8 Aula, 1 parte Mecanismos de carcinognese IV: alteraes

epigenticas I
Nota: O captulo da 8 aula j contempla o resumo do 14 artigo, apresentado na bibliografia
complementar;

Epigentica e seus mecanismos de regulao

Inicialmente Conrad Waddington
definiu a epigentica como o mecanismo
capaz de regular a expresso fenotpica,
atravs da interao entre o genoma e o
ambiente, por exemplo. Existem outras
definies
avanadas
por
outras
personalidades cientficas, mas de uma
maneira geral predomina a ideia da
interao entre o ambiente e o material
gentico, sob a forma de um () cdigo
qumico e fsico encriptado, escrito sobre a
prpria sequncia nucleotdica do DNA.
(s. 3, Jane Qiu, 2006). Quer-se com isto dizer que, para alm do que est escrito na sequncia de DNA,
h um outro tipo de informao capaz de regular a nossa expresso gentica. A importncia da
influncia do ambiente sobre a expresso do nosso material gentico inegvel, sobretudo aps a
constatao de que gmeos monozigticos separados nascena, e por isso submetidos a estmulos
ambientais diferentes, podem desenvolver fentipos semelhantes mas facilmente distinguveis
(imagem em cima, retirada do Alberts Molecular Biology of the Cell). No s. 8 apresentado mais um
exemplo de discordncia fenotpica entre gmeos monozigticos.
Um outro exemplo simples da importncia da regulao epigentica o da diferenciao
celular. Qualquer um dos nossos precursores celulares neuronais, assim como os hepticos ou at de
epitlio respiratrio, possuem exatamente a mesma informao gentica no seu ncleo mas ainda
assim apresentam fentipos citolgicos claramente distintos. O que determina esse silenciamento de
uns genes e ativao de outros, permitindo assim a obteno de diferenciao celular? A regulao
epigentica desempenha um papel importantssimo na diferenciao de cada um dos nossos tipos
celulares, conjuntamente com outros mecanismos de regulao da expresso de material gentico.
,

Ao contrrio das mutaes nucleotdicas somticas, as alteraes epigenticas caraterizam-se

pela sua reversibilidade, assim como pelo padro gentico que persiste durante a diviso mittica
e/ou meitica, por uma ou mais geraes celulares (no caso da mitose).
Esta informao epigentica, para alm de determinar um diferente fentipo de fisionomia
em gmeos monozigticos, tambm se manifesta pela discordncia fenotpica na propenso para
doenas mentais, por exemplo, ou at mesmo o cancro.
De uma forma genrica podemos dividir material genmico nuclear em eucromatina e
heterocromatina. A cromatina corresponde ao DNA associado s suas protenas de suporte, como o
caso das histonas. A eucromatina a poro da cromatina que acessvel maquinaria de transcrio,
e por isso codifica para os genes ditos ativos em cada clula (eu vem de verdadeiro, em Grego).
Ao resto da cromatina, mantida num grau de condensao mais elevado e por isso com um aspeto
mais eletrodenso em microscopia eletrnica, designamos por heterocromatina. O maior grau de

condensao reflete a sua inatividade em termos trancricionais, ou seja, no est a ser utilizada para
transcrever nenhum gene.
A heterocromatina pode ainda ser dividida em dois tipos principais (1 aula terica da unidade
curricular de Gentica Mdica, 2013/2014):
Heterocromatina constitutiva
o Contm centrmeros, telmeros e outras sequncias repetitivas. Estas
sequncias esto consistentemente condensadas (logo, inativas) em todas clulas
do organismo;
Heterocromatina facultativa (s. 7)
o A eucromatina que foi epigeneticamente silenciada, como acontece na normal
diferenciao de um entercito (p. ex.), organizada sob a forma de
heterocromatina. Ao contrrio da heterocromatina constitutiva, esta poder ser
recrutada pela alterao epigentica, pelo que expectvel que, dentro do
mesmo organismo, algumas clulas contenham genes em heterocromatina
facultativa, enquanto outras apresentam esses mesmos genes sob a forma de
eucromatina;
Os fenmenos de imprinting, diferenciao tecidular e inativao do cromossoma X (o mesmo
que lionizao) resultam no aparecimento de heterocromatina facultativa, a partir de fenmenos
de regulao epigentica. A tumorignese por mecanismos epigenticos tambm capaz de interferir
com a quantidade de material nuclear que se encontra organizado em heterocromatina facultativa.
Os principais mecanismos epigenticos que permitem o controlo epigentico do genoma so
(s. 6):
Metilao Adio de grupos metilo (-CH3) a sequncias nucleotdicas ou em histonas;
Modificaes ps-translacionais das histonas - Quer por acetilao, desacetilao,
metilao, entre outros (desenvolvido mais frente);
RNAs no codificantes Como o caso dos micro RNAs (miRNAs);
Remodeladores de cromatina;

Metilao do DNA
A metilao dos cidos desoxirribonucleicos ocorre sempre ao nvel das bases azotadas de
citosina, produzindo assim 5-metilcitosina (reao do s. 8). As enzimas responsveis pela catlise
dessa reao so as DNA metiltransferases (DNA MTases). Existem trs tipos principais de DNA
MTases (s. 12):
DNMT1
DNMT3A
DNMT3B
Note-se ainda que, no s. 8, enunciada a molcula de SAM (S-adenosyl-methionine) que
convertida em SAH (S-adenosyl-homocystein), um passo fundamental na metilao das citosinas pois
esta a fonte dos grupos metilo que so transferidos para as bases azotadas de citosina.
A metilao das citosinas no interfere na sua capacidade de emparelhamento com bases
azotadas de guanina, da mesma maneira que a troca de um nucletido de timina (DNA) por um uracilo
(RNA) no interfere na ligao complementar com adeninas.

As alteraes epigenticas por metilao podem ser herdadas, quer pela mitose, como pela
meiose, devido ao de uma enzima denominada por metiltransferanse de manuteno
(maintenance methylase, no esquema em baixo). A metiltransferase de manuteno corresponde
DNMT1 anteriormente referida, sendo a DNMT3A e a DNMT3B responsveis por metilaes de novo
(ou seja, em citosinas "novas", sem que haja um padro hereditrio prvio). Conforme se pode
observar pelo esquema, a enzima capaz de reconhecer os nucletidos de 5-metilcitosina na cadeia
parental (ou seja, que serve de molde replicao semiconservativa do DNA), para depois "metilar"
os nucletidos complementares presentes na cadeia filha. Fica assim explicado como que um
precursor eritrocitrio, por exemplo, capaz de "lembrar" as suas clulas-filhas que estas tm de se
diferenciar na linhagem celular rubra.

Dinucletidos CpG (s. 9)

A metilao de DNA tende a ocorrer em
citosinas pertencentes a um dinucletido do tipo CpG.
No canto inferior direito (s. 8) encontra-se
delineada a azul uma pequena parte de uma sequncia
nucleotdica, composta por um nucletido de guanina e
outro de citosina. De uma maneira genrica estes
dinucletidos so representados pela notao CpG,
onde o p representa a ligao fosfodister
estabelecida entre o grupo fosfato (circunferncia a
vermelho no s. 8) e as bases em questo. A utilizao da
notao CpG serve para o propsito de no se
confundir este tipo de ligao - atravs de um grupo
fosfato (imagem de cima, direita) -, com uma ligao
complementar entre uma citosina de uma cadeia
nucleotdica e uma guanina de outra cadeia que lhe seja
complementar (imagem de baixo, direita).
Cerca de 20% dos dinucletidos CpGs do
genoma encontram-se agrupados em ilhas CpG. As ilhas CpG correspondem a sequncias de cerca de
1000 a 2000 pares de bases, com uma grande densidade de dinucletidos do tipo CpG, quando
comparadas com o resto do genoma.

 partida seria expectvel que os nucletidos se distribussem de forma aleatria, ao longo de

todo genoma, pelo que no far sentido que existam estas ilhas CpG. Na verdade os nucletidos no
se distribuem de uma forma totalmente aleatria no ser Humano, sobretudo porque as citosinas
metiladas tendem a desaparecer do genoma ao longo de uma escala de tempo evolutiva, isto , ao
longo de toda evoluo biolgica mais de 75% das citosinas metiladas acabaram por sofrer uma
mutao por transio 5-C:T (uma 5-metil-citosina transforma-se numa timina).
Uma base de citosina no-metilada pode, acidentalmente, ser desaminada e converter-se em
uracilo. Estas mutaes no surtem grande efeito porque a enzima uracilo DNA glicosilase capaz de
reconhecer esse nucletido e proceder sua exciso, para que posteriormente possa substitu-lo por
uma nova citosina. As citosinas metiladas tambm podem sofrer desaminaes acidentais,
convertendo-se num outro nucletido - neste caso, uma timina. Uma vez que o uracilo no uma
base azotada tpica de cidos desoxirribonucleicos, mais fcil para as enzimas de reparao
reconhecerem uma desaminao de uma citosina no metilada, do que uma desaminao de
citosinas-metiladas que resulta na mutao para uma timina estas timinas so indistinguveis de
qualquer outra timina desoxirribonucleica.
Existem sistemas enzimticos capazes de reconhecer as timinas que tm origem na
desaminao acidental de 5-metilcitosinas, mas a sua eficcia reduzida precisamente porque no
fcil a identificao de timinas derivadas de mutao e timinas geneticamente herdadas. por este
motivo que, em escalas de tempo evolutivas, se verifica uma evidente tendncia para a perda de
citosinas metiladas no genoma. Desta forma torna-se claro o porqu de as sequncias de CpG
acabarem por se aglutinar naquilo a que chamamos de ilhas CpG.
A metilao do DNA pode ocorrer em CpGs presentes em diferentes regies do genoma (s. 9)
Ilhas CpGs presentes nas regies promotoras ou nos primeiros exes
o Salvo algumas excees importantes, estas ilhas tendem a permanecer no-metiladas
(60% dos promotores de genes Humanos s. 10) na maioria genes do tipo
housekeeping (codificam para protenas essenciais ao metabolismo de qualquer
clula, por exemplo)
CpG shores
o Por "CpG island shores" entende-se a "costa das ilhas CpG", ou seja, no mesmo o
ncleo das ilhas de CpG, mas sim sequncias algo perifricas com uma densidade
menor de dinucletidos CpGs. Estes que so os locais de verdadeira metilao
epigentica, que determina a diferenciao fenotpica celular;
CpG nas regies codificadoras em cerca de 30% destas sequncias;
CpG em sequncias repetitivas 10%;
Ao contrrio do que acontece com as ilhas de CpG associadas a promotores, as ilhas CpGs de
sequncias repetitivas longas tendem a ser metiladas, para que se reduza a instabilidade
cromossmica este ser um aspeto que talvez se torne mais evidente ao longo desta discusso, pelo
que ser oportunamente discutido mais frente.
A metilao de ilhas de CpG em promotores poder determinar, por exemplo, fenmenos de
imprinting mas no s: em vrios tipos de cancro verificam-se fenmenos de metilao de regies
promotoras com ilhas CpG.

Padro de metilao do DNA (s. 11)

Apesar de os padres de metilao tambm serem transmitidos aos gmetas (a partir da
diviso meitica), aps a fertilizao verifica-se uma desmetilao abrangente de praticamente todo
o genoma do indivduo repare-se na barra Demethylation no esquema do s. 11, onde se pode
observar que acompanha todo o desenvolvimento do zigoto at formao de um aglomerado de 8
clulas. Ainda no se sabe ao certo como este processo ocorre, mas as principais hipteses so:
Perda passiva de metilaes aps a diviso celular
o A inatividade das metiltransferases de manuteno facilmente resultar numa
perda do padro de metilao, uma vez que nas primeiras divises celulares
apenas as cadeias parentais estariam metiladas, acabando por "diluir" essa
regulao epigentica medida que o nmero de divises aumenta;
Eventual presena de uma enzima de desmetilao, revertendo o efeito das DNA MTases;
Durante a gastrulao restabelecido o padro de metilao caraterstico das clulas
somticas normais adultas (De Novo Methylation, no s. 11), na sua maioria exatamente com a mesma
configurao que havia sido herdada dos progenitores. Apesar de j se conhecerem estes factos, a
questo ainda persiste: Qual o mecanismo responsvel por "guardar memria" do padro de
metilao herdado, mesmo aps este ter sido "apagado?.

Metilao e a tumorignese
No caso do cancro, a metilao dos promotores com ilhas CpG e/ou CpG shores facilita o
recrutamento de protenas de ligao ao DNA-metilado, impedindo assim que se liguem fatores de
transcrio que numa clula saudvel iriam promover a transcrio do gene a jusante. precisamente
isso que ilustrado na sequncia de imagens Gene silencing, no s. 13: o promotor no metilado
acessvel pelos fatores de transcrio e a RNA polimerase (a verde, TF e RNA pol.), enquanto na clula
neoplsica h um bloqueio notrio pela presena de nucletidos 5-metilcitosina. Tambm na figura 1
do 14 artigo se verifica que a hipermetilao tumorignica afeta sobretudo as regies dos
promotores, ricas em ilhas CpG e costas de ilhas de CpG (CpG Island shores), impedindo a ligao
correta dos fatores de transcrio, e assim resulta numa expresso deficiente dos genes a jusante.
O promotor do gene BRCA1 um dos exemplos de genes envolvidos na tumorignese, com
um promotor constitudo por ilhas CpG. Este tambm um bom exemplo de um gene do tipo
housekeeping, uma vez que responsvel por codificar complexos proteicos de reparao de DNA,
tanto em clulas mamrias como noutras clulas com outro tipo de diferenciao. Para outros
exemplos consultar a tabela 2.4, s. 14.
Os restantes esquemas do s. 13 evidenciam a hipometilao caraterstica das clulas
neoplsicas ao nvel as sequncias gnicas (genes propriamente ditos, representados em Gene
transcription), assim como das sequncias repetitivas (genomic instability). No caso dos genes isto
resultar numa leitura errada da sequncia nucleotdica:
Uns fatores de transcrio ligam-se no incio do gene e permitem a leitura de quase toda
a sequncia nucleotdica;
Outros apenas iniciaro a meio do gene;
Isto ser problemtico para a clula uma vez que levar a uma traduo deficiente da
sequncia gnica em causa.
A transcrio de sequncias repetitivas, como o caso de retrotransposes, aumenta a
instabilidade genmica porque estes elementos mveis podem gerar novas configuraes da

sequncia nucleotdica, alterando a expresso de genes ou at mesmo a prpria conformao

cromossmica.
Epigentica na hiptese dos dois eventos de Knudson (5 aula)
No s. 15 est esquematizado todo o percurso tumorignico em genes supressores tumorais,
nos quais necessria a perda de expresso dos dois alelos para que se desenvolva a neoplasia. Como
j havia sido referido na 5 aula, segundo a hiptese de Knudson so necessrios dois eventos de
mutao para que se inicie a tumorignese, sendo que no caso dos cancros familiares esse primeiro
evento j herdado dos progenitores, originando assim as formas familiares de cancro, como o caso
do sndroma de Lynch, por exemplo, mas tambm o do retinoblastoma.
Este o momento oportuno para salientar a importncia das alteraes epigenticas na
tumorignese, uma vez que estas podero ser tambm incorporadas nesta hiptese dos dois eventos.
De facto, 50% dos genes que causam as formas familiares de cancro, sofrem metilao na respetivas
formas espordicas, ou seja, o resultado final poder ser o mesmo, quer haja mutao ou metilao.
Nos casos familiares at frequente que a metilao acabe por assumir o papel de segundo hit ou
evento (s. 15).
O esquema inferior do s. 15 demonstra que possvel chegar ao mesmo cancro s com
mutaes (mutao e depois LOH Loss of heterozigoty. Rever 5 aula para melhor compreenso do
que o LOH), s com metilaes ou pela conjugao destess dois processos tumorignicos. O que no
ocorre simultaneamente a mutao e a metilao no mesmo alelo a metilao e a mutao so
mutuamente exclusivas num mesmo alelo.
No s. 16 evidenciada o impacto equivalente de uma metilao (exemplo da alnea d)), em
comparao com a mutao por deficincias no sistema de reparao (exemplo b)) ou por quebras da
cadeia de DNA (c)). Neste exemplo do efeito da metilao sobre o DNA ilustrada a interao entre
bases de 5-metil-citosina e agentes alquilantes, como o caso dos benzopirenos (abordada a seguir,
em metilao de regies codificantes).
Metilao em regies codificantes (s. 17)
A hipometilao de regies codificantes contribui para o desenvolvimento de neoplasias, por
permitir a ligao incorreta de fatores de transcrio e maquinaria enzimtica responsvel pela
transcrio gentica (RNA polimerase, p. ex.). Contudo, segundo Jones e Baylin (s. 17), a presena de
5-metil-citosinas ao nvel das regies codificantes poder tambm contribuir para o desenvolvimento
neoplsico, no por determinar uma ligao incorreta da maquinaria de transcrio, mas porque
poder predispor para a ocorrncia de mutaes:
Desaminao espontnea
o Como j foi referido anteriormente, as 5-metil-citosinas tm um potencial
mutagnico intrnseco pois espontaneamente sofrem fenmenos de
desaminao, convertendo-se em bases azotadas de timina;
o Temos uma mutao por transio CT;
o 50% das mutaes pontuais inativadoras na regio codificante do supressor
tumoral TP53 ocorrem em citosinas metiladas;
Resultando em cerca de 50% dos tumores espordicos de clon;

 Maior absoro de radiao ultra-violeta:

o A presena do grupo metilo desvia o espetro de absoro da citosina para uma
gama de comprimentos de onda coincidentes com os da luz solar, tornando assim
a regio codificadora mais suscetvel ocorrncia de mutaes, principalmente
associadas ao cancro da pele;
o As mutaes so do tipo transio CCTT
Maior capacidade de ligao a benzopirenos
o A metilao aumenta a afinidade dos benzopirenos pela regio codificante,
facilitando assim a ocorrncia de mutaes do tipo GT;
o Mecanismo responsvel por cerca de 32% das neoplasias do pulmo;
Hipometilao e perda de imprinting (s. 19, 20, 21, 22, 23 e 24)
As neoplasias benignas e os estadios precoces de tumores agressivos apresentam-se
frequentemente com aberraes de metilao de DNA: hipometilao global do DNA e
hipermetilao especfica nos promotores, o que confere alguma solidez hiptese de que a
desregulao epigentica possa preceder transformaes tumorais, como quando ocorre com
mutaes em genes supressores tumorais, proto-oncogenes e instabilidade genmica.
A perda de metilao dos dinucletidos CpG foi a primeira alterao epigentica a ser
identificada em clulas tumorais (Feinberg e Vogelstein, 1983). Esta perda de metilao em
promotores que estavam previamente silenciados permite a perda de diferenciao celular,
caraterstica do crescimento neoplsico.
Um estudo recente de grande escala de metilao do DNA com o uso de microarrays
genmicos detetou extensas regies genmicas hipometiladas em reas no codificantes (Weber et
al., 2005).
Durante o desenvolvimento de uma neoplasia, o grau de hipometilao do DNA genmico
aumenta medida que a leso progride de uma proliferao de clulas benignas, para um cancro
invasivo (Fraga et al., 2004). De entre os genes possivelmente afetados pela hipometilao temos:
Genes reguladores do desenvolvimento embrionrio e crescimento
o Que deveriam estar silenciados;
Genes especficos de tecido, tais como antignios de clulas germinativas, especficos do
tumor em causa
o A famlia dos genes MAGE, BAGE, LAGE e GAGE no expressa em clulas adulta
normais;
Oncogenes que esto sobrexpressos devido a hipometilao, como o caso do c-MYC,
BCL2, B-CLLe R-RAS (cancro gstrico).
Como j foi referido anteriormente, o prprio fenmeno de imprinting depende de uma
metilao ntegra de um dos alelos, para que no haja sobrexpresso do gene. A desmetilao de
um gene que sofreu imprinting provoca uma expresso biallica. O tumor de Wilms (s. 23) um
exemplo de uma neoplasia em que 50% dos casos ocorrem com hipometilao, mais concretamente
por perda de imprinting (LOI Loss Of Imprinting do gene IGF2 (insulin-like growth factor-2) h uma
maior expresso deste sinalizador de crescimento celular). O LOI no IGF2 comum em indivduos
adultos e est associado a um risco 5 vezes superior de desenvolvimento de neoplasia colo-retal.

A expresso excessiva de IGF-2 tambm est associada aos nefroblastomas. Quando todas as
clulas perdem o seu imprinting original (LOI) estamos perante um sndroma de BeckwithWiedemann.
possvel que epimutaes, isto , mutaes, delees ou expresses alteradas da
maquinaria epigentica (enzimas de metilao, p. ex.) constituam o 2nd-hit na tumorignese o
segundo evento necessrio tumorignese, segundo a hiptese dois dois-eventos proposta por
Knudson (5 aula).
As desregulaes epigenticas mais conhecidas em tumores Humanos so os silenciamentos
de genes supressores tumorais, resultantes de hipermetilao de promotores com CpG islands, como
o caso do:

CDKN2A;
MLH1 (recorde-se, envolvido no sndroma de Lynch);
BRCA1;
VHL;

Modificao de histonas (s. 25)

As histonas so complexos proteicos que
entram na constituio do nucleossoma da cromatina.
O centro dos nucleossomas compostos por um
octmero de histonas (esquema do lado direito;
imagem do s. 26):

Duas histonas H2A;

Duas histonas H2B;
Duas histonas H3;
Duas histonas H4;

A histona H1 dispem-se perifericamente ao

nucleossoma e no est envolvida na modulao
epigentica. Todas as outras podero ser alvo de modificao epigentica, ao nvel do seu terminal
amino (mais corretamente descrito como a cauda terminal-N). Esta modificao consiste na adio
covalente de um ou vrios grupos qumicos funcionais (figura 4-38 do Alberts, apresentada a seguir):
Acetilao de lisinas
o acrescentado um grupo acetil aos resduos de lisina, presentes na cadeia
polipeptdica das histonas;
Metilao de lisinas
o Poder ser uma monometilao, di ou at trimetilao, conforme se observa na
figura 4-38 (apresentada a seguir) e no s. 27;

 Fosforilao de serinas;

Estas modificaes podem ocorrer na cauda de qualquer uma das histonas pertencentes ao
octmero (excluindo assim a H1). tambm possvel que haja modificaes ao nvel de aminocidos
que se localizam no centro do octmero, mas essa no uma discusso de interesse para o tema do
papel da epigentica no cancro.
As histonas que apresentam uma cauda-N com maiores dimenses so as H3 e a H4, pelo que
naturalmente sero as protenas mais frequentemente modificadas.
Existem enzimas especficas para cada tipo de modificao, assim como para cada local das
histonas que sofre essa mesma modificao. De entre essas vrias enzimas temos:
Grupos acetil
o Acetiltransferases de histonas (HAT) - Para adicionar grupos acetil;
o Desacetiltransferases de histonas (DHACs) e sirtunas - Para remover grupos acetil;
Grupos metilo
o Metiltransferases - Adicionar metilos;
o Demetiltransferases - Remover metilos;
Grupos fosfatos
o Cinases - Adicionar fosfatos;
o Fosfatases Remover esses grupos fosfatos;
Ubiquitinas
o Ligases de ubiquitinas;
o Desubiquitinases;
Entre outras;

Estas modificaes tm implicaes importantes na ativao ou inativao de genes. Tome-se

o exemplo da acetilao de lisinas, que acaba por lhes retirar carga positiva e assim perder a afinidade
para o DNA, tornando-o mais acessvel para replicao, por exemplo (s. 30 as HATs adicionam grupos
acetil e por isso tornam o material gentico ativo; As HADCs removem grupos acetil, inativando o
material gentico note-se que a legenda da imagem est cruzada, e por isso no est totalmente
concordante com a disposio do ttulo do slide Inativo/Ativo).
No s. 24 apresentado um exemplo de interao entre dois mecanismos epigenticos numa
clula neoplsica, impedindo assim a transcrio gnica: a metilao de um promotor (pontos a negro
sobre as sequncias mais esquerda) recruta MBPs (Methycytosine-binding proteins), protenas que
se ligam sequncias metiladas, que por sua vez recrutam outros complexos proteicos que contm
DNMTs e HDACs, culminando numa alterao de conformao da cromatina que eventualmente
provoca a represso da transcrio gnica.
Cdigo das histonas (s. 26)
O nmero de modificaes possveis num nucleossoma individual enorme, mas geralmente
tendem a surgir em padres, isto , modificaes num aminocido so acompanhadas por outras
modificaes especficas noutros aminocidos - p. ex., uma acetilao no aminocido 9 pode ser
sempre acompanhada de uma metilao do 27 (tudo isto na mesma histona, mas os padres podero
envolver vrias histonas, presentes em nucleossomas diferentes). Muitas destas combinaes
parecem ter um significado especial para a clula, pois determinam como e quando o DNA associado
dever ser acessvel. Diz-se que estas modificaes constituem a hiptese do cdigo de histonas: um
tipo de padro de modificaes pode determinar que aquele excerto de cromatina seja reparado, por
exemplo, ou ento que no deva ser expresso.
Como exemplos de padres de modificao de histonas temos os do s. 28, ou ainda os que
so apresentados no final do 3 pargrafo, do 14 artigo da bibliografia complementar:
Exemplo de padro de ativao
o Trimetilao das lisinas 4, 36 ou 79 na histona 3
H3K4me3, H3K36me3 ou K3HK79me3
H3, da histona 3; K, representa o resduo de lisina; K#, o nmero do
resduo de lisina; me3, de trimetilao (poderia ser me2, se fosse uma
dimetilao);
o Monometilao da lisina 20, na histona 4, e da lisina 5 da histona 2B
H4K20me e H2BK5me;
o Acetilao da lisina 9 e 14, da histona 3
H3K9ac e H3K14ac;
Exemplo de padro de represso
o Di ou trimetilao H3K9
H3K9me2 e K3K9me3;
o Trimetilao H3K27;
o Metilao da lisina 20 da histona 4;
Nota: A substituio do K pelo R no padro de metilao determina que, em vez de ser uma lisina,
uma arginina que modificada (s. 27)

Alterao do padro das modificaes das histonas em clulas neoplsicas (s. 29)
Em concordncia com os exemplos de modificaes de histonas supracitados, no s. 29
apresentado um esquema geral do tipo de modificaes das histonas presentes em clulas saudveis
e clulas neoplsicas:
Clula normal
o Nas regies codificantes h um predomnio das acetilaes que, tal como tambm j
foi referido, facilitam o acesso da maquinaria de transcrio ao interior da cromatina,
aumentando assim a capacidade transcripcional. Note-se que tambm existem
metilaes, mas so as acetilaes que predominam;
o As metilaes parecem surgir mais significativamente nas zonas reprimidas, isto ,
nas zonas de heterocromatina;
Clula neoplsica
o O padro inverte-se: acetilaes mais significativas na heterocromatina e metilaes
nas zonas de regies codificantes;
Regulao dinmica da metilao das histonas (s. 31, 32, 33 e 34)
No s. 31 reforada a ideia de que as enzimas de modificao de histonas so especficas para
cada resduo, isto , tomando o exemplo da enzima EZH2 percebemos que esta especfica para a
trimetilao apenas do resduo 27 de lisina para o nmero 9 temos muitas outras enzimas.
Atualmente j se conhece uma grande quantidade de enzimas que modificam o cdigo de
histonas (s. 32 e 33) e que por isso podero estar envolvidas na tumorignese. A enzima SMYD3, que
uma HMT (Histone methyl-transferase) caraterstica do H3K4, est sobrexpressa em
hepatocarcinomas e cancro colo-retal, por exemplo.
Nota: Apesar de ser ilegvel a tabela do s. 32, o exemplo da SMYD3 apresentado no s. 33 e no 14
artigo;
a inter-relao entre fenmenos epigenticos de metilao de DNA ou a partir do cdigo de
histonas que se estabelece o epigenoma, ou seja, a informao acerca da expresso ou represso
gnica que no codificada pela sequncia nucleotdica. No s. 34 apresentado um esquema que
rene a metilao de DNA e a modificao de histonas, numa comparao entre clulas saudveis e
outras neoplsicas.

RNAs no-codificantes (ncRNA)

Atualmente um lugar comum dizer que a maior parte do nosso DNA corresponde a junk
DNA, isto , sequncias no codificantes sem importncia para a nossa sobrevivncia, ainda que esta
seja uma ideia cientfica, pelo menos em parte, com os seus dias contados. Os exes codificantes de
genes que codificam protenas representam apenas 1,5% de todo o nosso DNA, e por isso muito
frequente ouvir-se dizer que o restante material gentico obsoleto - apelidado de junk DNA.
Atualmente j se sabe que uma boa parte deste material gentico corresponde a sequncias
reguladoras, como o caso de promotores, enhancers, insulators, entre outros. Para esta nossa
discusso importa referir que, no seio dessas sequncias reguladoras, existe informao que
transcrita mas no sofre traduo, pois a sua verdadeira funo a de regular a expresso gnica sob
a forma de molculas de RNA no-codificantes (ncRNA).
Nota: Talvez haja mesmo material gentico no ser Humano que totalmente dispensvel, dando
algum sentido expresso junk DNA. Prova disso o facto de no passado dia 27 de maro de 2014 a
Nature ter anunciado a sntese do primeiro cromossoma artificial de leveduras, no qual foi excludo

aquilo que se pensava ser junk DNA, sem que trouxesse repercusses para o microrganismo em
questo;
Os ncRNA podem assumir vrias formas, tal como apresentado na tabela do s. 36, desde
micro RNAs (miRNAs), at RNAs nucleolares pequenos (snoRNAs) ou mesmo os piRNAs que so formas
de represso de transposes.
miRNAs
Os miRNAs so as formas de ncRNAs que parecem ter um peso significativo nos mecanismos
genticos e epigenticos do cancro, conforme demonstrado pela tabela do s. 37, onde so
apresentados vrios tipos de miRNAs cujas alteraes esto implicadas no desenvolvimento
neoplsico.
Ao contrrio de outras formas de RNA mais conhecidas (mRNA, p. ex.), os miRNAs no
codificam para protenas: a sua verdadeira funo a da inibio da expresso gnica. O silenciamento
da expresso gnica por miRNAs um mecanismo preservado em todas as formas vivas, desde plantas
at seres Humanos, e por isso dever ser visto como fundamental para a regulao gnica. A
importncia destes agentes de tal ordem que a sua descoberta deu direito atribuio de um prmio
Nobel da Fisiologia ou Medicina, em 2006, a Andrew Fire e Craig Mello.
As estimativas mais recentes apontam para a existncia de cerca de 1000 genes Humanos que
codificam para miRNAs, perfazendo assim cerca de 5% do genoma humano. Estes cidos ribonucleicos
tm cerca de 18 a 24 pares de bases, localizando-se (s. 39):
Intres ou exes CpG ou no-CpG;
Desertos gnicos, regies intergnicas e/ou em extremidades 3UTR de mRNA;
Cerca de 60% genes Humanos so regulados por miRNA, podendo um nico miRNA regular
dezenas de transcritos, bem como um transcrito apenas pode ser alvo de vrios miRNA.
Nota: Esta percentagem no corresponde informao que apresentada no s. 39, porque o ppt
ainda no foi atualizado. 60% foi o nmero avanado pela prof. Dra. Carmen Jernimo; No 15 artigo
da bibliografia complementar (prof. Dr. Rui Henrique e prof. Dra. Carmen Jernimo), alargam a
estimativa de 30 a 70%;
As regies codificantes para miRNA com implicaes no desenvolvimento neoplsico
distribuem-se por todos os cromossomas (s. 40), exceto no cromossoma Y.
Regulao epigentica por miRNA (s. 41)
A transcrio dos genes miRNA produzem transcritos primrios, genericamente
representados por pri-miRNA. O processamento desse pri-miRNA atravs do complexo proteico
DGCR8-Drosha d origem a um pr-miRNA que, atravs do transportador exportina-5, passa para o
citosol. No citoplasma este RNA sofre ainda um outro processo de maturao, atravs de um corte
enzimtico executado por uma protena designada por Dicer, formando-se assim uma cadeia dupla
de miRNA no s. 41 est representada sob a forma de miRNA:miRNA porque este RNA est
emparelhado, como se fosse uma molcula de DNA. Repare-se que, logo aps a sua transcrio, o primiRNA adota uma conformao fechada sobre si mesma, isto , as suas bases emparelham umas com
as outras, permitindo que se forme uma dupla cadeia, tal como no DNA. A enzima Dicer vai clivar o
pr-miRNA ao nvel da sequncia circular que permite o emparelhamento do RNA sobre si mesmo (s.
41). Por ao de uma helicase, o miRNA:miRNA desemparelhado e obtm-se duas cadeias simples
de miRNA. De seguida a molcula de miRNA encaminhada para um complexo multiproteico

designado por complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC RNA-Induced Silencing Complex).
Mesmo incorporado no RISC, o miRNA emparelha com cadeias simples de mRNA presentes no citosol,
que numa outra qualquer situao teriam a funo de traduzir a informao gentica em protenas,
para que este complexo possa exercer uma de trs funes (s. 41):
1. Represso translacional
a. O miRNA emparelha com o mRNA, para que o RISC trave a traduo proteica,
funcionando assim como um silenciamento do gene que est a ser traduzido;
b. No s. 38 tambm apresentado de forma esquemtica este mecanismo;
2. Clivagem de mRNA
a. Neste caso o RISC no atua sobre o ribossoma, mas sim diretamente sobre o mRNA
para que este seja degradado, funcionando novamente como uma forma de
silenciamento do gene;
3. Ativao translacional
a. Em alguns casos tambm possvel que os miRNA possam ter o efeito oposto
represso translacional, isto , aumentam a traduo de determinados mRNA.
Normalmente a ativao translacional d-se por ligao do miRNA extremidade 5UTR do mRNA;
H ainda uma quarta possibilidade em termos de funo do miRNA, mas esta independente
do RISC, funcionando simplesmente como um decoy para impedir a ligao do mRNA ao ribossoma,
que ficar assim impossibilitado de traduzir essa informao gentica, pois encontra-se em dupla
cadeia.
O emparelhamento do miRNA com as molculas de mRNA no tem de ser perfeito, podendo
mesmo haver uma variabilidade at 5% entre as bases dos dois cidos ribonucleicos. por este motivo
que um mesmo miRNA poder atuar sobre vrios transcritos, assim como vrios transcritos podem
ser alvo do mesmo miRNA.
Desregulao de miRNA no cancro (s. 42)
Devido sua capacidade de controlo do crescimento, diferenciao e sobrevivncia celular,
atravs de mecanismos epigenticos, no ser de todo surpreendente que desregulaes na funo
do miRNA possam estar envolvidas na tumorignese. Sistematicamente tem sido verificado que os
miRNAs sofrem alteraes importantes em clulas neoplsicas, como o caso de amplificaes e
delees destes cidos ribonucleicos que foram identificadas em vrios cancros. Os miRNAs podero
intervir na transformao neoplsica atravs das seguintes maneiras:
Incremento da expresso de oncogenes
o Se um miRNA inibe a traduo de um oncogene, uma reduo na quantidade ou na
funo desse miRNA ir determinar uma sobrexpresso do produto do oncogene.
Neste caso o miRNA funciona como um supressor tumoral;
Reduo da expresso de genes supressores tumorais
o Se o alvo do miRNA for um gene supressor tumoral, a sua hiperatividade ir reduzir a
expresso de protenas supressoras de tumores, e aqui o miRNA funcionar como um
oncogene - oncomiRNAs;
Em alguns casos de leucemias e linfomas h mesmo uma produo ineficaz ou at deleo do
miRNA que controla a expresso de BCL2, uma protena anti-apopttica. Neste exemplo o miRNA
funcionaria como um supressor tumoral.

Os defeitos de expresso de miRNA podem dever-se a vrios tipos de defeitos genticos

relacionados quer com a prpria sequncia nucleotdica que os codifica, quer com o seu
processamento (s. 41):
Mutaes no gene TARBP2;
Mutaes no gene DICER1, produzindo DICERs no funcionantes;
Mutaes no gene XPO5, impedindo que haja passagem do miRNA do ncleo para o
citoplasma, por no haver exportinas5 funcionantes;
Na tabela do s. 43 so apresentados alguns exemplos de interaes entre miRNAs e cancro.
The clonal genetic model of cancer (s. 44)
A viso clssica do crescimento neoplsico centrava-se nas alteraes genticas que
transformavam clulas normais em neoplasias benignas e noutros casos em neoplasias malignas.
luz dos avanos cientficos na rea da epigentica percebeu-se que, para alm das alteraes
genticas, existe um papel relevante das alteraes epigenticas que normalmente precede as
primeiras as alteraes epigenticas conferem assim uma suscetibilidade para a ocorrncia de
alteraes genticas.