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Prá ticá Láborátoriál 5 Reações características dos glícidos Trabalho Realizado Por: Beatriz Lopes Dias Vieira da

Prá ticá Láborátoriál 5

Reações características dos glícidos

Trabalho Realizado Por:

Beatriz Lopes Dias Vieira da Silva 45517 Cláudia Filipa Abreu Miranda-44813 Hugo Daniel dos Santos Videira-44804

Sumário

Índice

  • 1. Resumo ......................................................................................................................................

3

  • 2. Apresentação, Tratamento e Discussão dos Resultados

..........................................................

4

 

2.1.

Testes de identificação de glícidos .....................................................................................

4

2.2. Doseamento de glícidos redutores numa farinha alimentar

7

Reação do método do dinitrosalicilato

8

 

Cálculo da concentração de glucose

9

  • 3. Bibliografia

11

Lehninger Principles of Biochemistry, 6th Edition David L. Nelson, Michael M. Cox,

Macmillan, International Edition, 2013

.......................................................................................

11

 
  • 4. Questões a desenvolver

11

1. Resumo

2. Apresentação, Tratamento e Discussão dos Resultados

2.1. Testes de identificação de glícidos

  • 2.1.1. Chave dicotómica de identificação de glícidos

  • 2.1.2. Quadro-resumo dos resultados obtidos.

  • 2.1.3. Discussão dos resultados obtidos

Estrutura química dos glícidos utilizados:

2. Apresentação, Tratamento e Discussão dos Resultados 2.1. Testes de identificação de glícidos 2.1.1. Chave dicotómica
2. Apresentação, Tratamento e Discussão dos Resultados 2.1. Testes de identificação de glícidos 2.1.1. Chave dicotómica
2. Apresentação, Tratamento e Discussão dos Resultados 2.1. Testes de identificação de glícidos 2.1.1. Chave dicotómica
 Amido Glucogénio (uma molécula está entre parêntesis rectos)
Amido
Glucogénio (uma molécula está
entre parêntesis rectos)

Teste Benedict

O reagente de Benedict é uma solução alcalina de CuSO 4 com Na 2 Co 3 e citrato de

sódio (Na 3 C 6 H 5 O 7 ). O ião citrato forma um complexo com o ião Cu 2+ , impedindo que este

precipite da solução sob a forma de Cu(OH) 2 (de cor azul) ou CuO (de cor preta). O Cu 2+ do

reagente de Benedict oxida os glícidos redutores presentes numa solução, originando uma

variedade de produtos ao mesmo tempo que Cu 2+ é reduzido a Cu +

.

Os glícidos que contêm grupos hemiacetálicos estão em equilíbrio na forma de um

agente redutor muito activo enodiol. A sua presença garante a redução dos iões Cu 2+ a

Cu + levando a formação de hidróxido cuproso que por aquecimento se transforma em

óxido cuproso que se identifica por ser insolúvel e de cor vermelha. Para umm glícido ser

redutor a extremidade do carbono anomérico (C1 para as hexoses e C2 para as pentoses)

pode estar ou não livre, ou seja, pode ou não, devido à sua reatividade, ter funções de

aldeído (capacidade que a ligação dupla tem de ceder um par de eletrões).

Foram testados sete glúcidos diferentes, sendo o tubo controlo da reação, o tubo

de ensaio contendo água destilada e reagente de Benedict. Analisando os resultados

obtidos, apenas as soluções de xilose, glucose, frutose e lactose reagiram, o que foi

possível observar pelas alterações de cor e formação de precipitado, por isso conclui-se

que são os únicos glícidos redutores.

No caso da glucose, frutose e xilose verifica-se que apresentam a extremidade do

carbono anomérico livre, o que as torna potenciais glícidos redutores, fazendo com que o

resultado da reação com o reagente de Benedict seja positivo. Verificou-se que, nessas

soluções ocorreu uma mudança de coloração do azul para laranja avermelhada, assim

como a formação de precipitado, donde se conclui que os carbonos anoméricos livres

reduziram o cobre do reagente. Estes resultados experimentais permitem afirmar que

tanto a xilose, como a glucose e a frutose são oses redutoras.

Observou-se, também, a formação de um precipitado e alteração de cor para

laranja avermelhado no tubo que continha a lactose, que é um diósido. Apesar de ser um

diósido composto por duas oses (a galactose e a glucose), a lactose é um glícido redutor,

uma vez que o carbono anomérico da glucose se encontra em condições de reduzir o

cobre do reagente (livre).

Quanto aos restantes tubos, estes tiveram reações negativas (tubos que

continham sacarose, amido e glucogénio) porque os grupos hemiacetálicos fazem parte

das ligações entre os monómeros, ficando assim indisponíveis, como no caso da sacarose

ou então os grupos redutores encontram-se no interior dos poliósidos (estrutura em

hélice) ou ocupados a fazer ligações glucosídicas ficando não reativos, no caso do amido e

do glucogénio.

Teste Benedict O reagente de Benedict é uma solução alcalina de CuSO com Na Co e

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Teste de Barfoed

As oses e os diósidos redutores têm velocidades de reação distintas quando em

contacto com o reagente de Barfoed (solução de acetato de cobre em ácido acético) pelo

que se podem distinguir por este método. A capacidade redutora de oses e diósidos é

diminuída em meio ácido ao contrário do que acontece no teste de Benedict. No entanto,

tal como no método antes referido, ocorre a oxidação das oses e o Cu 2+ é reduzido a Cu + ,

precipitando sob a forma de óxido cuproso de cor vermelha.

As mesmas sete soluções foram testadas com este método, utilizando-se

novamente como controlo negativo o tubo que continha água destilada, no entanto aqui já

foram utilizados controlos positivos, sabendo-se que as soluções que as soluções de xilose,

glucose e frutose continham oses redutoras.

Pelos resultados do Quadro , conclui-se que os resultados obtidos foram os es-

perados: resultados positivos para os tubos que continham soluções de xilose, glucose e

frutose oses redutoras (resultado do teste anterior), negativos para a lactose e a sacaro-

se diósidos, com capacidades de oxidação do grupo carboxilo do carbono onomérico

significativamente inferiores que as das oses e também negativos para o amido e o glu-

cogénio visto que os últimos dois são poliósidos, assim sendo não ocorre reação e o Cu 2+

não é reduzido.

Teste do Iodo

O Teste do Iodo permite identificar a presença de poliósidos em solução, mais

ou menos ramificados, devido à formação de um composto corado com cores diferentes

para os diferentes glícidos. Deste modo, poliósidos ramificados com hélices interrompidas

originam complexos castanhos e poliósidos muito ramificados com pequenos segmentos

helicoidais formam complexos castanho-avermelhados.

Depois de aplicado este método a todos os tubos, comprovou-se que o teste

apenas deu positivo na presença de poliósidos, o amido e o glucogénio.

Teoricamente, uma vez que tanto o amido como o glicogénio são poliósidos

ramificados, na presença do reagente KI, forma-se um complexo de iodo, conferindo à

solução uma coloração variável, de acordo com o grau de ramificação. Uma vez que o

amido é um poliósido pouco ramificado, apresenta uma coloração menos intensa do que o

glicogénio, que é um poliósido mais ramificado. Este último apresenta uma coloração mais

intensa.

É de salientar que a sacarose, que tal como o amido e o glucogénio tinha dado

resultado negativo nos outros dois testes, neste teste não obteve um resultado positivo

pois não se observou qualquer alteração, uma vez que esta é um diósido e não tem

capacidade de reagir com o iodo. Nos restantes tubos, como era esperado, obtiveram-se

resultados negativos, pois para ocorrer um resultado positivo é necessário que o glícido

apresente mais de 35 resíduos de glucose daí que com os ósidos e os diósidos se obtenha

um resultado negativo.

2.2. Doseamento de glícidos redutores numa farinha alimentar

Fluxograma comentado

Pesar 80 mg de farinha alimentar

e reduzir a pó fino com o auxílio de um almofariz

Pesar aproximadamente 50 mg de amostra e registar a massa até ao décimo de mg

Transferir o material pesado para um tubo de ensaio e adicionar

10mL de H 2 SO 4 1,5M

Aquecer o tubo de ensaio num banho de água em ebulição durante 20min na hotte, agitando de vez em quando

Arrefecer o tubo à torneira e transferir o conteúdo para um erlenmeyer de 50mL com rolha

Lavar o tubo cuidadosamente com 12mL de NaOH a 10% e transferir para o mesmo erlenmeyer

Aquecer ligeiramente o erlenmeyer e filtrar enquanto quente para um balão de 50mL

Lavar o erlenmeyer com água destilada quente e adicioná-la ao papel de filtro para transferir todo o hidrolisado

Prefazer o volume do balão até 50 mL. Agitar bem.

É necessário reduzir a farinha a pó fino para evitar a pesagem de ar que existe entre os

flocos e assim diminuir o erro experimental, e também aumentar a superfície de contacto para

faciltiar a reacção de hidrólise.

É necessário registar o valor da massa até ao décimo de mg para o cálculo mais da

quantidade de glícidos redutores que estão presentes na farinha ser feito de forma mais

rigorosa e precisa evitando assim um desvio maior relativamente ao vlaor real.

A adição de ácido sulfúrico permitiu a hidrolisação ácida de poliósidos, obtendo-se

oses redutoras. Além disso, o H 2 SO 4 desnatura as proteínas. O aquecimento deve ser feito na

hotte, porque o ácido encontra-se concentrado e com a evaporação ocorre libertação de gases

tóxicos.

A adição de NaOH neutralizar o ácidoem excesso e tornar o meio alcalino para que a

reação com DNS ocorra.

A filtração é mais rápida se a solução estiver quente, permitindo assim a recolha de

oses redutoras enquanto que os poliósidos não hidrolisados ficam retidos no papel de filtro.

Com o aquecimento o DNS é reduzido na presença de glícidos redutores e a solução

adquire uma cor castanho-avermelhada.

Reação do método do dinitrosalicilato

Em presença de um glícido redutor, o ácido 3,5dinitrosalicílico é reduzido a ácido 3-

amino-5-nitrosalicilato, por perda de 2 átomos de oxigénio ( um dos grupos NO 2 do ácido

inicial passa a NH 2 , existindo no ácido final apenas um grupo NO 2 ) e entrada de 2 hidrogénios,

à medida que os grupos aldeído do glícido redutor são oxidados a grupos carboxilo, como é

mostrado na figura (). O ácido 3-amino-5-nitrosalicilato tem uma cor castanho-avermelhada e

pode ser doseado espectrofotometricamente a 540 nm.

Prefazer o volume do balão até 50 mL. Agitar bem. É necessário reduzir a farinha a

Figura 1-Esquema da reacção química do método do dinitrosalicilato

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Cálculo da concentração de glucose

Para a realização do cálculo da concentração de glucose nos tubos de ensaio,

começou-se por calcular a concentração final dos tubos de ensaio que continham glucose a 5

mg/mL, com volumes iniciais diferentes e volume final de 25 mL.

Tubo 1

Para os restantes tubos, os cálculos foram iguais, variando só o volume inicial.

Tubo n.º

0

1

2

3

4

5

6

Concentração final

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,14

Absorvência

0,007

0,059

0,113

0,176

0,217

0,227

0,309

Tabela 1 - Registo dos valores das concentrações finais das soluções que contém Glucose 5,0 mg/mL.

Com estes valores é possível fazer a recta de calibração e depois determinar a

concentração de glucose. A absorvência do tubo 0(controlo), foi subtraída a todos os valores

de absorvência de modo a que a recta passe na origem.

Absorvência(540 nm) 0 0.1 0.12 0.02 0.08 0.16 0.06 0.14 0.04 0 y = 2.2908x +
Absorvência(540 nm)
0
0.1
0.12
0.02
0.08
0.16
0.06
0.14
0.04
0
y = 2.2908x + 0.0006
R² = 0.9482
0.25
0.35
0.2
0.3
0.05
0.15
0.1

Concentração (mg/mL)

Gráfico 1-Absorvência vs Concentração

A recta de calibração é y=2,2908x + 0,0006 sendo que y é a absorvência e x é a

concentração. A partir desta recta é possível calcular os valores de absorvência dos tubos 7,8 e

9.

Tubo 7

Abs 540 = 0,004

y=2,2908x + 0,0006 0,004 = 2,2908x + 0,0006 x = 1,48 x10 -3 mg/mL

Este valor corresponde à concentração final nos 25 mL. Mas a amostra foi diluida até perfazer

o valor de 50 mL e depois desse volume foram retirados volumes diferentes de solução aos

quais foi adicionado o reagente.

1,48 x10 -3 mg/mL

Massa de glucose na solução:

Vi=50 mL

  • 50 1,4 mg

Para os outros os tubos, os cálculos efectuados foram os mesmos. A seguir apresenta-

se um quadro com os resultados obtidos.

Tubo nº

7

8

9

Absorvência

0,004

0,006

0,008

(540nm)

Concentração

1,48 x10 -3

2,36 x10 -3

3,23 x10 -3

(mg/mL)

Volume de

1,3

1,6

2

hidrosilado (mL)

Massa de glucose (mg)

1,4

1,84

2,02

Média de concentração:

(1,48 x10 -3 +2,36 x10 -3 + 3,23 x10 -3 )/3 = 2,35 x10 -3 mg/mL

Massa média de glucose:

(1,4+ 1,84 + 2,02)/3 = 1,75 mg

Percentagem (m/m):

%(m/m) = (massa final/massa hidrosilado) x 100

  • %(m/m) = (1,75/50,2) x 100 %(m/m) = 3,49%

%(m/m) Nestum=84,7%

O rendimento desta experiência foi muito baixo. Conclui-se que houve uma série de

erros na experiência que contribuiram para um decréscimo do rendimento: erros na medição

de volumes, a hidrólise ácida pode não ter sido totalmente eficaz, a filtração também não foi

totalmente eficaz e houve perda de glúcidos na transferência do reagente de um recipiente

para o outro.

3. Bibliografia

Quintas, A., Halpern, M.J., Freire, A.P. Eds., “Bioquímica – Organização Molecular da Vida”,

Lidel, Lisboa, 2008.

Lehninger Principles of Biochemistry, 6th Edition David L. Nelson, Michael M. Cox,

Macmillan, International Edition, 2013.

4. Questões a desenvolver

4.1. A forma predominante da glucose em solução é a estrutura em anel representada pela

projeção de Haworth. Porque é que a glucose dá um resultado positivo, reagindo

completamente, nas reações características da sua forma em cadeia aberta?

A projeção de Haworth representa os glícidos na sua forma cíclica. Em solução a

glucose encontra-se predominantemente na sua forma cíclica, em anéis de cinco ou seis

carbonos que são as estruturas mais estáveis, e em menor quantidade na sua forma em cadeia

aberta ou linear, que ajuda a estabilizar as formas cíclicas.

Contudo, quando é introduzido um reagente específico para a estrutura de glucose em

cadeia aberta na solução, a glucose vai reagir completamente, perturbando o equilíbrio.

Segundo o princípio de Le Chatelier, o sistema vai evoluir no sentido de contrariar esta

perturbação e fazer aumentar a concentração de glucose em cadeia aberta.

A glucose reage completamente nas reações características da sua forma em cadeia

aberta, porque o sistema está continuamente a manter o equilíbrio das espécies no meio, ou

seja, permite que quando a concentração de glucose diminua, o sistema evolua no sentido de

formar mais glucose em cadeia aberta. Assim, toda a glucose em cadeia aberta acaba por

reagir e estas reações características são positivas.

  • 4.2. Apesar de possuírem uma extremidade redutora, o amido e o glucogénio dão um

resultado negativo nos testes de deteção de glícidos redutores. Justifique.

O amido e o glucogénio são poliósidos, ou seja são constituídos por muitos resíduos de

oses. O amido é constituído por glucose, amilose e amilopectinas. Enquanto o glucogénio é

constituído por polímeros de glucose.

O amido é constituído por amilose, que é uma macromolécula linear de estrutura

helicoidal, ou seja é constituída por resíduos de D-glucopiranose ligados entre si por ligações

glucosídicas α-1,4. A amilopectina e o glucogénio são polímeros ramificados de α-glucose

unidos por ligações glucosídicas. Contudo, o glucogénio tem uma estrutura mais ramificada do

que a amilopectina e só tem uma extremidade redutora.

A amilose, a amilopectina e o glucogénio efetuam ligações pela extremidade redutora

de cada resíduo osídico, o que significa que cada poliósido tem apenas uma extremidade

redutora, que pertence ao último resíduo. Porém, no amido, a extremidade redutora do

último resíduo está virada para dentro da molécula, no interior da hélice estrutural. Deste

modo, os agentes oxidantes não são capazes de atacar o interior da molécula, uma vez que os

grupos não redutores estão virados para fora, impedindo o contacto.

O amido e o glucogénio dão um resultado negativo no teste de Benedict de deteção de

glícidos redutores, porque a extremidade redutora está no interior da molécula e nunca chega

a estar em contacto com o (Cu²⁺), o agente oxidante.

O amido é uma molécula de grande dimensão, por isso existem muitos resíduos de

glucose que estão ligados e que não possuem uma extremidade redutora, em relação aos

resíduos que possuem essa extremidade. Se a concentração de amido e glucogénio em solução

é baixa, então não estão em solução moléculas suficientes para que o resultado do teste de

Benedict seja positivo.

  • 4.3. Como explica a obtenção de um falso resultado positivo se efetuar um aquecimento

prolongado de algumas soluções de glícidos no teste de Barfoed?

O teste de Barfoed oxida as oses através do ião (Cu²⁺) e permite a identificação de oses

numa solução e ainda a distinção entre ose e diósido. As oses e os diósidos têm uma

velocidade de reação distinta com uma solução de acetato de cobre em ácido acético. As oses

reagem mais depressa do que os diósidos.

Quando se efetua um aquecimento de um glícido ocorrem ruturas das ligações

glucosídicas, quebrando os ósidos e originando resíduos de oses mais pequenos. Nos glícidos a

extremidade redutora é responsável pela ligação glucosídica, quando esta ligação é quebrada,

a extremidade redutora fica livre em solução, podendo reagir com agentes oxidantes no teste

de Barfoed. As oses aparecem mais rapidamente que os diósidos, permitindo a sua deteção

em primeiro lugar e a presença de oses em solução constitui um resultado positivo no teste de

Barfoed.

Porém, quando se efetua um aquecimento prolongado de um glícido, os diósidos

começam a ser hidrolisados e a reagir com os iões (Cu²⁺) presentes em solução. Quando isto

ocorre obtém-se um falso positivo, pois estão a reagir diósidos quando apenas se pretendem

detetar oses. Um falso positivo torna um teste não fiável pois adultera os resultados da

experiência e neste caso, impossibilita a análise da presença ou não de oses em glícidos.

4.4. Por que foi necessário proceder à hidrólise ácida da farinha alimentar previamente à

aplicação do método do DNS?

O DNS ou 3,5-dinitrosalicilato, quando aquecido e em meio básico reage com glícidos

redutores para formar o 3-amino-5-nitrosalicilato. Este método oxida os grupos redutores dos

glícidos, tais como os aldeídos e cetonas das oses permitindo quantificar uma amostra.

A farinha alimentar é composta principalmente por amido e resíduos de glucose,

moléculas que não são redutoras e por isso não são capazes de reagir com o DNS. Para fazer a

farinha alimentar reagir com o DNS é necessário torna-la numa molécula redutora capaz de

reagir com o composto, que é oxidante. A farinha alimentar sofre uma hidrólise ácida que vai

quebrar as ligações glucosídicas e permitir que se formem oses cujas extremidades redutoras

passam a estar em contacto com a solução, em vez de estabelecerem ligações com outras

oses. Após o aparecimento das oses em solução, estas já são capazes de reagir com o DNS,

pois as extremidades redutoras das oses vão ser oxidadas pelo DNS e permitir a realização do

método.