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CAMPO MOURO
2015
CAMPO MOURO
2015
uma abertura pela qual a gua do meio drenada e levada para o exterior, causando
desidratao total da cultura.
O mtodo de conservao de manuteno em leos uma alternativa simples
que consiste na aplicao de uma camada de leo mineral esterilizado sobre uma
cultura, a fim de limitar a quantidade de oxignio disponvel, causando assim uma
reduo no metabolismo e consequemente na taxa de multiplicao do agente
(RHODES, 1957; COSTA & FERREIRA, 1991; ROMEIRO, 2006).
CANHOS et al., (2004) e COSTA et al., (2009) afirmaram que esta tcnica
proporciona uma maior longevidade s estirpes, quando comparada repicagem
peridica, bem como reduo da velocidade de desidratao do meio de cultura. Porm,
apresentam desvantagens equivalentes tcnica de subcultivo, como a possibilidade de
contaminaes, instabilidade gentica e dificuldades com a utilizao do leo, sua
esterilizao e seu manuseio. A manuteno de culturas submersas em leo mineral
promove a reduo do consumo de oxignio em torno de 10% em poucas horas.
Porm, segundo COSTA & FERREIRA (1991) e ROMEIRO (2006), camadas
de leo superiores a um centmetro no devem ser utilizadas visto que pode ocorrer a
reduo da viabilidade dos microrganismos em condies de total exausto de oxignio.
Os leos utilizados para a conservao de microrganismos devem ser de boa
qualidade e pureza, apresentar alta viscosidade, densidade relativa entre 0,8 e 0,9
temperatura de 20C e, alm disso, no devem conter produtos txicos, sendo a parafina
e a vaselina os mais recomendados (ROMEIRO, 2006).
Outra preocupao quanto ao uso de leos neste mtodo recorre quanto ao
processo de esterilizao. Neste procedimento, deve-se evitar a formao de umidade a
fim de se eliminar riscos de contaminao e se ter um controle de temperatura, pois sua
elevao pode resultar na formao de produtos txicos aos microrganismos em
estoque.
ROMEIRO (2006) relatou a existncia de dois procedimentos possveis para a
esterilizao do leo: autoclavagem a 1atm por 30 minutos, seguida de secagem a
150C, ou aquecimento a 170C por 1 hora.
Segundo PEREIRA (2008) e PASSADOR (2010), a transferncia de culturas
preservadas por este mtodo deve ser feita para o mesmo meio de cultivo em que o
microrganismo se encontrava durante a preservao, e a retirada do microrganismo deve
acontecer aps a drenagem total da camada de leo. Dados indicam que as bactrias
podem ser conservadas por perodos de um a sete anos em leos dependendo da espcie,
enquanto fungos sobrevivem por um a cinco anos, sendo que as leveduras,
especificamente, sobrevivem at sete anos (COSTA & FERREIRA, 1991).
1.3.2 Manuteno em gua esterilizada
A preservao em gua destilada esterilizada tambm conhecida pelo mtodo de
Castellani consiste no armazenamento de microrganismos em gua estril ou soluo
salina, sendo indicada na preservao de microrganismos sensveis a baixas presses
osmticas de solues hipotnicas. O mtodo consiste na transferncia de blocos de
gar contendo os microrganismos para um frasco, com a posterior adio de uma
soluo de gua esterilizada (COSTA & FERREIRA, 1991).
Esta tcnica deve ser utilizada preferencialmente com culturas jovens, com
cerca de 10 a 15 dias e visa atingir um estgio de hipobiose, com a diminuio do
metabolismo e formao do estado latente da clula diante da restrio de fontes
nutritivas (COSTA & FERREIRA, 1991; ABREU & TUTUNJI, 2003).
mdia de 0,001C a 0,06C por segundo. Nesta primeira fase cerca de 90% da gua
retirada do produto (PAOLI, 2005; COSTA et al., 2009).
A secagem secundaria envolve a remoo da gua absorvida pelo produto, a
gua que no se separou com o gelo durante o congelamento e, conseqentemente no
sublimou. A gua no congelada deve ser adsorvida na superfcie do produto cristalino,
pois sua presena, em quantidades suficientes, pode causar a rpida decomposio do
produto, quando estocado temperatura ambiente. Neste ponto a secagem deve ser
rpida para no danificar o produto. Os frascos so ento fechados (PAOLI, 2005;
COSTA et al., 2009).
Os procedimentos de estocagem e acondicionamento influenciam
significativamente na vida de prateleira dos materiais liofilizados. Desta forma, os
produtos liofilizados, armazenados em ampolas ou frascos de vidro, devem ser
acondicionados em ambiente com baixa umidade, baixa temperatura, abrigo de
oxignio, luz e contaminantes (MORGAN et al., 2006).
Apesar de a liofilizao ser amplamente empregada na manuteno de
diferentes microrganismos, as etapas que compem o processo so capazes de causar
injurias ou danos celulares, alm da alterao na permeabilidade da membrana celular,
levando ao aumento da sensibilidade e alguns agente seletivo, aumento da fase de
latncia (ou fase lag) de multiplicao celular e a necessidade de incremento nutricional
(ABREU & TUNTUNJI, 2003; CANHOS et al., 2004).
Considerando a ampla utilizao da tcnica na manuteno de microrganismos,
verifica-se que o mtodo oferece alta estabilidade do material a ser conservado, baixa
taxa de mutao e contaminao, no requer monitoramento nem manuteno freqente,
alm de ocupar pouco espao no armazenamento. Quanto ao transporte de culturas de
referencia ou at mesmo materiais de rotina, o liofilizado pode ser transportado a longas
distancias em temperatura ambiente, no havendo necessidade de refrigerao. Como
desvantagem verifica-se a necessidade de equipamentos onerosos para a desidratao do
material, alm dos custos com o preparo das culturas (MORGAN et al., 2006).
1.4.2 Congelamento em ultrafreezer
As clulas podem ser preservadas por um longo perodo de tempo atravs do
congelamento a temperaturas de -60 a -80C. Essas temperaturas so obtidas em
ultrafrezeers.
A cultura deve ser primeiramente cultivada at a o meio ou final da fase
logartmica e centrifuga-se o meio de cultivo para recuperar as clulas. As clulas
precipitadas so ressuspendidas em soluo de criopreservante (como glicerol 10% v/v)
e estocadas em vials criognicos ou ampolas. O material ento congelado at -70C
numa taxa de resfriamento de 1 a 2C por minuto.
Para evitar a perda das culturas em caso de falta de energia, deve haver um
gerador de emergncia para manter alguns equipamentos essenciais do laboratrio
funcionando, como o freezer -80C.
1.4.3 Criopreservao
A criopreservao consiste na manuteno de uma variedade de tipos celulares
sob baixas temperaturas, tendo como objetivo maior minimizar o dano a materiais
biolgicos, incluindo tecidos, clulas animais e vegetais, bactrias, fungos e vrus
durante o processo de congelamento e estocagem a frio (WOLFE & BRYANT, 2001).
Referncias