UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE UFF

Faculdade de Farmcia
Departamento de Tecnologia Farmacutica

Relatrio de Tecnologia Enzimtica e

das Fermentaes
Curva Padro e Curva de Crescimento de Saccaromyces cerevisiae

Professoras:
Alunos:

Yanina M. A. Calvette
Sorele B. Fiaux
Gabriel Duarte (Turma KC)
Fernanda Krajewski( Turma KC)
Letcia F. de Castro (Turma KC)
Mayara Nogueira Lara (Turma KC)

Niteri, 20 Maio de 2015.

1. Introduo
1.1

Saccharomicces cerevisiae

A Saccharomicces cerevisiae bastante empregada pelo homem, pode

ser utilizada em indstrias de fermentao, alimentcia e de bebidas. As
principais caractersticas que as tomam microrganismos interessante para
processos industriais so:
Desenvolvimento atravs de substrato barato e de fcil
disponibilidade
Facilidade de obteno e reproduo
Utilizao de nutrientes em suas formas mais simples
Possibilidade de cultivo independente do ambiente
Pouca exigncia de gua e de espao (rea)
Formao de produtos com valor nutritivo
Outra vantagem do emprego de clulas da S. Cerevesiae sua fcil
utilizao em procedimentos moleculares e seu completo sequenciamento
gentico.1
1.1Condies Ambientais
Vrios fatores influenciam o cultivo da S. cerevisiae. O crescimento
celular depende de fatores como pH, temperatura, componentes do meio de
cultura e a disponibilidade de oxignio para a clula. 2
As temperaturas timas para sua utilizao em processos industriais
esto entre 25 e 35C e o pH timo entre 4,5 e 5,5. Fontes de carbono e
nitrognio so muito importantes no crescimento desses microrganismos, o
modo de aplicao e a seleo de fontes de carbono um dos fatores
crticos dos processos fermentativos, pois muitos compostos, especialmente
aucares, podem causar intensa represso catablica de sntese de vrias
enzimas, alm da reduo na velocidade de crescimento. O estudo da
agitao e da aerao em processos fermentativos tambm essencial,
acredita-se que os objetivos principais so a disperso de bolhas de ar, com
consequente suprimento de oxignio aos microrganismos, a manuteno
das clulas em suspenso e o aumento da transferncia de calor e massa
no meio. 2
1.2 Importncia para a industria
Saccharomyces cerevisiae se desenvolve tanto em condies aerbias
como anaerbias. Em presena de oxignio, a levedura transforma a glicose
em gs carbnico e gua, liberando uma quantidade de energia que ser
utilizada no prprio metabolismo celular. Em ausncia de oxignio, a
levedura fermenta transformando acar em gs carbnico e lcool e
liberando
uma
quantidade
menor
de
energia.
Denominados
respectivamente respirao e fermentao, estes processos so a base da
produo de vrios alimentos e bebidas.3
A levedura S. cerevisiae obtida nas destilarias, depois de usada como
fermento para a obteno do lcool a partir da cana de aucar. Ela pode ser
considerada como um residuo na produo do lcool.
Na produo de bolos e pes, a S. cerevisiae transforma os acares
disponveis na massa em lcool e gs carbnico, sendo este ltimo o
responsvel pelo crescimento da massa. O termo "fermento biolgico" se
aplica s culturas puras de Saccharomyces cerevisiae vendidas no comrcio,
para conferir um sabor prprio e aumentar o volume e a porosidade de pes

e outros produtos de confeitaria. No deve ser confundido com o fermento

qumico (geralmente bicarbonato de sdio).3

1.2

Processos fermentativos

Em termos gerais, o processo fermentativo se implica na utilizao de

microrganismos para a obteno de um produto desejado atravs de
matria orgnica (substrato) catalisada por enzimas. 2
Hoje em dia temos diversos produtos utilizados nas indstrias qumicas,
farmacuticas e de alimentos que so obtidos por processos fermentativos.
Estes produtos podem ser produzidos pelo metabolismo primrio (ex:
etanol) ou secundrio (ex: antibiticos) do microrganismo cultivado e ao
lado da produo de biomassa, enzimas e protenas em geral, eles so os
responsveis pela evoluo tecnolgica e desenvolvimento das pesquisas
na rea.
Em termos industriais, portanto, aceita-se a denominao fermentao
ou processo fermentativo para caracterizar qualquer transformao
intermediada por um microrganismo atravs de uma sequncia de reaes
bioqumicas. Assim, tambm so considerados processos fermentativos as
transformaes envolvendo respirao microbiana, biossntese, fotossntese
e respirao com substratos orgnicos. 4

2. Objetivo:

Elaborar as curvas padro e de crescimento utilizando a levedura

Saccharomyces cerevisae por meio da tcnica de Densidade tica
associada ao Peso Seco.

3. Material e Mtodos (Procedimentos)

3.1

Materiais para a curva padro

Bales volumtricos (10,0ml; 25,0ml; 50,0ml; 100,0ml);

Pipetas volumtricas (1,0ml; 2,0ml; 5,0ml; 10,0ml);
Pipetas Pasteur
Erlenmeyers (100,0ml e 250,0ml);
Cubetas de espectrofotmetro
Espectrofotmetro
Tubos de centrfuga
Centrfuga
Cpsulas de porcelana
Estufa
Balana

Composio do meio de cultura para curva padro

O meio de cultivo foi preparado segundo as quantidades descritas abaixo:

Acar cristal
Sulfato de amnio
Fosfato dicido de potssio
Extrato de lvedo
Sulfato de magnsio 7.H2O
gua destilada q.s.p
pH

3.2

10 g/L
5,0 g/L
1,5 g/L
5.0 g/L
0,5 g/L
1000 mL
6,0

Materiais para curva de crescimento

Balo de fundo chato de 2000 mL

Filtro
Tubo de exausto
Tubo de coleta
Compressor de ar
Bico de Bunsen
Pipeta Pasteur

Nota: O Balo de fundo chato de 2000 mL contm 1000 mL de meio de

cultivo estril, adaptado a um filtro e um compressor de ar e um tubo de
exausto que permite a sada de ar e tubo de coleta para retirada da
amostra.

Composio do meio de cultura para curva de crescimento

Acar cristal
10 g/L
Sulfato de amnio
5,0 g/L
Fosfato dicido de potssio
1,5 g/L
Extrato de lvedo
Sulfato de magnsio 7.H2O
0,5 g/L
gua destilada q.s.p
1000 mL
pH

3.3

5,0 g/L
6,0

Mtodos

3.3.1 Curva padro

Para a obteno da suspenso de clulas do Saccharomyces

cerevisae, realizou-se o cultivo de fermento biolgico, que foi crescido por
cerca de 24h em 100 mL do meio de cultivo sob agitao a 30C.
O preparo da suspenso me foi realizado dividindo-se em 2 tubos de
centrfuga os 100 mL da suspenso de clulas obtida anteriormente (50 mL
para cada tubo). Os tubos foram conduzidos centrfuga e submetidos
centrifugao por 10 minutos a 3000 rpm. O sobrenadante foi retirado com
o auxlio de Pipeta de Pasteur e em seguida as clulas foram ressuspendidas
com gua destilada, repetindo o procedimento de centrifugao e remoo
do sobrenadante por duas vezes. Aps este procedimento os resduos do
tubo foram transferidos para um balo volumtrico de 100 mL e ele foi
avolumado.
Para a obteno da concentrao celular da suspenso me (Peso
Seco) pesaram-se 2 cpsulas de porcelana vazias, e em seguida retirou-se 5

mL da suspenso me (em duplicata) e transferiu-se para as cpsulas

previamente secas e taradas em uma estufa a 80C por 24h. Estas foram
ento novamente secas nas mesmas condies, resfriadas e ento pesadas.
Obteve-se o peso seco de massa celular pela diferena de peso entre
as cpsulas cheia e vazias, dividida pela alquota de soluo me adicionada
s cpsulas. O valor do peso seco foi expresso em grama por litro.
Em seguida foram feitas 4 diluies, selecionadas arbitrariamente, de
1:25 1:35 1:50 1:100 1:200. Estas diluies foram feitas transferindo
alquotas da suspenso me para bales volumtricos que foram
avolumados com gua destilada.
Leu-se a densidade tica atravs do espectrofotmetro, no
comprimento de onda a 540nm. Como branco para calibrar o aparelho,
utilizou-se gua destilada.
3.3.2 Curva de crescimento
O inculo foi preparado a partir do crescimento do Saccaromyces
Cerevisiae em um erlenmeyer contendo 100 mL de meio de cultivo de
mesma composio e meio de preparo da curva padro. O meio de cultivo
estava sob condies asspticas. O inculo foi crescido por 16h a 30C e
180 rpm.
Adicionou-se 100 mL do inculo em um balo de fundo chato de 2000
ml contendo 1000 ml do meio estril, com um filtro, compressor de ar e um
tubo de exausto adaptados.
Em intervalos de tempo regulares, foram retirados aproximadamente
5 mL em duplicata da suspenso pelo tubo de coleta.
Aps a coleta, o volume foi marcado e centrifugou-se a amostra
durante 10 inutos a 3500 rpm. Em seguida, lavou-se duas vezes o resduo
de clulas com gua destilada, centrifugando a novamente.
Ressuspendeu-se a amostra para o mesmo volume e em seguida, fezse a leitura da densidade ptica pelo espectrofotmetro em 540 nm,
utilizando gua destilada como branco.

4. Resultados
4.1 Curva Padro
Grup
o

Cpsul
a

Peso da
Peso da cpsula
Massa de
Mdia (g)
cpsula
com S.
clulas
vazia (g)
cerevisiae (g)
secas (g)
G2
6
43,5945
43,6056
0,1110
0,1160
G2
7
44,8990
44,9111
0,1210
Fez-se a mdia aritmtica dos pesos secos encontrados para as duas
alquotas da suspenso-me e calculou-se a concentrao em g/L.
Tabela 1. Mdia aritmtica dos pesos secos
Peso clulas = 0,1160 g

0,1160g ------- 10 mL
Xg ---------------1000mL
X = 11,6 g/L de clulas

Para a construo da curva padro, realizaram-se diluies seriadas da

soluo me e a densidade ptica de cada diluio foi medida pelo
espectrofotmetro. Os valores de densidade tica das amostras diludas
bem como os valores de peso seco para as respectivas diluies podem ser
observados na tabela 2:

Tabela 2. Tratamento de dados Curva padro

Diluio
1:25
1:35
1:50
1:100
1:200

Densidade ptica
A
B
Mdia
0,402 0,405 0,4035
0,325 0,323
0,324
0,189 0,188 0,1885
0,091 0,100 0,0955
0,074 0,072
0,073

Fator de Diluio

Peso Seco (g/L)

0,04
0,0286
0,02
0,01
0,005

0,464
0,331
0,232
0,116
0,058

A partir dos dados da tabela 2, plota-se a curva padro que relaciona a

densidade tica com o peso seco das clulas.

Curva Padro
0.5
0.4

f(x) = 0.89x
R = 0.99

0.3

Densidade Optica 0.2

0.1
0

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Peso seco (g/L)

Grfico 1: Curva padro DO x PS

Para esta curva temos: y= 0,8938 . x;

Logo, DO = 0,8938 . PS

PS=

DO
0,8938

4.2 Curva de Crescimento

Para o clculo das concentraes da massa celular utilizaram-se as
mdias dos valores de absorvncia obtidos experimentalmente para cada
tempo de cultivo (em horas) e relacionaram-se estas s concentraes
atravs da equao obtida a partir da curva padro:
PS = DO / 0,8938,
onde DO representa a densidade tica obtida experimentalmente e PS a
concentrao da massa celular.
Algumas amostras coletadas a partir do meio de cultivo tiveram sua
massa celular diluda pois aps um determinado tempo de cultivo, o
crescimento j havia sido grande o suficiente para prejudicar a leitura de
densidade tica das amostras no espectrofotmetro.

Tabela 3. Dados para contruo da curva de crescimento

N
pont
o

Aluno
Responsv
el

Horrio

Tempo
(h)

Dilui
o

DO 1

DO 2

Mdia
DO

Peso Seco
(g/L)

Tatiane

12:30

0,431

0,456

0,4435

0,4962

Peso
Seco
corrigid
o
(g/L)
0,4962

Letcia

13:09

0,65

1:5

0,105

0,104

0,1045

0,1169

0,5845

Vitor

14:05

1,58

1:5

0,132

0,156

0,144

0,1611

0,8055

Mayara

15:05

2,58

1:5

0,171

0,169

0,170

0,1902

0,951

5
6
7
8

Fernanda
Gabriel
Carla
Talita

16:15
17:00
18:00
19:00

3,74
4,5
5,5
6,5

1:5
1:10
1:12,5
1:25

0,253
0,238
0,323
0,173

0,248
0,265
0,327
0,176

0,2505
0,2515
0,325
0,1745

0,2803
0,2814
0,3636
0,1952

1,4015
2,814
4,545
4,88

Com base nos dados da tabela 3, plota-se a curva de crescimento da

levedura Saccharomyces cerevisiae:

ln PS

0,701
0,537
0,216
0,050
0,337
1,035
1,514
1,585

Curva de Crescimento
6
4
Concentrao celular (g/L)

2
0
0 1 2 3 4 5 6 7
Tempo de cultivo (horas)

Grfico 2. Curva de crescimento da levedura Saccharomyces

cerevisiae.
Plota-se ento a curva de crescimento linearizada a fim de identificar a
fase exponencial do crescimento.

Curva de crescimento linearizada

2
1.5
1
ln PS

0.5
0
-0.5 0

-1
Tempo (horas)

Grfico 3. Curva de crescimento linearizada da levedura

Saccharomyces cerevisiae.
A partir do quarto ponto , observado que a curva adquire um
carter exponencial, sendo estes pontos os que representam a fase
exponencial de crescimento e os quais sero utilizados para obtermos os
valores da taxa de crescimento espontneo () e o tempo de gerao (tg),
tempo necessrio para duplicao da massa celular dessa levedura, para
tanto plota-se a curva da fase exponencial de crescimento.

Curva da fase exponencial de crescimento

5
4 f(x) = 0.21 exp( 0.56 x )
3 R = 0.97
Concentrao Celular (g/L) 2
1
0
0 1 2 3 4 5 6 7
Tempo (horas)

Grfico 3. Curva da fase exponencial de crescimento da

levedura Saccharomyces cerevisiae.
Como, o R no satisfatrio, o segundo ponto desta curva est fora
do padro, provavelmente por um erro na mensurao e com base em
dados da literatura, onde possvel observar que em cerca de 3 horas de
cultivo a levedura Saccharoymes cerevisiae se encontra na fase exponencial
de crescimento, plota-se um grfico com a excluso do segundo ponto a fim
de obter a taxa especfica de crescimento.

Curva da fase exponencial de crescimento

5
4
3

f(x) = 0.24 exp( 0.54 x )

R = 1

Concentrao Celular (g/L) 2

1
0
2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6
Tempo (horas)

Grfico 4. Curva da fase exponencial de crescimento da

levedura Saccharomyces cerevisiae.
Plota-se ento uma curva da fase exponencial de crescimento
linearizada a fim de se obter a taxa especfica de crescimento () e o tempo
de gerao (tg).

Curva da fase exponencial de crescimento linearizada

1.5

f(x) = 0.54x - 1.43

R = 1

1
ln PS

0.5
0
-0.5

-1
Tempo (horas)

Grfico 5. Curva exponencial de crescimento linearizada da

levedura Saccharomyces cerevisiae.
Portanto, para esta curva, temos:
y = 0,5583x 1,5989 ; onde y = ln PS e x = tempo
logo:

ln PS=0,5583t1,5989

Sendo o coeficiente angular da reta = 0,5583.

Conhecendo o valor de , podemos calcular o tempo de gerao (tg):

tg=

ln 2
ln 2
=
=1,242 h
0, 5583

Bibliografia:
1) RIO, D. T. Biossoro de Cdmio por leveduras Saccharomyces cerevisae.
Piracicaba, 2004. 54p. Tese (Mestrado em Agronomia) Departamento de
Microbiologia agrcola Universidade de So Paulo.
2) NEVES, L. C. M. Reviso bibliogrfica.
Disponvel em:
http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde08102006-175534/publico/RevisaoBibliografica.pdf Acesso em: 18 de maio
de 2015.
3) MALAJOVICH M. A. Biotecnologia. Rio de Janeiro, Axcel Books do Brasil,
2004
4) BARROS, N. M.; AZEVEDO, J. L.; SERAFINI, L. A. Biotecnologia: avanos na
agricultura e na agroindstria. Caxias do Sul RS: Editora EDUCS, 2002.

QUESTES
1 Calcule a concentrao celular do inoculo empregado no
experimento executado objetivando a coleta de dados usados para
construir a curva de crescimento.

2- Explique a importncia do inoculo ser constitudo de clulas em

fase de crescimento exponencial.
A fase Lag (latente) a fase de adaptao do microorganismo ao
meio. Nesta fase no h crescimento microbiano e portanto uma fase sem
interesse para as industrias. Sendo assim, procura-se um modo de eliminar
ou reduzir o tempo desta fase. Logo, o inoculo sendo constitudo de clulas
na fase exponencial, a fase Lag consegue ser reduzida.
3- A curva de crescimento resultante do trabalho corresponde
uma curva de crescimento tpica, com todas as suas fases?
Uma curva de crescimento tpica constituda de sete fases. So elas
a fase lag (ou latente), fase de acelerao do crescimento, fase exponencial
do crescimento, fase de desacelerao do crescimento, fase estacionria,
fase da acelerao de morte e fase de morte.
Observando o grfico
correspondente curva de crescimento conseguimos observar a ausncia
da fase lag, da fase estacionria, da fase da acelerao de morte e de
morte.
A fase lag (latente) a fase de adaptao do microorganismo ao meio
e (taxa especfica de crescimento) igual zero. Notamos que essa fase
no est presente em nosso grfico pois no primeiro intervalo de tempo j
se nota o crescimento de microorganismos.
A fase estacionria, onde =0, no apresenta crescimento microbiano
e as fases de acelerao de morte ( <0) e morte (< 0 e constante)
tambm no esto presentes no nosso grfico. Evidenciamos este fato visto
que o final da curva de crescimento ainda apresenta crescimento
microbiano. Isto se deve ao fato do curto tempo de durao da anlise.
As fases presentes na curva de crescimento foram:
- Fase de acelerao de crescimento - >0;
- Fase exponencial de crescimento - >> 0, constante e mximo;
- Fase de desacelerao do crescimento - > 0.

4- Explique porque necessrio construir uma curva padro para

cada microorganismo e justifique a necessidade de construir
diferentes curvas padro para o mesmo microorganismo.
necessrio construir uma curva padro para cada microorganismo
pois cada um se desenvolve de uma diferente maneira, em condies
diferentes, tornando a curva padro mais restrita. Assim, uma mudana de
microorganismo ou parmetro de anlise, deve ocasionar uma mudana na
curva padro, uma nova construo da mesma.
5- Variaes, como mudana de microorganismo, alterao de
equipamentos (por exemplo, espectrofotmetro) e alteraes
drsticas no meio de cultivo exigem a construes de novas curvas
padres. Por qu?
Quando alteramos qualquer parmetro devemos construir novas
curvas padro. Isto acontece pois, a anlise estaria sendo baseada em
dados que no correspondem aos que vo ser utilizados na anlise da
amostra. A mudana de condies do meio e do prprio microorganismo
altera o comportamento e o crescimento do microorganismo, a mudana
nos equipamentos tem efeito na sensibilidade, alterando resultados e assim
sendo necessrio construir uma nova curva padro com as novas condies.
6- O uso de curva peso seco versus densidade tica no indicada
para a determinao de clulas viveis. Como poderamos construir
uma curva padro que relacionasse a densidade tica
concentrao de clulas viveis de um microorganismo?
Um mtodo utilizado para clulas viveis o de contagem por
plaqueamento. Nesta tcnica o inoculo espalhado por toda a extenso do
meio solidificado com auxlio da ala Drigalski e pode ser usada para
isolamento, contagem e identificao dda morfologia das colnias.
Para a construo da curva padro seria necessrio inicialmente
plaquear e incubar o inoculo e ento fazer a contagem das unidades
formadoras de colnia de clulas viveis e ento, a partir deste dado seria
possvel relacionar a densidade tica com a concentrao de clulas viveis.
7- Avalie e justifique os mtodos para confeco da curva padro e
da curva de crescimento so viveis em escala industrial.
Em escala industrial, o crescimento microbiano feito por processo
batelada. A confeco de curva de crescimento e curva padro necessita
que o processo seja interrompido, o que torna invivel. Durante o processo
batelada, as condies devem ser mantidas para garantir a obteno do
produto desejado.