Escola de Cincias e Tecnologia

Departamento de Qumica

MESTRADO EM BIOQUMICA

STRESSE E MORTE CELULAR

Rui Manuel Alves Ferreira

(Professor Associado)

Isabel Alves-Pereira
(Professora Auxiliar)

vora, 2014

MBQ Setresse e Morte Celular

Estudos de stresse e morte celular em leveduras

Estudos de stresse e morte celular em leveduras

Local: Lab. Bioqumica Analtica CLAVerney, Dep. de Qumica, Universidade de vora
Descrio:
Objectivos:
Estudos in vivo de exposio a agentes de stresse.
Quantificao de marcadores fisiolgicos de morte celular em leveduras.
Extraco, deteco e quantificao de marcadores moleculares de stresse e morte celular em
leveduras.
Trabalhos prticos a executar:
1. Estabelecer ensaios in vivo de exposio a diferentes factores de stresse
2. Avaliar a sobrevivncia celular na exposio a diferentes factores de stresse
3. Obter extractos e fraces celulares
4. Avaliar a importncia de alguns marcadores moleculares na sobrevivncia de leveduras em
condies de stresse
5. Discusso dos resultados obtidos. Elaborao do relatrio.

Rui Ferreira e Isabel Alves-Pereira

2014/15

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Estudos de stresse e morte celular em leveduras

1- Preparao de material e meios de cultura para microbiologia.

A cultura assptica
A prtica da asspsia essencial para obter culturas puras ou identificveis.

Preparao e esterilizao de material de vidro com o qual se podem iniciar trabalhos

de Microbiologia.

pipetas graduadas

caixas de Petri

bales de erlnmeyer

tubos de ensaio
Agente de esterilizao: calor seco

Colocar o material preparado numa estufa a 180 C durante 3:00 h.

Preparao e esterilizao de meios de cultura (lquidos e slidos)

Meio YPD (lquido)
Extracto de levedura 1 %
Peptona 2 %
Glucose 2 %

Dissolver em 100 mL de gua destilada, tapar com rolha de algodo e gaze.

Meio YPD (slido)
Adicionar ao meio anterior agar 2 %

frascos de 100 mL contendo gua destilada

Pontas de micropipetas (P200 e P1000)
Agente de esterilizao: calor hmido
Esterilizar em autoclave, a 1,2 atm, a 120 C, durante 20-45 min.

Rui Ferreira e Isabel Alves-Pereira

2014/15

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Estudos de stresse e morte celular em leveduras

2- Obteno de culturas de Saccharomyces cerevisiae em meio lquido

- Exposio ao indutor de stresse

Inoculao em meio lquido

1) Colocar os erlnmeyer (250 mL) A, B, C e D no banho termoestabilizado a 28 C, 150 rpm

A YPD
B YPD + H2O2 0,2 mM
C YPD + CH3COOH 80 mM
D YPD + NH4VO3 25 mM
2) Inocular 100 mL de meio A, B, C e D com 3 mL da cultura M
3) Recolher amostras para:

A600

4) Deixar incubar durante 12 h, ao final deste tempo passe ao ponto 3.

3- Obteno fraco ps-perxissomal de leveduras

5) Recolher amostras da cultura para:

A600

Clulas viavis (clorao com azul de metileno)

Clulas viavis (cfu)

6) Distribuir as culturas em meio liqudo por tubos de centrfuga

7) Centrifugar a 5000 g durante 10 min
8) Resuspender o sedimento em 25 mL de H2O
9) Centrifugar a 5000 g durante 10 min
10) Resuspender o sedimento em 5 mL de tampo de lise
11) Lisar as clulas por ultra-sons
12) Centrifugar o lisado a 5000 g durante 10 min
13) Recolher o sobrenadante e centrifugar a 12000 g durante 30 min
14) Recolher o sobrenadante e guardar em alquotas a -20 C, para utilizar nos pontos 4, 5 e 6.

Rui Ferreira e Isabel Alves-Pereira

2014/15

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Estudos de stresse e morte celular em leveduras

4- Quantificao de protenas por espectrometria de absoro molecular.

Obteno de uma curva de calibrao para doseamento de protena total

Quantificao da protena total presente nas amostras

1) Tomar 0,5 mL do reagente B e 0,5 mL do reagente C para um balo de 50 mL e preencher

o restante volume do balo com a soluo A (reagente de Lowry).
2) Diluir 5 mL de reagente de Folin Ciocalteau com 5 mL de gua destilada, agitar no
vortex (reagente de Folin Ciocalteau diluido).
3) Preparar uma srie de tubos de ensaio de acordo com o quadro:

[BSA] (g/mL)
amostra (L)
BSA (500g/mL) (L)
NaOH 0,5M (L)
reag.Lowry (L)

0
50
75
100
125
150
175
200
Xx?
50
-----------------------------------------------------------------------------------------25
38
50
63
75
88
100
200
250
225
212
200
187
175
162
150
1250

Agitar no vrtex. Aguardar 10 min.

125

reag Flolin dil. (L)

Agitar no vrtex. Aguardar 30 min.

Ler e registar a A720 nm

5- Deteco da actividade CAT T p/ espectrometria de absoro molecular

Obteno das curvas de reaco (A/tempo)

Quantificao da actividade enzimtica CAT T (nmol.min-1/ mg) presente na fraco

ps-peroxissomal de S. cerevisiae crescida em diferentes meios de cultura.

1) Preparar, em clulas de 1 cm3, a mistura de reaco de acordo com o quadro seguinte:

t. fosfato 50 mM pH 7,0 (mL)

H2O2 (30 mM ) (mL)
t lise (mL)
amostra biolgica (mL)

amostra
0,6
0,3
0,1

branco
0,6
0,3
0,1
-

2) Registar a variao da A240 nm durante 120 s a 25 C.

Rui Ferreira e Isabel Alves-Pereira

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6- Quantificao de marcador no-enzimtico de stresseGlutationo (GSH)

Obteno de uma curva de calibrao para quantificao de glutationo total

Quantificao do glutationo total presente na fraco ps-peroxissomal

1) Preparar, solues padro de GSH em tampo fosfato de sdio 0,1 M com EDTA 0,005
M, pH 8,0.
2) Preparar em tubos de ensaio de vidro as seguintes misturas:

Volume

amostra -fraco ps-peroxissomal (L)

60

solues padro (GSH) (L)

2a7

60

H2O ultra-pura (L)

60

tampo fosfato 0,1 M, EDTA 0,005 M , pH 8 (mL)

1,84

OPT (100 g/100 L) (L)

100

3) Deixar reagir durante 15 min T ambiente e ler PF a ex350nm e de em420nm.

Rui Ferreira e Isabel Alves-Pereira

2014/15

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Estudos de stresse e morte celular em leveduras

Stresse e Morte Celular - SMC

18T+30PL+4S

8 novembro
(sab. 10h)

1- Preparao de material e meios de cultura para microbiologia

22 novembro
(sab. 10h)

2- Obteno de culturas de Saccharomyces cerevisiae em meio

lquido - Exposio ao indutor de stresse

4h T + 6h PL

3- Obteno fraco ps-perxissomal de leveduras

4h T + 6h PL
28 novembro
(6f 6h)

4- Quantificao de protenas por espectrometria de absoro

molecular
6h PL

6 dezembro
(sab. 10h)

5- Deteo da atividade CAT T por espectrometria de absoro

molecular
4h T + 6h PL

12 dezembro
(6f 6h)

6- Quantificao de marcador no-enzimtico de stresse

Glutationo (GSH)
6h PL

20 dezembro
(sab. 10h)

Apoio ao trabalho de projeto (artigo)

Realizao e apresentao do relatrio
6h T + 4h S

Rui Ferreira e Isabel Alves-Pereira

2014/15