Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
Durante dcadas o mtodo de Sanger foi praticamente a nica opo utilizada para sequenciamento de DNA Nos ltimos anos surgiram novas tecnologias de sequenciamento em larga escala que foram denominadas como Next-Generation Sequencing (NGS)
Em comum elas tem a paralelizao de diversos processos levando a analise simultnea de milhares de molculas : Sanger ~104 nucleotdeos sequenciados/corrida, NGS ~108-10 nucleotdeos sequenciados/corrida
Mtodos de sequencamento
Diferentes mtodos podem ser utilizados para o sequenciamento das molculas de DNA: -Terminao ciclo-reversivel -Sequenciamento por ligao -pirosequenciamento -Sequenciamento em tempo real
Terminao ciclo reversvel Adio de nucleotdeos bloqueados ligados a molculas florescentes Desbloqueio de nucleotdeo permite sucessivos ciclos
Sequenciamento por ligao Sondas ligadas a molculas fluorescentes fluorescentes reconhecem 2 bases por ciclo. Necessidade de diversos ciclos de ligao para sequenciar molcula
Pirosequenciamento Reao luminescente acoplada a incorporao de nucleotdeos Sinal fluorescente proporcional ao numero de nucleotdeos incorporados
Sequenciamento em tempo real Nucleotdeos acoplados a molculas fluorescentes ligados a quenchers, somente quando ocorre incorporao h deteco de fluorescncia
Tamanho de genomas
possvel notar que no h uma correlao direta entre tamanho do genoma e complexidade do organismo
Seqenciamento de genomas
Genomas possuem grande numero de bases em seu genoma (105 a 1012) e ate o momento as tcnicas existentes de seqenciamento conseguem amostrar apenas algumas centenas de bases por reao. Deste modo, o genoma tem que ser seqenciado de forma descontinua com milhares de reaes sendo realizadas em paralelo para obteno da informao necessria Isto gera uma grande quantidade de seqncias derivadas do genoma que se apresentam de forma desconexa, visto que no existe nenhuma propriedade intrnseca que permite a ordenao inequvoca destas Deste modo um dos grandes desafio ao seqenciar genomas a montagem destas sequencias de modo que elas possam reproduzir a ordenao encontrada nos cromossomos
Quebra do DNA pode ser feita com enzimas de restrio ou via nebulizao Clonagem de fragmentos com tamanho aproximado conhecido importante para a posterior montagem das seqncias
Aps isso so selecionados clones que so separadamente cortados (por nebulizao) e sub-clonados em plamideos. Seqenciamento destes sub-clones permitir a reconstituio do clone do BAC
Apesar te ter sido a tcnica de referencia no inicio de sequenciamento de genomas, no mais utilizada com freqncia.
Cobertura de sequenciamento
Devido ao carter randmico de seqenciamento utilizando a tcnica de WGS necessrio seqenciar uma quantidade de bases muito maior do que o numero de bases do genoma (pelo menos 8X mais) devido a redundncia do sequenciamento
Par evitar isso em adio ao algoritmo de alinhamento de DNA utiliza-se a informao de distancia entre as seqncias das pontas de cada clone na montagem do genoma
Com esta informao possvel utilizar os contig para montar um esqueleto de cada cromossomo.
Analise de genomas
Uma vez que obtemos a sequncia extensiva do genoma de um organismo possvel analis-la com o intuito de obter uma maior compreenso sobre a informao contida no mesmo.
No entanto tal analise no trivial devido a composio e organizao de genomas.
Complexidade de genomas
Experimentos de cintica de reassociao permitem obter uma estimativa da complexidade de cada genoma De modo geral genomas de eucariotos possuem uma grande frao de regies repetitivas
Complexidade de genomas
Experimentos utilizado pequena quantidade de molculas de mRNA permitem ver que a maior frao do que expresso pela clula provem de regies no repetitivas
Este experimentos permitem deduzir que o DNA composto em grande parte por elementos repetitivos, mas os RNAs so transcritos principalmente de regies no-repetitivas.
Complexidade de genomas
A presena destas regies repetitivas explica em parte porque o tamanho dos genomas no proporcional a complexidade do organismo visto que uma serie de organismos menos completos possuem uma alta quantidade de DNA repetitivo. Este DNA repetitivo no possui uma funo clara e por isso muitas vezes referido como junk DNA
Seqenciamento de transcriptomas
Conforme mostrado no slide anterior organismos mais complexos tendem a possuir genes com um alto numero de exons. Alm disso, o genoma destes organismos possuem uma alta quantidade de seqncias nocodificantes e portanto a predio da estrutura de genes no trivial.
Deste modo o seqenciamento direto das molculas de mRNA pode fornecer informaes a respeito da estrutura de um gene, pois representa a molcula madura formada aps os eventos de splicing Alm disso, o seqenciamento de mRNA permite a amostragem direta das seqncias codificantes permitindo com que um menor volume de seqenciamento se obtenha maior informaes sobre as protenas deste organismo
Seqenciamento de transcriptomas
Aps o isolamento das molculas de mRNA realizada a reao de transcriptase reversa que ir gerar um fita de cDNA a partir de um mRNA molde.
Normalmente esta transcrio realizada com um oligo-dT como primer o que permite com que o mRNA interio seja transcrito Os cDNA produzidos so clonados e o conjunto de plasmideos produzidos denominado biblioteca
Seqenciamento de transcriptomas
Entretanto a abundancia de diferente mRNAs em uma clula varia muito. Existem alguns poucos mRNAs que possuem um numero de molculas at 1000 X maior que a maioria dos mRNAs.
Deste modo, seqenciamentos de bibliotecas de mRNAs tendem a amostrar muito umas poucas molculas e pouco um conjunto grande Alm disso, nem todos os mRNA vo estar sendo expressos em um nico tecido ou fase de vida do organismo e por isso para obter uma descrio completa dos mRNAs de um organismos vrios destes devero se amostrados
Splicing alternativo
Seqenciamento de transcritos permite a deduo de eventos de splicing alternativo a partir do mapeamento deste nas seqncias de DNA genomico
Spidey
Programa de mapeamento de seqncias de mRNA em pores de DNA genmico Possui vantagens em relao a alinhamento no blast2sequences pois o programa busca os stios de splicing e permite apenas um alinhamento por regio do RNA, alem disso o seu algoritimo busca evitar o alinhamento em pores do gene em pseudogenes ou copias do gene adjacentes a este
Spidey
Spidey
Spidey
Exemplo de alinhamento de um exon