UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE BIOCINCIAS
DEPARTAMENTO DE BOTNICA
ECOFISIOLOGIA DE PLANTAS DA CAATINGA

Introduo

O Espectrofotmetro e os medidores de sais

Exames

Colesterol, triglicerdeos,
glicose, cido rico, etc.

AULA 1
Introduo a Espectroscopia,
Lei de Lambert Beer
Exames

Marcelo Francisco Pompelli

Tipos de Espectrofotmetro

Como eles so analisados?

Tipos de Espectrofotmetro

Tipos de Espectrofotmetro
amostra

tela de cristal
lquido

teclado para entrada de

informaes

tela de cristal lquido ou PC?

entrada para pen drive

3
1

Lmpada de xenon,
emissora de fonte de luz

Detector de referncia,
funciona para calibrao
do aparelho e desconto
do zero de referncia

Funcionamento dos Espectrofotmetros

1 bacterioclorofila a
2 clorofila a
3 clorofila b
4 ficoeritrbilina
5 -caroteno

Intensidade de
luz incidente I0

Monocromador, funciona
como um prisma,
selecionando o
comprimento de onda
adequado

Mocrocromador

Detector ou tela

lmpada
emissora de luz

4
5

Intensidade de
luz transmida I

Detector, mostrar
um valor, dependendo
da absorvncia

Vai depender do
comprimento de onda
escolhido

Carrossel automtico
para at seis
cubetas, seis leituras
ao mesmo tempo

Funcionamento dos Espectrofotmetros

Ao passar pela cubeta comum que a
luz seja transmitida com caractersticas
distintas da luz emitida (ex. maior
comprimento de onda, menor energia)

Cubeta com a
amostra a ser
analisada

Lei de Lambert-Beer

Lei de Lambert-Beer

Absoro de luz pelas molculas

A frao de luz incidente absorvida por uma soluo num

determinado comprimento de onda relacionada com a
espessura do caminho ptico e a concentrao da
amostra.

uma ampla faixa de biomolculas absorvem luz num determinado

comprimento de onda

Ex.: o triptofano absorve luz em 280 nm

Coeficiente de extino Molar

(M-1 L-1 cm-1) prprio de cada
substncia a ser analisada

a medio da luz absorvida por uma biomolcula atravs do

espectrofotmetro usada para detectar, identificar e quantificar
molculas num determinado material biolgico
Para tanto deve-se levar em considerao a Lei de Lambert-Beer

A=cL
Absorbncia ou
absorvncia
Concentrao(M)

Caminho tico (cm),

profundidade da
cubeta, geralmente 1
cm

Lei de Lambert-Beer

Lei de Lambert-Beer

Coeficiente de extino molar

Quanto maior a concentrao (c) ou maior o caminho

ptico (L) maior ser a absorbncia da amostra, por isso
geralmente o L padronizado em 1 cm

Como vimos a profundidade do caminho ptico interfere

na absorbncia da soluo

O coeficiente de extino molar varia

Exemplo:

com base na lei de Lambert-Beer, calcule a absorbncia de uma soluo

com concentrao 0,002 mol L-1 de uma substncia com absortividade
molar de 313 L mol-1 cm-1, determinada em uma clula com 2,00 cm de
caminho ptico.

A=

A = 313 L mol-1 cm-1 x 0,002 mol L-1 x 2 cm

A = 1,252

Como visto a aborbncia no tem unidade

Pico mximo de absoro de luz

Porm, quando o caminho ptico fixado (geralmente

1 cm) a absorbncia diretamente proporcional a
concentrao da amostra
Sendo assim, deve-se ter conscincia que todo e qualquer
objeto que interrompa o caminho ptico vai atrapalhar a
leitura, podendo dar uma falsa impresso de aumento da
concentrao

Pico mximo de absoro de luz

0,8

Mas como determinar isso para uma substncia

desconhecida?

0,6

Simples

varre-se a soluo com diferentes comprimentos de onda

quando se desconhece completamente a natureza da

substncia pode-se usar comprimentos de onda que vo
desde o UV at o ultravioleta.

Absorbncia

Como vimos toda biomolcula apresenta um comprimento

de onda especfico onde a absoro de luz mxima

com a natureza da substncia analisada

com o tipo de solvente utilizado

com o comprimento de onda utilizado

com o pH da soluo

Como se calcula o coeficiente de absoro molar

Uma vez que se tenha o pico de absoro mxima da
molcula, basta fazer uma sequncia de diferentes
concentraes e medir a absorbncia respectiva.
De posse dos valores de absorbncia, voc pode calcular
o coeficiente de extio molar atravs da frmula A = c

0,4

Exemplo:

0,2
580 nm
0
300

400

500

600

700

Comprimentos de onda (nm)

800

900

1000

A = 0,351 e C = 0,01563 mM L-1, qual ser o ?

0,351 = x 0,01563 mM L-1 x 1cm

= 0,351 / 0,01563

= 22,46 mM L-1 cm-1

Como se calcula o coeficiente de absoro molar

0,8

Absorvncia (nm)

0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0

0,005

0,01

0,015

0,02
-1

Concentrao (g L)

0,025

0,03