Thiago Braga Izidoro et al.

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Atividade proteoltica de bactrias psicrotrficas em leites estocados

em diferentes temperaturas
Thiago Braga Izidoro1, Juliano Gonalves Pereira2, Vanessa Mendona Soares3,
Thiago Luiz Belm Spina4, Jos Paes de Almeida Nogueira Pinto5

RESUMO
A difuso do uso da tecnologia do resfriamento, como estratgia para manuteno das caractersticas microbiolgicas
e organolpticas do leite, no associada aos cuidados bsicos de higiene na obteno do produto, fez com que os
micro-organismos psicrotrficos emergissem como as principais bactrias deteriorantes da indstria lctea. Este estudo teve por objetivo avaliar como o metabolismo psicrotrfico proteoltico responde a diferentes temperaturas de
incubao do leite, delineando um paralelo entre multiplicao de psicrotrficos, quantidade de micro-organismos com
capacidade de hidrolisar protenas e quantidade de GMP (glicomacropeptdeo) liberada. As amostras de leite, coletadas
diretamente do tanque de resfriamento, foram submetidas contagem de micro-organismos psicrotrficos, contagem
de micro-organismos proteolticos e determinao da concentrao de GMP, em diferentes tempos (12 h; 24 h; 48 h) e
temperaturas (4C; 8C; 12C) de armazenamento. No houve linearidade entre os parmetros microbiolgicos e o GMP
aferido, segundo o binmio tempo/temperatura. A maior concentrao de GMP (5,07 g/mL) foi aferida no binmio 8C/
24 h (T8/M24). Esses dados indicam a necessidade de estudos sobre o metabolismo da microbiota psicrotrfica, de
forma a elucidar questes bsicas e de profunda relevncia sobre seu metabolismo.
Palavras-chave: leite, protelise, psicrotrficos.

ABSTRACT
Proteolytic activity of psychrotrophic bacteria in milk stored at different temperatures
The widespread use of cooling technology as a tool for maintaining the microbiological and organoleptic
characteristics of milk, Without effective hygienic practices throughout the milk production, caused the psychrotrophic
micro-organisms to become major deteriorative bacteria in the dairy industry. The present study aimed to assess how
the proteolytic psychrotrophic metabolism responds to different milk storage temperatures, drawing a parallel among
psychrotrophic growth, amount of micro-organisms capable of breaking down proteins and amount of GMP
(glycomacropeptide) released. Milk samples were collected directly from the cooling tank and subjected to count of
psychrotrophs, count of proteolytic micro-organisms and the concentration of GMP at different storage times and
temperatures. There was no linearity between the microbiological parameters and the GMP measured, according to the
time/temperature binomial. The highest concentration of GMP (5.07 mg/mL) was measured in the binomial 8C/24h (T8/
M24). The data make clear the need for further studies about questions involving the psychrotrophic microbiota in
order to clarify extremely important basic questions about their metabolism.
Key words: milk, proteolysis, psychrotrophs.

Recebido para publicao em 20/04/2012 e aprovado em 25/04/2013.

1
Mdico Veterinrio, Doutor. Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Campus de Botucatu, Caixa Postal 572, 18618-000, Botucatu, So
Paulo, Brasil. tizidoro@gmail.com
2
Mdico Veterinrio. Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Campus de Botucatu, Caixa Postal 572, 18618-000, Botucatu, So Paulo,
Brasil. julianopereira@veterinaria.com.br (autor para correspondncia).
3
Mdica Veterinria. Mestre. Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Campus de Botucatu, Caixa Postal 572, 18618-000, Botucatu, So
Paulo, Brasil. vanessamsoares@gmail.com
4
Mdico Veterinrio. Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Campus de Botucatu, Caixa Postal 572, 18618-000, Botucatu, So Paulo,
Brasil. thiagospina@uol.com.br
5
Mdico Veterinrio, Doutor. Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Campus de Botucatu, Caixa Postal 572, 18618-000, Botucatu, So
Paulo, Brasil. josepaes@fmvz.unesp.br

Rev. Ceres, Viosa, v. 60, n.4, p. 452-457, jul/ago, 2013

Atividade proteoltica de bactrias psicrotrficas em leites estocados em diferentes...

INTRODUO
Os psicrotrficos so definidos como bactrias que
apresentam altas taxas de multiplicao em baixas temperaturas, por causa do elevado metabolismo, predominantemente lipoproteoltico (Cousin, 1982).
A difuso do uso da tecnologia do resfriamento, como
estratgia para manuteno das caractersticas microbiolgicas e organolpticas do leite, no associada aos cuidados bsicos de higiene na obteno do produto, fez com
que esse grupo de micro-organismos emergisse como o
mais impactante na indstria de laticnios. O motivo dessa
relevncia est no fato de serem bactrias de carter altamente deteriorante (Munsch-Alatossava & Alatossava,
2006), sendo, por consequncia, um dos principais
limitantes da vida de prateleira do leite (Dogan & Boor,
2003). Destacam-se, no grupo, os gneros Pseudomonas
e Bacillus.
Pseudomonas o psicotrfico clssico, de todos os
micro-organismos presentes no leite o que possui a maior
atividade metablica (tendendo lipoltica) na faixa de
temperatura de 4C a 7C (Nrnberg et al., 2010). Por
outro lado, os Bacillus so predominantes em temperaturas de resfriamento marginal, de 8 a 10C, e, embora aproveitem fraes graxas, o metabolismo proteoltico prevalece (Srhaug & Stepaniak, 1997; Zacharov & Helpern,
2007).
A atividade psicrotrfica-proteoltica expressa-se, principalmente, sobre as casenas (Gebre-Egziabher et al.,
1980), mais especificamente sobre as pores glicolisadas
e hidroflicas da -casena. Essa atividade muito similar
ao da quimosina (coalho) sobre as fraes proteicas
do leite no processo de fabricao dos queijos, pois resulta na liberao de molculas de GMP. As proteinases
produzidas por essa microbiota so termoestveis, mantm-se ntegras e ativas aps o tratamento trmico, e os
prejuzos econmicos decorrentes dessa atividade so
considerveis (Rowe et al., 2003). A clivagem e a
consequente floculao das micelas de casena geram,
alm da geleificao do leite UHT (Renner, 1998; Datta &
Deeth, 2001), dificuldades para a obteno dos parmetros
fsico-qumicos necessrios na fabricao de queijos
(Raynal & Remeuf, 1998). Alm disso, o acmulo de
dipeptdeos e de aminocidos (especialmente tirosina)
confere ao leite o sabor amargo (Chen et al., 2003).
Apesar da relevncia do assunto, poucas respostas
consensuais existem entre os pesquisadores, a respeito
do mecanismo de quebra de fraes proteicas pela ao
da microbiota psicrotrfica (Tondo et al., 2004). Isto porque atuam, sinrgica e simultaneamente, em processos
proteolticos de origem bacteriana, endgena e oxidativa
(Wiking et al., 2003). Alm disso, a partir da quebra do
GMP, existem vrias rotas metablicas possveis, o que
torna praticamente impossvel aferir a quantidade de pro-

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tenas clivadas, por cada um dos fatores descritos. Finalmente, pequenas variaes de temperatura podem implicar variaes considerveis no metabolismo da microbiota
do leite (Muir et al., 1978).
Tendo em vista o exposto, este trabalho teve o objetivo de verificar como o metabolismo psicrotrfico
proteoltico responde a diferentes temperaturas de incubao do leite, traando um paralelo entre multiplicao
de psicrotrficos, quantidade de micro-organismos com
capacidade de quebrar protenas e quantidade de GMP
liberada.

MATERIAL E MTODOS
Coleta das amostras e estocagem do leite
O experimento avaliou amostras de leite, colhidas, semanalmente, em uma propriedade de mdio porte, com produo diria mdia de 500 L/dia. As coletas foram realizadas no perodo vespertino, tendo havido a preocupao de
que o leite fosse, invariavelmente, recm-ordenhado.
As amostras foram colhidas, diretamente do tanque
de resfriamento da propriedade, para trs frascos estreis
tipo Scott, com capacidade de 600 mL, acondicionados
em caixas isotrmicas, contendo gelo reciclvel e, imediatamente, transportadas ao laboratrio.
Chegando ao laboratrio, foram realizadas anlises
microbiolgicas e fsico-qumicas. A seguir, os frascos
foram incubados em estufas tipo BOD (Biochemistry
Oxygen Demand), ajustadas para as temperaturas 4, 8 e
12C (T4, T8 e T12, respectivamente).
Definiu-se como M0, o momento em que as primeiras
anlises foram efetuadas. Posteriormente, os procedimentos analticos foram repetidos para cada uma das temperaturas de estocagem j citadas, 12, 24 , 48 h (aps M0) e
estes momentos foram denominados, respectivamente,
M12, M24, M48.

Anlises microbiolgicas
Contagem total de micro-organismos psicrotrficos: primeiramente, cada frasco foi homogeneizado e, a
seguir, foram realizadas diluies decimais seriadas, empregando-se soluo salina 0,85%. Posteriormente, 0,1 mL
de cada diluio foi transferido para placas de Petri, contendo gar padro para contagem (PCA), realizando-se a
semeadura em superfcie (spread plate). Aps a secagem,
as placas foram incubadas em estufas, a 21C, por 25 h
(APHA, 2002). O resultado final foi expresso em log de
UFC/mL.
Contagem de micro-organismos proteolticos: aps a
realizao da contagem de micro-organismos psicrotrficos, como descrito no item anterior, as placas que apresentaram colnias isoladas (mximo de 50 colnias por
placa) foram utilizadas para a verificao da percentagem
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Thiago Braga Izidoro et al.

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de micro-organismos psicrotrficos proteolticos, por meio

da semeadura em gar leite desnatado (ALD). Das placas
escolhidas, foram retiradas 20 colnias, utilizando-se ala
de nquel cromo, e transferidas para uma placa contendo
ALD. As placas foram incubadas em estufa, a 21C, por 72
h (Frank et al., 1992). A expresso metablica foi evidenciada pela formao de um halo transparente ao redor da
colnia, decorrente do metabolismo bacteriano sobre as
pores proteicas existentes no meio. O resultado foi expresso em percentagem, baseado no nmero de colnias
de psicrotrficos repicadas e nmero de colnias confirmadas.

Anlise fsico-qumica
Determinao da concentrao de GMP por espectrofotometria: para a determinao da concentrao de
GMP, a prova foi executada em quatro etapas:
1 etapa Precipitao: Foram transferidos 20 mL da
amostra de leite para um bquer (utilizando-se uma pipeta
volumtrica) e adicionados 20 mL de cido tricloroactico
24% (TCA). Aps 30 min, (tempo necessrio para que
ocorra a coagulao cida), o contedo foi filtrado. A seguir, 20 mL do filtrado foram pipetados em 2 tubos (10 mL
em cada tubo), conferindo repetibilidade ao resultado. A
cada um dos tubos citados, foi acrescido 1 mL de cido
fosfotungustico.
2 etapa Centrifugao: Os tubos contendo o filtrado foram centrifugados a 3000 rpm, por 10 min. O
sobrenadante foi descartado e, aos tubos, foram adicionados 6 mL de lcool etlico absoluto. Uma nova
centrifugao foi realizada, na mesma rotatividade e pelo
mesmo tempo. Aps a centrifugao, o lquido sobrenadante foi descartado, restando apenas um precipitado
(pellet) no fundo de cada tubo.
3 etapa Leitura: Utilizando-se uma pipeta automtica, foram adicionados 1 mL de ninhidrina cida e 2 mL de
cido actico glacial nos tubos contendo o pellet. A soluo foi, ento, homogeneizada e levada ao banho-maria
(gua em estado de alta ebulio) por 10 min. Aps esse
perodo, os tubos foram imediatamente levados ao banho
de gelo, com o intuito de interromper a reao. A leitura da
absorbncia da soluo foi realizada em espectrofotmetro
com comprimento de onda de 470 nm.
4 etapa Converso dos valores de absorbncia em
g/mL de cido silico: Seguindo a metodologia do Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento (Brasil,
2006) foram feitas dez diluies de cido silico e, para cada
um delas, foi aferido um valor de absorbncia. Foi ento
traada uma reta de tendncia, que serviu de parmetro
para a converso dos valores de absorbncia para g/mL
de cido silico (Fukuda et al., 1994; Brasil, 2006).
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Anlise estatstica
As anlises estatsticas foram realizadas a partir de 30
repeties de todos os procedimentos descritos, ou seja,
efetuaram-se colheitas por 30 semanas seguidas. Utilizouse a tcnica da anlise de varincia para o modelo com
dois fatores, complementar ao teste de comparao de
mltiplos de Tukey (SAS). Todas as discusses foram
realizadas a 5% de significncia.

RESULTADOS E DISCUSSO
Como descrito na Tabela 1, em M0, a contagem mdia
de micro-organismos psicrotrficos foi de 3,81 (log UFC/
mL). Independentemente da temperatura analisada, houve um aumento significativo (p < 0,05) de M12 para M48.
Alm disso, independentemente do momento, as contagens foram mais altas (p < 0,05), na medida em que se
elevou a temperatura de incubao do leite.
Os resultados obtidos eram esperados, pois, com o
aumento da temperatura, reduziu-se sua importncia como
fator limitante da multiplicao bacteriana (Ercolini et al.,
2009). Da mesma forma, as contagens foram sempre crescentes, na medida em que se aumentava o tempo de
estocagem.
Como observado na Tabela 2, a partir de M0, momento
no qual foi aferido o valor mdio de 59,3%, a percentagem
de psicrotrficos proteolticos permaneceu constante, para
todas as temperaturas e todos os momentos de anlise (p
> 0,05). Entretanto, as pequenas variaes positivas,
aferidas em M24, podem indicar que, naquele momento,
houve uma converso metablica em direo atividade
proteoltica.
Na literatura, os valores de psicrotrficos com capacidade de clivar fraes proteicas convergem para algo
em torno do valor de 40 a 45% de psicrotrficos
proteolticos (Silveira et al., 1998; Martins et al., 2006;
Nrnberg et al., 2010).
preciso cautela para se interpretar essa aparente
constncia descrita; isto porque a prova apenas demonstra a produo de enzimas e no a quantidade de enzimas
produzidas. Isto significa que os dados no necessariamente descrevem uma constncia na atividade proteoltica
geral; afinal, um mesmo micro-organismo pode produzir
quantidades diferentes de enzimas proteolticas, conforme se altera o binmio tempo/temperatura.
Em M0, o valor aferido de GMP livre foi de 2,83 g/mL,
valor prximo ao de de Fukuda et al. (1994), que obtiveram mdia de 2,71 g/mL. J Furlanetti & Prata (2003),
tambm trabalhando com leite cru, descreveram uma mdia bem superior, de 4,33 0,62 g/mL. Entretanto, neste
experimento, os prprios autores consideraram que a influncia de alguns fatores, como estgio de lactao e
presena de vacas mastticas no rebanho podem ter gerado uma mdia superestimada.

Atividade proteoltica de bactrias psicrotrficas em leites estocados em diferentes...

A concentrao inicial de GMP, obtida neste trabalho,
est dentro do limite estabelecido pelo Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento como normal para o
leite cru (Brasil, 2006).
Nota-se, pela Tabela 3, que maiores concentraes
foram aferidas em M24, do que em M48. Isso ocorre por
causa da quebra do GMP em fraes menores, o que naturalmente impossibilitaria a ligao do cido silico
ninhidrina cida.
As tcnicas mais utilizadas para deteco de atividade proteoltica no leite, seja de origem bacteriana seja por
consequncia de fraude por adio de soro, baseiam-se
na concentrao do GMP e apresentam essas variaes
na leitura (Lopez-Fandio & Olano, 1999).

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Na temperatura de 4C, os valores de GMP se mantiveram constantes. Tanto pela temperatura de incubao,
quanto pela contagem de psicrotrficos, em 48 h, no se
esperaria atividades metablico-proteolticas muito
detectveis (Grieve & Kitchen, 1985).
Entretanto, os maiores teores de GMP foram obtidos
com o leite incubado a 8C, e no a 12C, como seria mais
provvel. Independentemente do perodo de anlise, foi
observada quebra de estrutura quartenria de casena em
molculas de GMP, a 8C, mais do que a 12C.
Alm da quebra de GMP no variar linearmente, de
modo crescente, acompanhando a multiplicao bacteriana
(Tabela 1) e a elevao da temperatura, outro padro
microbiolgico questionado pelos resultados apresen-

Tabela 1. Contagem de psicrotrficos (log UFC/mL) em leites estocados em diferentes temperaturas (4C/T4, 8C/T8, 12C/T12)
e analisados em diferentes momentos (0h/M0, 12h/M12, 24h/M24, 48h/M48)
Temperatura
2

Resfriada
T4
T8
T12

Populao analisada em diferentes momentos1

M0

M12

M24

M48

3,81 1,41
nr
nr
nr

nr
4,76 0,90aA
5,21 0,92aAB
5,77 1,05aB

nr
5,10 0,94abA
5,58 0,99aA
6,42 0,96bB

Nr
5,51 0,91bA
6,22 0,91bB
7,45 0,89cC

Valores seguidos de letras minsculas diferentes na mesma linha apresentam diferena estatstica significativa (p < 0,05). Valores seguidos
de letras maisculas diferentes na mesma coluna apresentam diferena estatstica significativa (p < 0,05).
1
Valores expressos em mdia e desvio padro.
2
Anlises realizadas com amostras em temperatura resfriada.
nr = no realizada

Tabela 2. Percentagem de psicrotrficos proteolticos (%) em leites estocados em diferentes temperaturas (4C/T4, 8C/T8, 12C/
T12) e analisados em diferentes momentos (0h/M0, 12h/M12, 24h/M24, 48h/M48)
Temperatura
Resfriada2
T4
T8
T12

Populao analisada em diferentes momentos1

M0

M12

M24

M48

59,3 13,1
nr
nr
nr

nr
58,3 11,5aA
59,7 11,7aA
62,5 9,8aA

nr
62,5 10,0aA
65,7 8,6aA
66,8 6,1aA

nr
59,0 8,0aA
59,5 7,7aA
62,7 9,8aA

Valores seguidos de letras minsculas iguais na mesma linha no apresentam diferena estatstica significativa (p > 0,05). Valores seguidos
de letras maiscula iguais na mesma coluna no apresentam diferena estatstica significativa (p > 0,05).
1
Valores expressos em mdia e desvio padro.
2
Anlises realizadas com as amostras em temperatura resfriada.
nr = no realizada

Tabela 3. Teor de GMP (g/mL de cido silico) em leites estocados em diferentes temperaturas (4C/T4, 8C/T8, 12C/T12) e
analisados em diferentes momentos (0h/M0, 12h/M12, 24h/M24, 48h/M48)
Temperatura
Resfriado
T4
T8
T12

Teor de GMP analisado em diferentes momentos1

M0

M12

M24

M48

2,83 0,97
nr
nr
nr

nr
2,66 0,70aA
3,82 1,46aA
3,05 0,92aA

nr
3,05 0,88aA
5,07 2,25bB
3,85 1,40aA

nr
2,94 0,72aA
4,52 1,93bB
3,31 0,95aA

Valores seguidos de letras minsculas diferentes na mesma linha apresentam diferena estatstica significativa (p < 0,05). Valores seguidos
de letras maisculas diferentes na mesma coluna apresentam diferena estatstica significativa (p < 0,05).
1
Valores expressos em mdia e desvio padro.
2
Anlises realizadas com a amostras em temperatura resfriada.

nr = no realizada

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Thiago Braga Izidoro et al.

tados. Griffiths (1989) afirmou que as enzimas psicrotrficas so produzidas, principalmente, no incio da fase
estacionria de multiplicao; entretanto, o que se verificou neste experimento foi uma intensa atividade de quebra, logo nas primeiras 12 h, em T8, que se manteve no
decorrer das 48 h de anlises. Esses dados ratificam o
raciocnio estabelecido por Stevenson et al. (2002), que
questionam quais so, afinal, os substratos que fomentam a multiplicao das bactrias psicrotrficas, durante
a fase log, visto que a lactose no consumida.
No h dados especficos que permitam uma discusso comparativa, mas h indcios que, se no explicam
totalmente, ao menos permitem hipteses viveis do que
poderia estar ocorrendo com a microbiota do leite incubada a 8C.
As informaes contidas nas Tabelas 1 e 3 permitem o
seguinte raciocnio: se a multiplicao bacteriana sempre crescente e se na temperatura de 8C, foi verificada
maior atividade proteoltica, provvel que haja uma atividade lipoltica mnima. Caso contrrio, haveria mais bactrias a 8C do que a 12C, j que se trata de uma microbiota
essencialmente lipoproteoltica. Izidoro et al. (2010) j
haviam verificado um brusco predomnio de atividade
proteoltica no leite, nessa faixa de temperatura. Alm disso, Srhaug & Stepaniak (1997) descrevem uma inverso
na microbiota do leite, a 8C: o gnero Pseudomonas
suplantado por Bacillus. No apenas uma substituio
de micro-organismos que est sendo reportada, est implcita uma inverso metablica, pois, embora sejam importantes micro-organismos proteolticos, Pseudomonas
so preferencialmente lipolticos, enquanto o gnero
Bacillus predominantemente proteoltico (Silveira et al.,
1998; Zacharov & Helpern, 2007).
O prprio metabolismo lipoltico pode fornecer outra
explicao para o evento proteoltico registrado a 8C:
alcois e aldedos, originados da degradao da gordura
do leite, induzem a oxidao e quebra de fraes proteicas
(Wiking et al., 2002). Desta forma, os resduos metablicos lipolticos de Pseudomonas poderiam somar-se atividade proteoltica de Bacillus (e de outros psicrotrficos,
inclusive as prprias Pseudomonas.) a 8C.
Por fim, no se deve desconsiderar o fato de que
as ligaes peptdicas so covalentes duplas, as mais fortes da natureza orgnica. Para que um micro-organismo
hidrolise protena necessrio que seu aparato metablico esteja funcionando de forma adequada, pois haver
um grande gasto energtico, at que se obtenha o
aminocido. Talvez a temperatura de 4C no oferea as
condies necessrias para que a microbiota do leite expresse seu metabolismo proteico. Desta forma, a 8C haveria uma migrao intensa para a atividade proteoltica,
pois estaria sendo aproveitado um substrato, at ento,
com poucos competidores.
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A exposio destes dados pode induzir a uma concluso, equivocada, a de que as alteraes no leite ocorrem
de forma mais intensa a 8C do que a 12C. Ressalta-se
que este trabalho avaliou apenas a atividade proteoltica.
Na temperatura de incubao de 12C, provvel que j
possa ser verificada uma atividade metablica residual de
micro-organismos mesfilos, que possuem a capacidade
de fermentar lactose e produzir cido lctico.

CONCLUSES
Os resultados no demonstraram relao de linearidade
entre a populao de micro-organismos psicrotrficos, a
percentagem de bactrias proteolticas e a atividade metablica proteoltica. De um modo geral, cada uma dessas
aferies respondeu de forma particular, diante do binmio
tempo-temperatura.
Uma possvel alterao na microbiota, e consequente
inverso metablica, implicou uma maior concentrao de
GMP, verificada na temperatura de 8C.
Os dados demonstraram a necessidade de estudos
sobre as questes que envolvem a microbiota psicrotrfica, de forma a elucidar questes bsicas e de profunda
relevncia sobre seu metabolismo, o que contribuiria para
a produo de leite e derivados de melhor qualidade
organolptica e maior vida de prateleira.

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Rev. Ceres, Viosa, v. 60, n.4, p. 452-457, jul/ago, 2013