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UNIVERSIDADE TECNOLGICA FEDERAL DO PARAN

DEPARTAMENTO ACADMICO DE ENGENHARIA E TECNOLOGIA EM


ALIMENTOS
CURSO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

NICOLLI GRECCO MARCHIORE

MTODOS DE CONSERVAO DE MICROORGANISMOS

ATIVIDADE PRTICA SUPERVISIONADA (APS)

CAMPO MOURO
2015

NICOLLI GRECCO MARCHIORE

MTODOS DE CONSERVAO DE MICROORGANISMOS

Trabalho apresentado disciplina de


Processos fermentativos, do Curso
Superior de Engenharia de Alimentos da
Universidade Tecnolgica Federal do
Paran UTFPR Campus Campo
Mouro, com o objetivo parcial de
aprovao na disciplina.
Orientadora: Prof. Dr. Mirela Vanin Dos
Santos.

CAMPO MOURO
2015

A preservao de linhagens de extrema importncia para processos


biotecnolgicos industriais. O isolamento e melhoramento de um microrganismo so
processos longos e caros, por isso essencial preservar a caracterstica obtida para no
ser preciso passar por esses procedimentos mais uma vez. Tambm necessrio na
indstria ter-se uma cultura pura para iniciar a fermentao. Por isso essas linhagens so
preservadas atravs de variadas tcnicas. A escolha de uma tcnica de preservao para
determinado microrganismo depende das caractersticas do mtodo, dos custos de
manuteno, da importncia do acervo, da disponibilidade de equipamentos, entre
outros fatores.
Um dos objetivos principais da conservao evitar a formao excessiva de
mutaes que mudem as caractersticas do microrganismo podendo afetar a
produtividade de um processo. Isso atingido atravs da conservao devido ao baixo
nmero de geraes filhas dos microrganismos conservados, no havendo grande
variao da clula-me. Algumas vezes pode-se desejar conservar um microrganismo
que foi selecionado e melhorado geneticamente de forma a evitar a perda dessa
modificao feita. Mas o objetivo da preservao de uma linhagem no somente
conservar o estado inicial do microrganismo evitando mutaes indesejveis, tambm
a mxima preservao da vitalidade das clulas e o nmero de clulas viveis.
Os mtodos de conservao podem ser divididos de acordo com tempo de
preservao mximo:

Mtodos de curto prazo: repique contnuo, ou subcultivo.


Mtodos de mdio prazo: preservao em leo mineral, preservao em gua
estril, congelamento a -20C, secagem em slica-gel, solo ou papel-filtro.
Mtodos de longo prazo: liofilizao, congelamento a -80C, criopreservao
em nitrognio lquido.

A conservao de microrganismos depende da manipulao de alguns fatores


ambientais de forma a retardar o crescimento. Eles so o mtodo de cultivo, a
temperatura, a composio do meio, o pH e a aerao. A idade, a condio fisiolgica e
a concentrao de cultura at o momento da conservao tambm so de grande
importncia.
A composio do meio de cultura afeta a resistncia da clula. No entanto,
existem dois conceitos que se opes sobre a propagao no meio: um meio rico em
nutrientes ou um meio pobre. Geralmente recomenda-se um meio pobre em nutrientes
para evitar o crescimento acelerado e gerao de mutantes indesejveis. O meio de
cultura pobre um sinal para o metabolismo da clula para reorganizao para
estocagem de energia. No entanto, em alguns casos o meio de cultivo rico
recomendado por causa da percentagem de clulas viveis ser maior em relao ao meio
pobre. A alterao de meios de cultivo que conduzam ao acumulo de protenas,
carboidratos e lipdios podem tambm aumentar a resistncia das clulas ao tratamento
por liofilizao.
A resistncia da clula durante a conservao pode depender da acidez do meio
de cultivo. bem conhecido que o pH do meio de cultivo influencia a propagao
celular: h um pH timo para toda cultura e o crescimento da clula pode ser inibido se
este fator no for adequado. Embora algumas clulas tenham o crescimento timo em
pH 4,2, a recuperao das clulas aps a liofilizao mnima. J em pH 5,4, a
sobrevivncia aumenta para 10 a 25%.
A temperatura de estocagem tambm influencia a eficincia do mtodo. Baixas
temperaturas so usadas para retardar as reaes qumicas, a ao das enzimas, e atrasar

ou inibir o crescimento dos microrganismos. Quanto mais baixa a temperatura mais


lenta sero as reaes qumicas, as aes enzimticas e o crescimento microbiano. Uma
temperatura suficientemente baixa inibir o crescimento de todos os microrganismos. O
congelamento evita a prolongao da maior parte dos microrganismos. A resistncia de
conservao pode depender das condies de aerao durante o cultivo. Como exemplo,
as espcies de Saccharomyces cerevisiae cultivadas em condies aerbicas so mais
resistentes em choque hipo e hipertnico. A propagao anaerbica reduz a resistncia
ao congelamento devido a organizao estrutural da membrana citoplasmtica e celular.
Para a conservao de uma cultura, importante conhecer a idade da cultura para se
obter uma alta viabilidade de recuperao da clula ps-estocagem. Alguns
pesquisadores indicam o inicio da fase estacionria de crescimento como fase ideal.
Dados confirmam que os microrganismos so mais resistentes ao congelamento ou
desidratao no fim do crescimento logartmico ou no inicio da fase estacionria. Com
relao ao tamanho da amostra de clulas para estocagem, recomenda-se a concentrao
inicial de 108 1010 clulas/mL.
As propriedades e caractersticas internas das clulas podem perder ou ser
influenciado pelo processo de conservao. Diferentes grupos de microrganismos
apresentam diferentes resistncias. As culturas produtoras de esporos possuem melhores
resultados de viabilidade em todos os mtodos de conservao, isto se deve pelas
pequenas quantidades de gua presente nos esporos, uma forma de preservao natural.
Os microrganismos no esporulados no possuem a mesma eficincia. E sabe-se que os
procariotos so mais resistentes que os eucariotos, bem como, as Gram positivas mais
resistentes que as Gram negativas.
Os microrganismos so fontes de uma infinidade de compostos teis ao ser
humano, a outros animais e s plantas, como antibiticos, enzimas, vitaminas,
biosurfactantes, entre outros. Portanto, de extrema importncia conservar essas
linhagens de microrganismos teis por um longo tempo.
Existem vrios centros de colees de culturas por todo o mundo, cujo objetivo
preservar a rica diversidade microbiana presente no planeta. Os mtodos de preservao
mais utilizados nesses locais so a conservao em nitrognio lquido, liofilizao, e
congelamento -80C. Essas tcnicas requerem a utilizao de um agente crioprotetor,
que evita o rompimento das clulas, como soluo 10% de glicerol (para o nitrognio
lquido e o cengelamento) e 10% de leite desnatado (para a liofilizao). Alguns
microrganismos precisam ser preservados no seu meio ativador como os da espcie
Thiobacillus. Alguns fungos necessitam de uma camada de leo para a preservao
adequada. Alguns desses centros no trabalham somente na preservao, mas tambm
na caracterizao de microrganismos, utilizando tcnicas de bioqumica e biologia
molecular. Os centros de culturas tambm podem oferecer cursos de treinamento sobre
mtodos de preservao e tcnicas de microbiologia para o aperfeioamento dos
profissionais que trabalham com cepas de microrganismos. Para se conseguir a patente
de um processo ou um produto, necessrio primeiramente depositar o microrganismo
em uma autoridade de depsito internacional (IDA International Depositary
Authority).
Um centro de cultura recebe o ttulo de IDA quando reconhecido pela WIPO
(World Intellectual Property Organization) e ento passar a receber o depsito de
microrganismos de um fornecedor, armazen-lo e fornec-lo somente a pessoa ou
instituio que realizou o depsito.
A escolha do melhor tipo de conservao muitas vezes feita aps a realizao
de testes com diferentes mtodos e constatando qual deles o mais adequado para o

microrganismo em questo. O sucesso da conservao depender do mtodo


empregado, da natureza do microrganismo, e do perodo de conservao.
A grande diferena entre a resistncia de cada clula e os resultados obtidos
durante a reativao impedem a determinao de um procedimento padro de
conservao aplicvel a todos os microrganismos.
A conservao de clulas de organismos est baseada na transio reversvel
entre um estado vital ativo (tambm chamado de biose) e um estado inativo (chamado
anabiose) ou um estado de atividade baixa (chamado hipobiose). Os estudos nessa rea
mostram que os mtodos mais eficientes so aqueles que fazem a transio para o
estado anabitico, pois o estado hipobitico tem uma aplicao mais limitada. Abaixo
esto os mtodos de conservao divididos com relao ao estado fisiolgico da clula
obtido:
Anabiose: secagem, congelamento a baixas temperaturas e liofilizao.
Hipobiose: repique contnuo, estoque em gua estril ou soluo fisiolgica,
resfriamento em temperaturas entre 4 a 8C.
Osmobiose: quando a gua extrada atravs da presso osmtica fora da
clula.
Anoxibiose: atingida atravs do cultivo em meios livres de oxignio.
O estado de anabiose encontrado tambm na natureza, como, por exemplo, em
amostras de microrganismos conservadas em geleiras na Antrtica e na Groenlndia.
Amostras de gelo tiradas de 85 metros de profundidade podem conter espcies de
microrganismos como actinomicetos, Nocadiopsis, Streptococcus albicans,
Micrococcus roseus, M. abus, e Sarcina lutea de 2200 anos atrs. Alguns pesquisadores
afirmam que bactrias congeladas em zonas de tundra conseguem sobreviver por
milhes de anos. J organismos eucariotos no so conservados com tanta facilidade
nesses locais devido a sua menor resistncia a grandes perodos de congelamento sem a
utilizao de crioprotetores. O solo tambm favorece a conservao natural de vrios
microrganismos, principalmente procariotos. Em camadas mais abaixo no solo h uma
temperatura constante de -10C com atividade de gua de 0,85, favorecendo a
conservao de alguns microrganismos.
1. MTODOS DE CONSERVAO DE MICROORGANISMOS
1.2 Mtodos de curto prazo
Para a conservao de microrganismos por um curto perodo de tempo existe a
tcnica de repicagem contnua. Atravs dela possvel preservar clulas por perodos de
30 dias a at alguns anos em alguns casos temperatura de 3 a 5C. De acordo com
alguns pesquisadores, o aumento de temperatura acima de 5C pode gerar uma perda
rpida da viabilidade celular. Em mdia leveduras so conservadas de 1 a 3 meses e
bactrias podem variar de 5 a 12 meses.
1.2.1 Repicagem contnua ou peridica
O repique contnuo, tambm chamado de subcultivo ou repicagem peridica,
uma das mais antigas tcnicas de conservao. Por ser um mtodo simples, caracterizase como tcnica tradicional de manuteno de culturas em laboratrio, sendo bastante
utilizada para se obter a viabilidade de microrganismos, principalmente de bactrias
(COSTA & FERREIRA, 1991; ROMEIRO, 2006).

O mtodo consiste na inoculao do microrganismo em meio adequado,


incubao em ambiente favorvel multiplicao e estocagem em baixas temperaturas,
aps sua multiplicao. Nesta situao, aconselhvel o armazenamento de culturas sob
refrigerao (5C a 8C), em busca da reduo do metabolismo do microrganismo e o
aumento entre os intervalos de repiques das culturas (COSTA & FERREIRA, 1991).
ROMEIRO (2006) considera que a repetio do processo para novos meios de
cultura deve ser realizada em intervalos de tempo condizentes com as necessidades e
particularidades de cada microrganismo, avaliando-se as condies timas e perodo
mximo de sobrevivncia entre as diferentes cepas. Entretanto, aconselhvel que a
transferncia de culturas seja realizada antes que o substrato do meio seja totalmente
consumido pelos microrganismos, ou antes, que o meio desidrate. Como vantagens
desde mtodo pode-se citar: simplicidade; baixo custo; no necessidade de reativao,
no provocando assim estresse ou injuria celular; e a no exigncia de equipamentos
sofisticados.
Apesar de alguns autores preconizarem o armazenamento das culturas sob
refrigerao, COSTA & FERREIRA (1991) relataram a possibilidade de incubao em
temperatura ambiente, alertando a necessidade de monitorao, a fim de evitar a
desidratao do meio de cultura e a consequente privao de elementos essenciais aos
microrganismos.
BARKER (2002) e ROMEIRO (2006) mencionaram que a repetio do processo
para novos meios deve ser realizada em intervalos de tempo condizentes com as
necessidades e particularidades de cada microrganismo, avaliando-se as condies
timas e perodo mximo de sobrevivncia entre as diferentes cepas. Entretanto,
aconselhvel que a transferncia de culturas seja realizada antes que o substrato do meio
seja totalmente utilizado pelos microrganismos, ou ento se desidrate.
PASSADOR et al. (2010) sugerem que os mtodos de repicagens peridicas para
fungos devem ser realizados em intervalos de trs ou quatro meses, a fim de evitar o
consumo total do substrato do meio de cultura e se evite o acmulo excessivo de
metablitos fngicos, j que estes se comportam como agentes mutagnicos.
Como desvantagens: apresenta maior risco de contaminao em decorrncia da
constante manipulao das culturas devido aos repiques contnuos e peridicos; perdas
de caractersticas genticas decorrentes de mutaes provenientes da intensa
multiplicao celular; necessidade de maior espao fsico para armazenamento das
culturas; logstica inconveniente quanto ao transporte; variabilidade entre as cepas e
conseqentemente entre os intervalos de repiques dos microrganismos armazenados
(COSTA & FERREIRA, 1991; ROMEIRO, 2006).
A idade das culturas influencia de forma significativa o emprego deste mtodo
de manuteno, pois culturas velhas tendem a produzir culturas-filhas alteradas, tanto
do ponto de vista morfolgico como fisiolgico. Alm do risco de comprometimento da
estabilidade gentica, a manuteno por repicagens peridicas traz consigo outro
problema considervel, a perda da patogenicidade ou virulncia, mesmo permanecendo
vivel, da a necessidade de verificao peridica das caractersticas de cada isolado
(GIRO, 2004).
MURRAY (2003) sugeriu que para minimizar o efeito da desidratao, os
isolados devem ser conservados em tubos de ensaio com tampa rosquevel ou selados
com parafina, em ambientes protegidos da luz e de variaes de temperatura, mantendo
preferencialmente uma faixa entre 5 e 8C.
COSTA & FERREIRA (1991) descreveram que este mtodo clssico, apresenta
como vantagens a facilidade e o baixo custo, por no provocar estresse ou injria celular
e no necessitar de reativao dos microrganismos. Entretanto, apresenta maior risco de

contaminao em decorrncia da constante manipulao das culturas devido aos


repiques contnuos e peridicos; perdas de caractersticas genticas decorrentes de
mutaes; necessidade de maior espao fsico para armazenamento das culturas;
logstica inconveniente quanto postagem; variabilidade entre as cepas e
consequentemente entre os intervalos de repiques para cada microrganismo armazenado
(ROMEIRO, 2006).
A idade das culturas e, principalmente, a frequncia de repicagens devem ser
avaliadas para o emprego deste mtodo de manuteno, pois, as culturas mais velhas
acabam por gerar culturas-filhas modificadas, levando-se em considerao a ocorrncia
de alteraes tanto de carter morfolgico quanto fisiolgico. Ainda assim, apesar do
risco de comprometimento da estabilidade gentica, a manuteno por repicagens
peridicas traz consigo outro problema considervel, como a perda da patogenicidade
ou virulncia de algumas bactrias, da a necessidade de verificao peridica das
caractersticas de cada isolado (COSTA & FERREIRA, 1991; ROMEIRO, 2006).
COSTA et al. (2009) descreveram que a composio do meio de cultura pode
interferir na resistncia das clulas, no entanto, existem dois conceitos que se opem
sobre qual a composio ideal de meio de cultivo na manuteno de microrganismos:
meios com boa composio de nutrientes ou meios menos elaborados, do ponto de vista
nutricional. Considerando a manuteno de bolores e leveduras, os meios devem conter
baixa concentrao de acares fermentadores para evitar o crescimento micelial
exagerado e prevenir alteraes.
Neste caso, procura-se utilizar meios que propiciem o mnimo de crescimento
micelial acompanhado do mximo desenvolvimento das frutificaes ou estruturas de
propagao e resistncia. Quanto manuteno de fungos esporulantes, preconiza-se a
utilizao de esporos e no de miclios durante a repicagem, visto que os esporos
tendem a manter as caractersticas genticas originais durante o processo de estocagem
(PIMENTEL & FIGUEIREDO, 1989; PEREIRA et al., 2008; PASSADOR et al., 2010).
1.3 Mtodos de mdio prazo
Para a conservao em mdio prazo existem algumas tcnicas que visam atingir
a hipobiose do microrganismo. Dentre essa tcnicas est a preservao em leo mineral,
em gua estril e alguns tipos de secagem.
1.3.1 Manuteno em leos
O mtodo de conservao em leo mineral foi proposto por Lumier e Chevrotier
em 1914 para a preservao do agente causador da gonorria. Esse mtodo consiste na
aplicao de uma camada de leo mineral estril de 1 cm de altura sobre uma cultura de
microrganismos em estado slido ou lquido. Essa camada de leo ir limitar a
quantidade de oxignio disponvel para o microrganismo, causando uma diminuio no
crescimento e no metabolismo, causando uma hipobiose. Foi verificado que culturas
submersas em 1cm de leo tem seu consumo de oxignio reduzido de 10% em cerca de
poucas horas. Camadas de leo superiores a 1 cm no so aconselhadas pois h uma
diminuio da viabilidade da cultura, pois o leo mineral em condies de total
exausto do oxignio extremamente txico para a maioria dos microrganismos. O leo
tambm previne a desidratao do meio de cultivo.
Se o leo for adicionado sob uma cultura em tubo inclinado, todo o meio deve ser
coberto, pois caso contrrio os microrganismos em contato com o ar funcionam como

uma abertura pela qual a gua do meio drenada e levada para o exterior, causando
desidratao total da cultura.
O mtodo de conservao de manuteno em leos uma alternativa simples
que consiste na aplicao de uma camada de leo mineral esterilizado sobre uma
cultura, a fim de limitar a quantidade de oxignio disponvel, causando assim uma
reduo no metabolismo e consequemente na taxa de multiplicao do agente
(RHODES, 1957; COSTA & FERREIRA, 1991; ROMEIRO, 2006).
CANHOS et al., (2004) e COSTA et al., (2009) afirmaram que esta tcnica
proporciona uma maior longevidade s estirpes, quando comparada repicagem
peridica, bem como reduo da velocidade de desidratao do meio de cultura. Porm,
apresentam desvantagens equivalentes tcnica de subcultivo, como a possibilidade de
contaminaes, instabilidade gentica e dificuldades com a utilizao do leo, sua
esterilizao e seu manuseio. A manuteno de culturas submersas em leo mineral
promove a reduo do consumo de oxignio em torno de 10% em poucas horas.
Porm, segundo COSTA & FERREIRA (1991) e ROMEIRO (2006), camadas
de leo superiores a um centmetro no devem ser utilizadas visto que pode ocorrer a
reduo da viabilidade dos microrganismos em condies de total exausto de oxignio.
Os leos utilizados para a conservao de microrganismos devem ser de boa
qualidade e pureza, apresentar alta viscosidade, densidade relativa entre 0,8 e 0,9
temperatura de 20C e, alm disso, no devem conter produtos txicos, sendo a parafina
e a vaselina os mais recomendados (ROMEIRO, 2006).
Outra preocupao quanto ao uso de leos neste mtodo recorre quanto ao
processo de esterilizao. Neste procedimento, deve-se evitar a formao de umidade a
fim de se eliminar riscos de contaminao e se ter um controle de temperatura, pois sua
elevao pode resultar na formao de produtos txicos aos microrganismos em
estoque.
ROMEIRO (2006) relatou a existncia de dois procedimentos possveis para a
esterilizao do leo: autoclavagem a 1atm por 30 minutos, seguida de secagem a
150C, ou aquecimento a 170C por 1 hora.
Segundo PEREIRA (2008) e PASSADOR (2010), a transferncia de culturas
preservadas por este mtodo deve ser feita para o mesmo meio de cultivo em que o
microrganismo se encontrava durante a preservao, e a retirada do microrganismo deve
acontecer aps a drenagem total da camada de leo. Dados indicam que as bactrias
podem ser conservadas por perodos de um a sete anos em leos dependendo da espcie,
enquanto fungos sobrevivem por um a cinco anos, sendo que as leveduras,
especificamente, sobrevivem at sete anos (COSTA & FERREIRA, 1991).
1.3.2 Manuteno em gua esterilizada
A preservao em gua destilada esterilizada tambm conhecida pelo mtodo de
Castellani consiste no armazenamento de microrganismos em gua estril ou soluo
salina, sendo indicada na preservao de microrganismos sensveis a baixas presses
osmticas de solues hipotnicas. O mtodo consiste na transferncia de blocos de
gar contendo os microrganismos para um frasco, com a posterior adio de uma
soluo de gua esterilizada (COSTA & FERREIRA, 1991).
Esta tcnica deve ser utilizada preferencialmente com culturas jovens, com
cerca de 10 a 15 dias e visa atingir um estgio de hipobiose, com a diminuio do
metabolismo e formao do estado latente da clula diante da restrio de fontes
nutritivas (COSTA & FERREIRA, 1991; ABREU & TUTUNJI, 2003).

Apesar do baixo custo e reprodutibilidade, sua aplicao restrita a


microrganismos que tenham grande aderncia ao Agar, como nota-se em bolores e
algumas leveduras. A utilizao de gua destilada estril como meio de manuteno tem
sido proposto com sucesso para bactrias fitopatogenas, esporos do gnero Baccillus e
vrus da hepatite. Considerando bolores e leveduras, resultados satisfatrios tm sido
obtidos no que se refere viabilidade (ABREU & TUTUNJI, 2003; PASSADOR,
2010).
PASSADOR et al. (2010) afirmam que este mtodo alm de garantir a
preservao das caractersticas originais da cultura por longos perodos, pode promover
a ausncia de contaminao por caros, apresentar baixo custo por utilizar somente gua
destilada e a necessidade de pequeno espao fsico para acondicionar os frascos, alm
de poder ser empregada para grande numero de gneros e espcies de fungos.
1.3.3 Congelamento
O congelamento consiste na conservao de microrganismos em temperaturas
relativamente baixa, entre -4C e -20C. Apresenta-se como um dos mtodos de
manuteno mais simples e baratos, alm de oferecer boa segurana para o
armazenamento de diversos microrganismos por perodos de alguns meses a dois anos
(TORTORA et al., 2011).
Como desvantagem do mtodo pode-se citar a possibilidade de reduo da
viabilidade de alguns microrganismos em funo dos danos causados s clulas
decorrentes da formao de cristais de gelo e da variao eletroltica na faixa de
temperatura utilizada (ROMEIRO, 2006).
SILVA et al. (2008), buscando avaliar a viabilidade dos microrganismos
presentes em uma coleo de cultura semearam um total de 328 leveduras do gnero
Candida, Cryptococcus, Trichosporon, Rodothorulla em caldo crebro-corao contendo
glicerol, mantendo-as sob refrigerao por sete dias e posterior congelamento a -20C.
Aps trs anos de congelamento observaram recuperao de 99% das leveduras e no
ano seguinte notaram uma reduo de viabilidade das culturas com 90,6% de
recuperao (144 leveduras). Diante dos resultados, observou-se que o emprego de
baixas temperaturas foi vantajosa por seu baixo custo, fcil execuo, alm de ter
favorecido a conservao de quase totalidade das leveduras por 48 meses.
1.3.4 Secagem
A tcnica consiste em uma suspenso do microrganismo que derramada sobre
carregadores como areia, lama, solo, carvo ativado, gros de trigo, esferas de vidro,
grnulos gelatinosos ou sintticos, papel-filtro, entre outros. Esses carregadores so
bons devido a grande superfcie e a capacidade de absorver parte da umidade para ento
serem secos temperatura ambiente ou em aquecimento de 36-40C. A secagem
tambm pode ser feita na presena de algum composto hidroflico como a slica-gel e o
petxido de fsforo.
O mtodo de preservao em tubos contendo solo ou areia estril foi idealizado e
empregado por muito tempo para a conservao de bactrias. Teve tambm aceitao
ampla em diversos laboratrios para conservao de fungos comercialmente
importantes. As tcnicas para o preparo de culturas em solo so basicamente duas.
A primeira consiste na inoculao de um pequeno volume de solo seco e estril
ou areia estril, com pequena quantidade de suspenso de esporos do fungo que se

deseja manter, seguindo-se a imediata secagem. Essa tcnica no permite o crescimento


do fungo e preserva os condios ou esporos inicialmente introduzidos no solo.
Essa a tcnica mais comumente empregada por quem usa este mtodo e foi
descrita por Greane & Fred em trabalho publicado em 1934. Inicialmente inocula-se
cerca de 5 gramas de solo rico em matria orgnica, previamente autoclavado por 1 hora
a 121 C, com 1 mL de uma suspenso concentrada de esporos, seguido pela secagem
do material a temperatura ambiente.
O armazenamento feito temperatura ambiente ou em refrigerador. A segunda
tcnica consiste na utilizao de um volume de inculo em solo umedecido e
previamente esterilizado por autoclavagem, seguido de um perodo de incubao. Esta
tcnica possibilita, para fungos, o crescimento, preservando as clulas propagativas e de
resistncia (clamidsporos esclercios, etc) alm do miclio, provenientes da
germinao do inculo inicial.
So obtidos resultados mais satisfatrios quando o solo possui de 20 a 25% de
capacidade de reteno de gua. Para a determinar esse valor de capacidade de reteno
de gua do solo pode-se colocar uma poro de solo em um funil contendo um cone de
papel-filtro umedecido e adiciona-se gua at que uma gota dgua se forme na ponta do
cone de papel. A quantidade de gua adicionada ao solo corresponde aproximadamente
capacidade de reteno de gua desse tipo de solo. Entre os tipos de solo que tm sido
utilizados para a preservao de microrganismos esto a turfa e a argila. Tambm se
pode utilizar uma combinao de solo e areia na proporo de 1:1, atingindo-se
resultados satisfatrios.
A preservao em papel-filtro pode ser feita utilizando tiras de papel de filtro de
0,5 x 2,0 cm previamente esterilizadas. Elas so imersas em suspenso microbiana e
postas a secar em ambiente fechado contendo slica-gel e armazenadas em geladeira.
Tambm se pode fazer a secagem em slica-gel. Esse mtodo consiste em
pequenos frascos de vidro com tampas metlicas que so parcialmente preenchidos com
slica-gel purificada, de malha 6-22 mesh, previamente esterilizada pelo calor, seca a
130C por 3 horas e resfriadas em congelador. A suspenso de esporos misturada com
5% de leite desnatado adicionada slica gel em quantidade suficiente para umedecer
da slica gel dos frascos. Os frascos so ento colocados por 20 minutos em banho
frio, para evitar efeitos do desprendimento de calor. Como a slica-gel libera calor
quando em contato com a gua ou suspenses aquosas h a necessidade de resfriamento
em banho de gelo para evitar danos aos microrganismos. Aps, os frascos so guardados
a temperatura ambiente. Para recuperar as culturas, alguns poucos cristais de slica so
assepticamente removidos e colocados em meio de cultura propcio ao desenvolvimento
microbiano.
As vantagens dos mtodos de secagem so o longo perodo de preservao (em
mdia de 5 ou mais anos); as modificaes morfolgicas ou fisiolgicas so reduzidas
ou praticamente eliminadas, pois so utilizados formas de resistncia como esporos; a
obteno de inculo por longos perodos, necessitando fazer somente a repicagem de
pequenas pores de solo quando se necessita reativar a cultura; e a manuteno da
capacidade esporulao do microrganismo.
No entanto, as desvantagens envolvem a utilizao desse mtodo somente para
um nmero reduzido de microrganismos (aqueles que tm a capacidade de produzir
esporos resistentes ou outras formas de resistncia), a dificuldade de se perceber
contaminaes que muitas vezes s so notadas quando durante a repicagem.
Os fungos que j foram preservados por essa tcnica so de gneros anamrficos
ou mitospricos (Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Rhizoctonia, Septoria,

Verticillium). Vrias espcies de actinomicetos e leveduras tambm j forma


conservadas dessa forma.
O mtodo de liofilizao que ser abordado mais adiante tambm realiza a
secagem da amostra, mas esse mtodo proporciona um perodo de conservao mais
longo, e por isso se encontra separado.
1.4 Mtodos de longo prazo
Os mtodos de conservao a longo prazo so bastante utilizados em
laboratrios que possuem os equipamentos necessrios e principalmente nos centros de
preservao de culturas. Dentre essas tcnicas de preservao esto a liofilizao, o
congelamento em ultrafreezers e a criopreservao em nitrognio lquido.
1.4.1 Liofilizao
A liofilizao considerada uma das tcnicas mais eficientes para a manuteno
de microrganismos, justamente por garantir viabilidade dos microrganismos por longos
perodos e ser aplicvel para a maioria deles (COSTA & FERREIRA, 1991; CANHO et
al., 2004).
O controle de qualidade de um vasto nmero de testes utiliza cepas microbianas
de referncia como controle positivo. Essas cepas so distribudas graas ao uso da
tcnica de liofilizao que garantem maior estabilidade das culturas e possibilita o
transporte a temperaturas ambientes. As desvantagens atribudas liofilizao esto
relacionadas ao tempo consumido pelo processo, ao seu custo e necessidade da
otimizao de protocolos especficos para cada tipo de clula e espcie microbiana
(PAOLI, 2005; MORGAN et al., 2006).
A tcnica se baseia na remoo da gua intracelular de materiais biolgicos
congelados, por sublimao, evitando a formao de cristais de gelo, que so capazes de
provocar danos s estruturas celulares, alm de poder degradar as enzimas presentes no
citosol, o que poderia levar morte dos microrganismos (MORGAN et al., 2006).
A liofilizao constituda por trs etapas: congelamento, desidratao primaria
e desidratao secundria. Durante o processo de congelamento pode ocorrer um dano
estrutura celular relacionado com o comportamento peculiar da gua sob condies de
baixas temperaturas. A gua congelada expande-se ao cristalizar e no processo de fuso
tende a recristalizar e aglutinar, formando longos e protuberantes cristais de gelo,
capazes de produzir uma srie de danos mecnicos, bioqumicos e osmticos clula
(CARVALHO, 2007).
O congelamento promove a inrcia do material a ser liofilizado, gerando uma
interrupo das reaes qumicas e atividades biolgicas, sendo considerada uma das
etapas mais crtica. Durante essa fase, a suspenso lquida resfriada com a formao
de cristais de gelo. medida que o processo de congelamento avana gradativamente a
gua contida no lquido congela. Isso resulta no incremento da concentrao do liquido
remanescente. Com a suspenso tornando-se mais concentrada, a viscosidade aumenta,
induzindo inibio de nova cristalizao. Esse lquido, altamente concentrado e
viscoso, solidifica, produzindo uma fase amorfa, cristalina ou amorfo-cristalina
combinada (PAOLI, 2005; COSTA et al., 2009).
Na secagem primaria a gua removida por sublimao que ocorre sob vcuo e
com a adio de calor. O calor aqui fornecido deve ser apenas suficiente para gerar o
calor latente de sublimao. A velocidade de secagem na liofilizao lenta, sendo em

mdia de 0,001C a 0,06C por segundo. Nesta primeira fase cerca de 90% da gua
retirada do produto (PAOLI, 2005; COSTA et al., 2009).
A secagem secundaria envolve a remoo da gua absorvida pelo produto, a
gua que no se separou com o gelo durante o congelamento e, conseqentemente no
sublimou. A gua no congelada deve ser adsorvida na superfcie do produto cristalino,
pois sua presena, em quantidades suficientes, pode causar a rpida decomposio do
produto, quando estocado temperatura ambiente. Neste ponto a secagem deve ser
rpida para no danificar o produto. Os frascos so ento fechados (PAOLI, 2005;
COSTA et al., 2009).
Os procedimentos de estocagem e acondicionamento influenciam
significativamente na vida de prateleira dos materiais liofilizados. Desta forma, os
produtos liofilizados, armazenados em ampolas ou frascos de vidro, devem ser
acondicionados em ambiente com baixa umidade, baixa temperatura, abrigo de
oxignio, luz e contaminantes (MORGAN et al., 2006).
Apesar de a liofilizao ser amplamente empregada na manuteno de
diferentes microrganismos, as etapas que compem o processo so capazes de causar
injurias ou danos celulares, alm da alterao na permeabilidade da membrana celular,
levando ao aumento da sensibilidade e alguns agente seletivo, aumento da fase de
latncia (ou fase lag) de multiplicao celular e a necessidade de incremento nutricional
(ABREU & TUNTUNJI, 2003; CANHOS et al., 2004).
Considerando a ampla utilizao da tcnica na manuteno de microrganismos,
verifica-se que o mtodo oferece alta estabilidade do material a ser conservado, baixa
taxa de mutao e contaminao, no requer monitoramento nem manuteno freqente,
alm de ocupar pouco espao no armazenamento. Quanto ao transporte de culturas de
referencia ou at mesmo materiais de rotina, o liofilizado pode ser transportado a longas
distancias em temperatura ambiente, no havendo necessidade de refrigerao. Como
desvantagem verifica-se a necessidade de equipamentos onerosos para a desidratao do
material, alm dos custos com o preparo das culturas (MORGAN et al., 2006).
1.4.2 Congelamento em ultrafreezer
As clulas podem ser preservadas por um longo perodo de tempo atravs do
congelamento a temperaturas de -60 a -80C. Essas temperaturas so obtidas em
ultrafrezeers.
A cultura deve ser primeiramente cultivada at a o meio ou final da fase
logartmica e centrifuga-se o meio de cultivo para recuperar as clulas. As clulas
precipitadas so ressuspendidas em soluo de criopreservante (como glicerol 10% v/v)
e estocadas em vials criognicos ou ampolas. O material ento congelado at -70C
numa taxa de resfriamento de 1 a 2C por minuto.
Para evitar a perda das culturas em caso de falta de energia, deve haver um
gerador de emergncia para manter alguns equipamentos essenciais do laboratrio
funcionando, como o freezer -80C.
1.4.3 Criopreservao
A criopreservao consiste na manuteno de uma variedade de tipos celulares
sob baixas temperaturas, tendo como objetivo maior minimizar o dano a materiais
biolgicos, incluindo tecidos, clulas animais e vegetais, bactrias, fungos e vrus
durante o processo de congelamento e estocagem a frio (WOLFE & BRYANT, 2001).

COSTA et al. (2009) relataram que apesar da existncia de diversas tcnicas de


manuteno de microrganismos, o principio do congelamento-descongelamento se
manteve entre os mais importantes e viveis para a preservao celular. Este mtodo
compreende a manuteno de materiais a baixas temperaturas, - 20C a -80C em
freezers, e a ultra-baixas temperaturas, -150C a -196C em containeres de nitrognio
liquido (WOLFE & BRYANT, 2001; PAOLI, 2005).
No processo de criopreservao, o material biolgico deve ser primeiramente
resfriado temperatura ambiente (20C), etapa esta que aparentemente no causa danos,
desde que o material esteja diludo em meio adequado. Existe, porm, uma faixa critica
de temperatura no processo de refrigerao, entre 19C e 8C, em que o material pode
ser severamente lesado quando realizado de maneira inadequada. Pode ocorrer um
choque trmico, que induz a prejuzos irreversveis como danos membrana plasmtica,
aumento da permeabilidade, com conseqente perda de ons e molculas intracelulares e
a reduo do metabolismo. O resfriamento na faixa de 19C a 8C faz com que os
lipdios da membrana plasmtica passem por uma fase de transio do estado liquido
cristalina, para o estado de gel (WATSON, 2000; OLIVEIRA, 2007; COSTA et al.,
2009).
De -6C a -15C, a gua no meio comea a cristalizar e a concentrao de soluto
na frao descongelada aumenta, enquanto a membrana plasmtica impede a formao
de cristais de gelo intracelular. A gua dentro da clula permanece descongelada e no
momento que o material alcana a temperatura critica de -60C as clulas ficam
relativamente inertes e o material pode ser imerso em nitrognio lquido, para seu
armazenamento (WATSON, 2000).
O desafio das clulas durante o processo de congelamento no sua habilidade
em resistir temperatura de armazenamento de -196C, mas sim a capacidade de
suportar as possveis alteraes que ocorrem durante a dupla passagem pelas faixas
intermediaria de temperatura, 19C a 8C e -15C a -60C, durante o congelamento e o
descongelamento (COSTA & FERREIRA, 1991; OLIVEIRA, 2007).
A efetividade na criopreservao de microrganismos depende de uma srie de
fatores como a espcie qual o microrganismo pertence, tipo de cepa, tamanho e
estrutura celular, a fase e a taxa de desenvolvimento, a temperatura de incubao, a
composio do meio de cultivo, o pH, a osmolaridade e aerao, o teor de gua da
clula, o teor lipdico e a composio do meio de congelamento, a taxa de resfriamento,
a temperatura e o tempo de estocagem, a taxa de aquecimento e o meio de recuperao
(COSTA et al., 2009).
A estocagem a baixas temperaturas, apesar de eficiente, pode comprometer a
qualidade das amostras armazenadas, visto a possibilidade de variaes de temperaturas
em freezers. J os sistemas de nitrognio lquido garantem o armazenamento a
temperaturas constante e por longos perodos (WOLFE & BRYANT, 2001; PAOLI,
2005).
A elevada taxa de sobrevivncia alcanada desperta o interesse de pesquisadores
quanto a sua utilizao, principalmente pelo aspecto pratico, visto a recuperao e
viabilidade de populaes celulares, mas tambm na reduo das possveis alteraes na
sua composio gentica. Entretanto, faz-se necessrio frisar que os protocolos de
criopreservao necessitam de adequao metodolgica para cada tipo de
microrganismo de interesse (ABREU & TUTUNJI, 2003; COSTA et al., 2009).

2. Danos provenientes da criopreservao


Deve-se chamar a ateno ao fato de que o emprego da criopreservao exerce
efeitos deletrios maioria dos materiais biolgicos, com nfase membrana celular. O
dano estrutura celular esta relacionado com o comportamento peculiar da gua sob
condies de baixas temperaturas. A gua congelada expande-se ao cristalizar e no
processo de fuso tende a recristalizar e aglutinar, formando longos e protuberantes
cristais de gelo, capazes de produzir uma srie de danos mecnicos, bioqumicos e
osmticos clula (CARVALHO 2007).
A crioinjria um evento letal. O congelamento um processo probabilstico e,
na maioria dos casos, a soluo extracelular apresenta maior volume que a intracelular.
Por essa e outras razes, o congelamento extracelular tende a ocorrer primeiro. Quando
isso acontece, os solutos contidos no meio externo se concentram numa pequena frao
de gua em estado liquido que passa a exibir maior presso osmtica. Esse mecanismo
promove o fluxo de gua para fora da clula. A alta concentrao intracelular inibe a
formao de gelo, contudo a desidratao e a elevada contrao de ons podem ser
severas o bastante para causar danos (WOLFE & BRYANR, 2001; HUBALEK, 2003).
A combinao entre os mecanismos de e fluxo de gua e a constituio de
cristais de gelo responsvel por danos irreversveis membrana e morte celular.
Portanto, alm da cuidadosa manipulao das variaes de temperatura empregadas no
processo de resfriamento e congelamento de materiais biolgicos, freqente a incluso
de substncias protetoras aos sistemas de criopreservao, conhecidas como agentes
crioprotetores, com vistas a prevenir a cristalizao, via depresso da atividade de gua
(HUBALEK, 2003).
3. Agentes crioprotetores
Agentes crioprotetores reduzem o estresse fsico e qumico derivado do
congelamento e do degelo das clulas. As caractersticas fsico-qumicas ideais para um
crioprotetor devem abranger: baixo peso molecular, alta solubilidade em gua e baixa
toxicidade celular (BUENO & GALLARDO, 1998).
A presena de um agente crioprotetor apropriado, na composio do meio
utilizado para o congelamento, geralmente aumenta a sobrevivncia de microrganismos
mantidos a temperaturas de congelamento. Esses compostos podem ser adicionados
durante o crescimento do microrganismo ou na fase anterior ao congelamento
(HUBALEK, 2003).
Estes agentes tm sido classificados de formas variadas. Uma das mais
tradicionais divises aplicadas consiste na classificao desses aditivos quanto
capacidade de penetrao em materiais biolgicos: crioprotetores penetrantes ou
intracelulares, como metanol, etilenoglicol, propilenoglicol, dimetilformaldeido,
metilacetamida, DMSO e glicero; e crioprotetores no penetrantes ou extracelulares,
como os mono, oligo, e polissacardeos, manitol, sorbitol, dextrana, metilcelulose,
polietilenoglicol entre outros (HUBALEK, 2003).
Os crioprotetores no penetrantes ou extracelulares so capazes de induzir o
aumento da osmolaridade do meio externo, gerando a passagem da gua do interior da
clula para o meio extracelular, prevenindo a formao de cristais de gelo durante o
congelamento. So particularmente apropriados preservao de microrganismos por se
fixarem superfcie microbiana formando uma camada viscosa capaz de proteger mais
efetivamente suas paredes celulares e membranas (HUBALEK, 2003).

Entre os crioprotetores penetrantes ou intracelulares destaca-se a propriedade de


realizar ligaes com as molculas de gua, minimizando a formao e o tamanho dos
cristais de gelo, bem como, reduzindo as concentraes de soluto tanto no meio
extracelular quanto no intracelular (HUBALEK, 2003).
De uma forma geral, muitas substncias com propriedades crioprotetoras
elevam a permeabilidade da membrana celular, diminuem o ponto de congelamento da
gua e de fluidos biolgicos por meio de aes coligativas. Portanto, reduzem a
concentrao de sais dissolvidos em soluo e evitam assim o choque osmtico. Alm,
dos efeitos coligativos, a ao crioprotetora de determinados compostos pode estar
relacionada com a capacidade de defender a superfcie da clula do estresse
hiperosmolar. Crioprotetores tambm podem proteger microrganismos e suas protenas
contra desidratao, destruio trmica e radiao (HUBALEK, 2003).
Apesar dos crioprotetores serem essenciais para o congelamento seguro da
maioria dos sistemas biolgicos, essas substncias no permitem a sobrevivncia de
todas as clulas, o que pode ser explicado por apresentarem efeitos txicos que
dependem principalmente da concentrao do crioprotetor utilizado bem como do
tempo de exposio da clula ao mesmo (OLIVEIRA, 2006).
4. Colees de microorganismos (Ex Situ)
Diante da diversidade biolgica que o planeta possui e a busca pelo
desenvolvimento tecnolgico e cientfico em que muitos pases se encontram, os
Ncleos ou Servios de Colees de Culturas tornaram-se responsveis por um amplo
trabalho em microbiologia, sendo responsveis na colheita, manuteno e distribuio
de microrganismos vivos e sem variaes genticas (cepas de referncia), atendendo
assim as requisies para diversos fins, incluindo atividades de ensino e pesquisa,
controle de qualidade e biotecnologia (HOLLAND et al., 2003; ABREU & TUTUNJI,
2004 ).
Atualmente existem vrios centros de colees de culturas, podendo citar os
ncleos com relevncia mundial como a ATCC (American Type Culture Collection), de
Manyland, nos EUA; a DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen) na Alemanha; o IMI (International Mycological Institute), com sede na
Inglaterra; o CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures), em Baar-Delft, Holanda; o
IFO (Institute For Fermentation), em Osaka, Japo; o JCM (Japan Collection of
Microorganisms), em Wako, Japo e a MUCL (Mycotheque De L.Universite Catholique
de Luvaim), localizada em Luvain-le-Neuve, Blgica (CAVALCANTI, 2010).
A World Federation for Culture Collections (WFCC) e a European Culture
Collection Organization (ECCO), atuam como fruns de discusso, agrupando uma
massa crtica de colees e usurios a fim de facilitar o progresso da conservao
gentica ex situ. O WFCC rene em torno de 700 scios, pertencentes a 62 pases e
conta com aproximadamente 470 colees registradas no World Data Center for
Microorganisms (WDCM). Das colees cadastradas no WDCM estima-se a
manuteno de mais de um milho de cepas, onde 44% so fungos, 43% bactrias, 2%
vrus, 1% clulas vivas e 10% espcimes como plasmdeos, plantas, clulas animais e
algas (ABREU & TUTUNJI, 2004; COSTA et al., 2009).
No Brasil, o ltimo levantamento nacional identificou a existncia de 43 ncleos
de pesquisa registrados no Centro Mundial de Dados de Microrganismos (WDCM),
porm apenas 16 prestavam servio para usurios de outras instituies. Nas 80
colees que os ncleos abrigam, esto armazenados acervos de microrganismos
associados a enfermidades em humanos, animais e plantas, destacando a Coleo de

Culturas do Instituto Adolfo Lutz So Paulo/SP; a Coleo de Culturas Tropicais


(CCT) da Fundao Tropical de Pesquisas e Tecnologia Andr Tosello Campinas/SP;
Coleo de Culturas IBSBF do Instituto Biolgico- Campinas/SP; Coleo de Culturas
da Fundao Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)- Rio de Janeiro/RJ; o Banco de Clulas do Rio
de Janeiro (BCRJ), localizado no Hospital Universitrio Clementino Fraga Filho, da
Universidade Federal do Rio de Janeiro; o Hospital de Medicina Tropical de So Paulo;
a Universidade Federal de Pernambuco e o Centro Especializado em Micologia Mdica,
da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Cear (CEMM) (ABREU &
TUTUNJI, 2004; CANHOS et al., 2004).
Diante da imensa diversidade gentica entre os microrganismos e a necessidade
de conservao destes recursos, verifica-se a importncia da intercomunicao entre os
ncleos de colees de culturas a fim de fortalecer o desenvolvimento de pesquisas no
pas, propiciando novas aplicaes biotecnolgicas dos microrganismos e possibilitando
a abertura de novas linhas de pesquisa.
5. Revitalizao de microrganismos conservados
Os requerimentos para a restaurao das culturas aps a conservao dependero
do mtodo utilizado e do tipo de microrganismo, sendo que se deve realizar testes para
determinar qual o mtodo de revitalizao da cepa mais adequado. No entanto, alguns
fatores so comuns s vrias culturas.
Amostras liofilizadas tm uma melhor restaurao das clulas quando utilizado o
mesmo meio de cultivo que foi usado para o crescimento do microrganismo antes da
liofilizao. Na recuperao de amostra de congelamento em nitrognio lquido tambm
se utiliza o mesmo princpio, utilizando meios de cultivo com mesma composio
osmtica e nutritiva.
A concentrao celular do material preservado depender da taxa de
sobrevivncia das clulas ao processo. Uma soluo de 0,2mL de amostra que foi
congelada em nitrognio lquido tem um bom crescimento em 10mL de meio lquido em
apenas 16-18 horas. A taxa de sobrevivncia de microrganismos que suportam a
liofilizao tambm bastante alta. A utilizao da concentrao inadequada de clulas
para a recuperao pode gerar um grande crescimento e excessivo nmero de geraes
de clulas, aumentando a probabilidade de ocorrncia de uma mutao.
A adio de gua destilada em amostras liofilizadas ou secas em solo para
rehidratao pode resultar na destruio de grande parte das clulas devido ao grande
choque osmtico. Deve-se usar o meio de cultivo ou solues isotnicas para evitar esse
problema.
O restabelecimento de crescimento dos microrganismos provenientes de amostra
de nitrognio lquido muito mais rpido do que amostras que passaram pelos
procedimentos de secagem, independentemente da forma em que eles foram
conservados: clulas, esporos, ou miclio vegetativo (para fungos).
Deve-se verificar tambm aps a recuperao da amostra se a cultura ainda
continua pura, atravs de microscopia ou verificao de colnias indesejveis.
Geralmente amostras que sero utilizadas em um processo industrial so testadas em
pequenos frascos para verificao desse possvel problema.

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