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Licenciatura Licenciatura em em Enfermagem Enfermagem - - ESEC ESEC Bioquímica Bioquímica e e Biofísica

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BioquímicaBioquímica ee BiofísicaBiofísica

- - ESEC ESEC Bioquímica Bioquímica e e Biofísica Biofísica DNA DNA & & RNA RNA

DNADNA

&&

RNARNA

AC Santos - 2008/2009

DNA é Material Genético?

Griffith, 1928

- injectou ratinhos com a estirpe S de pneumococcus => morriam

- ratinhos injectados com a estirpe R sobreviviam

=> extractos da estirpe S transformam a estirpe R na estirpe virulenta S = teste potencial para material genético

extractos da estirpe S transformam a estirpe R na estirpe virulenta S = teste potencial para

Avery, MacLeod e McCarty, 1944

- usaram extractos purificados da estirpe S para caracterizar o princípio

da transformação

- o material era resistente a proteases; não continha lípidos nem açúcares

- se o DNA no extracto for destruído perde-se o “princípio transformador”

- DNA puro isolado do extracto da estirpe S transforma a estirpe R => Avery sugeriu que o DNA era o material genético

puro isolado do extracto da estirpe S transforma a estirpe R => Avery sugeriu que o

Confirmação por Hershey e Chase, 1952

- durante a infecção genes virusais entram na célula hospedeira levando à produção de novos vírus

- vírus marcados com isótopos radioactivos => proteínasproteínas marcadas com 35 S e DNADNA marcado com 32 P

- o bacteriófago T2 (vírus) foi misturado com bactérias e depois colocado num misturador para retirar os vírus da célula

- as bactérias foram depois separadas dos vírus por centrifugação

- só o DNA radioactivo entra nas bactérias

- só o DNA radioactivo entra nas bactérias Martha Chase e Alfred Hershey, 1952 Conclusão :
- só o DNA radioactivo entra nas bactérias Martha Chase e Alfred Hershey, 1952 Conclusão :

Martha Chase e Alfred Hershey, 1952

Conclusão: o DNA é o material genético! Uma vez aceite esta ideia como verdade científica foi preciso explicar como podia uma simples molécula de DNA representar a nossa informação genética…

Estrutura do DNA - WH Bragg e WL Bragg (pai e filho), inventaram em 1912
Estrutura do DNA - WH Bragg e WL Bragg (pai e filho), inventaram em 1912

Estrutura do DNA

- WH Bragg e WL Bragg (pai e filho),

inventaram em 1912 a cristalografia. O Inglaterra era o centro desta técnica no séc. XX e WL Bragg era o director da Medical Research Division dos Cavendish Laboratories de Cambridge em 1950.

Division dos Cavendish Laboratories de Cambridge em 1950. - Rosalind Franklin (King’s College) =>

- Rosalind Franklin (King’s College) => cristalografia de raios X do DNA

- Chargaff (1950) – concluiu que em qualquer

DNA as concentrações da adenina eram iguais às da timina e as de guanina eram iguais às de citosina = regrasregras dede ChargaffChargaff.

eram iguais às da timina e as de guanina eram iguais às de citosina = regras
eram iguais às da timina e as de guanina eram iguais às de citosina = regras

Estrutura do DNA (cont.)

Modelo de Watson and Crick (1953) -

baseado na informação de Franklin e Chargaff 2 conjuntos de pares de bases foram conjugados numa dupla hélice

de pares de bases foram conjugados numa dupla hélice Fosfatos e desoxiribose são dispostos como um

Fosfatos e desoxiribose são dispostos como um esqueleto com o carbono 3' de um açúcar ligado através de uma ligação fosfodiéster ao carbono 5' do açúcar seguinte.

o carbono 3' de um açúcar ligado através de uma ligação fosfodiéster ao carbono 5' do
o carbono 3' de um açúcar ligado através de uma ligação fosfodiéster ao carbono 5' do

Estrutura do DNA

As bases são como degraus de uma escada, com a Adenina ligada à Timina e a Guanina à Citosina. O espaçamento do monómero é de 0,34 nm; o passo de volta helicoidal é 3,4 nm (10 pares de bases). As duas cadeias de DNA da dupla hélice são antiparalelas.

duas cadeias de DNA da dupla hélice são antiparalelas . A replicação do DNA e a

A replicação do DNA e a transcrição do RNA só ocorrem na direcção 5' => 3' .

são antiparalelas . A replicação do DNA e a transcrição do RNA só ocorrem na direcção

Histones são as proteínas principais da cromatina. Actuam como “molas” em torno do DNA e desempenham um papel na regulação dos genes.

do DNA e desempenham um papel na regulação dos genes. Conhecem-se 6 classes de histonas :

Conhecem-se 6 classes de histonas :

H1 (por vezes chamada histona conectora ou H5)

H2A

H2B

H3

H4

Histonas primitivas As histonas H2A, H2B, H3 e H4 são designadas core histones, juntam-se para formar o nucleosoma (centro da partícula octamérica) envolvendo 146 pares de bases do DNA à volta da “mola” proteica em 1,65 super-hélices de enrolamento levógiro. A histona espaçadora H1 liga o nucleosoma aos locais de entrada e saída do DNA, bloqueando o DNA no seu lugar e permitindo a formação de estruturas + complexas. Durante a meiose, através da combinação de interacções do nucleosoma com outras proteínas, o cromosoma é montado. As histonas + o DNA designam-se cromatina.

Replicação do DNA

Meselson e Stahl em 1957 obtiveram dados experimentais que evidenciavam que a cadeia de DNA servia como molde para uma nova síntese, processo designado por replicação semi-conservativa.

Colocaram E. coli a crescer com 15 N (isótopo pesado). Mudaram para 14 N (isótopo leve) e após 1, 2 e 3 gerações retiraram amostras de DNA Misturaram depois com cloreto de césio e separaram o DNA “leve” e o “pesado”.

retiraram amostras de DNA Misturaram depois com cloreto de césio e separaram o DNA “leve” e

O DNA de densidade leve, pesada e intermédia pode ser separado por centrifugação.

pesada e intermédia pode ser separado por centrifugação. Resultados da experiência Conclusões Os resultados mostram

Resultados da experiência

ser separado por centrifugação. Resultados da experiência Conclusões Os resultados mostram que após 1 geração a

Conclusões Os resultados mostram que após 1 geração a dupla hélice de DNA é 1/2 pesada (da molécula mãe) e 1/2 leve (sintetizada de novo). Este resultado é previsto pela replicação semiconservativa. Tal como o previsto por Watson e Crick as cadeias de DNA servem como molde pra a sua própria replicação.

Replicação do DNA O molde de DNA com síntese da nova cadeia ocorre na direcção

Replicação do DNA

O molde de DNA com síntese da nova cadeia ocorre na direcção 5‘

=> 3'.

O trifosfato 5' só pode ser adicionado a um 3' livre da desoxiribose.

As duas cadeias antiparalelas são replicadas em simultâneo. Usam-se primers de RNA para iniciar uma nova cadeia.

A cadeia mãe, na extremidade 3', determina a cadeia filha ou cadeia

codante na replicação contínua.

A cadeia mãe, na extremidade 5‘, produz a cadeia não codante como pequenos pedaços

de DNA (100-200 nucleótidos nos eucariotas e um pouco + maiores nos procariotas). Estes pedaços foram descobertos por Reiji Okazaki, chamando-se fragmentos de Okazak. Os primers de RNA são removidos e os fragmentos juntam-se através da ligase do DNA.

fragmentos de Okazak . Os primers de RNA são removidos e os fragmentos juntam-se através da
fragmentos de Okazak . Os primers de RNA são removidos e os fragmentos juntam-se através da

Conclusões

A estrutura do DNA prediz que a sequência de bases determina a replicação

do DNA. Se a sequência contém informação, então as bases A,T,G, e C têm de algum modo de determinar a sequência de aa nas proteínas.

Mutações no DNA são devidas a alterações na sequência das bases.

Será que os genes especificam sequências de aa nas proteínas?

As sequências de bases no DNA são

convertidas a RNA através da Transcrição.

no DNA são convertidas a RNA através da Transcriç ão . Os genes determinam o fenótipo

Os genes determinam o fenótipo através da

síntese das proteínas.

A teoria de Garrard da existência de

enzimas determinantes de genes foi

continuada por Beadle e Tatum estudando mutantes em Neurospora crassa (bolor do pão) (1940's).

O tipo selvagem cresce em meio pobre.

Usando raios X, que causam quebras do DNA e mutações, produzem-se alguns mutantes sobreviventes (auxotró-ficos) que crescem em meios ricos mas não em meios pobres.

Conclusões Nutrientes adicionados, tais como aa ou vit, podem fazer crescer os auxotrofos. Mutações no

Conclusões Nutrientes adicionados, tais como aa ou vit, podem fazer crescer os auxotrofos. Mutações no DNA causam perca de enzimas que codificam genes.

TEORIA - a função de 1 gene é controlar a produção de 1 enzima específica.

Dogma Central da Biologia Molecular DNA codifica a produção de DNA (replicação) e de RNA (transcrição). RNA codifica a produção de proteínas (translação). A informação genética é armazenada sob forma de mensagem linear nos ác. nucleicos.

Notação para escrever uma sequência de DNA:

5'-AGTCAATGCAAGTTCCATGCAT

1 gene determina a sequência de aa nas proteínas. Usam-se abreviaturas para escrever a sequência de uma proteína :

NH2-Met-Gln-Cys-Lys-Phe-Met-His

(ou 1 letra do código: M Q C K F M H)

Vírus de RNA Alguns vírus usam RNA em vez de DNA como material genético. 1 grupo de vírus de RNA, designados retrovírus, convertem RNA de novo em DNA. Vírus de RNA fazem muitos erros na replicação da informação genética. Isto significa que alguns vírus como o HIV (SIDA) se alteram muito rapidamente, o que torna difícil a produção de uma vacina.

Transcrição Síntese de RNA a partir de um molde de DNA.

Requer 1 polimerase RNA dependente de DNA + os 4 nucleótidos (ATP, GTP. CTP e UTP).

A síntese começa num local de iniciação no DNA.

A cadeia molde é lida de 3' => 5' e o mRNA é sintetizado de 5' => 3‘.

local de iniciação no DNA. A cadeia molde é lida de 3' => 5' e o
local de iniciação no DNA. A cadeia molde é lida de 3' => 5' e o

Tipos de RNA

mRNA - RNA mensageiro. Molde para síntese de proteínas. tRNA - RNA de transferência. A molécula "adaptadora" que converte a sequência de ác. nucleico em sequência proteica. rRNA - RNA ribosómico. Molécula estrutural e catalítica do ribosoma.

A síntese proteica requer mRNA, tRNA e ribosomas, além de 1 fonte de energia e factores proteicos.

do ribosoma. A síntese proteica requer mRNA, tRNA e ribosomas, além de 1 fonte de energia

O RNA pode existir ainda como:

snRNA (small stable RNA) – nas células eucariotas existem com ribonucleoproteínas e estão distribuídos no núcleo, citoplasma ou ambos. hnRNA – RNA nuclear heterogéneo. Nas células dos mamíferos os mRNA presentes no citoplasma não são imediatamente sintetizados a partir do molde de DNA mas sim formados por 1 precursor antes de entrar no citoplasma. snurps (small nuclear ribonucleoprotein particles) – poderão estar envolvidos na regulação de 1 gene, na produção das extremidades 3´corretas das histonas do mRNA.

RNA de transferência

A informação genética do mRNA está na forma de sequências de 3 letras chamadas codões. tRNA contém o anticodão, uma sequência de bases que é complementar para o seu codão.

Existe pelo menos um tRNA para cada aa. tRNAs têm de ser “carregados” com aa específicos por aminoacil-tRNA sintetases. A reacção requer energia da hidrólise do ATP, crucial na correcta conversão da sequência do ác. nucleico na sequência do aa.

Tradução: processo com 3 etapas

Iniciação Formação do complexo de iniciaçao entre o mRNA, tRNA “carregado” e o ribosoma. A tradução começa com um codão específico: o codão de iniciação (AUG).

o mRNA, tRNA “carregado” e o ribosoma. A tradução começa com um codão específico: o codão
o mRNA, tRNA “carregado” e o ribosoma. A tradução começa com um codão específico: o codão

Alongamento

A cadeia polipeptídica crescente é ligada a 1 aa no local P. O próximo codão

a ser lido está presente sob o local A.

O tRNA que tem o aa seguinte entra no local A.

Forma-se 1 lig. peptídica entre o novo aa e a cadeia crescente, transferindo-a para o tRNA no local A. O ribosoma move-se 1 codão, levando o peptídeo-tRNA para o local P e o ciclo repete-se.

o peptídeo-tRNA para o local P e o ciclo repete-se. Mais de 1 ribosoma pode estar

Mais de 1 ribosoma pode estar envolvido na tradução de uma dada molécula de mRNA. O complexo chama-se polisoma.

Retículo endoplasmático - produz membranas celulares, proteínas membranares e proteínas para secreção. RER coberto por polisomas. O RE representa 1 série de cisternas ou canais dentro da célula. Ribosomas citoplasmáticos ligam-se ao mRNA e começam a síntese de proteínas. Estas proteínas são destinadas à secreção ou a localização membranar; incluem 1 "sequência de sinal" que liga a "docking sites" na superfície do RE. Durate a síntese, a proteína passa para dentro das cisternas no RE. A entrada no RER sequestra a proteína do resto da célula e torna-a acessível a 1 sistema que inclui vesículas de transporte e ao Ap. de Golgi para modificação e localização em sites dentro deste sistema ou para secreção para fora da célula.

Ap. de Golgi para modificação e localização em sites dentro deste sistema ou para secreção para

O código genético baseia-se em conjuntos de bases de DNA.

Como pode 1 alfabeto só com 4 letras (A, T, C, G) ser traduzido para proteínas com 20 aa? Só existem 4 bases para os 20 aa. 1 código de 2 nucleótidos pode especificar apenas 16 aa diferentes (4 x 4 = 16 combinações possíveis). Grupos de 3 nucleótidos seriam suficientes (4 x 4 x 4 = 64 combinações possíveis).

Decifrando o código genético

Nirenberg e Matthaei Desenvolveram 1 mét para síntese proteica in vitro com adição de mRNA. Lab Khorana e Nirenberg sintetizaram polímeros de RNA. Poly "U" ou UUUUUUUUUUU codifica para 1 proteína contendo só fenilalanina. Poly "CA" codifica para polipeptídeos que alternam histidina-treonina. Poly "CAA" codifica para 3 polipeptídeos; poliglutamina, politreonina ou poliasparagina. A determinação completa do código obteve-se quando se observou que 1 aa- tRNA só ligava a código sintético na presença de ribosomas.

O código genético Tripletos são como palavras de código, não são sobreponíveis. - Degenerado (+

O código genético

Tripletos são como palavras de código, não são sobreponíveis.

- Degenerado (+ do que 1 tripleto codifica para alguns aa) mas não ambíguo (cada palavra de código especifica só 1 aa).

- Universal – todos os organismos (excepto algumas mitocôndrias). AUG - metionina e o código começa UAA, UAG, UGA – codões de stop