19/12/2013

1
Enzimas
Nilson Penha-Silva
Professor
Universidade Federal de Uberlndia
Instituto de Gentica e Bioqumica
Laboratrio de Biofisicoqumica
Ao Professor Edyr Rogana
Ao Professor Marcos Mares-Guia (In memorian)
19/12/2013
2
Importncia
As isoenzimas da lactato desidrogenase
Conceitos iniciais
A natureza geral das enzimas
Catalisadores
biolgicos
Enzimas Abzimas Ribozimas
19/12/2013
3
Conceitos iniciais:
Velocidade de reao
Numa reao em que:




a velocidade da reao ser dada por:



dt
dP
dt
dS
v = =
P S
Conceitos iniciais
Equilbrio e espontaneidade de reaes
S P









K
eq
G Sentido da reao
> 1 - Direto
= 1 0 Equilbrio
< 1 + Reverso

19/12/2013
4
Conceitos iniciais
Ao catalisadora
As enzimas aumentam a velocidade,
mas no o equilbrio
das reaes das quais participam,
sem serem consumidas no processo.

Ao catalisadora
A teoria do estado de transio
19/12/2013
5
Ao catalisadora
A teoria do estado de transio
Centro ou stio ativo
Definio

19/12/2013
6
Centro ou stio ativo
Composio
Stio de especificidade
Stios de ligao (binding sites) primrios
Stios de ligao (binding sites) secundrios

Stio cataltico
Centro ou stio ativo
Stio de especificidade

19/12/2013
7
Centro ou stio ativo
Stio cataltico

Especificidade de ao
Por grupos qumicos

19/12/2013
8














D-Malato Maleato
Especificidade de ao
Estereoespecificidade
Formao de complexo enzima-substrato
Equilbrio (de estado estacionrio) de Briggs-Haldane
19/12/2013
9
Formao de complexo enzima-substrato
Enzima complementar ao substrato (modelo chave-fechadura)
Formao de complexo enzima-substrato
Enzima complementar ao estado de transio
19/12/2013
10
Atividade enzimtica:
Conceito
Unidade Internacional

1 UI a quantidade de enzima capaz de converter 1 mol de substrato
em produto por minuto.


Katal

1 Katal a quantidade de enzima capaz de converter um mol de
substrato em produto por segundo.
Atividade enzimtica
Conceito
Atividade especfica

Unidade de atividade por massa (mg) de protena.




Turnover number

Nmero de molculas de S convertidas em P por 1 molcula de enzima por
minuto.
19/12/2013
11
Fatores que afetam as reaes enzimticas:
1- Concentrao da enzima
Fatores que afetam as reaes enzimticas:
2- Concentrao do substrato
19/12/2013
12
Fatores que afetam as reaes enzimticas:
3- pH
Fatores que afetam as reaes enzimticas:
4- Temperatura
19/12/2013
13
Fatores que afetam as reaes enzimticas:
5- Presso
PV = nRT
P = Presso
V = Volume
n = Nmero de mol de molculas
R = Constante universal dos gases (1,987 cal/K.mol)
T = Temperatura absoluta (K)
Fatores que afetam as reaes enzimticas:
6- Constante dieltrica do meio
A fora de atrao (F) entre duas cargas opostas (q1 e q2)
dada por:



onde D a constante dieltrica do meio e r a distncia
entre as cargas.
2
2 1
r
q q
D F =
19/12/2013
14
Enzimas
Nilson Penha-Silva
Professor
Universidade Federal de Uberlndia
Instituto de Gentica e Bioqumica
Laboratrio de Biofisicoqumica
Quanto ao nmero de subunidades
1. Monomricas
2. Oligomricas
Classificao
Quanto ao nmero de subunidades
19/12/2013
15
Quanto composio
1. Simples
2. Conjugadas (holoenzima)
1. Poro protica (apoenzima)
2. Poro no-protica (grupo prosttico)
1. Cofator
2. Coenzima
Classificao
Quanto composio
Cofatores
Inorgnicos
Elemento Funes Deficincia Excesso
Cobalto Mutases
(Desoxiadenosilcobalamina)
Acidose metilmalnica
Anemia megaloblstica
Cobre Oxidases (citocromos) Anemia hipocrmica
Ferro Oxidases (citocromos) Anemia hipocrmica Siderose
Magnsio Quinases Astenia
Mangans Hidrolases
Descarboxilases
Superxido-dismutase
Parkinson Psicose
Parkinson
Molibdnio Oxidases (xantina-oxidase)
Selnio Glutation peroxidase Enrijecimento de membranas
Exacerbao da autoimunidade
Dermatite
Irritabilidade
Zinco Anidrase carbnica
Carboxipeptidase
Desidrogenases
DNA polimerase
Fosfatase alcalina
Hipogonadismo
Deficincia de crescimento
Deficincia na cicatrizao
Deficincia na sensao de sabor e odor
19/12/2013
16
Coenzimas
Produzidas a partir de vitaminas
Vitamina Coenzima Ao Enzimas Deficincia
cido ascrbico cido ascrbico Hidroxilao
Antioxidante
Hidroxilases Depresso
Despigmentao
cido flico Tetrahidrofolato Metilao Metil-transferases Anemia megaloblstica
Depresso
Cianocobalamina Desoxiadenosil-
cobalamina
Mudana de grupos Mutases Anemia megaloblstica
Depresso
Acidose metilmalnica
cido pantotnico Coenzima A Transferncia de acila Acil-transferases Cetoacidose
Biotina Biotinil-lisina Carboxilao Carboxilases Acidose propinica
Niacina NAD
+
/NADH
NADP
+
/NADPH
Oxirreduo Desidrogenases Pelagra
Riboflavina FMN/FMNH
2
FAD/FADH
2
Oxirreduo Desidrogenases Queilose
Piridoxina Piridoxal-
Piridoxamina-
Transaminao Amino-transferases
Glicognio-fosforilase
Hipoglicemia
Tiamina Tiamina-pirofosfato Descarboxilao Piruvato-desidrogenase Beribri
Classificao
Quanto natureza da reao catalisada
# Classe Tipo de reao Exemplo
1 Oxidorredutases xido-reduo Lactato desidrogenase
2 Transferases Transferncia de grupos Aspartato aminotransferase
3 Hidrolases Hidrlise Quimotripsina
4 Liases Remoo de grupos com
formao de ligao dupla
e vice-versa
Fumarase
5 Isomerases Isomerizao Triose-fosfato isomerase
6 Ligases Ligao de dois substratos
custa de hidrlise de NTP
Propionil-CoA carboxilase
19/12/2013
17
Classificao
Quanto natureza da reao catalisada
# Classe Tipo de reao Exemplo
1 Oxidorredutases xido-reduo Lactato desidrogenase
2 Transferases Transferncia de grupos Aspartato aminotransferase
3 Hidrolases Hidrlise Quimotripsina
4 Liases Remoo de grupos com
formao de ligao dupla
e vice-versa
Fumarase
5 Isomerases Isomerizao Triose-fosfato isomerase
6 Ligases Ligao de dois substratos
custa de hidrlise de NTP
Propionil-CoA carboxilase
Classificao
Quanto natureza da reao catalisada
# Classe Tipo de reao Exemplo
1 Oxidorredutases xido-reduo Lactato desidrogenase
2 Transferases Transferncia de grupos Aspartato aminotransferase
3 Hidrolases Hidrlise Quimotripsina
4 Liases Remoo de grupos com
formao de ligao dupla
e vice-versa
Fumarase
5 Isomerases Isomerizao Triose-fosfato isomerase
6 Ligases Ligao de dois substratos
custa de hidrlise de NTP
Propionil-CoA carboxilase
19/12/2013
18
Classificao
Quanto natureza da reao catalisada
# Classe Tipo de reao Exemplo
1 Oxidorredutases xido-reduo Lactato desidrogenase
2 Transferases Transferncia de grupos Aspartato aminotransferase
3 Hidrolases Hidrlise Quimotripsina
4 Liases Remoo de grupos com
formao de ligao dupla
e vice-versa
Fumarase
5 Isomerases Isomerizao Triose-fosfato isomerase
6 Ligases Ligao de dois substratos
custa de hidrlise de NTP
Propionil-CoA carboxilase
Classificao
Quanto natureza da reao catalisada
# Classe Tipo de reao Exemplo
1 Oxidorredutases xido-reduo Lactato desidrogenase
2 Transferases Transferncia de grupos Aspartato aminotransferase
3 Hidrolases Hidrlise Quimotripsina
4 Liases Remoo de grupos com
formao de ligao dupla
e vice-versa
Fumarase
5 Isomerases Isomerizao Triose-fosfato isomerase
6 Ligases Ligao de dois substratos
custa de hidrlise de NTP
Propionil-CoA carboxilase
19/12/2013
19
Classificao
Quanto natureza da reao catalisada
# Classe Tipo de reao Exemplo
1 Oxidorredutases xido-reduo Lactato desidrogenase
2 Transferases Transferncia de grupos Aspartato aminotransferase
3 Hidrolases Hidrlise Quimotripsina
4 Liases Remoo de grupos com
formao de ligao dupla
e vice-versa
Fumarase
5 Isomerases Isomerizao Triose-fosfato isomerase
6 Ligases Ligao de dois substratos
custa de hidrlise de NTP
Propionil-CoA carboxilase
Classificao internacional das enzimas:
Subclasses
Oxidorredutases Transferases Hidrolases Liases Isomerases Ligases
Desidrogenases
Redutases
Oxidases
Peroxidases
Catalases
Oxigenases
Hidroxilases
Trans-cetolase
Trans-aldolase
Acil-transferases
Metil-transferases
Uridilil-transferases
Fosforil-transferases
Quinases
Fosfomutases

Amidases
Peptidases
Esterases
Fosfolipases
Glicosidases
Fosfatases
Tiolases
Desaminases
Ribonucleases
Descarboxilases
Aldolases
Hidratases
Desidratases
Sintases
Liases

Racemases
Epimerases
Isomerases
Mutases

Sintetases
Carboxilases

19/12/2013
20
Identificao internacional das enzimas:
EC W.X.Y.Z
EC Sistema numrico da Comisso de Enzimas (CE) da
Unio Internacional de Bioqumica (UIB)
W Indica a classe da reao catalisada (1-6)
X Indica o substrato geral ou grupo envolvido
Y Indica o substrato especfico ou a coenzima
Z Nmero de srie da enzima
19/12/2013
21
Tripsina: EC 3.4.21.4
Identificao internacional das enzimas:
EC W.X.Y.Z
A cintica enzimtica de Michaelis-Menten:
O grfico
S K
S V
v
M
mx
+
=
19/12/2013
22
A cintica enzimtica de Michaelis-Menten:
Afinidade do complexo ES
1
cat 1 -
M
k
k k
K
+
+
=

reacional afinidade
1
K
M
Determinao de V
mx
e K
M
:

Mtodos analticos
Mtodo Y X
Michaelis-Menten v S
Lineweaver-Burk 1/v 1/S
Hanes-Woolf S/v S
Eadie-Hofstee v v/S
Eadie-Scatchard v/S v
Merino v S
Cornish-Bowden v S
19/12/2013
23
Mtodo de Michaelis-Menten:
Determinao de V
mx
e K
M
M
M
M
M
max max
M
max
K S
S K 2S
S K
S
2
1
S K
S V
2
V
S K
S V
v
=
+ =
+
=
+
=
+
=
Determinao de V
mx
e K
M
:

Mtodos analticos
Mtodo Y X
Michaelis-Menten v S
Lineweaver-Burk 1/v 1/S
Hanes-Woolf S/v S
Eadie-Hofstee v v/S
Eadie-Scatchard v/S v
Merino v S
Cornish-Bowden v S
19/12/2013
24
Mtodo de Lineweaver-Burk:
Determinao de V
mx
e K
M
A equao de Michaelis-Menten,




pode ser linearizada,


pela sua forma dupla-recproca,




que constitui a equao de Lineweaver-
Burk.
Quando 1/v zero, tem-se que:
S K
S V
v
M
mx
+
=
mx. mx.
M
V
1
S
1
V
K
v
1
+ =
b ax y + =
mx. mx.
M
V
1
S
1
V
K
0 + =
mx. mx.
M
V
1
S
1
V
K
=
M
K
1
S
1
=
Mtodo de Lineweaver-Burk:
Determinao de V
mx
e K
M
19/12/2013
25
Inibidores de atividade enzimtica
Importncia
Pesquisa sobre as caractersticas do centro ativo das
enzimas
Pesquisa de vias metablicas
Compreenso do mecanismo de ao de frmacos
Pesquisa de novos frmacos
Farmacoteraputica
Inibidores
Classificao
Reversvel
Competitiva
No-competitiva
Acompetitiva
Irreversvel
19/12/2013
26
Inibio competitiva:
Conceito
Inibio competitiva:
Exemplo: ao do malonato sobre a succinato-desidrogenase
19/12/2013
27
Inibio competitiva:
Exemplo: ao da sulfanilamida sobre a sntese de folato
Inibio competitiva:
Equilbrio de Briggs-Haldane
k
1
k
-1
k
2
M M'
app
M
K K K > =
1
2 1
M
k
k k
K
+
=

19/12/2013
28
|
|
.
|

\
|
+ =
i
M M
K
I
1 K K
a p p
: onde
Inibio competitiva:
Mtodo de Michaelis-Menten
S K
S V
v
app
M
mx
+
=
Inibio competitiva:
Mtodo de Lineweaver-Burk

Michaelis-Menten:


Lineweaver-Burk:
mx mx
M
V
1
S
1
V
K
v
1
app
+ =
S K
S V
v
app M
mx
+
=
M
K
1

app
M
K
1

mx.
V
1
19/12/2013
29
Inibio no-competitiva:
Conceito
Inibio no-competitiva:
Equilbrio de Briggs-Haldane
mx
app
mx
V V <
k
1
k
-1
k
2
19/12/2013
30
Inibio no-competitiva:
Mtodo de Michaelis-Menten
S K
S V
v
M
app
mx
+
=
app app
mx mx
M
V
1
S
1
V
K
=
Inibio no-competitiva:
Mtodo de Lineweaver-Burk
S K
S V
v
M
app
+
=
max
app app
mx mx
M
V
1
S
1
V
K
v
1
+ =
= 0
v
1
M
K
1
S
1
=
M
K
1

mx.
V
1
app
mx.
V
1
19/12/2013
31
Inibio irreversvel
Equilbrio de Briggs-Haldane
Inibio irreversvel:
Exemplos
19/12/2013
32
Inibio irreversvel:
Exemplos
Inibio irreversvel:
Exemplos
19/12/2013
33
Inibio irreversvel:
Exemplos

Ao reguladora
Conceito
C D E
F
G
A B
E
1
E
2
E
3
E
4
E
5
E
6
H
E
4
()
()
Inibio por feed-back
Inibio pelo produto
Ativao
pelo substrato
(+)
()
Inibio por feed-back
19/12/2013
34
o tipo de regulao fundamentado na
ao de regies da enzima chamadas de
stios alostricos, existentes apenas
em algumas enzimas que, alm de fazer
catlise, tambm regulam a velocidade
de suas reaes.

Um stio alostrico uma outra
(allos) regio ou espao (stereo)
da enzima, alm do centro ativo.

O stio alostrico modulado por
substncias chamadas de efetores
alostricos.
Regulao alostrica:
Conceito
o tipo de regulao fundamentado na
ao de regies da enzima chamadas de
stios alostricos, existentes apenas
em algumas enzimas que, alm de fazer
catlise, tambm regulam a velocidade
de suas reaes.

Um stio alostrico uma outra
(allos) regio ou espao (stereo)
da enzima, alm do centro ativo.

O stio alostrico modulado por
substncias chamadas de efetores
alostricos.
Regulao alostrica:
Conceito
19/12/2013
35
o tipo de regulao fundamentado na
ao de regies da enzima chamadas de
stios alostricos, existentes apenas
em algumas enzimas que, alm de fazer
catlise, tambm regulam a velocidade
de suas reaes.

Um stio alostrico uma outra
(allos) regio ou espao (stereo)
da enzima, alm do centro ativo.

O stio alostrico modulado por
substncias chamadas de efetores
alostricos.
Regulao alostrica:
Conceito
Conceito

Classificao quanto estrutura:
1-Homotrpicos
2-Heterotrpicos

Classificao quanto ao efeito:
1-Positivos (ativao)
2-Negativos (inibio)
Regulao alostrica:
Efetores alostricos
19/12/2013
36
Conceito

Classificao quanto estrutura:
1-Homotrpicos
2-Heterotrpicos

Classificao quanto ao efeito:
1-Positivos (ativao)
2-Negativos (inibio)
Regulao alostrica:
Efetores alostricos
Conceito

Classificao quanto estrutura:
1-Homotrpicos
2-Heterotrpicos

Classificao quanto ao efeito:
1-Positivos (ativao)
2-Negativos (inibio)
Regulao alostrica:
Efetores alostricos
19/12/2013
37
Regulao alostrica:
Modelo TR
Regulao alostrica
Grficos de v x S de enzimas alostricas
v
2
V
max
V
max
19/12/2013
38
Regulao alostrica
Equao matemtica de Hill
Forma trivial


Forma cannica



Forma linearizada
K log S log n
v V
v
log =

n
n
S K
VS
v
+
=
K
1
S
v - V
v
v)S (V vS VS vK
VS vS vK
n
n n n
n n
=
= =
= +
Regulao covalente:
Conceito
Regulao da atividade enzimtica pela
quebra ou unio de grupos enzima,
Com ativao e/ou inibio da atividade
enzimtica.
19/12/2013
39
Modificao Modificante Modificado Funo
Fosforilao ATP Glicognio-fosforilase Catabolismo do glicognio
Acetilao Acetil-CoA Histona Transcrio
Miristilao Miristil-CoA Src Transduo de sinal
ADP-ribosilao NAD RNA polimerase Transcrio
Farnesilao Farnesil-PP Ras Transduo de sinal
-Carboxilao HCO
3
-
Trombina Coagulao do sangue
Sulfatao 3-P-Adenosina-5-P-Sulfato Fibrinognio Coagulao do sangue
Ubiqitinao Ubiqitina Ciclina Controle do ciclo celular
Uridilao UTP Glutamina-sintetase Metabolismo de aminocidos
Protelise Protease Zimognio Diversos
Regulao covalente:
Exemplos
Bioenergtica
Nilson Penha-Silva
Professor
Universidade Federal de Uberlndia
Instituto de Gentica e Bioqumica
Laboratrio de Biofisicoqumica
19/12/2013
40
Agora, na segunda lei da termodinmica...
Bioenergtica e Metabolismo

19/12/2013
41
Energia
Unidades de medida da energia
Caloria (cal): quantidade de energia necessria
para elevar a temperatura de 1 g de gua de 14,5
para 15,5 C a 1 atm de presso

Joule (J): trabalho feito quando a fora de 1
Newton avana por 1 metro

1 cal = 4,184 J
Conceitos termodinmicos fundamentais
Energia livre, entalpia e entropia
Energia livre de Gibbs (G)
Energia til a p e T constantes
Unidade: cal/mol ou J/mol

Entalpia (H)
Contedo de calor
Unidade: cal/mol ou J/mol

Entropia (S)
Manifestao da desordem
Unidade: cal/mol.K ou J/mol.K
19/12/2013
42
Conceitos termodinmicos fundamentais
Entropia em sistemas biolgicos
Conceitos termodinmicos fundamentais
Entropia informacional
19/12/2013
43
Espontaneidade e equilbrio de reaes
A segunda lei da termodinmica
Todas as transformaes fsicas e qumicas
tendem a ocorrer na direo em que a energia til
irreversivelmente convertida em uma forma
desordenada de energia chamada de entropia.

Essas transformaes chegam ao fim em um ponto
de equilbrio em que a entropia gerada a mxima
possvel sob as condies existentes.
Espontaneidade e equilbrio de reaes
K
eq
, G, equilbrio e espontaneidade de reaes
aA + bB cC + dD
K
eq
G Sentido da reao
> 1 - Direto
= 1 0 Equilbrio
< 1 + Reverso
19/12/2013
44
Espontaneidade e equilbrio de reaes
K
eq
, G, G, equilbrio e espontaneidade de reaes
aA + bB cC + dD
b a
d c
B A
D C
RT G G
] [ ] [
] [ ] [
l n ' ' + A = A
Espontaneidade e equilbrio de reaes
G de hidrlise de vrios compostos de nosso organismo
19/12/2013
45
Espontaneidade e equilbrio de reaes
G de hidrlise de vrios compostos de nosso organismo
Espontaneidade e equilbrio de reaes
Aditividade de valores de G de reaes
19/12/2013
46
Espontaneidade e equilbrio de reaes
O ATP como intermedirio comum
B
i
o
e
n
e
r
g

t
i
c
a

M
e
t
a
b
o
l
i
s
m
o

19/12/2013
47
O ciclo do cido ctrico
Reaes
19/12/2013
48
O ciclo do cido ctrico
Anaplerose
O ciclo do cido ctrico
Uma via anfiblica
19/12/2013
49
A cadeia de transporte de eltrons
A via final do catabolismo energtico aerbico
A cadeia de transporte de eltrons
A via final do catabolismo energtico aerbico
19/12/2013
50
A cadeia de transporte de eltrons
Como uma escada de eltrons
A cadeia de transporte de eltrons
A via final do catabolismo energtico aerbico
19/12/2013
51
A cadeia de transporte de eltrons
A via final do catabolismo energtico aerbico
A cadeia de transporte de eltrons
A via final do catabolismo energtico aerbico
19/12/2013
52
A cadeia de transporte de eltrons
A via final do catabolismo energtico aerbico
Este no pode ser o


Fim

A histria deve continuar...