banda de absoro que antes estava em 269 nm se desloca para 298 nm e no metanlico o deslocamento ainda maior, de 269 nm para 305 nm, ocorrendo assim, para ambos, um deslocamento do tipo batocrmico (para comprimentos de onda maiores), ou seja, o meio metanlico parece ser um pouco mais seletivo que em meio aquoso. Muitos complexos inorgnicos e orgnicos exibem deslocamento por transferncia de carga. Este consiste de um grupo doador de eltrons ligado a um que os aceitam. Quando este produto absorve radiao, um eltron do doador transferido a um orbital que est associado ao aceitador. O estado excitado , portanto, um produto de um tipo de processo interno oxidao/reduo. Este comportamento difere de outros cromforos orgnicos no qual o eltron excitado est em um orbital molecular que dividido por dois ou mais tomos (SKOOG et al., 2000). Para a quantificao do AK em creme cosmtico foi importante avaliar se algum componente da formulao base absorveria no UV de forma a interferir na quantificao do analito. Para esta avaliao, foram adquiridas duas formulaes de AK em creme no inico e o creme lanette. Na composio das mesmas foram identificados os conservantes metilparabeno (nipagin) e propilparabeno (nipazol) figura 27.

79

(A )

(B)

FIGURA 27 ESTRUTURAS QUMICAS DO METILPARABENO (A), PROPILPARABENO (B) FONTE: THE INDEX MERCK (1983)

Tanto o Nipagin, quanto o Nipazol absorvem na regio do UV. Quando em soluo aquosa acidificada os espectros so praticamente iguais, com mximo de absoro em 256 nm e 257 nm, respectivamente. Em meio metanlico o nipagin no se solubilizou, sendo possvel separ-lo da amostra por meio fsico. O Nipazol em metanol, tem um mximo de absorbncia em 257 nm Outro interferente a hidroquinona, um ativo comumente prescrito em associao com o AK em tratamentos de clareamento de pele. Os espectros das solues de hidroquinona (20 g/ml) em gua e em metanol acidificados so praticamente iguais entre si, diferindo nos comprimentos de onda mximos, no meio aquoso = 290 nm e no meio metanlico = 294 nm. Considerando que os conservantes (nipagin e nipazol) no se complexam com o ction alumnio e, por isso no tem a banda de absoro deslocada, pode-se dizer que o sistema formado pelo AK em meio metanlico com cloreto de alumnio mais seletivo. Deve-se considerar tambm que em pH alcalino, apesar do AK apresentar um mximo de absoro em 315 nm, h a possibilidade de degradao do mesmo neste pH e o nipazol tambm tem um deslocamento batocrmico que interfere na quantificao nesse meio alcalino. Com o objetivo de se verificar a seletividade foram tambm obtidos os espectros de cremes comerciais, creme lanette contendo 2% de AK em associao ou no com HQ 4%, o prprio creme base e soluo do padro de AK, todos na mesma concentrao (15 g/ml) do analito (figura 28). Observa-se que a absoro do creme base mais intensa ocorreu na regio entre 250-260 nm o que era esperado devido ao nipazol, Observa-se tambm que o creme base no apresenta interferncia alguma em 305 nm regio de absoro mxima da soluo do padro de AK com cloreto de alumnio. Quando comparamos o espectro obtido da soluo do creme lanette contendo 2% AK com o do padro observamos que eles diferem em intensidade em torno de 260 nm provavelmente pela presena do conservante

80

na amostra, mas prximo a 300 nm os espectros do padro e da amostra so perfeitamente sobreponveis. Na amostra que continha AK e HQ nota-se um aumento significativo tanto na regio de 260 nm como 300 nm pelo fato de que se somam as absores dos conservantes, do prprio AK e da hidroquinona. Em creme no inico, sob as mesmas condies, os resultados foram exatamente iguais.

FIGURA 28 ESPECTROS DE UV DE SOLUES METANLICAS DE AK (15 g/mL) CREME LANETE CONTENDO AK 2% EM ASSOCIAO OU NO COM HQ 4% E SOMENTE O CREME LANETTE. TODOS COM ADIO DE SOLUO CIDA DE AlCl3 0,2% FONTE: O AUTOR (2008)

Isso significa que para produto que contm apenas AK e conservantes o comprimento de onda em 305 nm adequado para quantificao do analito. Entretanto, se for um produto de AK com hidroquinona necessrio escolher outro comprimento de onda. Nota-se que um comprimento de onda que poderia ser adequado seria de = 320 nm, j que no h mais ab soro da hidroquinona (figura 29), nessas condies.

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FIGURA 29 ESPECTROS DE UV DA SOLUO METANLICA DO AK (15 g/mL) COM CLORETO DE ALUMNIO EM COMPARAO COM ESPECTROS DE ABSORO DA HIDROQUINONA E NIPAZOL EM METANOL FONTE: O AUTOR (2008)

Uma das formas de se demonstrar que esse comprimento de onda (320 nm) adequado para quantificao construir curvas analticas e calcular o coeficiente de correlao de cada ponto na regio de anlise. Foram preparadas 17 amostras de soluo metanlica com cloreto de alumnio com concentraes de AK variando na faixa de 0,1 a 50 g/ml. Como a regio de comprimento de onda = 320 nm tem um coeficiente de correlao superior a 0,999 pode ser considerado como adequado para quantificao de AK quando em associao com hidroquinona. Fez-se tambm a avaliao da seletividade atravs da estatstica, utilizando o teste t para comparao de mdias pareadas com o analito com e sem a matriz. Os valores de p para os conjuntos de dados referentes comparao de dados de AK na concentrao de 15 g/mL em 305, 315 e 320 nm com e sem as matrizes Lanette e Creme No Inico, so maiores que 0,05. Isto significa que no se deve rejeitar a hiptese nula e os valores so estatisticamente iguais. Quando se tem a adio de hidroquinona s matrizes os valores de p para 269 e 305 nm so menores que 0,05, e apenas para 320 nm eles so maiores, indicando que nesse comprimento de onda os valores so estatisticamente iguais.

82

5.2.4 A proporo molar AK e Alumnio

Um aspecto importante garantir que a limitao de resposta no seja por falta de reagente, ou seja, que todo o analto seja complexado e quantificado, e que o alumnio esteja em excesso em relao a um valor terico. Do outro lado no se pode colocar um excesso de forma aleatria, pois a quantidade de alumnio na soluo final pode influenciar na leitura seja pela densidade ou ndice de refrao elevado. Foram feitas anlises variando a relao molar com a concentrao de AK fixa e aumentando a concentrao de cloreto de alumnio desde AK : Al3+ na proporo 1:0 at 1:136 Os valores obtidos de absorbncia pelas relaes molares AK : Al3+ no comprimento de onda de 305 nm esto na figura 30. medida que essa relao aumenta no sentido de ter mais alumnio os valores aumentam at estabilizar em uma proporo prxima de 1:1. A partir desse ponto at a relao 1 : 136 no h mais diferena estatstica entre os valores de absorbncia obtidos.

FIGURA 30 GRFICO DA ABSORBNCIA DAS SOLUES NA VARIAO MOLAR DE AK (15g/mL) COMPLEXADO COM AlCl3 (0,2%) EM 305 nm FONTE: O AUTOR (2008)

A relao completa de todas as variaes molares pode ser visualizada atravs da figura 31, desde AK : Al3+ na proporo 1: 0, em que a absoro maior em 269 nm, at 1 : 136 em que a absoro mxima se d em 305 nm.

83

2.500

2.000

Absorbncia

1.500

1.000

0.500

0.000 200 250 300 350 400

Comprimento de onda (nm)

FIGURA 31 - ESPECTRO DE ABSORO UV DE SOLUES METANLICAS COM AK E AlCl3 EM DIFERENTES RELAES MOLARES FONTE: O AUTOR (2008)

Depois de finalizada a etapa de desenvolvimento o mtodo ficou definido com os seguintes parmetros: solvente metanol; AK : Al3+ na proporo molar 1 : 20, = 305 nm para matria-prima e produto, quando no associado, e = 320 nm para produto, quando associado hidroquinona; sistema de filtrao: papel quantitativo.

5.3

VALIDAO

O mtodo desenvolvido foi validado de acordo com as normas nacionais e internacionais para determinao de princpio ativo em produtos farmacuticos ou matria-prima. Os parmetros analisados foram linearidade e intervalo; seletividade; preciso; exatido e robustez.

5.3.1 Linearidade e intervalo

A linearidade do mtodo foi avalia atravs da proporcionalidade entre duas grandezas, concentrao e absorbncia. O mtodo com cloreto de alumnio em metanol para matria-prima linear para quantificao de AK em 305 nm no intervalo entre 5 a 50 g/mL, com um coeficiente de correlao de 0,9998 (figura 32) e na faixa de 10-20 g/mL (figura 33), como no creme Lanette sem hidroquinona (figura 34) ou com hidroquinona em 320 nm (figura 35). Valores satisfatrios por atender o exigido pelo INMETRO, que de 0,9, e pela ANVISA que de 0,99.

84

2,0

y = 0,0369x - 0,0037

Absorbncia

1,5

R2 = 0,9997

1,0

0,5

0,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0

Concentrao (g/ml)
FIGURA 32 RESULTADO DA AVALIAO DA LINEARIDADE DO MTODO ESPECTROFOTOMTRICO DE AK COM AlCl3 DE 5-50 g/mL EM 305 nm NO MEIO METANLICO FONTE: O AUTOR (2008)

A faixa de trabalho foi de 10 a 20 g/ml (figura 33) e a concentrao de trabalho definida como 15 g/ml. A variao desta concentrao foi de aproximadamente 65 a 135%. Valores estes que contemplam a faixa mnima de 80 a 120%, recomendada pela ANVISA.

1,0 y = 0,0374x - 0,0137 R2 = 0,9999

Absorbncia

0,5

0,0 0,0 10,0 20,0 30,0

Concentrao (g/ml)
FIGURA 33 RESULTADO DA AVALIAO DA LINEARIDADE DO MTODO ESPECTROFOTOMTRICO DE AK COM AlCl3 DE 10-20 g/mL EM 305 nm NO MEIO METANLICO FONTE: O AUTOR (2008)

85

1,2 y = 0,0378x + 0,0078 R2 = 0,9998

Absorbncia

0,8

0,4

0,0 0 5 10 15 20 25 30

Concentrao (g/ml)
FIGURA 34 RESULTADO DA AVALIAO DA LINEARIDADE DO MTODO ESPECTROFOTOMTRICO DE PELA RECUPERAO DE AK EM CREME LANETTE COM AlCl3 DE 5-30 g/mL EM 305 nm NO MEIO METANLICO FONTE: O AUTOR (2008)

1,2 y = 0,0379x - 0,0109 R2 = 0,9997 0,8

Absorbncia

0,4

0,0 0 5 10 15 20 25 30

Concentrao (g/ml)
FIGURA 35 RESULTADO DA AVALIAO DA LINEARIDADE DO MTODO ESPECTROFOTOMTRICO DE PELA RECUPERAO DE AK EM PRESENA DE HIDROQUINONA EM CREME LANETTE COM AlCl3 DE 5-30 g/mL EM 320 nm NO MEIO METANLICO FONTE: O AUTOR (2008)

86

Para se testar se a caracterstica estudada da amostra oriunda de uma populao com distribuio normal. Foi aplicado o teste no paramtrico de Kolmogorov-Smirnov ao conjunto de dados da linearidade na faixa de concentrao de 5-50 g/mL de AK na matria-prima em 305 nm e tambm para produto acabado de AK sem hidroquinona em 305 nm de 5-30 g/mL e com hidroquinona em 320 nm de 5-30 g/mL. O teste baseado na maior diferena absoluta entre a freqncia acumulada observada e a estimada pela distribuio normal. Como o nmero de amostras menor que 100 os valores calculados devem ser comparados com os valores tabelados. Para a matria-prima o valor calculado igual a 0,321, menor que o valor tabelado igual a 0,410 (para n=10 e significncia de 0,05). Para o produto acabado os valores calculados foram iguais a 0,311 (AK 2 %) e 0,309 (AK 2 % + HQ 4 %), que so menores que o valor tabelado igual a 0,565 (para n= 5 e significncia de 0,05). Como os valores calculados so menores que cada respectivo valor crtico tabelado a hiptese nula no rejeitada e conclui-se que os valores nessa populao seguem a distribuio normal. O valor de p tambm foi calculado e foi igual a 1,000. Isto significa que no h evidncia suficiente para rejeitar a hiptese nula, que corrobora com o resultado encontrado no teste de Kolmogorov-Smirnov. Os valores mnimos do resduo padro foi de -1,187 e o mximo de 1,343 para AK matria-prima e mnimo de -1,079 (AK 2 %), 0,937 (AK 2 % + HQ 4 %) e o mximo de 1,102 (AK 2 %), 0,875 (AK 2 % + HQ 4 %) para produto acabado, o que indica que os valores esto prximos do ponto zero e dentro da curva normal A razo das mdias quadrticas da regresso pelas mdias quadrticas dos resduos foi de 17839 para AK matria-prima e 16406 (AK 2 %) e 6683 (AK 2 % + HQ 4 %) para produto acabado, ou seja, muito maiores que os valores de F tabelado dos dados para matria-prima (Ftab 1,8= 5,3177) e dos dados para produto acabado (Ftab 1,3= 10,13), por isso rejeita-se a hiptese nula e aceitase o modelo linear como adequado.

5.3.2

Sensibilidade

A sensibilidade foi verificada pelo limite de deteco e quantificao. O limite de deteco calculado foi de 0,15 g/mL e o limite de quantificao foi de 0,46 g/mL..

87

5.3.3

Preciso

a avaliao da disperso de resultados entre ensaios independentes e foi avaliada em dois nveis: repetitividade (intra-dia) e preciso intermediria (inter-dias).

5.3.3.1

Repetitividade

o grau de concordncia entre os resultados de mensuraes de um mesmo analito por um nico analista em um mesmo equipamento num curto espao de tempo. A repetitividade foi avaliada atravs do DPR (desvio padro relativo) obtido para cada conjunto de dados das concentraes de 10, 15 e 20 g/mL. Este ensaio visa representar se h concordncia entre os resultados das leituras de modo sucessivo do mtodo a ser validado. Os resultados para a repetitividade encontram-se na tabela 02, sendo que cada valor para cada concentrao representa a mdia de trs leituras consecutivas. Em todas as concentraes testadas o valor de DPR menor que o estabelecido pela norma vigente que preconiza 5%. Isso satisfaz o critrio para a repetitividade e indica que o mtodo apresenta boa preciso intra-dia.
TABELA 02 VALORES DE CONCENTRAO DE AK E ERRO RELATIVO NA AVALIAO DA REPETITIVIDADE Concentrao (g/mL) 10 15 20 A1 A2 A3 A4 A5 A6 Mdia DP DPR Erro relativo (%) FONTE: O AUTOR (2008) 9,902 9,939 9,964 9,872 9,866 9,876 9,903 0,040 0,406 0,325 14,799 14,720 15,069 14,951 14,791 14,835 14,861 0,127 0,855 0,684 20,089 20,084 20,097 19,749 19,911 19,737 19,945 0,171 0,857 0,686

Pelo teste t para amostras independentes para cada uma das concentraes de 10, 15 e 20 g/ml o valor de p foi de 0,076, 0,357 e 0, 777 respectivamente, assumindo-se varincias iguais e como os valores so maiores que 0,05 no se deve rejeitar a hiptese nula e os valores so estatisticamente iguais.

88

5.3.3.2

Preciso intermediria

a preciso avaliada sobre a mesma amostra por analistas, equipamentos e em dias diferentes. Para a avaliao da preciso intermediria foram realizadas anlises em dias consecutivos e verificados atravs do DPR (desvio padro relativo) obtido para cada conjunto de dados das concentraes 10, 15 e 20 g/ml. Os resultados para a repetitividade encontram-se na tabela 03, sendo que cada valor para cada concentrao representa a mdia de trs leituras consecutivas. Em todas as concentraes testadas o valor de DPR menor que o estabelecido pela norma vigente que preconiza 5%. Isso satisfaz o critrio para a preciso intermediria e indica que o mtodo apresenta boa preciso intermediria.
TABELA 03 VALORES DE CONCENTRAO DE AK E ERRO RELATIVO NA AVALIAO DA PRECISO INTERMEDIRIA Concentrao (g/ml)

Dia / Equipamento / Amostra 1 1 A1 1 1 A2 1 1 A3 2 2 B1 2 2 B2 2 2 B3 Mdia DP DPR Erro relativo (%) FONTE: O AUTOR (2008)

10 9,872 9,866 9,876 9,585 9,475 9,434 9,685 0,210 2,171 5,319

15 14,799 14,720 15,069 14,743 14,735 14,663 14,788 0,144 0,976 0,781

20 19,749 19,911 19,737 20,028 19,936 19,845 19,868 0,113 0,568 0,455

Foi calculado o p pelo teste t para amostras independentes para cada uma das concentraes de 10, 15 e 20 g/ml, entres os dias 1 e 2. O valor de p para a concentrao de 10 g/ml foi de 0,010 assumindo-se varincias iguais. Como o valor foi menor que 0,05, significa que deve-se rejeitar a hiptese nula em que os dois conjuntos de dados seriam iguais. Para as concentraes de 15 e 20 g/ml os valores de p foram 0,242 e 0,149 respectivamente quando se assumem varincias iguais. Valores estes maiores que 0,05 e, neste caso, no se deve rejeitar a hiptese nula e os valores entre o dia 1 e 2 so estatisticamente iguais.

89

5.3.4 Exatido

Expressa o grau de concordncia entre um valor dado como referncia aceito como verdadeiro e o valor encontrado na prtica. Para a verificao da exatido do mtodo para quantificao do AK por espectrofotometria no UV utilizou-se o ensaio de recuperao. Quantidades conhecidas de AK foram incorporadas s bases creme Lanette ou creme no inico, com adio ou no de hidroquinona. Neste caso uma concentrao de 2% para AK e 4% para HQ para simular as concentraes em que so vendidas no comrcio. As solues foram diludas at concentraes de 10, 15 e 20 g/mL e com a adio de 1,5 mL de cloreto de alumnio 0,2% ([H +]= 0,1 M) quando completados para 10 mL com metanol foram lidas em 305, 315 e 320 nm em espectrofotmetro UV. As anlises foram realizadas em triplicata e cada amostra avaliada em trs comprimentos de onda. Os resultados da recuperao de AK em creme Lanette podem ser visualizados na tabela 04, e com presena de hidroquinona em Lanette, na tabela 05.
Tabela 04 VALORES DE CONCENTRAO DE AK NO ENSAIO DE RECUPERAO EM CREME LANETTE E ERRO RELATIVO Erro Conc. Concentrao (g/ml) Mdia DP DPR Recuperao relativo terica (nm) (%) (%) (g/ml) 305 10,15 10,13 10,09 10,12 0,030 0,294 101,24 0,341 10 315 10,22 10,20 10,16 10,20 0,033 0,327 101,90 0,339 320 10,31 10,29 10,24 10,28 0,036 0,354 102,80 0,397 305 14,93 14,92 14,94 14,93 0,011 0,072 99,53 0,076 15 315 14,98 15,00 14,97 14,99 0,015 0,103 99,90 0,115 320 15,05 15,03 15,06 15,04 0,019 0,124 100,30 0,115 305 19,94 19,92 19,86 19,91 0,039 0,197 99,53 0,237 20 315 20,04 20,03 19,96 20,01 0,042 0,211 100,06 0,247 320 20,15 20,13 20,06 20,12 0,049 0,245 100,58 0,266 FONTE: O AUTOR (2008)

Os valores de p para os conjuntos de dados referentes concentrao de 15 g/mL em 305, 315 e 320 nm , na recuperao de AK em creme Lanette foram 0,560, 0,319 e 0,158 respectivamente, assumindo que as varincias so iguais. Todos os valores so maiores que 0,05 e isto significa que no se deve rejeitar a hiptese nula e os valores so estatisticamente iguais aos verdadeiros.

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Tabela 05 VALORES DE CONCENTRAO DE AK EM PRESENA DE HIDROQUINONA NO ENSAIO DE RECUPERAO EM CREME LANETTE E ERRO RELATIVO Erro Conc. Concentrao (g/ml) Mdia DP DPR Recuperao relativo terica (nm) (%) (%) (g/ml) 305 18,97 18,97 19,00 18,98 0,019 0,099 189,81 0,121 10 315 11,04 11,03 11,08 11,05 0,028 0,249 110,51 0,282 320 10,33 10,33 10,40 10,35 0,045 0,434 102,02 0,491 305 27,49 27,49 27,48 27,49 0,002 0,005 183,24 0,006 15 315 16,02 16,02 16,02 16,02 0,004 0,023 106,80 0,026 320 15,01 15,02 15,02 15,02 0,005 0,031 100,10 0,035 305 36,58 36,56 36,56 36,57 0,012 0,033 182,84 0,037 20 315 21,54 21,55 21,54 21,54 0,010 0,047 107,81 0,046 320 20,32 20,34 20,42 20,36 0,056 0,277 101,80 0,313 FONTE: O AUTOR (2008)

Os valores de p para os conjuntos de dados referentes concentrao de 15 g/mL em 305, 315 e 320 nm na recuperao de AK em presena de HQ em creme Lanette foram 0.000, 0.000 e 0.219 respectivamente quando se assumem varincias iguais. Para os dois primeiros comprimentos de onda os valores de p so inferiores a 0,05 e isto significa que deve-se rejeitar a hiptese nula de que os conjuntos so iguais aos verdadeiros. Para 320 nm o valor maior que 0,05, sendo considerado estatisticamente igual ao verdadeiro. De acordo com os resultados da recuperao de AK em creme Lanette podese destacar, pela tabela 04, que quando ele o nico ativo no h interferncia do creme lanette na quantificao do mesmo nas concentraes finais de 10, 15 e 20 g/ml e nos comprimentos de onda de 305, 315 e 320 nm. A hidroquinona est presente em muitas formulaes em associao com o AK na concentrao de 4 e 2%, respectivamente. Nessa proporo, pelo ensaio de recuperao em lanette (tabela 05), pode-se verificar que nas concentraes finais de 10, 15 e 20 g/ml e nos comprimentos de onda de 305, 315 h interferncia superior a 5%, pois a hidroquinona ainda absorve um pouco at essa faixa. J em 320 nm a interferncia insignificante, de modo que nesse comprimento de onda a quantificao do AK possvel, mesmo na presena de hidroquinona. Os resultados da recuperao de AK em presena ou no de hidroquinona em creme no inico encontram-se nas tabelas 06 e 07, respectivamente.

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TABELA 06 VALORES DE CONCENTRAO DE AK NO CREME NO INICO E ERRO RELATIVO Conc. Concentrao (g/ml) Mdia DP terica (nm) (g/ml) 305 10,13 9,84 9,85 9,94 0,165 10 315 10,15 10,19 10,20 10,18 0,025 320 10,17 10,22 10,24 10,21 0,034 305 14,44 14,38 14,38 14,36 0,033 15 315 14,49 14,41 14,43 14,45 0,038 320 14,58 14,49 14,53 14,53 0,048 305 19,16 19,11 19,14 19,13 0,025 20 315 19,28 19,21 19,25 19,25 0,031 320 19,39 19,31 19,34 19,35 0,040 FONTE: O AUTOR (2009)

ENSAIO DE RECUPERAO EM Erro relativo (%) 1,874 0,282 0,371 0,258 0,297 0,374 0,148 0,182 0,233

DPR 1,657 0,250 0,328 0,228 0,262 0,331 0,131 0,161 0,206

Recuperao (%) 101,53 101,81 102,10 95,75 96,30 96,90 95,67 96,23 96,74

Os valores de p para os conjuntos de dados referentes concentrao de 15 g/mL em 305, 315 e 320 nm na recuperao de AK em creme no inico foram 0,013, 0,018 e 0,039 respectivamente. Todos os valores so menores que 0,05 e isto significa que se deve rejeitar a hiptese nula e os valores no so estatisticamente iguais aos verdadeiros.
TABELA 07 VALORES DE CONCENTRAO DE AK EM PRESENA DE HIDROQUINONA NO ENSAIO DE RECUPERAO EM CREME NO INICO E ERRO RELATIVO Erro Conc. Concentrao (g/ml) Mdia DP DPR Recuperao relativo terica (%) (%) (g/ml) (nm) 305 19,06 315 11,00 320 10,22 305 26,53 15 315 15,33 320 14,51 305 35,52 20 315 20,65 320 19,26 FONTE: O AUTOR (2009) 10 18,49 11,01 10,24 26,51 15,34 14,56 35,54 20,67 19,32 18,49 11,01 10,24 26,51 15,35 14,48 35,53 20,64 19,27 18,68 11,00 10,23 26,52 15,34 14,51 35,53 20,65 19,28 0,329 0,008 0,013 0,010 0,010 0,009 0,010 0,015 0,031 1,762 0,068 0,128 0,039 0,063 0,065 0,029 0,074 0,158 190,83 110,05 102,34 176,78 102,29 96,76 177,67 103,26 96,42 1,994 0,077 0,113 0,044 0,071 0,073 0,032 0,083 0,180

Os valores de p para os conjuntos de dados referentes concentrao de 15 g/mL em 305, 315 e 320 nm na recuperao de AK em presena de HQ em creme Lanette foram 0.000, 0.011 e 0.33 respectivamente. . Para os dois primeiros comprimentos de onda os valores de p so inferiores a 0,05 e isto significa que deve-se rejeitar a hiptese nula de que os conjuntos so iguais aos verdadeiros. Para 320 nm o valor maior que 0,05, sendo considerado estatisticamente igual ao verdadeiro.

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De acordo com os resultados da recuperao de AK pode-se destacar pela tabela 06, que quando ele o nico ativo o nvel de interferncia do creme no inico na quantificao do mesmo nas concentraes finais de 10, 15 e 20 g/ml e nos comprimentos de onda de 305, 315 e 320 nm est dentro do limite de 5%. Quando a hidroquinona est presente, pelo ensaio de recuperao em creme no inico (tabela 07) pode-se verificar que nos comprimentos de onda de 305 e 315 h interferncia superior a 5%, pois a hidroquinona ainda absorve um pouco at essa faixa. J em 320 nm a interferncia menor que 5 %, de modo que nesse comprimento de onda a quantificao do AK possvel mesmo na presena de hidroquinona.

5.3.5

Robustez

A robustez um ensaio que tem por objetivo verificar a capacidade do mtodo em suportar pequenas variaes em parmetros do mtodo de modo que os resultados continuem inalterados. Ele mede a confiabilidade do mtodo em condies normais, permitindo verificar as tolerncias dos parmetros crticos do mtodo. Neste caso foram avaliados o fator tempo, pH, temperatura e variao da concentrao do metal. Para determinao do erro do mtodo tambm foram estimados componentes de varincia associados s fontes de variao de cada particular mtodo, considerando-se na especificao do erro relativo intervalos com 95% de confiana para mdia.

5.3.5.1

Influncia do tempo de leitura na intensidade de absoro

O primeiro parmetro analisado foi a influncia do tempo sobre a estabilidade da soluo e a intensidade de absoro. Uma soluo de concentrao conhecida foi preparada e lida no tempo zero, 24 h e 72 h aps o preparo, sendo que as duas ltimas foram mantidas em temperatura controlada de 20C at leitura. Como pode ser observado, atravs da anlise da tabela 08, no houve diferena significativa nos valores de absorbncia do tempo zero at setenta e duas horas. A estabilidade do sistema faz com que a soluo possa ser lida em espectrofotmetro at trs dias

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aps o seu preparo. Deste modo o fator tempo no um parmetro crtico inerente ao mtodo.
TABELA 08 RESULTADO DO ENSAIO DE ROBUSTEZ PELA AVALIAO DO TEMPO Conc. mdia real Erro relativo Tempo (h) Concentrao (g/mL) Absorbncia mdia (g/mL) (%) 0,121 0 15 0,547 14,72 0,214 24 15 0,551 14,84 0,262 72 15 0,536 14,43 Mdia DP DPR FONTE: O AUTOR (2008) 0,545 0,008 1,438 14,66 0,212 1,448

Foi aplicado o test t para amostras pareadas na comparao entre os valores verdadeiros e os tempos zero, 24 e 72 h no ensaio de robustez para a avaliao da influncia do tempo sobre a estabilidade do sistema e a intensidade de absoro referentes concentrao de 15 g/mL. Os valores de p para os conjuntos de dados foram 0,185, 0,222 e 0,221, respectivamente. Todos os valores so maiores que 0,05 e isto significa que no se deve rejeitar a hiptese nula e os valores so estatisticamente iguais aos verdadeiros. Tambm foi aplicado o teste ANOVA one way. O teste de homogeneidade de varincias foi verificado pelo teste de Levene, sendo: Ho: s21= s22= s23 ; H1: As varincias so homogneas Como pelo teste de Levene F=1,545 < F(0.05;2;6) = 5,14, ou p-value =0.288 > =0.05, conclui-se que as varincias so homogneas, isto , dentro de cada um dos tratamentos a variabilidade apenas devida a causas aleatrias. Por ANOVA F= 3,325 < F(0.05;2;6) = 5,14, ou p-value = 0.107 > =0.05, conclui-se que no existem diferenas significativas entre os tempos zero, 24 e 72 h com um nvel de significncia de 5%.No teste de comparaes mltiplas so identificados apenas um tratamento que se difere significativamente, que entre o tempo zero e 72 h, mas apenas o teste LSD que acusa essas diferenas. Isto , o teste LSD acusa como diferentes tratamentos cujas mdias esto menos afastadas do que o teste Tuckey, que d, por assim dizer, maior margem de dvida antes de imputar essas diferenas aos efeitos dos tratamentos.

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5.3.5.2

Influncia da temperatura na intensidade de absoro

O segundo parmetro avaliado foi a influncia da temperatura sobre a estabilidade do sistema. Uma soluo de concentrao conhecida foi preparada e dividida em trs pores, sendo que a primeira foi reservada em geladeira a 5C, a segunda mantida em temperatura controlada a 20C e a terceira em estufa a 30C, todas mantidas nesses ambientes por quatro horas. Para essa faixa de temperatura no houve alterao significativa na leitura de absorbncia, como pode ser visualizado na tabela 09. Pequenas variaes para mais ou para menos no afetam o sistema e isso faz com que o fator temperatura no seja crtico ao mtodo.
TABELA 09 RESULTADO DO ENSAIO DE ROBUSTEZ PELA AVALIAO DA TEMPERATURA Temperatura Conc. mdia real Erro relativo (C) Concentrao (g/mL) Absorbncia mdia (g/mL) (%) 0,243 5 15 0,5200 13,99 0,262 20 15 0,5214 14,03 0,120 30 15 0,5191 13,97 Mdia DP DPR FONTE: O AUTOR (2008) 0,5202 0,001159 0,2227 13,99 0,03141 0,2244

Foi aplicado o test t para amostras pareadas na comparao entre os valores verdadeiros e as temperaturas 5C, 20C e 30C no ensaio de robustez para a avaliao da influncia da temperatura sobre a estabilidade do sistema e a intensidade de absoro referentes concen trao de 15 g/mL. Os valores de p para os conjuntos de dados foram 0.357, 0.221 e 0.369, respectivamente. Todos os valores so maiores que 0,05 e isto significa que no se deve rejeitar a hiptese nula e os valores so estatisticamente iguais aos verdadeiros. Tambm foi aplicado o teste ANOVA one way. O teste de homogeneidade de varincias foi verificado pelo teste de Levene, sendo: Ho: s21= s22= s23 H1: As varincias so homogneas Como pelo teste de Levene F=1,980 < F(0.05;2;6) = 5,14, ou p-value= 0,219 > z= 0.05, conclui-se que as varincias so homogneas, isto , dentro de cada um dos tratamentos a variabilidade apenas devida a causas aleatrias. Por ANOVA

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F= 1,030 < F(0.05;2;6) = 5,14, ou p-value = 0,415 > =0.05, conclui-se que no existem diferenas significativas entre as temperaturas 5, 20 e 30C com um nvel de significncia de 5%. No teste de comparaes mltiplas no so identificados nenhum tratamento que se difere significativamente.

5.3.5.3

Influncia do pH na intensidade de absoro

O terceiro parmetro avaliado foi a influncia do pH sobre a estabilidade do sistema. Foram preparadas nove solues de concentrao conhecida e o pH de cada uma foi ajustada com hidrxido de potssio. O pH da soluo obtida diretamente do mtodo igual a 1 e atravs da avaliao dos dados obtidos pela variao do pH pode-se verificar que o intervalo de 1 a 3 o que deve ser utilizado para a quantificao do AK. O pH 4, apesar do valor ser muito prximo aos outros, no se recomenda que seja utilizado uma vez que a soluo resultante levemente turva. Entre pH 5 e 8 houve a formao de um precipitado floculado que se dissolvia facilmente. Pela anlise do material lmpido sobrenadante possvel gerar a hiptese de que nessa faixa de pH em que o alumnio precipita pode ter carreado quase todo o AK ainda na forma de complexo, pois se o analito estivesse livre na soluo a absorbncia deveria ser maior que a verificada. Em pH 11 a soluo volta a ficar lmpida, entretanto o rearranjo eletrnico no meio bsico diferente do cido, gerando picos de absorbncia em (nm) diferente de 305 nm como na faixa cida. Em pH 14 a soluo voltou a ficar turva.
TABELA 10 RESULTADO DO ENSAIO DA ROBUSTEZ PELA AVALIAO DO pH Concentrao Absorbncia Concentrao real DP DPR pH terica (g/ml) mdia (g/ml) 1 2 3 4 5 7 8 11 15 15 15 15 15 15 15 15 0,541 0,532 0,531 0,540 0,110 0,015 0,076 0,339 0,650 14,648 14,399 14,392 14,636 2,980 0,412 2,047 9,198 17,611 0,0157 0,0094 0,0097 0,0224 0,0450 0,0952 0,1128 0,0379 0,0294 0,1071 0,0654 0,0676 0,1530 1,5096 23,1094 5,5121 0,4125 0,1667

p
0,185 0,051 0,052 0,167 0,000 0,000 0,000 0,000 0,002

14 15 FONTE: O AUTOR (2008)

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Foi aplicado o test t para amostras pareadas na comparao entre os valores verdadeiros e os valores de pH no ensaio de robustez par a a avaliao da influncia do pH sobre a estabilidade do sistema e a intensidade de absoro referentes concentrao de 15 g/mL. Os valores de p para os conjuntos de dados de pH 1 a 4 foram maiores que 0,05 e isto significa que no se deve rejeitar a hiptese nula e os valores so estatisticamente iguais aos verdadeiros. Do pH 5 ao 14 os valores so inferiores a 0,05, ou seja, so estatisticamente diferentes. Tambm foi aplicado o teste ANOVA one way. O teste de homogeneidade de varincias foi verificado pelo teste de Levene, sendo: Ho: s21= s22= s23 H1: As varincias so homogneas Como pelo teste de Levene F= 3,524 > F(0.05;8;18) = 2,510, ou p-value = 0,013 < = 0.05, conclui-se que as varincias no so homogneas, isto , dentro de cada um dos tratamentos a variabilidade no se d apenas devido a causas aleatrias. Por ANOVA F= 44157 > F(0.05;8;18) = 2,510, ou p-value = 0,000 < = 0.05, conclui-se que existem diferenas significativas entre os valores de pH com um nvel de significncia de 5%. No teste de comparaes mltiplas so identificados em todos os tratamentos que se diferem significativamente, exceto entre o pH 1 e 4 e entre pH 2 e 3. O pH um fator crtico que deve ser verificado para que no se tenha solues de pH superiores a 3.

5.3.5.4

Influncia da concentrao do metal na intensidade de absoro

Este ensaio foi verificado numa das primeiras etapas do processo analtico (figura 30 pgina 77) e por ele nota-se que na proporo prxima de 1:1 em diante at a relao em que se tem excesso de alumnio com AK 1 : 136 Al3+ no h mais diferena estatstica entre os valores de absorbncia obtidos. Deve-se garantir que sempre se tenha alumnio em excesso de at 136 vezes mais para se ter uma intensidade de leitura mxima e constante, pois esse um fator crtico ao processo.

97

5.4

ESTUDO DO COMPLEXO Para confirmar como ocorrem as coordenaes (AK-Al3+) e quais grupos da

molcula do AK estariam envolvidos na complexao do mesmo com o alumnio foram feitos ensaios por espectroscopia no infravermelho e de ressonncia magntica nuclear de
13

C com base nas espcies encontradas nas titulaes

potenciomtricas e nos diagramas de especiao, de acordo com a variao do pH.

5.4.1

Titulao potenciomtrica e espectroscopia no ultravioleta

importante caracterizar o tipo do complexo e a porcentagem em que cada tipo aparece medida que se varia o pH. Uma das tcnicas utilizadas para caracterizar as espcies formadas no sistema atravs da titulao potenciomtrica. Os complexos metlicos do AK tm uma estabilidade relativa alta (BHATIA; KAUSHIK; SODHI, 1988). A determinao das constantes de estabilidade por titulao potenciomtrica uma maneira poderosa para se definir a identidade e distribuio de complexos ligante-metal e conseqentemente para se proceder a investigao da especiao em sistemas aquosos (JORDAN et al., 1996). uma tcnica comum, pela simplicidade do instrumento e da automao. O objetivo da utilizao da tcnica de titulao potenciomtrica, neste trabalho, foi inicialmente determinar a constante de protonao do AK e as constantes de complexao do sistema aquoso AK na presena de ons alumnio, de acordo com a variao de pH. Dados da literatura, de estudos anteriores sobre AK no complexado e complexado alumnio foram relatados em 2001 (MARTELL , A. E.; SMITH, R. M. 2001)e mostraram valores para log K = 7.66 +- 0,05 (25C e I = 0,1mol/L) e log K para os complexos metal-ligante ML= 7.66 (25C e I = 0,1 mol/L), e log para ML2 e ML3 = 13,72 e 19,26 ( 25C e I = 0,5 mol/L). Os dados encontrados por (SALLAM; HAGGAG; MASOUD, 1990) em meio aquoso tambm indicam que apenas um prton liberado entre = 0 - 1 (= mols de base adicionada por mol de ligante). O valor obtido da constante de protonao (7,68) para o equilbrio protoltico envolvendo as espcies neutras e aninicas esto de acordo com os reportados na literatura de 7,75, 7,83, 7,61 e 7,80 (SALLAM;

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HAGGAG; MASOUD, 1990). Outro pKa encontrado na literatura por HEDLUNT; OHMAN (1988) foi de 7,61. A titulao potenciomtrica do cido kjico foi tambm realizada por MURAKAMI (1962) e forneceu somente uma inflexo ntida (porm o artigo no mostra a curva da titulao potenciomtrica), a qual corresponde dissociao que pode ser visualizada na figura 36.

FIGURA 36 REPRESENTAO DA DISSOCIAO DO CIDO KJICO FONTE - MURAKAMI (1962)

O valor de log K relatado (MURAKAMI, 1962) foi de 7,68. O mesmo autor sugere a formao de um complexo tetracoordenado com o on magnsio ( II), conforme figura 37. O on magnsio (II) tem um comportamento parecido com o on mangans (II), com similar magnitude na formao das constantes em sistema aquoso.

FIGURA 37 - ESTRUTURAS DA COORDENAO DO AK COM MAGNSIO FONTE: MURAKAMI (1962)

Inicialmente, de posse das constantes de protonao do ligante procedeu-se aos clculos das constantes de complexao do ligante mais o on metlico em estudo. Os clculos com os dados potenciomtricos da titulao do AK na ausncia do alumnio forneceu uma desprotonao, com pKa= 7,68+-0,02 (25,0C, I= 0,100 mol/L KCl), valor em conformidade com os outros relatados na literatura. A desprotonao ocorre pela perda do hidrognio ligado ao oxignio do carbono 5, que pode ser visualizado na figura 43. Na figura 38 visualiza-se a curva de titulao

99

experimental (linha grossa formada pela unio de pequenos quadrados) e simulada (linha fina) para o AK puro, curva esta que feita a partir do teste estatstico do qui quadrado e contando com 95% de confiana. Com os dados das titulaes potenciomtricas para AK (0,1 mmol) + Al3+(10 mL) (proporo ligante-metal 1:1), AK (0,1 mmol) + Al3+(5 mL) (proporo ligantemetal 1:0,5) e AK (0,1 mmol) + Al3+(3 mL) (proporo ligante-metal 1:0,3), calculouse utilizando o programa HYPERQUAD (GANS; SABATINI; VACCA 1993) em cada um desses trs experimentos feitos em triplicata, para se obter as constantes de complexao de cada um dos sistemas nas propores estudadas. Os clculos, utilizando-se este programa com o mtodo matemtico de mnimos quadrados, so feitos utilizando-se os valores obtidos inicialmente por suposies qumicas e matemticas e recalculados. A cada nova etapa de clculo, as curvas de simulao matemtica e experimental so checadas e quando a maior sobreposio for atingida e o erro no diminuir mais, d-se por terminado os clculos. Tendo-se procedido assim com a matriz matemtica composta de concentrao das espcies conhecidas, expressas em milimol, constantes de hidrlise do alumnio (BAES E MESMER, 1976), log Ka do AK e possveis espcies complexas do sistema AK:Al3+, obteve-se as constantes de complexao que esto dispostas na tabela 12. A figura 48 mostra os perfis das titulaes potenciomtricas do AK + Al3+ nas propores 1:1, 1: 0,5 e 1:0,3, ligantemetal. Atravs da curva da titulao potenciomtrica do cido kjico no complexado (figura 38) pode-se observar que at pH 11 existe uma inflexo ntida e uma segunda discutvel. D-se o nome de ponto de inflexo ao ponto que separa uma parte convexa de uma curva contnua de uma parte cncava, ou seja, a inflexo uma indefinio transitria das tendncias da funo em um determinado ponto no qual ela passa da condio de tendncia ao crescimento para a tendncia ao decaimento, ou vice-versa.

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FIGURA 38 - CURVA DE TITULAO DO CIDO KJICO NO COMPLEXADO (SOLUO AQUOSA 0,1mmol) FONTE: O AUTOR (2009)

As solues tiveram seus valores de pH aumentados e os espectros foram obtidos nestas solues de razo e pHs variados. Durante a converso qumica de uma espcie em outras, absorventes no UV e/ou visvel, os espectros se cruzaro no mesmo comprimento de onda, cruzamento conhecido como ponto isosbstico (HARRIS, 2001). Dois pontos isosbsticos (ponto onde as curvas se juntam e comprimento de onda da forma cida e bsica tem o mesmo coeficiente de extino e ndices de absorbncia iguais) aparecem no espectro cido kjico no complexado (figura 39). Um deles corresponde desprotonao e o segundo corresponde possivelmente a uma interconverso de espcie hidrolisada, no determinada neste estudo. Atravs do espectro no UV do AK (figura 40) tem-se que na regio prxima ao comprimento de onda 270 nm pode-se observar que do pH 2,0 at 6,0 tem-se espectros praticamente idnticos, j em 6,5 h um decrscimo discreto que continua em 7,0 e em 7,5 significativo (desprotonao de AKH para AK -). A queda persiste at estabilidade a partir de 9,5 at 12, j com total inverso da banda no espectro de 270 nm para 315 nm (figura 41).

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FIGURA 39 ESPECTROS DE UV DO CIDO KJICO NO COMPLEXADO EM SOLUO AQUOSA (15g/mL) NA VARIAO DE pH DE 2,0 A 12,0 E IDENTIFICAO DOS DOIS PONTOS ISOSBSTICOS FONTE: O AUTOR (2009)

FIGURA 40 ESPECTROS DE UV DO CIDO KJICO NO COMPLEXADO EM SOLUO AQUOSA (15g/mL) NA VARIAO DE pH DE 2,0 A 12,0 E IDENTIFICAO DOS pH NO = 270 nm, DEPOIS DO PRIMEIRO PONTO ISOSBSTICO FONTE: O AUTOR (2009)

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FIGURA 41 - ESPECTRO DE UV DO CIDO KJICO NO COMPLEXADO EM SOLUO AQUOSA (15g/mL) NA VARIAO DE pH DE 2,0 A 12,0 E IDENTIFICAO DOS pH NO = 315 nm, DEPOIS DO SEGUNDO PONTO ISOSBSTICO. FONTE: O AUTOR (2009)

A existncia de dois pontos isosbsticos aumentaram ainda mais a dvida sobre a possvel segunda inflexo do AK, que corresponderia segunda ionizao do mesmo ainda no relatada na literatura. Para confirmar essa possibilidade foram calculadas as derivadas dos dados da variao do pH em funo da adio de base. Os possveis pontos de inflexo so aqueles que separam uma parte convexa de uma curva contnua de uma parte cncava e quando existe derivada segunda nos pontos de inflexo, ela nula. Atravs desse clculo verificou-se que existe apenas um nico ponto em que a segunda derivada nula na variao mxima dos dois eixos (figura 42).

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FIGURA 42 GRFICO DA SEGUNDA DERIVADA DA TITULAO POTENCIOMTRICA DO AK NO COMPLEXADO FONTE: O AUTOR (2009)

Deste modo, concluiu-se que na titulao potenciomtrica do AK h apenas uma inflexo e dados posteriores descritos a seguir, envolvendo outras tcnicas analticas, demonstraram que somente h a perda do hidrognio ligado ao oxignio do carbono 5 (figura 43).

FIGURA 43 - ESTRUTURA DO CIDO KJICO COM OS CARBONOS ASSINALADOS FONTE: O AUTOR (2009)

Com base no modelo de apenas uma ionizao e de posse dos valores da titulao e das constantes calculadas, o programa HYSS (ALDERIGHI et al., 1999) calculou e desenhou o diagrama de distribuio das espcies para o sistema do AK no complexado como pode ser visualizado na figura 44.

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FIGURA 44 - DIAGRAMA DE ESPECIAO DO AK NO COMPLEXADO EM MEIO AQUOSO FONTE: O AUTOR (2010)

Foram realizados, na seqncia, ensaios para vrias propores de metalligante seguindo o mesmo raciocnio dos clculos. A curva da titulao potenciomtrica da proporo AK 1:1 Al3+ est representada na figura 45. As titulaes, na presena de alumnio, apresentam uma regio de tamponamento grande, pois a soluo de cloreto de alumnio utilizada, acidificada, necessita de um grande volume de base para neutralizar esse cido inorgnico. Um nmero maior de inflexes observado sugere a presena de um nmero grande de espcies complexadas presentes. Estas espcies sugeridas pela titulao potenciomtrica (tabela 12), podem ser visualizadas atravs do maior nmero de pontos isosbsticos (figura 46) no espectro no UV e tambm observadas nos diagrama de distribuio das espcies, figura 47.

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FIGURA 45 - CURVA DE TITULAO NA PROPORO AK 1:1 ALUMNIO EM MEIO AQUOSO FONTE: O AUTOR (2009)

As espcies complexadas e hidroliticas de Al3+ esto representadas como: metal = Al3+; ligante cido kjico = L; n prtons = Hn e n OH- = H-n. Os sistemas aquosos de alumnio apresentam normalmente varias espcies complexadas que podem ou no ser solveis em gua, dependendo sempre do ligante e do valor de pH que se est considerando. De acordo com a literatura at 2001 (MARTELL , A. E.; SMITH, R. M. 2001) que uma compilao de dados da literatura, h 3 constantes de complexao, do tipo metal ligante, detectadas nos estudos efetuados at ento, ML, ML 2 e ML3. No entanto, estudos anteriores mostram que o AK na presena de Al3+ forma espcies complexas tanto n protonadas como n hidroxiladas (HEDLUNT; OHMAN, 1988). Portanto sistemas aquosos que contem AK + Al3+ em diferentes propores M e L e em pH variveis, so sistemas interessantes e ricos para estudos continuados. medida que os sistemas analticos se aproximam em sensibilidade e limite de deteco, mais espcies so possveis de serem detectadas, tornando o desafio de encontrar essas espcies e de calcular suas constantes de complexao, maior. A lista de valores de Ka de complexao, conforme tabela 12, maior que os valores relatados at 2010 na literatura, pode no ser ainda exaustiva, nem a final, pois o sistema AK+Al3+ em gua rico em espcies complexadas e que a solubilidade dessas espcies em funo do pH.

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FIGURA 46 - ESPECTROS DE UV DO CIDO KJICO 1:1 ALUMNIO EM SOLUO AQUOSA (15g/mL) NA VARIAO DE pH DE 2,0 A 12,0 E IDENTIFICAO DOS PONTOS ISOSBSTICOS FONTE: O AUTOR (2009)

Os espectros obtidos no UV-Vis, contendo vrios pontos isosbsticos confirmam a variedade de espcies complexadas nos sistemas estudados e calculados anteriormente. De posse dos valores das constantes calculadas, o programa HYSS (ALDERIGHI et al., 1999) calculou e desenhou o diagrama de distribuio das espcies para cada um dos sistemas estudados. Cada um dos sistemas contendo diferentes propores de AK e Al3+ foi estudado pela tcnica de espectroscopia no UV para se tentar mapear a presena das espcies propostas pela tcnica da titulao potenciomtrica (figura 47).

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FIGURA 47 - DIAGRAMA DE ESPECIAO DA PROPORO AK 1:1 Al FONTE: O AUTOR (2010)

3+

Espcies hidrolticas complexadas, AK desprotonado no complexado, espcies polimricas do ligante no hidrolticas e hidrolticas esto presentes em toda a faixa de pH estudado, tanto para a proporo 1:1 como 1:0,5. Os valores de pH em que h maior concentrao de espcies complexadas solveis entre pH 6 e 10. Somente espcies solveis e presentes em concentrao acima de 10% em relao a todas as espcies metlicas presentes no equilbrio foram consideradas para o clculo dos diagramas de distribuio das espcies. Foi possvel verificar atravs da figura 45 que o alumnio forma uma enormidade de espcies complexadas com o ligante estudado e a concentrao e solubilidade delas so funo da concentrao dos reagentes e do pH considerado. As curvas de titulao do AK puro e na presena de alumnio, em duas propores estudadas podem ser visualizados na figura 48. A proporo estudada Ligante 1:0,3 Metal no apresentou diferena nas espcies complexadas em relao s outras duas estudadas, e por isso no ser discutida neste trabalho. No estudo realizado por STENSON et al (2007) foi concludo que o cido kjico forma prontamente complexos com 11 ons metlicos testados com trs cargas positivas. Os complexos mais comuns encontrados foram ML 3H+ e M2L5. No caso do complexo com alumnio foram obtidos com maior abundncia relativa a ons

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correspondentes ao (ML2)+, (ML3H+)+, (M2L5)+ e (M2L4OH-)+ em que L representa o cido kjico desprotonado (ou AK-) e M o on metlico 3+. A energia de coliso necessria para dissociao do (ML2)+ com alumnio foi a maior entre os 11 elementos testados (Al, As, Cr, Ga, Fe, In, Yb, Y, Gd, Nd e La) e no por acaso ele o elemento de menor nmero atmico e menor camada de valncia, indicando que a ligao com o alumnio a mais forte, pois necessita de uma energia de coliso maior. As diferenas entre os espectros obtidos por UV da soluo de cido kjico puro e da soluo AK 1:1 Al podem ser visualizadas nos comprimentos de onda mximos e intensidades do pH 2 at 11,5, conforme a tabela 11.
TABELA 11. COMPARAO ENTRE AS SOLUES DE AK PURO E COMPLEXADO COM ALUMNIO PARA OS VALORES DE ABSORBNCIA EM COMPRIMENTOS DE ONDA E DIFERENTES VALORES DE pH AK no complexado mx (nm) 216 269 216 269 216 269 216 269 216 269 216 269 216 269 216 269 216 269 217 269 217 269 220 269 226 315 226 315 226 315 AK 1:1 Al mx (nm) 217 268 218 265 218 259 218 256 296 218 255 294 219 255 295 219 255 297
3+

pH 2,0 2,5 3,0 3,5

Abs. 1,347 0,876 1,357 0,886 1,325 0,869 1,322 0,868 1,333 0,874 1,355 0,887 1,337 0,867 1,329 0,861 1,340 0,871 1,325 0,839 1,357 0,801 1,419 0,616 1,970 0,546 2,005 0,560 1,993 0,553

pH 2,0 2,5 3,0 3,5

Abs. 2,341 1,140 1,584 0,542 1,786 0,449 1,870 0,425 0,386 1,898 0,411 0,394 1,920 0,407 0,408 1,893 0,426 0,402

4,0

4,0

4,5

4,5

5,0

5,0

5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0

6,0

220 258

1,691 0,428

7,0 7,7

220 259 220 260

1,695 0,450 1,668 0,449

8,5

220 260

1,666 0,442

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9,5 10,0 10,5 11,0 11,5

Pontos isosbsticos FONTE: O AUTOR (2009)

226 2,042 315 0,592 226 2,056 315 0,601 226 2,034 315 0,593 226 2,092 315 0,613 226 2,082 315 0,607 = 240 e 290nm

9,5 10,0 10,5 11,0 11,5 Pontos isosbsticos

226 1,614 313 0,390 227 1,688 314 0,432 227 1,766 315 0,469 227 1,832 315 0,503 228 1,861 315 0,517 = 243, 287, 293 e 303nm

TABELA 12 - CONSTANTES CIDO KJICO EM MEIO AQUOSO EM VRIAS PROPORES MOLARES NA PESENA DE ALUMNIO ( 25,0 C E I = 0.100 mol/L) Espcies Al H-1 Al H-2 Al H-3 Al H-4 Al-2 H-2 Al-2 H-3 Al-3 H-4 Al-3 H-11 Al-6 H-15 Al-8 H-22 AK H AK Al AK Al H AK Al2 AK2 Al AK2 Al H AK2 Al H2 AK3 Al AK3 Al H AK3 Al H2 AK4 Al AK4 Al H4 AK5 Al AK5 Al H AK7 Al H-1 FONTE: O AUTOR (2010) AK no complexado Log -5.4091 -9.9816 -15.6916 -23.4551 -7.7 -9.5742 -13.6944 -54.694 -49.398 -76.425 7,842 14,7147 19,8244 19,3613 25,8912 33,9850 39,5787 32,5274 45,1462 52,6295 44,2361 77,1048 52,7751 61,2327 67,9809 -13.78 Al : AK

7,842

-13.78

De acordo com os resultados obtidos (tabela 11) pode-se observar que em relao ao AK puro: de pH 2,0 a 6,0 o mx das duas bandas so os mesmos (216

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nm) e as intensidades tambm (1,33); de pH 6,0 para 6,5 h deslocamento batocrmico da primeira banda de 216 nm para 217 nm, em pH 7,2, para 220 nm, e, em pH 8,0, tambm com deslocamento batocrmico pequeno para 226 nm e hipercrmico na intensidade de 1,419 em pH 7,5 (220 nm) para 1,970 (226 nm); na segunda banda (269 nm) o deslocamento batocrmico bem mais significativo de 269 nm (pH 7,5) para 315 (pH 8,0). Pode-se observar que em relao ao sistema AK 1:1 Al (tabela 11), em pH 2,0 o AK est majoritariamente na forma protonada e as bandas em 217 nm e 268 nm so muito caractersticas, j em pH 2,5 h uma diminuio significativa da intensidade de absoro com deformao das bandas, fato esse que associado ao diagrama de especiao calculado pode-se sugerir que o alumnio j teria fora suficiente para deslocar e ocupar o lugar do hidrognio na ligao com o AK formando a primeira espcie complexada (AKAlH MLH, onde M = Al3+, L = AK); em pH 3,0 as bandas continuam deformadas e j de pH 3,5 a 5,0 voltam a ficar bem definidas, e desta vez so trs bandas e no duas como abaixo de 3,5 e acima de 5,0; de pH 6,0 at 8,5 as bandas no esto bem definidas, sendo intermedirias ao formato das resultantes de pHs mais cidos e mais bsicos. A primeira banda caracterstica (217 nm) em todos os pHs esto prximos a 220 nm e depois se desloca para 227 nm; a partir do pH 9,5 a segunda banda (269 nm) comea a se caracterizar melhor at ficar bem evidente em pH 11,5; de pH 2,0 a 5,0 a segunda banda se inicia em 268 nm e vai sofrendo um deslocamento hipsocrmico at 255 nm (poderia ser em funo da maior solvatao do par de eltrons n no-ligados, o que abaixa a energia do orbital n. Em solvente polares hidroxilados, como gua ou lcoois, a formao de ligaes de hidrognio entre prtons do solvente e o par de eltrons no-ligados extensiva. Aqui a energia dos orbitais n reduzida por uma grandeza aproximadamente igual energia de ligao de hidrognio. Quando uma transio n * ocorre, no entanto, o eltron n remanescente no consegue manter a ligao de hidrognio, assim, a energia do estado excitado n, * no efetuada por esse tipo de interao com o solvente. Um deslocamento hipsocrmico corresponde, de modo geral, energia de ligao de hidrognio, aumentando at 260 nm em pH 8,5 com um salto at 313 nm em pH 9,5 e tendncia de estabilizao de pH 10,5 a 11,5 com 315 nm; a partir de pH 9,5 no se tem mais dados que confirmem a manuteno da complexao, induzindo concluso que a partir deste ponto ela seja mnima e decrescente (LEVER, 1964)

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Os mesmos resultados mostram as correlaes entre AK puro e o sistema AK 1:1 Al: no AK puro a primeira banda se estabiliza com absoro mxima em 226 nm no pH 8,0, enquanto que no outro sistema ela s chega ao mesmo em 9,5 e mesmo assim continua aumentando com o aumento do pH; com o analito puro a segunda banda se estabiliza com absoro mxima em 315 nm no pH 8,0, enquanto que com alumnio a partir de pH 10,5; apenas em alguns pHs so verificados comprimentos de onda mximo coincidentes, como em pH 7,5 (220 nm), 9,5 (226 nm) e de 10,5 a 11,5 (315nm); no pH 2,0 as duas bandas de absoro mxima so muito prximas (216 e 217, 269 e 268 nm) e de 2,5 at 7,5 so bem diferentes.

FIGURA 48 - CURVAS DE TITULAO DO AK NO COMPLEXADO (0,1 mmol) E PROPORES AK 1: 0,5 Al e AK 1:1 Al EM SOLUO AQUOSA FONTE: O AUTOR (2009)

Murakami, em 1962, estudou como seriam os complexos formados com AK e ferro. Segundo ele, atravs de reaes graduais de hidrlise, o complexo se formaria em equilbrio em que poderiam ocorrer propores de AK e ferro 1:1 ou 2:1 como pode ser visto na figura 49 e 50.

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FIGURA 49 - REAES GRADUAIS DE HIDRLISE DO COMPLEXO Fe(III) 1 : 1 AK FONTE: MURAKAMI, 1962b

FIGURA 50 - REAES GRADUAIS DE HIDRLISE DO COMPLEXO Fe(III) 2 : 1 AK FONTE: MURAKAMI, 1962b

O on hidrxido substitui facilmente os grupos aquo enquanto grupos doadores de forte afinidade com o on metlico em um ligante polidentado pode no ser substitudo to facilmente, mesmo em faixas elevadas de pH. A propriedade cida do on metlico central diminui conforme o nmero de coordenao com grupos doadores de carga negativa aumenta (MURAKAMI, 1962b). Baseado nas estruturas complexas de AK e ons metlicos na literatura, podese sugerir que o on metlico alumnio se complexa atravs a hidroxila desprotonada do C-5 e da carbonila C-4.

5.4.1

Espectroscopia no infravermelho

Uma das aplicaes mais comuns da espectroscopia no infravermelho a identificao de compostos orgnicos (STUART, 2004). A espectroscopia no infravermelho o mtodo mais utilizado para a anlise de complexos metal carbonila de acordo com HUHEEY et al (1993), pois pode-se

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verificar nos resultados qualitativos dos espectros que a ligao metal -carbono de carbonila aumenta a frequncia e a ligao C-O diminui. Os espectros, neste trabalho foram obtidos para o padro, AK puro, e para as amostras contendo complexos de AK com alumnio. Em um primeiro momento, o objetivo foi verificar a pureza e identidade da amostra de AK atravs da comparao com um padro. O espectro da amostra (figura 51) igual ao do padro, confirmando assim a identidade do analito. A localizao das bandas muito importante, pois substncias idnticas devem apresentar bandas nas mesmas regies. Assim, no caso desta tcnica, so fatores relevantes a correspondncia e a similaridade das bandas. Mesmo para molculas relativamente simples, o espectro no infravermelho geralmente complexo. Pela anlise do espectro da amostra de AK, as atribuies provveis de bandas relacionadas com o tipo de ligaes so: - estiramentos em 3273 e 3175 cm-1 de hidroxilas de lcool primrio e fenlica. As bandas caractersticas observadas no espectro de lcoois e fenis resultam do estiramento O-H e C-O (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2005). Em geral a banda fenlica aparece entre 50-100 cm-1 da alcolica (STUART, 2004). O deslocamento para freqncias menores e alargamento da banda pode ser devido a ligaes de hidrognio intermoleculares (FURNISS et al., 1989). - estiramento da ligao =C-H em 3101 cm-1 atribuda aos carbonos 3 e 6; - estiramento da ligao de hidrognio intramolecular e acoplamento por estiramento C-O e deformao O-H em 3075 cm-1 correspondente poro superior e/ ou inferior da molcula; - estiramento de CH2- em 2843 cm-1 remete ao carbono 7; - estiramento de CH2 assimtrico de C sp3 em 2926 cm-1 tambm de C-7; - pico de CO2 em 2343 e 2362 cm-1, contaminao, provavelmente incorporado no preparo da pastilha e/ou variaes do ar atmosfrico no compartimento da amostra, no fazendo parte da estrutura da amostra; - estiramento de C=O observado em 1768 cm -1. A intensidade desse pico est muito abaixo da esperada. As ligaes de hidrognio internas podem aumentar as interaes de ressonncia e perturbar significativamente o estiramento C=O (MAYO; MILLER; HANNAH, 2003). Quando um grupo ligado ao carbono da carbonila pode efetivamente fazer uma conjugao, seja pelo par de eltrons livres ou eltrons , a direo e magnitude do deslocamento da freqncia so

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relacionadas ao balano da deslocalizao de tais eltrons e efeitos indutivos (FURNISS et al., 1989). A banda em 1660 cm-1 alm da carbonila tambm pode estar relacionada com os grupos C=C-H e C=C-O. Insaturaes adjacentes ao C=O reduzem a absoro da carbonila (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2005) (MAYO; MILLER; HANNAH, 2003); Ligaes no carbono podem resultar em diminuio no ngulo de ligao C-CO-C e consequente aumento da freqncia para valores entre 1750-1775 cm-1(FURNISS et al., 1989). - estiramento C=O que pode ser de cetona aromtica ou C=C-O- em 1699 cm-1; - quando a ligao C=C est conjugada com o grupo carbonila mais dupla ligao aparece, mas no to caracterstica. O nmero de bandas observadas pode ser relacionado ao nmero de conjugaes com as duplas ligaes (FURNISS et al., 1989) e neste caso aparecem duas bandas em 1602 e 1630 cm -1; - deformao tesoura de CH2- 1473 cm-1do carbono 7; - flexo no plano de O-H, estiramento C-O, deformao C-H e flexo no plano de C-O-H de fenol em 1350 cm-1; - resultante de estiramento C-C-C e flexo de C-C(=O)-C em 1284 cm-1; - estiramento de ligao C-O de fenol em 1226 cm-1; - vibrao simtrica C-O-C que pode estar acoplado a estiramento de C-O e deformao no plano de O-H de lcool primrio em 1075 cm-1; - banda em 850 cm-1 de deformao fora do plano C-H, estiramento assimtrico CH de C=C encoberto em 3049 cm-1, estiramento simtrico C-H de C=C em 3007 cm-1 e em 1699 cm-1 de alceno trissubstitudo; - flexo ou toro fora do plano de C-O-H em 767 cm-1; - deformao angular fora do plano de O-H em ligao hidrognio prxima a 650 cm-1 - deformao angular simtrica de ligaes C-C do anel prximas a 600 cm-1.

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FIGURA 51 ESPECTROS DE ABSORO DO AK MATRIA-PRIMA EM COMPARAO COM O AK PADRO NA REGIO DO INFRAVERMELHO FONTE: O AUTOR (2008)

Para elucidao estrutural dos complexos deste trabalho ensaios no infravermelho foram realizados para o padro e solues da amostra com e sem alumnio, em diferentes valores de pH. Para a obteno de material slido para a produo das pastilhas, as solues foram liofilizadas e armazenadas em congelador a -80C. Os espectros do AK padro, em comparao com o pH 9 e 14 podem ser visualizados na figura 52; os espectros do complexo AK/Al3+, em pH 1, 11 e 14, esto apresentados na figura 53; a comparao entre o padro de AK e os diferentes pH do complexo na figura 54 e a comparao entre o pH 14 da soluo de AK puro e do complexo, na figura 55. Os valores dos principais picos obtidos esto descritos na tabela 11. Quando se compara o AK no complexado com a soluo liofilizada pH 9 e 14 (figura 52) pode-se notar que a banda caracterstica de OH prxima de 3200 cm -1 diminui sensivelmente em pH 9 e em 14 ela volta a aumentar em intensidade e tambm no intervalo de freqncias onde ela ocorre (alargamento). possvel que no preparo da soluo de pH 14 hidroxilas provenientes da base, e em excesso no equilbrio dado o alto valor de pH, tenham se incorporado matriz no processo de liofilizao e tambm, que os compostos sejam mais higroscpicos. A banda prxima de 3075 cm-1 que poderia indicar ligao de hidrognio intramolecular est encoberta ou no existe. O estiramento da ligao =C-H em 3101 cm-1 pode ser observado em todos os espectros. Prximo a 1770 cm-1 a banda de C=O em pH 9 e 14 no se caracterizam, enquanto a banda que pode ser de ligao C=C- ou C=C-

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O- em 1700 cm-1 parece estar sobreposta em pH 9 e mais intensa em 14, podendo ser referente estrutura de ressonncia que desloca parte da carga dos oxignios para o anel. Em 1530 cm-1 no observado o pico no espectro do AK padro, mas essa banda aparece com grande intensidade nos espectros obtidos dos outros dois pHs. As bandas referentes flexo no plano de O-H, estiramento C-O, deformao C-H e flexo no plano de C-O-H de enol em 1350 cm-1 no aparecem em pH 9. O estiramento C-C-C e flexo de C-C(=O)-C em 1284 cm-1 permanece em pH 9 e se desloca para 1300 cm-1 em pH 14.

FIGURA 52 ESPECTROS DE ABSORO DO AK PADRO E A PARTIR DE SOLUES pH 9 E 14 NA REGIO DO INFRAVERMELHO FONTE: O AUTOR (2009)

Na comparao entre os complexos AK:Al3+ nos pH 1, 11 e 14 (figura 53) nota-se que de 2000 a 4000 cm-1 h caractersticas semelhantes entre os espectros, com alargamento de banda prximo de 3200 cm-1 provavelmente pelo mesmo fato ocorrido com as solues do analito puro e por serem, essas amostras, muito higroscpicas.

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FIGURA 53 ESPECTRO DE ABSORO DO COMPLEXO AK / ALUMNIO A PARTIR DE SOLUES NOS pH 1, 11 E 14 NA REGIO DO INFRAVERMELHO FONTE: O AUTOR (2009)

A comparao entre o AK no complexado com os complexos pode ser vista na figura 54. De 2000 a 4000 cm-1 no h grandes diferenas, apenas o alargamento da banda prxima de 3200 cm-1 em pH 11 e 14. Em 3075 a ligao de hidrognio intramolecular est presente em todos os espectros, exceo do pH 14, indicando que possivelmente a hidroxila alcolica pode estar prxima do oxignio do anel, justamente pela livre rotao do carbono sp3 vizinho de livre rotao. Somente o padro apresenta banda de C=O prximo de 1750 cm-1, mas a de C=C e C=C-Oprximo de 1700 cm-1 est presente nos outros trs valores. A ligao entre alumnio e oxignio se d tambm prximo a 1750 cm-1 e a banda ou est encoberta ou no est presente. Os espectros entre 1600-1700 cm-1 so muito semelhantes, regio que caracteriza principalmente as ligaes do tipo C=C- e C=C-CO-. Entre 1600-1650 cm-1 o nmero de bandas pode ser igual ao nmero de conjugaes presentes na molcula e apenas no pH 14 parece existir apenas uma banda, enquanto que nos outros pH e no padro h 2 bandas. Bandas em 1610 cm-1 podem caracterizar ligao entre carbono e oxignio com ressonncia da carga entre os oxignios e essa banda est presente no padro, no complexo pH 1 e 11, mas parece no estar presente no pH 14. Entre 1500-1600 em geral se d a ligao entre

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o grupo fenil e um metal e nesse caso o padro e o complexo pH 1 tm picos intensos de absoro em 1583 cm -1 e pH 11 e 14 parecem ter, mas sobrepostos enquanto que o pH 14 ainda tem em 1530 cm -1 e o pH 11 parece estar sobreposto e o padro e pH 1 no tm. O espectro de infravermelho obtido por BHATIA et al (1988) tem uma banda intensa em 1655 cm -1, o qual assinalado ligao C=0. Na complexao, esta freqncia reduzida cerca de 50 cm -1, indicando que o grupo carbonila quelado . A ligao C=C deslocada de 1580 para 1560 cm -1 no complexo devido a formao de ligaes de coordenao com o on metlico (BHATIA; KAUSHIK; SODHI, 1988). Aparentemente nenhum deles apresenta banda de C=O prximo de 1750 cm1, mas a de C=C e C=C-O- prximo de 1700 cm-1 est presente nos trs valores. De acordo com o diagrama de especiao obtido com os dados da titulao potenciomtrica, os slidos que potencialmente poderiam trazer mais informaes sobre o comportamento dos complexos no estado slido, seriam entre pHs 6 e 10. Porm, dificuldades operacionais no permitiram a realizao dos ensaios at o presente momento. Para maiores concluses deste sistema por espectroscopia no infravermelho, espectros desses complexos devem ser obtidos no futuro. No foi possvel visualizar diferenas muito significativas e mais conclusivas no restante do espectro pela intensidade e sobreposio de bandas nos pH 11 e 14 a no ser na regio de comprimentos de onda entre 1300 a 1420 cm-1. Nesta regio, o espectro do AK puro demonstra absoro referente s vibraes v(C-OH) e (OH) (se atribui aos estiramentos simtricos do tipo tesoura e wagging), que desaparecem nos complexos a pH 11 e AK hidrolisado pH 9. Esta modificao comprova que o grupamento cabonil e o grupamento alfa-hidroxo esto ligados ao on metlico alumnio (MASOUD, 1989;FRANCO; MERC, 2006)

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FIGURA 54 ESPECTROS DE ABSORO DO AK PADRO EM COMPARAO COM O COMPLEXO AK / ALUMNIO A PARTIR DE SOLUES NOS pH 1, 11 E 14 NA REGIO DO INFRAVERMELHO FONTE: O AUTOR (2009)

Os espectros em pH 14 do analito no complexado e do complexo (figura 55) so exatamente iguais em toda a faixa entre 400-4000 cm-1. A este valor de pH, o comportamento dos complexos imprevisvel com esse on metlico. Os picos mais significativos e suas respectivas atribuies mais provveis podem ser visualizados na tabela 13.

FIGURA 55 ESPECTRO DE ABSORO DO CIDO KOJIKO pH 14 EM COMPARAO COM O COMPLEXO AK / ALUMNIO pH 14 NA REGIO DO INFRAVERMELHO FONTE: O AUTOR (2009)

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TABELA 13 PICOS MAIS SIGNIFICATIVOS E ATRIBUIES MAIS PROVVEIS NO ESPECTRO DE INFRAVERMELHO DA VARIAO DE PH DO AK PURO E DO COMPLEXO AK/ALUMNIO cido kjico cido kjico 1 : 1 Alumnio Atribuio pH Padro 9* 14* 1* 11* 14* 3273, F 3420, m 3400, F,L 3180, F,L 3295, F,L 3400, F,L O-H (CH2OH) 1290, F 3075 3076 3175. F 3400, F,L O-H fenol OH (H-ligado) 1660, F 1630, F 1710, F 1701, m 1699, m 1703, F C=0 str. 1685, f 1670, F 1658, F 1668, F 1630, F 1629, F 1635, F 1635, F 1630, F 1579, F 1585, F 1581, F 1585, F 1585, F C=C 1615, F 1552, F 1531, F C=C 1583, F 879, F 885, F C=C 865, F 865, F 860, F C=C F: forte ; m: mdio; f: fraco; L: largo *em soluo aquosa e, posteriormente, liofilizado FONTE: O AUTOR (2009)

O espectro do AK no complexado em pH 9 parece no ter pico que caracterize o estiramento da ligao C=C, o que poderia sugerir que neste pH o carter de dupla est enfraquecido. Em 1290 cm-1 tem a banda de O-H de lcool primrio, mas a de fenol entre 1310-1410 cm-1 no est bem caracterizado, da mesma forma entre 3250-3500 cm-1. Em 1579 cm-1 o pico pode corresponder ligao C=C-CO-. Em 1965, MURAKAMI e MERA, publicaram alguns estudos por infravermelho do AK puro e quelado com os metais cobre (II), zinco (II), nquel (II) e cobalto (II). Pelos picos de absoro desses quelatos observa-se que eles so praticamente idnticos, com uma leve diferena para o cobre em relao aos outros trs como pode ser observado na tabela 14.
Tabela 14 PICOS SIGNIFICANTES NO ESPECTRO NO INFRAVERMELHO DE ALGUNS QUELATOS DE AK Cu (II) kojate Zn (II)-kojate Ni (II)-kojate Co (II)-kojate Kojic acid Atribuio 3290 m 3215 m,b 2680 w 2760 w 2610 w, b 2440 w 1634 s 2755 w 2590 w, b 2440 w 1634 s 1570 s 1540 s 905 m 2760 w 2590 w, b 2450 w 1635 s 1570 s 1550 s 905 m 3175 m, b 3090 m 3085 m 3085 m 3090 m O-H (CH2OH) O-H fenol OH (H-ligado)

1580 s 1572 s 1535 s 1540 s 895 m 905 m 876 w 867 m s: forte ; m: medio; w: fraco; b:largo FONTE: MURAKAMI; MERA, 1965

1710 w 1668 s 1640 s 1621 s 1591 s 865 s

1635 s

C=0

C=C

121

O comportamento espectral quase idntico entre os quelatos de zinco, nquel e cobalto sugerem que eles possuem ligaes de coordenao de caractersticas praticamente idnticas (MURAKAMI; MERA, 1965). De acordo com os dados, o mesmo autor prope estruturas de ressonncia para o AK puro (figura 56) e de coordenao com metais (figura 57). Os deslocamentos de C=O e C=C para freqncias mais baixas parecem indicar que a contribuio das estruturas de ressonncia de II a IV, no qual o tomo de hidrognio substitudo por um on metlico, se tornam maiores com a formao das ligaes de coordenao com o metal (MURAKAMI; MERA, 1965). Essas estruturas propostas na literatura so coerentes com os dados espectrais obtidos neste trabalho, tanto por titulao potenciomtrica como por espectroscopia no infravermelho.

FIGURA 56 POSSVEIS ESTRUTURAS DE RESSONNCIA DO AK FONTE: MURAKAMI; MERA, 1965

FIGURA 57 POSSVEL ESTRUTURA DE RESSONNCIA DO AK COMPLEXADO FONTE: MURAKAMI; MERA, 1965

122

5.4. 2

Ressonncia magntica nuclear

Sob

condies

apropriadas

uma

amostra

pode

absorver

radiao

eletromagntica na regio de radiofreqncia em uma freqncia governada pelas caractersticas estruturais da amostra. A absoro funo de determinados ncleos da molcula (SILVERSTEIN; BASSLER; MORRILL, 1979). Para confirmar as coordenaes e quais grupos qumicos da molcula do AK estariam envolvidos na complexao com o alumnio foram feitos ensaios de ressonncia magntica nuclear de 13C. O primeiro experimento foi realizado com soluo concentrada de AK puro (7,5 mg/ mL) em meio aquoso, com pH iguais a 4, 7, 9 e 11 como pode ser visualizado pela figura 58, exceto pH 9.

FIGURA 58 ESPECTROS DE RMN E DADOS OBTIDOS EM pH 4, 7 E 11 DO CIDO KJICO NO COMPLEXADO FONTE: O AUTOR (2009)

Os carbonos numerados como 3, 6 e 7 no sofreram deslocamento qumico significativo, somente os carbonos 2, 4 e 5 como esto representados nas tabelas 15 e 16.

123

TABELA 15 VALORES DOS DESLOCAMENTOS QUMICOS DOS CARBONOS DO CIDO KJICO NO COMPLEXADO EM DIVERSOS pH 13 (ppm) (RMN C) AK puro pH C2 C3 C4 C5 C6 C7 4 168,2 110,3 176,4 144,4 141,8 59,6 7 167,8 110,4 177,5 146,1 142,0 60,0 9 165,3 110,0 181,2 152,0 142,2 60,2 11 164,9 109,8 182,0 153,6 142,2 60,2 14 166,0 109,2 181,6 153,0 141,9 60,2 -2,2 -0,5 +5,2 +8,6 +0,1 +0,6 FONTE: O AUTOR (2009) TABELA 16 COMPARAO DOS DESLOCAMENTOS QUMICOS DOS CARBONOS DO AK PELA VARIAO DE pH 13 (ppm) (RMN C) AK puro pH C2 C3 C4 C5 C6 C7 4 168,2 110,3 176,4 144,4 141,8 59,6 7 -0,4 -0,1 +1,1 +1,7 +0,2 +0,4 9 -2,9 -0,3 +4,8 +7,6 +0,4 +0,6 11 -3,3 -0,5 +5,6 +9,2 +0,4 +0,6 14 -2,2 -0,5 +5,2 +8,6 +0,1 +0,6 -2,2 -0,5 +5,2 +8,6 +0,1 +0,6 FONTE: O AUTOR (2009)

O carbono 2 sofreu um deslocamento qumico para campo mais alto com um de -2,2, ou seja, com a variao de pH ele se protegeu mais. Isso se deve ao fato de que provavelmente ele recebeu eltrons doados pelo grupo alquil ligado diretamente a ele. Os carbonos 4 e 5 sofreram um deslocamento qumico mais intenso, principalmente o 5 que estava ligado diretamente hidroxila enlica. Notase que os deslocamentos nesses carbonos so crescentes e proporcionais, exceto quando se considera o pH 14, com uma variao mais significativa na transio de pH 7 para 9 que a faixa em que se encontra o pKa do analito. O carbono 3 provavelmente sofreu dois -shift, um de cada lado e por isso ficou praticamente sem nenhum deslocamento evidente. A partir dos dados de RMN foi possvel criar uma hiptese de como estaria a molcula em pH cido (figura 59 - A) e alcalino (figura 57- B).

(A)

(B)

FIGURA 59 ESTRUTURAS HIPOTTICAS DA RESSONNCIA DO AK NA FORMA CIDA (A) E BSICA (B) FONTE: O AUTOR (2010)

124

Da mesma forma foram realizados ensaios com a proporo AK 1:1 Al3+, mas apenas na faixa cida (pH 2 e 4), uma vez que o alumnio precipita em pH bsico, como est representada atravs da tabela 17.
TABELA 17 - VALORES DOS DESLOCAMENTOS QUMICOS DOS CARBONOS DO CIDO KJICO COMPLEXADO COM ALUMNIO EM pH 2 e4 13 3+ (ppm) (RMN C) AK 1:1 Al pH C2 C3 C4 C5 C6 C7 2 168,0 110,2 176,1 143,9 141,6 59,5 171.2 105.8 177.9 149.3 142.0 60.0 4 171.3 105.9 178.1 149.4 141.8 60.0 -0.1 -0.1 -0.2 -0.1 +0.2 0 FONTE: O AUTOR (2009)

Observa-se que em pH 2 o analito no est totalmente na forma complexada por apresentar dois grupos de valores significativos de deslocamentos para cada carbono, sendo que um deles praticamente coincidente ao valor obtido do AK puro. Considerando apenas a variao do deslocamento qumico dos complexos no houve diferena significativa. Quando se compara em um mesmo pH os deslocamentos qumicos obtidos do AK puro com a proporo AK 1:1 Al3+ percebe-se que h uma variao no deslocamento mais evidentes nos carbonos 2, 3, 4 e 5 como est representada na tabela 18.
TABELA 18 - COMPARAO DOS DESLOCAMENTOS QUMICOS DOS CARBONOS DO AK PURO E COMPLEXADO COM ALUMNIO EM pH 4 13 (ppm) (RMN C) pH 4.0 C2 C3 C4 C5 C6 C7 AK puro 168.2 110.3 176.4 144.4 141.8 59.6 AK + Al 171.3 105.9 178.1 149.4 141.8 60.0 +3.1 -4.4 +1.7 +5.0 0 +0.4 FONTE: O AUTOR (2009)

O carbono 3 sofre um deslocamento para campo mais alto, protegendo-se mais e isso pode ser devido ao fato de que houve um aumento do trnsito eletrnico. Os carbonos 2, 4 e 5 sofreram deslocamento para campo mais baixo, e desblindando mais. Para o carbono 2 pode ser que como ele tinha uma dupla ligao e agora h uma diviso de carga a proteo eletrnica menor. O carbono 4 sofreu o menor deslocamento dos trs, mas deve ser porque deslocamento qumico de cetona j alto e por isso no sofreria uma alta variao. O carbono 5 teve o maior deslocamento, para campo mais baixo, desblindando-se, pois est ligado

125

diretamente ao oxignio que fez a ligao com o metal e este por sua vez atrai mais os eltrons para si, tambm fazendo com que houvesse menor carga eletrnica para proteg-lo. Na figura 60 representa-se uma hiptese de uma das possveis espcies complexadas de AK com alumnio em pH 4 na proporo AK 1:1 Al 3+.

FIGURA 60 ESTRUTURAS HIPOTTICAS DE UMA DAS REPRESENTAES DO AK COMPLEXADO EM pH 4 FONTE: O AUTOR (2009)

Na especiao por ionizao por eletrospray com on trap e transformada de Fourrier evidencia-se que o AK forma complexo com todos os metais 3+ (exceto As3+ em que o sinal provavelmente muito baixo). O complexo envolve um metal (M 3+), dois ons de AK desprotonados (AK-) e uma molcula de AK (HKA) (STENSON; CIOFFI, 2007). Em um estudo realizado por KINGSBURY et al (1975) de ressonncia magntica nuclear para o AK e alguns derivados foram obtidos valores de deslocamentos qumicos muito prximos aos encontrados no presente trabalho como pode ser visualizado na figura 61 e na tabela 19.

FIGURA 61 ESTRUTURA QUMICA DO AK com OS ASSINALAMENTOS POR Me2SO-d6 FONTE: KINGSBURY et al (1975)

RMN

13

C EM

126

TABELA 19 COMPARAO DOS DADOS DE ASSINALAMENTOS DOS CARBONOS DO 13 RMN C - DADOS DA LITERATURA COM OS OBTIDOS NO PRESENTE TRABALHO 13 (ppm) (RMN C) AK puro C2 C3 C4 C5 C6 KINGSBURY et al 167,8 109,6 173,5 145,4 139,0 (1975) (AK 17,0 mg/mL) Presente Trabalho 168,2 110,3 176,4 144,4 141,8 (AK 7,5 mg/ mL) FONTE: O AUTOR (2009)

AK POR

C7 59,3 59,6

Os valores so muito parecidos, entretanto os solventes utilizados foram diferentes e talvez esse seja o motivo pelo qual os deslocamentos no so exatamente iguais. O solvente utilizado neste trabalho foi gua e gua deuterada 10%, enquanto que o utilizado por KINGSBURY et al (1975) foi Me2SO-d6. De acordo com JAIN; KAUSHIK (1997) pelos experimentos de ressonncia magntica nuclear de hidrognio do AK pode-se verificar que na complexao o pico correspondente hidroxila fenlica desaparece e que o deslocamento para campo mais baixo de dois hidrognios so atribudos ao envolvimento da carbonila do carbono 4 e do grupo fenlico do carbono 5. Todos os dados experimentais do presente trabalho confirmam que o AK coordena o on metlico alumnio, e que provavelmente essa complexao se d preferencialmente atravs o tomo de oxignio do grupo OH fenlico e a carbonila do C-4, formando uma estrutura de um quelato com anel de 5 membros em valores de pH entre 6 e 10, preferencialmente.

127

Concluso

128

6. CONCLUSO

De acordo com os resultados obtidos no presente trabalho foram obtidas as seguintes concluses: - O mtodo por UV desenvolvido, com base nas propriedades de complexao do AK com ctions metlicos mostrou-se adequado para a quantificao do AK na matria-prima e nos cremes, mesmo quando em associao com hidroquinona e na presena de conservantes. - A reao de complexao AK-Al apresenta uma certa seletividade em relao ligao, e tambm permitiu tornar o mtodo espectrofotomtrico mais seletivo, deslocando a banda de absoro mxima do AK puro de 269 nm para 305 nm quando complexado. - A vantagem da utilizao do metanol como solvente o fato de permitir um deslocamento da banda de absoro do complexo para comprimento de onda maior (305 nm) do que aquele quando se utilizou gua (298 nm). E tambm no caso do produto contendo conservantes este facilita a eliminao do nipagin, pois o mesmo fica insolvel nesse meio, podendo ser facilmente separado por filtrao. - O pH uma propriedade que deve ser levado em considerao nas condies de execuo do mtodo, e no deve ser maior que 3, pois em valores superiores ocorre turvao. - O mtodo desenvolvido atendeu os limites estabelecidos para os parmetros de validao linearidade (r> 0,999 na faixa de 5-50 g/mL), exatido (recuperao prxima de 100%), preciso (DPR de 0,402%, 1,284 e 1,192 para 10, 15 e 20 g/mL na repetitividade; DPR de 2,171, 0,976 e 0,439 10, 15 e 20 g/mL na preciso intermediria) e robustez (pH, tempo de leitura e temperatura) conforme normas nacionais e internacionais; - Por este mtodo, uma vez desenvolvido e validado, obteve-se respostas satisfatrias nas anlises de quantificao do AK em produtos feitos base de creme no inico e creme lanette, mostrando-se apto para ser usado na rotina laboratorial para este tipo de anlise. - As principais vantagens do mtodo, em relao aos mtodos j descritos na literatura, ser de baixo custo, requerer reagentes e equipamentos acessveis e simples, de fcil execuo e rpido.

129

- A comparao de espectros no IV do AK puro e do complexo AK-on metlico, em diferentes valores de pH, foi um recurso que permitiu correlacionar as modificaes na absoro do grupamento enlico e carbonlico complexados. - Pela anlise dos espectros de RMN
13

C, atravs dos deslocamentos

qumicos de, principalmente C-5, pode-se inferir que a complexao sugerida pelos dados da titulao potenciomtrica e da espectroscopia no infravermelho, esto de acordo com os deslocamentos qumicos observados nos espectros de RMN obtidos. - Pelos dados de especiao por titulao potenciomtrica verificou-se que o cido kjico complexa o on alumnio de diferentes maneiras: dependendo da proporo molar em que eles se encontram e da faixa de pH, os complexos obtidos so bem diversos. Dois modelos se ajustaram perfeitamente, ou seja, a curva experimental coincidiu igualmente com a curva da simulao matemtica: o primeiro com o cido kjico perdendo um prton da hidroxila do C-5. No segundo modelo matemtico, o AK ainda poderia perder um segundo prton, do OH alcolico do C-7. Esse modelo matemtico mostrou-se incoerente com os fatos e hipteses qumicas, tendo sido descartado aps anlise dos resultados das tcnicas analticas empregadas e de resultados publicados na literatura.

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