Rev bras Coloproct Julho/Setembro, 2006

Pesquisa em Biologia Molecular: como fazer? Mauro de Souza Leite Pinho

Vol. 26 N 3

GENTICA E BIOLOGIA MOLECULAR ________________________________

Pesquisa em Biologia Molecular: Como Fazer?

Molecular Biology Research - How to do it?
MAURO DE SOUZA LEITE PINHO - TSBCP

PINHO MSL. Pesquisa em Biologia Molecular: como fazer? Rev bras Coloproct, 2006;26(3): 331-336.

RESUMO: O estudo da biologia molecular representa hoje uma das reas de maior potencial para a realizao de pesquisas em Medicina e um nmero cada vez maior de profissionais de sade tem se interessado em aprofundar seus conhecimentos e produo cientfica, mediante a realizao de projetos de pesquisa nesta rea. Entretanto, a elaborao do projeto de pesquisa necessita ser realizada de forma bastante cuidadosa, considerando a grande amplitude dos potenciais objetivos e metodologias a serem utilizadas, dependentes em grande parte da disponibilidade de recursos tecnolgicos e experincia prvia da equipe. O objetivo deste trabalho contribuir para esta elaborao do projeto de pesquisa atravs da apresentao de alguns modelos estruturais mais freqentemente utilizados na realizao de estudos em biologia molecular, assim como rever seus princpios e mtodos empregados. Descritores: Pesquisa, biologia molecular.

O estudo da biologia molecular representa hoje uma das reas de maior potencial para a realizao de pesquisas na rea mdica, considerando-se no apenas sua grande relevncia clnica e epidemiolgica, mas tambm pela possibilidade de aplicao de ferramentas recentemente desenvolvidas a um nmero bastante amplo de doenas. Em conseqncia do grande interesse despertado por esta rea, observa-se um nmero cada vez maior de profissionais da rea de sade motivados em aprofundar seus conhecimentos e produo cientfica, mediante a realizao de projetos de pesquisa, os quais de alguma forma utilizem conceitos e procedimentos relacionados biologia molecular. Entretanto, j aos primeiros passos neste caminho o candidato a pesquisador defronta-se com questes bastante complexas referentes no apenas escolha do tema a ser estudado, mas principalmente definio de seus objetivos gerais, especficos ou mesmo aos recursos adequados e/ou disponveis para a execuo de sua metodologia. Assim sendo, o objetivo deste texto ser apresentar uma breve reviso de conceitos bsicos sobre a biologia molecular, confrontando-os com a respectiva
Recebido em 01/06/2006 Aceito para publicao em 08/08/2006

seqncia de potenciais reas e metodologias de pesquisa.

BIOLOGIA MOLECULAR: O QUE ?

At algumas dcadas atrs, o estudo dos tecidos vivos baseava-se quase que exclusivamente em observaes de natureza morfolgica, fossem estas a nvel macroscpico ou microscpico. Desta forma, a anlise das alteraes ocorridas na intimidade destes tecidos poderiam ser identificadas apenas mediante a constatao de seus efeitos sobre sua estrutura, a qual iria apresentar modificaes em sua forma, tamanho, aparncia e outras variveis. O grande e acelerado desenvolvimento da tecnologia permitiu que estes mesmos tecidos fossem posteriormente analisados em seu contedo submicroscpico, ou seja, atravs da identificao das molculas que os compem pela aplicao de mtodos qumicos ou fsicos. O grande salto de conhecimento ocorrido nesta rea foi proporcionado pelos trabalhos pioneiros de Watson e Crick, na dcada de 50, os quais, ao definir a estrutura qumica da molcula de DNA, estabelece-

Trabalho realizado na Disciplina de Clnica Cirrgica - Univille - Joinville - SC - Brasil.

331

Rev bras Coloproct Julho/Setembro, 2006

Pesquisa em Biologia Molecular: como fazer? Mauro de Souza Leite Pinho

Vol. 26 N 3

ram a principal diferena entre os seres vivos e a matria inanimada. A partir deste achado, sucedeu-se uma seqncia de descobertas que demonstrou que esta molcula representava o elemento primordial, a partir do qual poderamos compreender as principais caractersticas dos seres vivos. Nascia a biologia molecular.

VIDA, DNA, GENES, PROTENAS

A identificao da molcula de DNA possibilitou uma melhor compreenso do ciclo finito da vida, descrito como o intervalo entre os processos de nascimento e morte, e mantido atravs de um constante funcionamento baseado na ao de molculas, a qual seria o elemento bsico das transformaes morfolgicas observadas de forma peculiar em cada ser vivo no reino animal ou vegetal. Para melhor analisarmos o impacto destas descobertas, consideremos como elemento vivo uma nica clula, mnimo organismo capaz de realizar as tarefas inerentes vida como captao de energia e o metabolismo interno necessrio durante o seu ciclo de existncia. Os estudos bioqumicos nos trouxeram o conhecimento de que as principais molculas responsveis pela realizao destas tarefas so as protenas . Estas macromolculas, compostas por seqncias de aminocidos, representam a maior parte de matria seca de uma clula. Alm de auxiliar a compor sua estrutura, as protenas realizam praticamente todas as funes celulares, como enzimas, transporte, transmisso de sinais, recepo de estmulos e at a regulao da ativao de genes para a produo de outras protenas. Estima-se hoje que cada clula necessite para seu funcionamento vital de cerca de 10 000 protenas diferentes, cada uma delas desempenhando uma tarefa especfica. Estas protenas, como sabemos, so produzidas a partir de segmentos de seqncias gnicas no DNA, atravs da qual se estruturam molculas de RNA, descritas como mensageiras (RNAm). Estas molculas iro migrar a partir do DNA nuclear para os ribossomos, no citoplasma, onde, atravs de ligaes com outra forma de RNA (descrito como transportador), iro realizar a sntese das protenas mediante o encadeamento seqencial de aminocidos. Poderamos ento sumarizar esta seqncia de eventos da seguinte forma:
332

Estruturando um projeto de pesquisa em biologia molecular Utilizando os conceitos acima revistos, discutiremos a seguir trs tipos de projetos mais freqentemente utilizados em biologia molecular: 1 tipo: Pesquisar no DNA de um indivduo saudvel o risco de desenvolver uma doena de carter hereditrio Esta certamente um dos tipos de projetos de pesquisa mais realizados, representando a base do estudo das doenas genticas. Como exemplo clssico na rea da Coloproctologia para este modelo de estudo, podemos citar a necessidade de identificar se um membro de uma famlia de um paciente portador de polipose adenomatosa familiar ter ou no o risco de desenvolver a mesma doena. Neste caso, sabemos que o gene responsvel pela ocorrncia desta doena dominado como APC, cuja funo codificar uma protena relacionada ao controle da atividade proliferativa da clula intestinal. Para realizar este estudo, precisamos responder s seguintes perguntas: A seqncia deste gene APC em um DNA normal (sem mutaes) j conhecida ? Sim, como a maior parte dos genes de relevncia clnica, sua seqncia j publicamente disponvel em bases de dados facilmente acessveis pela Internet; J foi identificada a mutao existente no paciente portador da polipose ? Provavelmente no. Neste caso, teremos necessariamente que fazer um sequenciamento de todo o gene APC deste paciente, em qualquer clula normal somtica (ou seja, excluindo vulos e espermatozides), pois ao se tratar de uma mutao (tambm chamada

Rev bras Coloproct Julho/Setembro, 2006

Pesquisa em Biologia Molecular: como fazer? Mauro de Souza Leite Pinho

Vol. 26 N 3

de polimorfismo) provavelmente herdada geneticamente, esta deve estar necessariamente universalmente presente. Para esta finalidade, utiliza-se mais freqentemente as clulas sanguneas, cujo DNA extrado. Para realizar esta avaliao da seqncia de todo o gene, necessitaremos utilizar seqenciadores eletrnicos, os quais nos permitiro determinar a seqncia de bases nitrogenadas (adenina, citosina, guanina e timina) no segmento desejado, conforme demonstrado na figura 1, e compar-la com a seqncia previamente conhecida. Este um procedimento ainda disponvel em poucos centros, demorado e de alto custo, especialmente se considerarmos que o gene APC bastante longo, contendo 8535 pares de bases nitrogenadas. Caso este exame seja possvel, e tenha sido possvel identificar uma mutao em algum segmento (como uma troca de uma adenina por timina, por exemplo), ento estaremos aptos a prosseguir em nosso estudo. Como saber se um familiar assintomtico apresenta a mesma mutao em seu DNA ? Para isto, bastar extrair o DNA de algum tecido celular deste paciente (sangue, esfregao da bochecha, etc) para pesquisar se esta mutao estar presente. Como neste caso j sabemos onde e qual a mutao a ser procurada, no necessitamos fazer um sequenciamento novamente. Para isto, podemos apenas utilizar uma tcnica de amplificao do DNA denominada como reao em cadeia pela polimerase (PCR), a qual ir permitir a replicao in vitro em lar-

ga escala apenas do segmento de DNA desejado, ou seja, aquele no qual est contida a seqncia que apresentou a mutao no familiar doente. Caso o laboratrio disponha de aparelhos de PCR mais modernos (real-time PCR) esta identificao e mensurao dos segmentos a serem examinados poder ser realizada eletronicamente, no chamado tempo real. Caso o aparelho de PCR no disponha deste recurso, o produto de sua amplificao dever ser identificado posteriormente em gel de eletroforese (Figura 2). Como qualquer alterao na seqncia de DNA implicar uma alterao de seu peso molecular, ser possvel observar se a seqncia do segmento gnico examinado est ntegra ou no, pois o peso molecular do segmento normal conhecido (Figura 3). Este tipo de estudo , portanto, utilizado quando desejamos conhecer a existncia de uma alterao gentica, hereditria ou no, e usualmente descrito como pesquisa de polimorfismos. 2 tipo: Pesquisa de DNA estranho ao indivduo em um tecido Este tipo de estudo, de grande relevncia na esfera da infectologia, semelhante a este ltimo apresentado acima, com a diferena de que o segmento de DNA pesquisado no tecido do indivduo no uma variao de uma seqncia gnica humana normal, mas uma seqncia presente exclusivamente em um determinado ser vivo de outra espcie, seja este um vrus ou bactria, denotando assim a sua presena anmala.

Figura 1 - Sequenciamento do DNA.

Figura 2 - Gel de agarose contendo dez amostras teciduais, nas quais fragmentos de DNA podem ser identificados atravs de seu posicionamento decorrente de seu peso molecular.

333

Rev bras Coloproct Julho/Setembro, 2006

Pesquisa em Biologia Molecular: como fazer? Mauro de Souza Leite Pinho

Vol. 26 N 3

cessidade de realizao da cultura, nem sempre disponvel. Embora tenhamos utilizado um exemplo referente a tecido intestinal, exames anlogos de identificao de DNA extrnseco podem tambm ser realizados em outros tecidos, incluindo o sangue circulante, o que feito com grande freqncia, por exemplo, no diagnstico de infeces virais sistmicas. 3 tipo: Determinao do comportamento biolgico de um tecido tumoral Este o principal objetivo de muitos estudos em biologia molecular, destacando-se aqueles referentes rea oncolgica, e descrito como anlise da expresso gnica tecidual. Atravs desta anlise, podemos compreender as funes de cada protena mediante a correlao entre sua expresso tecidual e diferentes parmetros clnicos e anatomo-patolgicos observados, como grau de diferenciao tumoral, potencial metasttico, resposta teraputica, intensidade de processos inflamatrios, prognstico etc. Como o comportamento biolgico de uma clula ou um tecido, seja ele normal ou patolgico, ser determinado pela presena e concentrao das protenas existentes em seu interior, os mtodos anteriormente citados para determinar a seqncia gnica no DNA no se aplicam neste caso, pois todos os genes devero estar presentes em todas as clulas somticas de nosso corpo, independentemente de serem ou no ativados para a produo de sua respectiva protena. Desta forma, o gene da insulina, por exemplo, se mostrar presente e ntegro em clulas como neurnios ou linfcitos, embora no ocorra sua ativao (expresso) visando produo desta protena nestas clulas. Assim sendo, toda clula, seja ela um organismo independente como uma bactria ou integrante de um grande organismo multicelular como um hepatcito ou clula tumoral, ter suas funes realizadas pela ao de milhares de protenas distintas, formadas a partir de um nmero equivalente de RNAs mensageiros, os quais foram produzidos sobre os respectivos genes em seu DNA. Assim sendo, podemos estudar o comportamento biolgico de cada clula atravs da determinao do estado funcional e integridade de uma protena ou um conjunto delas.
334

Figura 3 - Eletroforese em gel de fragmentos de DNA. Observe que a alterao na banda mais inferior do DNA do tecido a ser estudado revela uma provvel mutao em relao ao fragmento normal correspondente ao peso molecular de 1000 pb (pares de bases).

Como exemplo, vamos definir como nossa hiptese que a ileite em um paciente portador de diarria causada pela presena de uma infeco por Yersinia enterocolitica. Neste caso, como poderemos utilizar as ferramentas da biologia molecular para fazer este diagnstico ? Extrao do DNA a partir de uma bipsia do leo terminal colhida por colonoscopia Trata-se de um procedimento bioqumico relativamente simples, podendo ser realizado por laboratrios bem equipados com pessoal treinado. Pesquisa do DNA da Yersinia atravs de PCR Neste caso, a tcnica de reao em cadeia pela polimerase dever incluir, alm do DNA ileal extrado, pequenas seqncias (denominadas como primers) previamente preparadas para amplificar apenas um segmento conhecido do DNA da Yersinia. Se neste tecido houver DNA da Yersinia, mesmo em mnima quantidade, este ser amplificado e identificado pelo PCR (em tempo real ou no gel de eletroforese), gerando um resultado preciso e sem ne-

Rev bras Coloproct Julho/Setembro, 2006

Pesquisa em Biologia Molecular: como fazer? Mauro de Souza Leite Pinho

Vol. 26 N 3

importante destacar que, ao contrrio dos estudos anteriores, em que o foco estava sobre o cdigo gentico do indivduo e portanto presente em qualquer clula somtica, neste caso necessitaremos fazer a anlise biomolecular especfica do tecido a ser estudado, seja ele um tumor, um processo inflamatrio, ou mesmo um tecido normal cuja atividade celular fisiolgica necessite ser esclarecida. Para esta avaliao, dispomos de duas abordagens distintas, a saber: 1. Pesquisa do RNAm de uma determinada protena Considerando a seqncia: DNA RNAm Protena,

tante complexo para sua utilizao em bases clnicas. 2. Pesquisa da protena propriamente dita no tecido Para correlacionar o comportamento biolgico de um tecido diretamente com as protenas ali expressas dispomos de dois procedimentos mais freqentemente utilizados. O primeiro deles a imunohistoqumica, j revista recentemente nesta Seo, a qual nos permite a visualizao in loco da protena em questo em um corte do tecido aps sua reao com um anticorpo especfico, como demonstrado na Figura 4. A imunohistoqumica apresenta grandes vantagens, como sua maior disponibilidade em laboratrios de anatomia patolgica, baixo custo, a possibilidade de identificao do posicionamento da protena no tecido (nuclear, citoplasmtica, etc) ou a intensidade de sua presena atravs do grau de colorao. Por outro lado, apresenta-se pouco adequada anlise estatstica devido ao forte componente subjetivo na quantificao dos resultados durante a observao das lminas. Outra forma de demonstrar a presena de uma determinada protena a ser estudada em um determinado tecido atravs da tcnica conhecida como Western blotting. Este mtodo consiste na extrao bioqumica de um pool, contendo todas as protenas presentes no tecido, sendo estas posteriormente separadas por um processo de eletroforese.

podemos concluir que, ao contrrio da seqncia gnica do DNA, a qual estar presente em todas as clulas somticas, seu respectivo RNA mensageiro (RNAm) somente estar presente em um tecido no qual tenha havido a ativao deste gene especfico visando a produo de sua respectiva protena. Para identificarmos a presena deste RNAm, necessitamos inicialmente extrair, por meios bioqumicos, todo o RNA do tecido a ser analisado. Em seguida teremos que, atravs de reaes qumicas que utilizem uma enzima denominada como transcriptase reversa, reverter a transcrio deste RNAm em DNA novamente (em segmentos denominados como cDNA ou DNA complementar), os quais podero ser quantificados, segundo o mtodo de PCR descrito acima. Caso possamos identificar a presena deste, ento iremos demonstrar que sua respectiva protena est sendo produzida naquele tecido, pois foi formado a partir de um RNAm j existente. Este mtodo de anlise de expresso gnica denominado como RT-PCR (RT = reverse transcriptase) e apresenta a vantagem de permitir a avaliao das protenas produzidas naquele tecido, possibilitando uma anlise do perfil genmico tumoral. Uma aplicao mais sofisticada deste procedimento denominada como microseqncia (microarrays), para a qual so utilizados os chamados microchips , possibilitando a identificao simultnea de milhares de genes que esto sendo ativados (ou no) no DNA daquele tecido. Este mtodo, embora venha sendo aplicado cada vez mais em laboratrios avanados de pesquisa, ainda bas335

Figura 4 - Cortes histolgicos de tecido tumoral (cncer colorretal) pela colorao convencional em (a) e imunohistoqumica em (b), na qual podemos observar a presena de protena p53 (colorao acastanhada).

Rev bras Coloproct Julho/Setembro, 2006

Pesquisa em Biologia Molecular: como fazer? Mauro de Souza Leite Pinho

Vol. 26 N 3

Feito isto, a identificao de uma determinada protena naquele tecido poder ser feita atravs da adio de um anticorpo especfico e sua demonstrao atravs de corante, conforme demonstrada na Figura 5. Assim sendo, o conhecimento destes tipos mais freqentes de estruturas de pesquisa em biologia molecular representa, na verdade, a primeira etapa na elaborao de um projeto, pois baseia-se na disponibilidade de equipamentos e experincia de cada laboratrio, devendo ser ento o resultado de uma perfeita integrao entre o pesquisador clnico e o grupo de profissionais que atuam neste, incluindo outros profissionais da rea de sade, como biologia, bioqumica e farmcia. Uma vez definidos os recursos disponveis e a estrutura do projeto, restar ao pesquisador enfrentar outra etapa bastante complexa, referente definio dos elementos biomoleculares a serem estudados. Discutiremos esta delicada etapa em um prximo nmero desta seo.

Figura 5 - Tcnica de Western-Blotting. Observa-se na avaliao de duas amostras (2 e 3) a presena de uma banda de peso molecular correspondendo a 100 kDa, demonstrando a existncia da protena pesquisada no presente espcime. (Extrado de www.upstate.com)

ABSTRACT: Molecular biology studies are presently regarded as a major source for research in Medicine, and an increasing number of medical professionals are interested in improving their knowledge and scientific production in this subject. However, structuring the research project may become a difficult challenge due to the wide range of methods and techniques available in this area, most of them depending on existing technological facilities and personal skill. The aim of this study is to contribute for the task of setting up a research project by presenting a brief review of most used structure models in molecular biology studies as well as its related principles and methods. Key words: Research; Molecular biology.

REFERNCIAS
1. 2. 3. 4. Alberts e cols. Fundamentos da Biologia Celular, Artmed, 1999. Lodish e cols. Biologia Celular e Molecular, Revinter, 2002. Pinho M. Biologia Molecular do Cncer, Revinter, 2005. Croner RS, Peters A, Brueckl WM, Matzel KE, Klein-Hitpass L, Brabletz T, Papadopoulos T, Hohenberger W, Reingruber B, Lausen B. Microarray versus conventional prediction of lymph node metastasis in colorectal carcinoma. Cancer. 2005 Jul 15;104(2):395-404. Eschrich S, Yang I, Bloom G, Kwong KY, Boulware D, Cantor A, Coppola D, Kruhoffer M, Aaltonen L, Orntoft TF, 6.

Quackenbush J, Yeatman TJ. Molecular staging for survival prediction of colorectal cancer patients. J Clin Oncol. 2005 May 20;23(15):3526-35. Pinho M. Imunoistoqumica: o estudo da biologia molecular ao alcance de todos. Ver Bras Coloproctologia 2005;25:18891.

5.

Endereo para correspondncia: MAURO PINHO Rua Palmares, 380 89.203-230 Joinville (SC)

336