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Importncia
Uso de DNA para estudos de natureza variada: diagnstico (sensvel e especfico); medicina (estudo do cncer; identificao doenas); processos evolutivos (filogenias, estudos populacionais); genoma investigaes de percia, paternidade... Uso de RNA para estudos de natureza variada: Transcrio Reversa do RNA (cDNA); Anlises de expresso gnica Northern, RT-PCR, construo de bibliotecas de cDNA
Organismos
bactrias, fungos, vrus, tecidos vegetais e tecidos animais
Organismos
bactrias, fungos, vrus, tecidos vegetais e tecidos animais
A extrao e a purificao de cidos nuclicos uma etapa fundamental para se obter alta eficincia de amplificao nos protocolos que usam a reao em cadeia da polimerase (PCR).
Tipos de DNA
Eucariontes (ncleo individualizado) DNA nuclear; DNA mitocondrial; DNA cloroplasto;
Tipos de DNA
Eucariontes (ncleo individualizado) DNA nuclear; DNA mitocondrial; DNA cloroplasto;
Tipos de DNA
Procariontes (sem ncleo) DNA circular; DNA plasmidial;
Extrao de DNA/RNA
Extrao de DNA/RNA
Passos principais: lise das membranas plasmticas e nucleares; degradao protenas; purificao do DNA/RNA.
Para cada tipo de amostra, vrios protocolos podem ser testados, adaptados e otimizados, de maneira a se conseguir DNA de boa qualidade.
Extrao de DNA/RNA
Passos principais: lise das membranas plasmticas e nucleares; solubilizadas por agentes que rompam associaes hidrofbicas e destruam a bicamada lipdica.
detergentes
Extrao de DNA/RNA
Passos principais: lise das membranas plasmticas e nucleares; solubilizadas por agentes que rompam associaes hidrofbicas e destruam a bicamada lipdica.
detergentes
micelas
Extrao de DNA/RNA
Passos principais: lise + degradao protenas;
detergentes
Proteinase k
Extrao de DNA/RNA
Passos principais: lise + degradao protenas; A Proteinase K foi descoberta em 1974, no fungo Tritirachium album; capaz de digerir a queratina (Keratin), da o nome Proteinase K. detergentes Rapidamente inativa as nucleases, que degradam o DNA e RNA
Proteinase k
Extrao de DNA/RNA
Passos principais: lise + degradao protenas;
detergentes
Proteinase k
O tempo de incubao pode variar. Importante que a amostra se apresente totalmente digerida
Extrao de DNA/RNA
Fenol:Clorofrmio:lcool isoamlico (25:24:1): eficiente para desproteinizar e sua ao se fundamenta na propriedade hidrfoba das protenas que apresentam afinidade por solventes orgnicos. IAA reduz espuma, deixa parte orgnica mais densa. Clorofrmio: retira resduos de fenol
Extrao de DNA/RNA
Passos principais: purificao do DNA/RNA (eliminao de resduos orgnicos)
formao do Pellet
A molcula de DNA no solvel em lcool e, desta maneira, tende a formar um aglomerado de molculas quando em meio alcolico.
Quantificao DNA/RNA
Espectrofotmetro Qualidade da extrao Determinao da quantidade de DNA/RNA extrado nucleotdeos podem ser detectados por espectrofotometria a um comprimento de onda de 260 nm 280 nm para estimar a contaminao com protenas
260 e 280 nm
Conservao da amostra
Amostras de tecidos (p.ex. animais) devem ser colocadas em lcool absoluto imediatamente aps a coleta, e trocado aps 24h. Amostras de partes vegetais devem ser lavadas e secadas com slica. Para todas amostras congeladas em estoque, prefervel o fracionamento em pequenas alquotas para que o material no sofra descongelamentos sucessivos, que poderiam contribuir para a oxidao do tecido e para a degradao do DNA. O manuseio dessas amostras deve ser feito preferencialmente com o uso de luvas, para que uma parte dos cidos nuclicos no sejam degradados
Material Necessrio
Para executar os protocolos de extrao de DNA, necessrio que o laboratrio tenha os equipamentos bsicos, o material plstico e todas as solues utilizadas nos procedimentos. O material mnimo necessrio o seguinte: a) Centrfuga com rotor para vrios tipos de tubos b) Capelas de exausto. c) Banho-maria com termostato ou com termmetro para aferio da temperatura. d) Microtubos de polipropileno. e) Micropipetas automticas para volumes diversos (com ponteiras).
Eletroforese
um mtodo simples e muito eficiente para separar, para identificar e para purificar fragmentos de DNA, RNA e de protenas. Ela consiste na separao de molculas ionizadas de acordo com sua carga eltrica e seu peso molecular. Molculas com carga negativa migram para o plo positivo (nodo) e molculas com carga positiva migram para o plo negativo (ctodo).
A migrao das cargas quando so submetidas a uma diferena de potencial chamada de eletroforese.
Eletroforese
Existem dois modelos bsicos de eletroforese: Gel de agarose
AGE
Eletroforese
Existem dois modelos bsicos de eletroforese: Gel de agarose Gel de poliacrilamida
AGE
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Eletroforese
Existem dois modelos bsicos de eletroforese: Gel de agarose Gel de poliacrilamida
AGE
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Fonte
Eletroforese
Plo -
Plo +
Equipamento - Agarose
gar-gar (gar ou agarose) um hidrocolide componente da parede celular, extrado de diversas algas marinhas vermelhas da classe Rodophyta; insolvel em gua fria dissolve em gua quente (absorve uma quantidade de gua de cerca de vinte vezes o seu prprio peso) formando um gel noabsorvvel, no-fermentvel e com importante caracterstica de ser atxico. Concentraes de 0,5 2,5% Diludos no tampo TBE ou TAE. (Tris-borato-EDTA ou Tris-acetato-EDTA)
a migrao velocidades
DNA superenrolado DNA linear mais lento mais rpida
Equipamento - Agarose
Despeja na forma com o pente Agarose tampo aquece
Equipamento
DNA
marcador migrao
aumentar a densidade da amostra (faz afundar no poo) adicionar cor s amostras Permite acompanhar a corrida
(+)
Equipamento
DNA
(+)
Brometo de Etdio
AVISO: Danoso se for engolido ou absorvido pela pele. Prejudicial se for inalado. Causa irritao pele, olhos e trato respiratrio.
Equipamento - Poliacrilamida
Utilizado tanto para Protenas quanto para DNA/RNA Composto por Acrilamida e Bis-Acrilamida
AVISO: Perigoso!!! Danoso se for engolido,inalado ou absorvido pela pele. Causa irritao da pele, olhos e trato respiratrio. Pode afetar o sistema nervoso central.
Protenas: a carga e a forma devem ser excludas, com adio de SDS (dodecilssulfato de sdio) que possui carga negativa converte protenas em estrutura linear
Equipamento - Poliacrilamida
Colorao com:
Brometo de Etdio (EtBr), prata (sensibilidade maior: menos amostra no gel e anlise de amostra diluda) SYBR Green (menos mutagnico)
Coomassie Blue se liga inespecificamente a praticamente todas as protenas. menos sensvel que corar com a prata mas efetivo tambm, alm de ser fcil de corar
Fotodocumentao
Transluminador Caixa acoplada mquina fotogrfica Computador
AGE
Fcil preparo, no-txico.
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mais difcil de ser preparado e muito txico quando em p ou em soluo. tem maior capacidade de resoluo e mais efetivo para separar pequenos fragmentos de DNA (5-500 bp pares de base). podem ser separados fragmentos com tamanho de apenas uma base de diferena. tambm usados para separao de protenas
menor capacidade de resoluo, porm apresenta maior extenso de separao. Longos fragmentos de DNA (50-20.000 bp)