PRODUO DE BIOSSURFACTANTES POR Rhodococcus

erythropolis E SUA APLICAO NA REMOO DE LEO

DE SEDIMENTOS ARENOSOS

G R A ZIE L A J A R D IM PA C HE C O

Dissertao Apresentada ao Curso de

Ps-Graduao

em

Tecnologia

de

Processos Qumicos e Bioqumicos para a

Obteno do Grau de Mestre em Cincias

ORIENTADOR:
Prof. Nei Pereira Jr, PhD

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Escola de Qumica
2008

ii

PRODUO DE BIOSSURFACTANTES POR Rhodococcus

erythropolis E SUA APLICAO NA REMOO DE LEO DE
SEDIMENTOS ARENOSOS

G RAZIELA J ARDIM P ACHECO

Dissertao Apresentada ao Curso de Ps-Graduao em Tecnologia de

Processos Qumicos e Bioqumicos para a Obteno do Grau de Mestre em
Cincias (MSc)

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Escola de Qumica
2008

iii

PRODUO DE BIOSSURFACTANTES POR Rhodococcus

erythropolis E SUA APLICAO NA REMOO DE LEO DE
SEDIMENTOS ARENOSOS

G RAZIELA J ARDIM P ACHECO

Dissertao submetida ao Programa de Ps-graduao em Tecnologia de

Processos Qumicos e Bioqumicos da Escola de Qumica da Universidade Federal
do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessrios obteno do grau de
Mestre em Cincias, sob orientao do Prof. Nei Pereira Jr.

Aprovada por:

____________________________________________

Prof. Nei Pereira Jr., PhD (Orientador)

_____________________________________
Prof. Alexandre Soares dos Santos, DSc

________________________________________
Prof Denise Maria Guimares Freire, DSc

________________________________________
Prof Magali Christe Cammarota, DSc

Rio de Janeiro
2008

iv

FICHA CATALOGRFICA

Pacheco, Graziela Jardim

Produo de biossurfactantes por Rhodococcus erythropolis e sua aplicao na remoo de

leo de sedimentos arenosos/ Graziela Jardim Pacheco Rio de Janeiro, 2008.

Dissertao (Mestrado em Cincias) Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ,

Escola de Qumica, Ps-Graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos.

Orientador: Nei Pereira Jr.

1. Biossurfactantes. 2. Rhodococcus erythropolis. 3.Otimizao. 4. Planejamento

experimental. 5. Remoo de hidrocarbonetos Teses. I. Pereira Jr., Nei (Orient.). II. PsGraduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos. III. Ttulo

Dedico este trabalho aos meus pais,

pelo apoio e incentivo dado
ao longo de todos esses anos.

vi

AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter me dado o dom da vida e pela oportunidade de desenvolver este trabalho;
Ao professor Nei Pereira Jr, pela orientao, por suas palavras otimistas e pelos
conhecimentos transferidos durante estes anos;
Aos meus pais, Jos Benacy e Valeria, por todo amor, amparo e incentivo; pelo esforo
que fizeram para que eu chegasse at aqui;
Ao meu irmo Gustavo, por seu carinho e sorriso sinceros de criana, que tornam especial
cada dia da minha vida;
A Elisa, por toda sua experincia, convivncia e amizade; pelos ensinamentos
fundamentais para que este trabalho fosse concludo. Muito obrigada!
Ao professor Mrcio Nele de Souza, por possibilitar a realizao das anlises de tenso
superficial em seu laboratrio;
Ao professor Reginaldo Ramos de Menezes, pela liberao do laboratrio para a realizao
das anlises espectrofotomtricas;
Aos amigos da EQ companheiros de disciplinas, almoos e afins: Patrcia, Bianca, Sabrina,
Ricardo, Clenilson, Diego, Gizele. Sentirei saudades da convivncia diria!
A amiga Roberta, sempre presente na minha vida, que acompanhou as ansiedades,
dificuldades e sucesso, me apoiando nos momentos mais difceis;
Aos colegas e amigos do laboratrio: Maeda, Eleandro, Dani, Mari, Vernica, Gabriel e
tantos outros, pela convivncia e apoio durante a realizao deste trabalho;
Ao Cenpes, CNPq e FAPERJ, pelo suporte financeiro.

vii

RESUMO

PACHECO, Graziela Jardim. Produo de biossurfactantes por Rhodococcus erythropolis

e sua aplicao na remoo de leo de sedimentos arenosos. Orientador: Nei Pereira Jr. Rio
de Janeiro: UFRJ/ EQ, 2008. Dissertao (Mestrado em Cincias)

Biossurfactantes so compostos tensoativos produzidos por microrganismos, quando

cultivados em diferentes fontes de carbono. Apresentam uma ampla variedade de
aplicaes que incluem biorremediao, biodegradao e limpeza de reservatrios de leos.
Neste trabalho, objetivou-se definir um bioprocesso para a produo de biossurfactantes
por Rhodococcus erythropolis cepa ATCC 4277, investigando a influncia de diferentes
suplementos sobre a concentrao final do produto e suas propriedades fsico-qumicas. Do
mesmo modo, foi investigada a atuao do produto obtido na remoo de leo de
sedimentos

arenosos

contaminados

artificialmente,

com

diferentes

tempos

de

contaminao. Foi demonstrado que concentraes de tampo fosfato de potssio variando

de 30 a 150 mmol/L levaram produo de concentraes crescentes de biossurfactantes,
chegando a 285 mg/L. Adicionalmente, concentraes iguais ou superiores a 60 mmol/L
foram suficientes para a manuteno do pH do meio de cultivo ao longo de todo o
experimento, fundamental para a produo de biossurfactantes. Utilizando-se ferramentas
estatsticas de planejamento experimental, foi demonstrado que a presena de glicerol,
nitrato de sdio e extrato de levedura exercem influncia positiva sobre o processo
produtivo. Superfcies de resposta com mximos absolutos para a produo de
biossurfactantes, YP/S e IE24 em funo das concentraes de glicerol, nitrato de sdio e
extrato de levedura foram geradas atravs de experimentos em frascos agitados e
confirmadas atravs da conduo do processo produtivo em biorreatores de bancada.
Observou-se uma produo de biossurfactante associada ao crescimento bacteriano, capaz
de reduzir a tenso superficial do sistema de 68 mN/m para 40 mN/m. A produo de
biossurfactantes foi favorecida com o uso de altas relaes C/N, variando de 28 a 75.
Ensaios de remoo de leo de sedimentos arenosos demonstraram a habilidade do
biossurfactante produzido em remover leo de solos contaminados mesmo aps 1 ms de
impactao. Concentraes duas e quatro vezes acima da CMC foram capazes de remover
97 e 99% do leo, respectivamente.

viii

ABSTRACT

PACHECO, Graziela Jardim. Produo de biossurfactantes por Rhodococcus erythropolis

e sua aplicao na remoo de leo de sedimentos arenosos. Orientador: Nei Pereira Jr. Rio
de Janeiro: UFRJ/ EQ, 2008. Dissertao (Mestrado em Cincias)

Biosurfactants are surface-active compounds produced by microorganisms when grown on

different carbon sources. They have an ample variety of applications, including
bioremediation, biodegradation and oil storage tank cleaning. This work aims at defining a
bioprocess for biosurfactant production by Rhodococcus erythropolis ATCC 4277,
investigating the influence of different supplements on the final concentration of
biosurfactants and their physical-chemical properties. Additionally, the ability of the
synthesized product to remove crude oil from soil contaminated artificially at different
times of impactation was performed. It was demonstrated that potassium phosphate buffer
varying of 30 up to 150 mmol/L stimulate an increase in biosurfactant production. Also,
concentrations equal or higher than 60mmol/L were sufficient for the maintenance of pH in
the culture medium throughout the experiments, particularly for the production of
biosurfactants. Using response surface methodology, it was demonstrated that glycerol,
sodium nitrate and yeast extract influenced positively the bioprocess. Response surfaces
with optimum conditions for biosurfactant production, reflected on the product yield on
substrate consumed (YP/S) and on the emulsification index (IE24) were performed in shake
flasks and confirmed in batchwise bioreactor. It was observed a growth-associated
production and a surface tension reduction to 40 mN/m. Additionally, a high C/N ratio was
favorable for biosurfactant production, varying from 28 up to 75. Applications of the
produced biosurfactant in washing crude oil contaminated soil were carried out. Results
showed that the biosurfactant were able to remove significant amount of crude oil from
contaminated soil up to 1 month of impactation. In this case, twice or four times the CMC
concentration removed 97 and 99 % of the oil, respectively.

ix

ABREVIATURAS
cAMP: adenosina monofosfato cclica
ATP: adenosina trifosfato
CG/ MS: cromatografia gasosa integrada a espectrmetro de massas
CMC: concentrao micelar crtica
g: gramas
h: hora
IE24: ndice de emulsificao aps 24 horas
KLa: coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio
L: litro
MEOR: Recuperao melhorada do petrleo
mg: miligrama
mmol/L: milimol por litro
PAH: Hidrocarbonetos Policclicos Aromticos
PC: pontos centrais
pH: potencial hidrogeninico
QP: produtividade volumtrica, g/ L.h
RSM: metodologia de superfcie de resposta
SAO: separador leo/ gua
SDS: dodecil sulfato de sdio
TPH: Hidrocarbonetos de Petrleo Totais
YP/S: Fator de rendimento em produto por substrato consumido, mg/g
YP/X: Fator de rendimento em produto por biomassa, mg/g
x: taxa especfica de crescimento, h-1

NDICE DE TABELAS
Tabela 2.1: Biossurfactantes, microrganismos produtores e respectivas tenses superficial
e interfacial. Fonte: Adaptado de DESAI & BANAT, 1997. ..........................14
Tabela 2.2: Aplicaes industriais de surfactantes e biossurfactantes. Fonte: Adaptado de
SINGH et al, 2007. ..........................................................................................16
Tabela 2.3: Biossurfactantes produzidos por Rhodococcus sp. Fonte: Adaptado de PHILP
et al., 2002. ..................................................................................................24
Tabela 2.4: Produo de surfactina antes e aps a otimizao das condies nutricionais e
ambientais. RSM baseada na estratgia de otimizao multifatorial. Fonte:
MURKHERJEE et al., 2006. ...........................................................................31
Tabela 4.1: Descrio dos componentes do meio de crescimento bacteriano. ..................41
Tabela 4.2: Descrio dos componentes do meio mineral para a produo de
biossurfactantes. ..............................................................................................41
Tabela 4.3: Variveis analisadas e seus nveis de acordo com o planejamento experimental
fatorial fracionado 28-4. ....................................................................................43
Tabela 4.4: Constituio da soluo de elementos traos. Fonte: RAPP et al., 1979. .......44
Tabela 4.5: Variveis analisadas e seus nveis de acordo com o planejamento experimental
composto central 23. ........................................................................................44
Tabela 4.6: Caracterizao do resduo oleoso de fundo de separador O/A de Unidade de
Explorao & Produo da Petrobrs em Sergipe e Alagoas. Fonte: MELO,
2004. ................................................................................................................47
Tabela 5.1: Valores observados para o pH, biomassa, IE24 e tenso superficial aps 5 dias
de cultivo. ........................................................................................................51
Tabela 5.2: Variveis analisadas e resultados obtidos para YP/X e YP/S no planejamento
experimental fatorial fracionado 28-4 com 8 fatores e 2 nveis. .......................55
Tabela 5.3: Composio do meio mineral para a produo de biossurfactantes em
biorreator instrumentado segundo o planejamento experimental fatorial
fracionado. .......................................................................................................60
Tabela 5.4: Parmetros analisados a partir do bioprocesso apresentado na Figura 5.3. ....61
Tabela 5.5: Variveis analisadas e resultados obtidos para YP/S, biossurfactantes e
IE24 no planejamento experimental composto central 23 com 3 fatores e 2
nveis. ..............................................................................................................63

xi

Tabela 5.6: Composio do meio mineral para a produo de biossurfactantes em

biorreator instrumentado segundo o delineamento composto central
rotacional. ........................................................................................................71
Tabela 5.7: Parmetros obtidos para os bioprocessos presentes na Figura 5.11. ...............74
Tabela 5.8: Fator de rendimento de produto por biomassa (YP/X) antes e aps a
otimizao das condies nutricionais para a produo de biossurfactantes
por R. erythropolis. ..........................................................................................75

xii

NDICE DE FIGURAS
Figura 2.1: Representao esquemtica de algumas estruturas organizadas de surfactantes
Fonte: SANZ-MEDEL et al., 1999. ..................................................................5
Figura 2.2: Tenso superficial, interfacial e solubilidade em funo da concentrao de
surfactante. Fonte: MULLIGAN, 2005. ............................................................6
Figura 2.3: Estruturas moleculares do SDS (A), um surfactante qumico aninico, e do
Triton X-100 (B), um surfactante qumico no inico. .....................................7
Figura 2.4: Estruturas moleculares de glicolipdios: (A) ramnolipdio, (B) soforolipdeo
e (C) Trealoselipdeo. ......................................................................................12
Figura 2.5: Estrutura molecular da surfactina, um lipopeptdio. .......................................13
Figura 2.6: Micrografia eletrnica de Rhodococcus sp. cepa RHA1, mostrando o
crescimento por ramificaes filamentosas. Fonte:
http://www.microbiology.ubc.ca/eltis/genomics.htm .....................................20
Figura 2.7: Diversidade de reaes oxigenase catalizadas por Rhodococcus. As reaes
incluem: (A) epoxidao (ex: enzimas citocromo P450), (B) cis-dihidroxilao
(ex: dioxigenases, como naftaleno dioxigenase), (C) hidroxilao de grupos
alquil secundrios, (D) hidroxilao de grupos alquil primrios (ex: alcano
monooxigenases), (E) sulfoxidao de sufeto a sulfxido, (F) sulfoxidao de
sulfxido a sulfona. Fonte: LARKIN et al., 2005. ..........................................22
Figura 4.1: Biorreator operando em batelada simples para a produo de biossurfactantes
por Rhodococcus erythropolis. ........................................................................42
Figura 4.2: Frascos contendo o sistema areia: soluo de biossurfactantes imediatamente
antes da lavagem. ............................................................................................49
Figura 5.1: Efeito de diferentes concentraes de Tampo Fosfato de Potssio sobre a
produo de biossurfactantes e sobre YP/X. .....................................................55
Figura 5.2A: Grfico de Pareto do Planejamento Experimental Fatorial Fracionado 28-4
para a seleo de variveis que exercem influncia sobre YP/S. ......................57
Figura 5.2B: : Grfico de Pareto do Planejamento Experimental Fatorial Fracionado 28-4
para a seleo de variveis que exercem influncia sobre YP/X. ......................58
Figura 5.3: Perfil cintico da sntese de biossurfactantes por Rhodococcus erythropolis em
um meio mineral de composio descrita na Tabela 5.3. ................................60

xiii

Figura 5.4: Diagrama de Pareto para o fator de rendimento de produto por substrato (YP/S,
expresso em mg/g). ..........................................................................................65
Figura 5.5: Diagrama de Pareto para a produo de biossurfactantes (mg/L). .................65
Figura 5.6: Diagrama de Pareto para o ndice de emulsificao (IE24). ............................66
Figura 5.7: Superfcie de resposta de YP/S em funo das concentraes de nitrato de sdio
e glicerol (A) e glicerol e extrato de levedura (B). ..........................................67
Figura 5.8A: Superfcie de resposta da concentrao de biossurfactantes em funo das
concentraes de nitrato de sdio e glicerol. ...................................................68
Figura 5.8B: Superfcie de resposta da concentrao de biossurfactantes em funo das
concentraes de nitrato de sdio e extrato de levedura. ................................69
Figura 5.9: Superfcie de resposta do ndice de emulsificao IE24 em funo das
concentraes de glicerol e extrato de levedura. .............................................69
Figura 5.10: Produo de biossurfactantes por R. erythropolis em batelada simples. .......71
Figura 5.11: Perfil cintico da sntese de biossurfactantes por Rhodococcus erythropolis
em um meio mineral conforme a composio descrita para o biorreator 1 (A)
e para o biorreator 2 (B). .................................................................................72
Figura 5.12: IE24 obtido atravs do biossurfactante purificado do meio de cultivo do
biorreator 1 (A) e do biorreator 2 (B). .............................................................74
Figura 5.13: IE24 obtido a partir de solues de biossurfactantes com concentraes duas
vezes abaixo da CMC (A), na CMC (B) e duas vezes acima da CMC (C). ....77
Figura 5.14: Percentual de remoo de leo de sedimentos arenosos por diferentes
concentraes de biossurfactantes, imediatamente aps a contaminao e aps
um perodo de impactao de 1 ou 2 meses. ...................................................78
Figura 5.15: Frascos contendo o sistema areia : soluo de biossurfactantes imediatamente
aps a lavagem com gua (A) e biossurfactantes nas concentraes 0,23 g/L
(B), 0,45 g/L (C), 0,9 g/L (D) e 1,8 g/L (E), num perodo de contaminao de
1 ms. ...............................................................................................................78

xiv

SUMRIO

1. INTRODUO................................................................................................................1

2. REVISO BIBLIOGRFICA........................................................................................4
2.1 Surfactantes..................................................................................................................4
2.2 Biossurfactantes............................................................................................................8
2.2.1 Funes fisiolgicas dos biossurfactantes...........................................................9
2.2.2 Classificao dos biossurfactantes.....................................................................11
2.2.3 Aplicaes comerciais dos biossurfactantes......................................................15
2.3 Bactrias do gnero Rhodococcus............................................................................20
2.4 Biossurfactantes produzidos por Rhodococcus sp. ..................................................23
2.5 Influncia da composio do meio de cultivo sobre a produo de
biossurfactantes...............................................................................................................27
2.5.1 Otimizao de processos: a melhor combinao de fatores essenciais............30
2.6 Biossufactantes na remediao de solos impactados por leo..................................32
2.7 Consideraes gerais.................................................................................................36

3. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS...............................................................................38

4. MATERIAIS E MTODOS..........................................................................................40
4.1 Microrganismo...........................................................................................................40
4.2 Meios de cultivo e condies de crescimento............................................................40
4.2.1 Inculo..............................................................................................................40
4.2.2 Experimentos em frascos agitados....................................................................41
4.2.3 Ensaios em biorreator.......................................................................................42
4.3 Planejamento experimental........................................................................................43
4.3.1 Planejamento experimental fatorial fracionado................................................43
4.3.2 Planejamento experimental composto central rotacional.................................44
4.4 Mtodos analticos.....................................................................................................45
4.4.1 Concentrao de biomassa...............................................................................45
4.4.2 Recuperao e quantificao de biossurfactante..............................................45
4.4.3 Quantificao de glicerol.................................................................................45

xv

4.4.4 Quantificao de nitrato....................................................................................45

4.4.5 Determinao do ndice de emulsificao (IE24)..............................................46
4.4.6 Medida da tenso superficial............................................................................46
4.4.7 Medida do pH...................................................................................................46
4.5 Ensaios de remoo de leo de solos arenosos.........................................................47
4.5.1 Caractersticas da borra oleosa.........................................................................47
4.5.2 Preparao da areia contaminada.....................................................................48
4.5.3 Mtodo de lavagem..........................................................................................48

5. RESULTADOS E DISCUSSO...................................................................................50
5.1 Avaliao do efeito da concentrao de Tampo Fosfato de Potssio......................51
5.2 Efeito da adio de nutrientes sobre a produo de biossurfactantes........................54
5.2.1 Planejamento experimental fatorial fracionado................................................54
5.2.2 Produo de biossurfactantes em biorreator instrumentado condies
previstas pelo planejamento experimental fatorial fracionado..................................59
5.2.3 Planejamento experimental composto central rotacional.................................62
5.2.4 Produo de biossurfactantes em biorreator instrumentado condies
previstas pelo delineamento composto central rotacional.........................................70
5.3 Ensaios de remoo de leo de sedimentos arenosos...............................................76
5.4 Consideraes finais.................................................................................................80

6. CONCLUSES..............................................................................................................81

7. PERSPECTIVAS............................................................................................................84

8. REFERNCIAS.............................................................................................................86

1. INTRODUO
Nas ltimas dcadas tm-se observado a rpida expanso e o aumento da
sofisticao das indstrias qumicas, com destaque indstria do petrleo e suas atividades
de prospeco, refino e distribuio. Esta intensa atividade industrial tem tornado cada vez
mais comum derramamentos acidentais de leo, os quais necessitam de tratamento
imediato por meio de tecnologias ambientais eficientes. Ao mesmo tempo, autoridades
reguladoras tm dado maior ateno aos problemas de carter ambiental, seja por presso
da opinio pblica mundial ou por segmentos da sociedade civil organizada.

Desde a ocorrncia do derramamento de leo do navio Exxon Valdez, em 1989,

agncias federais e indstrias tm implementado iniciativas visando aumentar as aes
preventivas e reativas quanto a eventuais acidentes. Em 1990, em resposta ao acidente
ocorrido com o referido navio petroleiro, foi assinada em Londres a Conveno
Internacional para preparo, resposta e cooperao em caso de poluio por leo (OPRC 90)
estabelecendo, a nvel internacional, que as partes se comprometem conjunta ou
individualmente, a tomar todas as medidas adequadas para o preparo e a resposta em caso

de incidente por poluio por leo. No Brasil, a OPRC 90 foi ratificada por ocasio da
publicao do Decreto presidencial n 2.870/ 90, assumindo o compromisso de estabelecer
um sistema nacional capaz de responder pronta e efetivamente aos incidentes de poluio
por leo (CAMARGO & FAERTES, 2004).

Embora esforos ambientais e polticos devam continuar direcionados a pressionar

as indstrias no sentido da reduo de incidentes de poluio por leo, o avano da
tecnologia tem apresentado diversas oportunidades de tratamento e recuperao em reas
de solo e mar impactadas com petrleo e derivados. Dentre as alternativas existentes est a
utilizao de compostos com atividade tensoativa, ou surfactantes, os quais so capazes de
emulsificar e dispersar hidrocarbonetos em gua, aumentando a degradao destes
compostos.

A grande maioria dos surfactantes disponveis comercialmente sintetizada

quimicamente, a partir de derivados do petrleo. Entretanto, sabe-se que muitos destes
compostos apresentam alta toxicidade e baixa biodegradabilidade, necessitando de
tratamento adicional aps sua aplicao.

Dentro deste contexto, a produo de surfactantes de origem biolgica surge com

base na demanda de pesquisas que visem gerar produtos e processos que atendam
manuteno das atividades relacionadas indstria do petrleo e sua relao de
responsabilidade com problemas de carter ambiental. Essa preocupao vem ao encontro
da dimenso e abrangncia das atividades deste setor em nosso pas. Alm de ser um
produto de potencial aplicao nos setores de reparo ambiental, os biossurfactantes podem
ser usados na recuperao melhorada do petrleo, solubilizao de borras em tanques de
armazenamento e em produtos das indstrias de qumica fina e farmacutica.

Apesar de apresentar vantagens como a alta biodegradabilidade e a possibilidade de

produo in situ a partir de substratos renovveis, o custo da produo de biossurfactantes
ainda um fator que dificulta a competio deste produto no mercado tradicional. Assim, o
desafio est centrado na otimizao do processo produtivo, determinando o melhor modo
de conduo do bioprocesso.

Em resposta problemtica levantada, o presente trabalho teve como objetivo geral

a otimizao da produo deste tensoativo a partir da cepa Rhodococcus erythropolis
ATCC 4277, utilizando-se glicerol como fonte de carbono. A utilizao do glicerol, um
dos subprodutos da produo de biodiesel, objetiva dar um destino grande quantidade
deste composto gerado em biorefinarias, o qual tem provocado grandes preocupaes
ambientais. O biossurfactante obtido foi utilizado na lavagem ex situ de solo impactado
com borra oleosa oriunda do processamento de petrleo pela Petrobrs, mostrando o
potencial de utilizao deste produto na remoo de leo e contribuindo com bases tericoexperimentais para o desenvolvimento de um processo biotecnolgico de produo de
biossurfactantes por bactrias deste gnero.

Esta dissertao est estruturada em trs partes bsicas. Inicialmente, feita uma
descrio sobre biossurfactantes qumicos e sintticos, bem como suas aplicaes na
indstria qumica moderna. A segunda parte apresenta toda a metodologia empregada no
desenvolvimento deste estudo, tanto referente otimizao da produo quanto aplicao
do biossurfactante obtido na remoo de leo de areia contaminada. Na terceira parte esto
exibidos e analisados os resultados obtidos, apresentando-se em seguida uma breve
concluso e perspectivas para este trabalho.

2. REVISO BIBLIOGRFICA
2.1 Surfactantes
Surfactantes so molculas constitudas de uma poro hidrofbica e outra
hidroflica, que tendem a se acumular na interface entre fases de diferentes graus de
polaridade, tais como leo/ gua ou ar/ gua. Elas exibem algumas caractersticas
fascinantes devido a sua tendncia de associao quando em presena de gua ou de
solventes apolares. A estrutura final dos agregados supramoleculares microscopicamente
ordenada, sendo capaz de formar micelas, bicamadas, vesculas, macro e micro emulses
(FIECHTER, 1992).

Estas estruturas so determinadas pela natureza do monmero do surfactante, pela

natureza do solvente e tambm por possveis ons vizinhos. Dentre os grupamentos
organizados de surfactantes existentes, como os mostrados esquematicamente na Figura
2.1, micelas e vesculas so possivelmente os meios organizados mais interessantes e os
mais investigados (SANZ-MEDEL et al., 1999).

Monmeros

Vescula

Micela

Bicamada

leo-gua

Micela Reversa

Micela Cilndrica

gua-leo

Micro emulses

Figura 2.1 Representao esquemtica de algumas estruturas organizadas de surfactantes

(SANZ-MEDEL et al., 1999)

Molculas de surfactantes existem como monmeros em solues muito diludas,

mas quando sua concentrao excede um determinado mnimo (chamado de concentrao
micelar crtica, CMC), estes monmeros associam-se espontaneamente dando forma a
agregados de dimenses coloidais. Quando a concentrao de surfactante aumenta e atinge
a concentrao micelar crtica, a adio de novos monmeros resulta na formao de novas
micelas, de tal maneira que a concentrao de monmeros permanece essencialmente
constante e aproximadamente igual CMC. Isto , as micelas esto em equilbrio dinmico
com os monmeros dissolvidos do surfactante, que permanecem em uma concentrao
aproximadamente constante aps a CMC ter sido alcanada (FENDLER & TUNDO,
1984).

Vesculas, em geral, so bem menos dinmicas que as micelas e formam agregados

mais estveis. A dinmica de interao de solutos com as vesculas controlada pela
estabilidade cintica vesicular. Esta interao, responsvel pela manuteno de solutos no
interior de vesculas, bem maior do que nas micelas.

A eficcia de um surfactante costuma ser determinada por sua capacidade de

reduzir a tenso superficial e interfacial dos sistemas. A tenso superficial definida como

a medida de energia livre da superfcie por unidade de rea, necessria para trazer uma
molcula do interior do lquido para a superfcie. Devido presena de surfactantes, uma
menor energia requerida para trazer uma molcula at a superfcie e a tenso superficial
reduzida. Por exemplo, um bom surfactante permite baixar a tenso superficial da gua de
72 para 35mN/m e a tenso interfacial entre a gua e n-hexadecano de 40 para 1 mN/m
(MULLIGAN, 2005). Alm destas caractersticas, um bom biossurfactante deve apresentar
baixa concentrao micelar crtica (CMC).

As tenses superficial e interfacial esto correlacionadas com a concentrao de

surfactante at o momento em que CMC alcanada (Figura 2.2). A CMC definida como
a concentrao mnima de surfactante necessria para atingir valores mais baixos de tenso
superficial e interfacial. Com a adio de surfactantes acima da CMC ocorre a associao
das molculas, resultando na formao de micelas, sem afetar a tenso superficial. Desta
maneira, mesmo adicionando-se surfactante acima da CMC, as tenses superficial e
interfacial mantm-se constantes (DATYNER, 1983).

Monmeros

Micelas

Propriedade fsica

Solubilidade

Tenso superficial

Tenso interfacial
Concentrao de surfactante

Figura 2.2 Tenso superficial, interfacial e solubilidade em funo da concentrao de

surfactante (MULLIGAN, 2005).

Estruturas organizadas de surfactantes tm sido usadas em inmeras aplicaes

cientficas, biotecnolgicas, farmacuticas e industriais, por levarem ao aumento da
adsoro de molculas, aumentarem a disperso ou agregao de slidos, apresentarem
ao espumante, aumentarem a detergncia, a solubilidade e a molhabilidade. Devido a

estas propriedades, os surfactantes constituem uma importante classe de compostos

qumicos amplamente utilizados em diversos setores industriais, dentre eles a recuperao
de petrleo e o tratamento de resduos oleosos, a indstria cosmtica, farmacutica, de
alimentos e a minerao (FIECHTER, 1992).

Durante a dcada de 90, a demanda de surfactantes aumentou 300% nas indstrias

qumicas e sua produo mundial excedeu 3 milhes de toneladas por ano (um valor
estimado de US $ 4 bilhes) (BANAT et al, 2000). A indstria do petrleo tem sido
tradicionalmente a principal usuria, utilizando-o para aumentar a remoo de leo de
solos contaminados e na recuperao melhorada do petrleo.

A maior parte dos surfactantes disponveis comercialmente so surfactantes

qumicos, principalmente aqueles derivados do petrleo. Geralmente, os surfactantes
qumicos so classificados de acordo com sua carga como aninicos, no-inicos,
catinicos e anfteros (VAN HAMME et al., 2006). Exemplos familiares de surfactantes
qumicos utilizados em laboratrios rotineiramente incluem o sodium n-dodecil sulfate
(SDS) e o Triton X-100, os quais so aninico e no-inico, respectivamente (Figura 2.3).

Figura 2.3 Estruturas moleculares do SDS (A), um surfactante qumico aninico, e do

Triton X-100 (B), um surfactante qumico no inico.

Recentemente, grande nfase tem sido dada para os impactos ambientais gerados
pela utilizao de surfactantes qumicos. Muitos deles so txicos (FLASZ et al, 1998) e
de difcil degradao (MOHAN et al, 2006). Quando no biodegradados tendem a
acumular-se, podendo provocar efeitos adversos para o ambiente e a sade humana.

O rpido avano da biotecnologia e o aumento da conscincia ambiental entre os

consumidores, combinado com o surgimento de legislaes mais rigorosas tm levado a
srias consideraes sobre a utilizao de surfactantes biolgicos como uma possvel
alternativa para os produtos existentes (BANAT et al., 2000).

2.2 Biossurfactantes
Um biossurfactante definido como uma molcula superficialmente ativa
produzida por clulas vivas, na maioria das vezes microrganismos, a partir de uma grande
variedade de substratos que incluem acares, leos e n-alcanos.

Apesar de sua importncia biolgica, os biossurfactantes tm sido alvo de pesquisas

sistemticas h menos de meio sculo, inseridos no contexto de trabalhos direcionados
para o desenvolvimento de novos antibiticos, quando se observou que muitas das culturas
haviam desenvolvido um comportamento tensoativo ao final do processo de crescimento
(BOGNOLO, 1999). A possibilidade de serem produzidos utilizando procedimentos e
substratos relativamente simples e de baixo custo (KOSARIC, 1992; MAKKAR &
CAMEOTRA, 2002) despertou o interesse das mais diversas indstrias qumicas,
interessadas no grande potencial destas molculas.

Embora exista uma grande diversidade de composio qumica e propriedades entre

os biossurfactantes, algumas caractersticas so comuns maioria deles. Muitas destas
caractersticas representam vantagens sobre os surfactantes qumicos convencionais:

Baixa toxicidade Os biossurfactantes tm recebido especial ateno devido
crescente preocupao com os efeitos alrgicos de produtos artificiais
(CAMEOTRA & MAKKAR, 1998). Alm disso, a baixa toxicidade dos
biossurfactantes permite sua utilizao em alimentos, cosmticos e produtos
farmacuticos (FLASZ et al., 1998);

Biodegradabilidade Os biossurfactantes so facilmente degradveis na gua e no

solo, o que os torna adequados para aplicaes como biorremediao e tratamento
de resduos;

Tolerncia temperatura, pH e fora inica Muitos biossurfactantes apresentam
elevada estabilidade trmica e de pH, podendo ser utilizados em condies
ambientais variadas. Podem suportar concentraes de 10% de soluo salina,
enquanto concentraes de 2-3% so suficientes para inativar surfactantes qumicos
convencionais (BOGNOLO, 1999);

Atividade superficial e interfacial Biosurfactantes so mais efetivos e eficientes
que muitos surfactantes qumicos, produzindo menores tenso superficial e
interfacial em menores concentraes de biossurfactante (COOPER & PADDOCK,
1984). A Concentrao Micelar Crtica dos biossurfactantes varia entre 12000mg/L, enquanto a tenso interfacial (leo/ gua) e superficial fica em torno de
1 e 30mN/m, respectivamente (BOGNOLO, 1999).

Produo a partir de substratos renovveis Estima-se que os custos com matriaprima para produtos biotecnolgicos estejam entre 10 e 30% do custo total. Para
tornar o processo produtivo mais barato, necessrio que se utilize matrias-primas
de mais baixo custo. Os biossurfactantes apresentam a vantagem de poderem ser
produzidos in situ ou a partir do uso de substratos renovveis (leos vegetais,
efluentes agroindustriais e subprodutos da indstria do petrleo e alimentcia), o
que torna a produo mais barata e vivel economicamente (DESAI & BANAT,
1997).

2.2.1 Funes fisiolgicas dos biossurfactantes

Surfactantes de origem biolgica so produzidos por uma grande variedade de

organismos vivos, desde plantas (saponina) e microrganismos (glicolipdios) at animais
de grande complexidade estrutural, incluindo o homem (cidos biliares) (BOGNOLO,
1999).

Embora a exata funo fisiolgica dos biossurfactantes ainda no tenha sido

completamente elucidada, sabe-se que exercem influncia sobre a sobrevivncia de

10

microrganismos por estarem relacionados com a mobilidade e comunicao celular, o

acesso a nutrientes, a competio clula-clula e a patognese em plantas e animais.
Podem ser usados ainda como fonte de carbono para a produo de energia, como
mecanismo protetor contra alta fora inica ou como subprodutos liberados em resposta a
mudanas ambientais (VAN HAMME et al., 2006).

Mobilidade um processo fisiolgico essencial para microrganismos procura de

novos ambientes para colonizar. Complexos mecanismos de sinalizao levam o
microrganismo a responder a estmulos externos (luz, pH, nutrientes) e internos (nveis de
energia, fora prton motora). Uma vez recebido o sinal e decifrado, o movimento pode
ocorrer via rotao flagelar ou deslizando, por meio de um movimento friccional da
membrana protica contra a superfcie. Neste caso, se o microrganismo estiver na interface,
molculas de biossurfactantes podem ser secretadas para reduzir a tenso interfacial e
facilitar o movimento da colnia como uma unidade. Estudos de KEARNS & LOSICK
(2003), por exemplo, demonstraram que tanto a biossntese flagelar quanto a produo de
surfactina so importantes para a mobilidade de B. subtilis.

Microrganismos tambm podem utilizar surfactantes ligados parede celular para

regular as propriedades de sua superfcie, induzindo o quorum sensing (comunicao
clula-clula dependente da densidade celular). Enquanto sabido que o quorum sensing
importante para a formao de biofilme, apenas recentemente foi mostrado que
biossurfactantes, induzidos por molculas sinalizadoras de quorum sensing, atuam sobre a
estrutura do biofilme (VAN HAMME et al., 2006).

Muitas pesquisas tm sido direcionadas para determinar como microrganismos

interagem com compostos orgnicos hidrofbicos e os biossurfactantes tm sido propostos
como mediadores do acesso a estes substratos. O mecanismo pode consistir no contato
direto das clulas com grandes gotculas de leo sem que haja emulsificao ou pelo
contato com pequenas gotculas de leo, levando emulsificao. No primeiro caso, o
biossurfactante fica retido na poro externa da superfcie celular, facilitando a ligao e o
subseqente transporte do composto hidrofbico para o interior da clula. No segundo caso,
o microrganismo pode ter acesso ao substrato pseudosolubilizado em micelas de
surfactantes ou emulses (VAN HAMME et al., 2006).

11

possvel que alguns biossurfactantes tambm sejam produzidos como molculas

de carbono para armazenamento externo, e no como agentes interfaciais. Por exemplo,
HOMMEL et al. (1994) sugerem que soforolipdios de Candida albicans, crescendo em
glicose ou frutose, so produzidos para esta finalidade ou como uma adaptao alta fora
osmtica.

Devido ao interesse no desenvolvimento de antibiticos para uso farmacutico e

aplicaes na agricultura, um grande nmero de biossurfactantes com propriedades
antibiticas, principalmente da classe dos lipopeptdios e glicopeptdios, tem sido descrito.
Os raminolipdeos de P. aeruginosa e a surfactina de B. subtilis, por exemplo, funcionam
como antibiticos, solubilizando os principais componentes das membranas celulares
microbianas. Atravs da excreo destes biossurfactantes no meio, os microrganismos
adquirem maior chance de sobrevivncia e maior competitividade na busca por nutrientes
(LIN, 1996).

2.2.2 Classificao dos biossurfactantes

Microrganismos produzem uma grande variedade de biossurfactantes, tanto de alto

quanto de baixo peso molecular. Biossurfactantes de baixo peso molecular so geralmente
glicolipdeos e lipopeptdeos, e so muito efetivos na reduo das tenses superficial e
interfacial (LIN, 1996). Biossurfactantes de alto peso molecular so normalmente
polissacardeos anfipticos, protenas, lipopolissacardeos e lipoprotenas, caracterizandose como importantes formadores de emulses (VAN HAMME et al., 2006). A maior parte
destes compostos so aninicos ou neutros. Apenas alguns so catinicos, como aqueles
que apresentam um grupamento amino. A poro hidrofbica da molcula constituda de
uma longa cadeia de cidos graxos, enquanto a poro hidroflica pode ser um carboidrato,
um aminocido, um peptdeo cclico, fosfato, cido carboxlico ou lcool (BANAT, 1995;
MULLIGAN, 2005). A presena de diferentes pores hidroflicas faz com que os
biossurfactantes sejam agrupados em diferentes classes, de acordo com sua composio:

12

Glicolipdeos Por exemplo, os lipdios ligados a acares, como os

trealoselipdeos, raminolipdeos, soforolipdeos. Esto envolvidos na assimilao
de hidrocarbonetos de baixa polaridade por microrganismos (Figura 2.4);

O n(H2C)
O n(H2C)

C
O

HO

HO

C
H

CH3
H
C

C
(CH2)n CH3

OH
O

C
H

CH3
H
C

(CH2)n CH3

OH

O
OH
OH
HO

OH
O

Figura 2.4 Estruturas moleculares de glicolipdeos: (A) raminolipdeo, (B) soforolipdeo

e (C) Trealoselipdeo

Lipopolissacardeos Molculas de alta massa molecular e emulsificantes

extracelulares solveis produzidos por bactrias degradadoras de hidrocarbonetos,
como Acinetobacter calcoaceticus e algumas cepas de Rhodococcus sp (NEU et al.,
1992);

13

Lipopeptdeos Por exemplo, viscosina, surfactina e subtilisina, produzida por

Bacillus subtilis. So reportados por estarem entre os biossurfactantes mais efetivos
dentre os caracterizados at o momento (Figura 2.5);

Figura 2.5 Estrutura molecular da surfactina, um lipopeptdio

Fosfolipdeos Embora estejam presentes em todo microrganismo, existem poucos

exemplos de sua produo extracelular. O mais notvel seria o biossurfactante
produzido por Corynebacterium lepus (BOGNOLO, 1999);

cidos graxos e lipdeos neutros Por exemplo, cidos lipoteicicos (algumas
vezes classificados como glicolipdeos), cido corinomiclico e protenas
hidrofbicas (BOGNOLO, 1999).

A Tabela 2.1 exemplifica alguns microrganismos produtores e respectivos

biossurfactantes produzidos:

14

Tabela 2.1 Biossurfactantes, microrganismos produtores e respectivas tenses superficial

e interfacial (adaptado de DESAI & BANAT, 1997)
Biossurfactantes

Microrganismos

Tenso superficial Tenso interfacial

(mN/m)

(mN/m)

29

Rhodococcus erythropolis

32-36

14-17

Nocardia erythropolis

30

3,5

Mycobacterium sp.

38

15

Torulopsis bombicola

33

1,8

T. apicola

30

0,9

T. petrophilum

n.d.

n.d.

Ustiligo maydis

n.d.

n.d.

Viscosina

P. fluorescens

26,5

n.d.

Surfactina

Bacillus subtilis

27-32

Liquenisina

B. licheniformis

28

n.d.

cidos graxos

Corynebacterium lepus

30

Lipdeos neutros

Nocardia erythropolis

32

T. thiooxidans

n.d.

n.d.

Emulsan

Acinetobacter calcoaceticus

n.d.

n.d.

Liposan

Candida lypolitica

n.d.

n.d.

Carboidrato-

P. fluorescens

27

n.d.

Glicolipdeos
Raminolipdeos
Trealoselipdeos

Pseudomonas aeruginosa

Soforolipdeos

Lipopeptdeos

Fosfolipdeos
Biossurfactantes
polimricos

Protena-Lipdeo
n.d. = no determinado

15

2.2.3 Aplicaes comerciais dos biossurfactantes

Durante alguns anos a produo de biossurfactantes por vrios microrganismos tem

sido estudada extensivamente, dando origem a uma srie de estudos relacionados sua
produo, tipos e propriedades. Como conseqncia, muitas propriedades comercialmente
atrativas e claras vantagens comparadas com os surfactantes qumicos tm sido observadas.

Apesar de suas vantagens, a produo de surfactantes de origem microbiana em

escala comercial tem sido dificultada devido ao seu baixo rendimento e alto custo de
produo, sendo necessrio o desenvolvimento de estudos baseados em trs fatores: custo
da matria-prima inicial; rendimento da produo pelo microrganismo; e a disponibilidade
de uma produo e recuperao do produto economicamente adequada. Dentro deste
contexto, trs estratgias bsicas tm sido adotadas mundialmente para tornar a produo
de surfactantes de origem biolgica financeiramente competitiva: a utilizao de substratos
mais baratos e/ ou renovveis para reduzir os custos com a matria-prima inicial envolvida
no processo; desenvolvimento de um bioprocesso eficiente, incluindo a otimizao das
condies de cultivo e o custo associado ao processo de separao para uma mxima
produo e recuperao de biossurfactante; e o desenvolvimento de cepas modificadas
geneticamente de modo que apresentem uma maior produtividade do biossurfactante
(MUKHERJEE et al., 2006).

O maior mercado para os biossurfactantes a indstria petrolfera, onde so

utilizados na produo de petrleo ou incorporados em formulaes de leos lubrificantes
(VAN DYKE et al., 1991). Outras aplicaes incluem biorremediao e disperso no
derramamento de leos, remoo e mobilizao de resduos de leo em tanques de
estocagem, e a recuperao melhorada do petrleo. Atualmente, entretanto, as aplicaes
tm se distribudo entre os mais diversos setores industriais (Tabela 2.2).

16

Tabela 2.2 Aplicaes industriais de surfactantes e biossurfactantes (Adaptado de

SINGH et al., 2007)
Indstria

Aplicao

Funo do surfactante

Petrleo

Limpeza de

Reduzir a viscosidade e formar emulses,

reservatrios de leo;

facilitando

aumento da

depositados em fundos de reservatrios; reduzir

recuperao de

as foras capilares estimulando a liberao de

petrleo

leo atravs dos poros da rocha.

Biorremediao;

Emulsificao e remoo de hidrocarbonetos;

Ambiental

remediao de guas e remoo

Alimentcia

de

remoo

metais;

de

leos

agente

pesados

espumante;

solos

detergente; dispersante.

Emulsificao;

Emulsionar, favorecendo a consistncia e a

ingrediente funcional

textura; interao com lipdios, protenas e

carboidratos; agente protetor.

Agrcola

Biocontrole

Emulsionar pesticidas e herbicidas, facilitando a

disperso do composto ativo.

Cosmtica

Farmacutica

Produtos de higiene e

Emulsificantes;

umectantes;

beleza

solubilizantes; mediadores da ao enzimtica.

Produtos teraputicos

Inibir

formao

antibacteriana

de
e

espumantes,

cogulos;

atividade

antifngica;

vacinas;

imunomodulatrios.

Aplicao de biossurfactantes na recuperao melhorada do petrleo

No processo de recuperao melhorada do petrleo (MEOR), a participao de
microrganismos produz uma variedade de produtos como biossurfactantes, polissacardeos,
dixido de carbono, metano e hidrognio. Estas substncias produzem efeito de queda da
tenso interfacial entre a rocha e o leo, reduzindo as foras capilares e promovendo a
movimentao do mesmo atravs dos poros das rochas (BANAT et al., 2000).

As estratgias envolvendo MEOR dependem das condies do leo presente no

reservatrio, incluindo temperatura, presso, pH, porosidade, salinidade e a presena da

17

microbiota endgena. Dentro desta perspectiva, pode-se destacar os estudos feitos por
MAKKAR & CAMEOTRA (1997), onde se observou uma boa recuperao de leo (5662%) utilizando duas cepas de Bacillus subtilis.

Biossurfactantes e biorremediao
Biossurfactantes

apresentam

tambm

importante

papel

no

processo

de

biorremediao de solos impactados, principalmente emulsionando hidrocarbonetos,

aumentando a solubilidade destes compostos hidrofbicos e disponibilizando-os para a
biodegradao realizada pela microbiota nativa (BANAT et al., 2000). Podem tambm ser
usados diretamente para emulsificar e aumentar a solubilidade de contaminantes
hidrofbicos no solo, atravs da lavagem ex situ. Como exemplo, pode-se destacar o
trabalho de SHULGA et al. (2000), no qual examinaram a utilizao de biossurfactantes na
remoo de leo de areia litornea, bem como de penas e pele de aves marinhas e outros
animais. A cepa Pseudomonas PS-17 produziu um surfactante capaz de remover 95, 85 e
82% do leo presente na areia, penas e pele dos animais, respectivamente.

SANTA ANNA et al. (2007) investigaram a utilizao de biossurfactantes do tipo

raminolipdeo na remoo de dois tipos de leo de solos contaminados. O meio de cultivo
utilizado, contendo 13,2 g/L de raminolipdeo, apresentou tenses superficial, interfacial e
CMC de 30 mN/m, 2 mN/m e 60 mg/L, respectivamente. Em solos contendo
predominantemente hidrocarbonetos parafnicos ou aromticos, o percentual de remoo
de leo atingiu 91 e 78%, respectivamente, na presena de meios de cultivo com baixas
concentraes de raminolipdeos (6,3 a 7,9 g/L).

Outro exemplo a empresa Biodetox, sediada na Alemanha, que possui um

processo de descontaminao de solos, lamas industriais e guas resituais. O procedimento
envolve o transporte de material contaminado para biopilhas, onde receber tratamento
atravs de um produto comercial contendo bactrias, nutrientes e biossurfactantes, que
promovem a degradao e limpeza do material (BANAT et al., 2000).

18

Remediao de solos contaminados com metais pesados

Estudos acerca da utilizao de biossurfactantes na remediao de solos
contaminados com metais pesados tambm tm sido expressivos, seja pela complexao
das formas livres do metal em soluo aquosa, promovendo a adsoro do metal ao
biosurfactante, ou pelo acmulo de biossurfactantes na interface slido/ lquido, sob
condies de reduzida tenso interfacial, permitindo seu contato com o metal adsorvido.
Trabalhos reportados por NEILSON et al. (2003) e MULLIGAN & WANG (2004)
apontam a atividade de raminolipdios na remoo de metais pesados, como Ni e Cd do
solo, com eficincia de 80-100% em laboratrio e 20-80% no campo.

Limpeza de reservatrios de leo
Outra aplicao de biossurfactantes relacionada com a indstria do petrleo est na
limpeza de reservatrios de leo. Resduos e fraes de leos pesados que se depositam no
fundo de tanques de estocagem so altamente viscosos e podem se tornar depsitos slidos
que no so removidos por bombeamento convencional. A remoo normalmente requer
lavagem com solventes ou limpeza manual, ambas perigosas, demoradas e caras
(BOGNOLO, 1999). A utilizao de biossurfactantes tem sido estudada como uma
alternativa, promovendo a reduo da viscosidade de leos pesados e a formao de
emulses leo/ gua, facilitando a recuperao e transporte em oleodutos (BANAT et al.,
2000). Estudos feitos por BANAT et al. (1991) indicaram que a utilizao de
biossurfactantes para a limpeza de tanques, em substituio aos surfactantes convencionais,
promoveu a limpeza e recuperao de 90% dos hidrocarbonetos presentes no resduo.

Outras aplicaes
Embora grande parte dos trabalhos envolvendo as aplicaes de biossurfactantes
estejam limitados ao seu uso na indstria petroqumica, estas molculas apresentam grande
variedade de outras aplicaes, que incluem atividades voltadas para a agricultura,
indstria farmacutica, cosmtica e de alimentos.

19

Biossurfactantes so usados na agricultura especialmente em formulaes de

herbicidas e pesticidas, aumentando o efeito de agentes de biocontrole. Mecanismos de
ao do biossurfactante incluem a facilitao da penetrao do agente de controle ou de seu
produto nas clulas ou tecidos do organismo alvo (SINGH et al., 2007).

Na indstria farmacutica a surfactina, um lipopeptdeo cclico produzido por cepas

de B. subtilis, um dos biossurfactantes cujas propriedades antimicrobianas so mais
conhecidas. Apresenta atividade antifngica e moderada atividade antibacteriana, inibindo
a formao de cogulos de fibrina, a formao de canais inicos em bicamadas lipdicas e a
liberao de adenosina monofosfato cclica (cAMP), alm de exibir propriedades antivirais
e antitumorais. A inibio da adeso de bactrias entricas e a formao de biofilme,
essenciais para a colonizao de uma superfcie por bactrias, foi relatada por
biossurfactantes produzidos por bactrias do gnero Lactobacillus, permitindo sua
utilizao como probitico para a preveno de infeces urogenitais (SINGH &
CAMEOTRA, 2004).

Na indstria de alimentos, biossurfactantes so utilizados como emulsificantes para

o processamento de matrias-primas. A emulsificao desempenha um importante papel na
formao da consistncia e textura, assim como na solubilizao de aromas. O
bioemulsificante produzido por C. utilis, por exemplo, tem sido utilizado em molhos
prontos para salada (BANAT et al., 2000).

Na cosmtica, os biossurfactantes tambm tm encontrado um mercado em

expanso, sobretudo devido sua maior compatibilidade com a pele. A Kao Chemical
Corporation, por exemplo, utiliza soforolipdios comercialmente como umectantes em
batons e como hidratante para pele e cabelos (BANAT et al., 2000).

20

2.3 Bactrias do gnero Rhodococcus

Dentre os organismos produtores de biossurfactantes destacam-se bactrias do
gnero Rhodococcus.

O gnero Rhodococcus pertence ao txon supragenrico Mycolata, o qual inclui

outros gneros como Corynebacterium, Mycobacterium e Nocardia. Membros deste txon
exibem uma complexidade pouco comum na composio e organizao de seu envelope
celular, quando comparada com outras bactrias Gram-positivas. O envelope celular de
Rhodococcus dominado pela presena de uma parede celular de polissacardeos do tipo
arabinogalactana, longas ramificaes de cidos graxos e cidos miclicos, ligados
covalentemente a uma matriz de peptideoglicana-arabinogalactana-cido miclico
(SUTCLIFFE, 1998).

So actinobactrias aerbias, Gram-positivas, com ciclo de vida alternante entre as

formas cocos e bastonetes, algumas vezes mostrando projees filamentosas (FINNERTY,
1992). No produzem esporos, so imveis e suas colnias apresentam aspecto mucide
(ESCH et al., 1999). Podem ser encontradas em solo, rochas, guas subterrneas,
sedimentos marinhos, excretas de animais, intestinos de insetos e em plantas (BELL et al.,
1998) (Figura 2.6).

Figura 2.6 Micrografia eletrnica de Rhodococcus sp. cepa RHA1, mostrando o

crescimento por ramificaes filamentosas
(Fonte:http://www.microbiology.ubc.ca/eltis/genomics.htm)

21

Estudos vm demonstrando que a grande diversidade de bactrias pertencentes ao

gnero Rhodococcus apresenta a habilidade de degradar um grande nmero de compostos
orgnicos, incluindo alguns dos mais difceis compostos, como os recalcitrantes e que
apresentam toxicidade. Rhodococcus so candidatas ideais para aumentar a biorremediao
de locais contaminados e tm provado apresentar vasta utilidade como agentes de
biotransformao, como modificaes em esterides e produo de amidas a partir de
nitrilas (LARKIN et al., 2005).

Trabalhos direcionados para a atividade metablica destas bactrias demonstram

sua grande aplicabilidade na biotecnologia industrial, farmacutica e ambiental. Bactrias
deste gnero costumam ser excelentes degradadoras de compostos hidrofbicos, sendo
capazes de consumir, transformar ou biodegradar parafinas, olefinas, nafta, poliaromticos,
fenis clorados, esterides e lignina (BICCA et al., 1999). Catabolizam cadeias curtas e
longas de alcanos e compostos aromticos heterocclicos e policclicos, e a biodegradao
de quinolona e piridina tem sido estudada em Rhodococcus (LARKIN et al., 2005).

Uma caracterstica comum a bactrias do gnero Rhodococcus a presena de

muitos tipos de monooxigenases e dioxigenases, que facilitam o crescimento e degradao
de uma grande variedade de poluentes (Figura 2.7) (LARKIN et al., 2005). Por exemplo,
destaca-se o envolvimento do grupamento heme de enzimas citocromo P450 na
degradao de atrazina (NAGY et al., 1995) e ETBE (CHAUVAUX et al., 2001).

22

Figura 2.7 Diversidade de reaes oxigenase catalisadas por Rhodococcus. As reaes

incluem: (A) epoxidao (ex: enzimas citocromo P450), (B) cis-dihidroxilao (ex:
dioxigenases, como naftaleno dioxigenase), (C) hidroxilao de grupos alquil secundrios,
(D) hidroxilao de grupos alquil primrios (ex: alcano monooxigenases), (E) sulfoxidao
de sufeto a sulfxido, (F) sulfoxidao de sulfxido a sulfona (LARKIN et al., 2005)

A seqncia genmica de Rhodococcus sp. cepa RHA1 revela uma seqncia de

9,7 Mb distribuda em um cromossomo e trs plasmdios. Compatvel com o tamanho do
genoma est o grau de redundncia genmica. Por exemplo, muitas oxigenases, incluindo
seis dioxigenases e dez citocromos P450 so codificados. Isto pode explicar por que muitas
cepas podem se adaptar para catabolizar um grande nmero de substratos.

O genoma de outras bactrias do gnero, como Rhodococcus aetherovorans cepa

I24 (7 Mb) e R. erythropolis cepa PR4 (7 Mb) revelam padres similares de mltiplos
genes homlogos (LARKIN et al., 2005). Alm disso, a presena de mltiplas alcano
hidroxilases uma caracterstica comum a muitas cepas de Rhodococcus. Plasmdios de
Rhodococcus tambm codificam genes para o catabolismo de uma srie de compostos,
incluindo tricloroeteno e naftaleno (KULAKOV et al., 2005).

23

A habilidade de Rhodococcus em utilizar difceis substratos tambm apresenta base

fisiolgica. Tem sido observada a presena de cepas ativas de Rhodococcus na presena
tanto de solventes miscveis em gua (etanol, butanol) quanto de solventes imiscveis
(dodecano, tolueno) (DE CARVALHO et al., 2004). A degradao de alcanos tambm
ocorre pela aderncia a gotculas de leo devido superfcie celular hidrofbica, contendo
cido miclico. Associado com esta caracterstica est a habilidade de produzir
biossurfactantes, os quais auxiliam na assimilao de substratos hidrofbicos modificando
a hidrofobicidade na superfcie celular (WHYTE et al., 1999).

As principais espcies de Rhodococcus apontadas como boas produtoras de

biossurfactante so R. erythropolis, R. ruber, R. opacus e R. rhodochrous.

2.4 Biossurfactantes produzidos por Rhodococcus sp

A produo de biossurfactantes por Rhodococcus sp. tem sido estudada por
diversos autores nas ltimas dcadas. Assim como outras bactrias degradadoras de
hidrocarbonetos, Rhodococcus responde presena de compostos hidrofbicos pela
produo de molculas de biossurfactantes, tornando-se capaz de utilizar estes compostos
como substrato para seu crescimento.

No gnero Rhodococcus tem-se observado a predominncia da produo de

biossurfactantes do tipo glicolipdeo, embora outros tipos tambm venham sendo
reportados, como polissacardeos associados parede celular (LANG & PHILP, 1998;
NEU et al., 1992). A prevalncia de um composto sobre o outro ser influenciada pelas
condies de cultivo, sobretudo a fonte de carbono utilizada (RAPP et al., 1979a). A
Tabela 2.3 exemplifica alguns biossurfactantes produzidos por bactrias do gnero
Rhodococcus:

24

Tabela 2.3 Biossurfactantes produzidos por Rhodococcus sp. (adaptado de

PHILP et al., 2002)
Microrganismo

Produto

Tenso

Tenso

CMC

Referncia

superficial interfacial (mg/L)

(mN/m)

(mN/m)

Polissacardeo

n.d*

n.d.

n.d.

Rapp et al., 1979

Trealose-lipdeo

n.d

n.d

n.d

Rapp et al., 1979b

Trealose-2,2,3,4-

26

<1

15

Kim et al., 1990

Polissacardeo

n.d

n.d

n.d

Neu et al., 1992

Sobrenadante

30

n.d

n.d

Espuny et al., 1996

R. ruber IEGM235

Glicolipdeo

26,8

0,9

54

Ivshina et al., 1998

Rhodococcus sp.

Sobrenadante

36

n.d

n.d

Whyte et al., 1999

R. rodochrous

Polissacardeo

n.d

n.d

n.d

Iwabuchi et al., 2002

R. ruber

Sobrenadante

27,4

2,7

72

Philp et al., 2002

R. erythropolis

Sobrenadante

43

15

n.d

Ciapina et al., 2006

R. erythropolis
DSM43215
R. erythropolis
DSM43215
R. erythropolis
DSM43215
Rhodococcus cepa

tetraester

33
Rhodococcus cepa
51T7

cepa Q15

ATCC4277

*n.d. = no determinado

RAPP et al. (1979a) verificaram a produo de polissacardeos por Rhodococcus

erythropolis quando a bactria foi crescida em diferentes fontes de carbono. Foi
demonstrado que as condies de cultura timas para a formao de polissacardeos eram
obtidas utilizando glicerol como fonte de carbono. O polissacardeo obtido apresentava em
sua composio glicose e manose, uma pequena poro de protenas e traos de
glicosamina.

RISTAU & WAGNER (1983), utilizando como fonte de carbono uma mistura de nalcanos C14 e C15, obtiveram 8g/L de trealose-lipdeos constitudos de 90% de trealose-

25

tetraester e 10% de trealose-corinomicolatos por Rhodococcus erythropolis, em

experimentos realizados em biorreator. KIM et al. (1990) obtiveram produo superior a
30g/L de trealose-2,2,3,4-tetraester utilizando a mesma espcie em um meio de cultivo
contendo uma mistura de hidrocarbonetos n-C10 (86%), n-C11 (11,5%) e n-C12 (2,4%).

NEU et al. (1992), utilizando uma cepa de Rhodococcus crescida em hexadecano

obtiveram 158mg/L de polissacardeos, os quais apresentavam em sua estrutura raminose,
glicose e cido glucurnico. Estudos feitos por ESPUNY et al. (1996) com a cepa
Rhodococcus sp 51T7 levaram produo do glicolipdio trealose 2,3,4,2 tetraester, a qual
foi associada ao crescimento bacteriano.

WHYTE et al. (1999), ao estudarem as adaptaes fisiolgicas envolvidas na

assimilao de alcanos a baixa temperatura por Rhodococcus sp. cepa Q15, uma espcie
ainda no identificada mas com grande proximidade com R. erythropolis, verificaram a
produo de um surfactante capaz de reduzir a tenso superficial para 36mN/m, em meio
com 0,3% de hexadecano a 24C. Experimentos realizados com microscopia eletrnica de
transmisso revelaram a presena de incluses intracelulares conectadas com uma
substncia extracelular polimrica contendo uma mistura de glicoconjugados, a qual
variava quanto sua composio de acordo com a fonte de carbono utilizada.

IWABUCHI et al. (2002) verificaram a produo de um polissacardeo contendo

glicose, galactose, manose, cido glucurnico e lipdios, produzido por Rhodococcus
rhodochrous S-2. O polissacardeo produzido estimulou o crescimento da bactria em
fraes aromticas de leo e o aumento da degradao destes compostos pelo
microrganismo.

PHILP et al. (2002) verificaram a produo de biossurfactantes por Rhodococcus

ruber utilizando diferentes n-alcanos como fonte de carbono e compararam o produto
obtido com os glicolipdeos produzidos por R. erythropolis. Maiores concentraes de
biossurfactante foram obtidas quando hexadecano foi utilizado como fonte de carbono (9,9
g/L) e a tenso superficial atingiu 27,4 mN/m ainda na fase lag de crescimento bacteriano.
Embora o cultivo em batelada simples tenha apresentado perfis muito semelhantes para R.
ruber e R. erythropolis, as tenses superficiais e interfaciais atingiram valores mais baixos

26

para R. ruber. Em ambos os casos, o biossurfactante obtido foi caracterizado como

glicolipdeo do tipo trealoselipdeo.

Biossurfactantes do tipo trealose dinocariomicolatos foram obtidos por NIESHER

et al. (2006) crescendo Rhodococcus opacus 1CP em um meio contendo n-alcanos.
Observou-se uma produo associada ao crescimento bacteriano e altas taxas de converso
quando utilizou-se n-tetradecano e n-hexadecano.

Com o objetivo de entender os princpios atravs dos quais polissacardeos

produzidos por Rhodococcus levavam emulsificao e aumento da degradao de
hidrocarbonetos poliaromticos, URAI et al. (2006) realizaram uma anlise dos
polissacardeos produzidos por R. rhodochrous cepa S-2. O mesmo era composto de
galactose, manose, glicose, cido glucurnico, cido octadecanico e cido hexadecanico.
Trata-se de um tetrassacardeo constitudo de unidades que se repetem em sua estrutura. De
um modo anlogo, PERRY et al. (2007) estudaram a estrutura do polissacardeo
extracelular produzido por Rhodococcus sp. RHA1 e observaram que se tratava tambm de
um tetrassacardeo composto por cido glucurnico, glicose, galactose e frutose.

No Brasil existem poucos trabalhos envolvendo a produo de biossurfactantes por

Rhodococcus. BICCA et al. (1999) verificaram a produo de biossurfactantes por R.
ruber e R. erythropolis, analisando a influncia de fatores ambientais como pH,
temperatura, composio do meio e fonte de carbono sobre o processo produtivo.
Obtiveram melhor resultado utilizando R. ruber, num meio contendo extrato de levedura
como suplemento e 1% de diesel como fonte de carbono, em pH 7,0 e temperatura 37C. A
tenso superficial do meio foi reduzida para 40 dina/cm em 48 horas e o ndice de
emulsificao E24 obtido foi de at 60%.
CIAPINA et al. (2006) investigaram a produo de biossurfactantes por
Rhodococcus erythropolis crescendo em glicerol ou hexadecano como nicas fontes de
carbono. Embora a produtividade alcanada tenha sido semelhante em ambos os casos, o
glicerol foi capaz de promover a produo e liberao do biossurfactante para o meio
fermentado, enquanto em hexadecano apenas parte do produto foi liberada para o meio,
sendo necessria uma etapa posterior de sonicao para a liberao do mesmo. Estudos em

27

batelada indicaram uma produo de biossurfactante semi-associada ao crescimento

bacteriano quando glicerol foi utilizado como nica fonte de carbono.

Para investigar a eficincia do biossurfactante produzido por esta espcie utilizando

glicerol como nica fonte de carbono, experimentos preliminares foram realizados
utilizando o meio contendo o surfactante para a remoo de hidrocarbonetos de borras
oleosas. Foi verificada uma remoo de at 94%, confirmando o potencial deste
biossurfactante para a recuperao de leo e remediao de reas contaminadas (MELO,
2005; CIAPINA et al., 2006).

2.5 Influncia da composio do meio de cultivo sobre a produo de

biossurfactantes
A eficincia de um bioprocesso a base para qualquer indstria biotecnolgica,
incluindo aquela voltada para a produo de biossurfactantes. Neste caso, a busca pelo
aumento da produtividade demanda a adio de componentes ao meio de cultura que
induziro a mxima ou tima produtividade. De um modo similar, eficientes tcnicas e
metodologias so necessrias para a recuperao mxima do produto (MUKHERJEE et al.,
2006).

Dentre os fatores que influenciam a natureza qumica e a concentrao de

biossurfactante produzido est o microrganismo utilizado, a fonte de carbono, as possveis
limitaes nutricionais envolvidas no crescimento microbiano, alm de fatores abiticos,
como pH, temperatura, agitao e aerao (COOPER et al., 1981; DESAI & BANAT,
1997; MUKHERJEE et al., 2006; AMZCUA-VEGA et al., 2007). Deste modo, modelos
para a produo de biossurfactantes por diferentes espcies de bactrias devem ser
otimizados caso a caso (LIN, 1996).

Diferentes elementos, como nitrognio, ferro e mangans so reportados por afetar

a produo de biossurfactantes. Por exemplo, SANTA ANNA et al. (2002) verificaram a
produo de biossurfactantes por Pseudomonas aeruginosa PA1 utilizando diferentes
fontes de carbono e nitrognio. Foi observado que nitrato de sdio (YP/X = 0,8 g/g) foi mais

28

efetivo que sulfato de amnio (YP/X = 0,4 g/g) e uria (YP/X = 0,5 g/g). Estes resultados
foram confirmados por SANTOS et al. (2002), que verificaram a produo de
raminolipdeos por esta cepa, utilizando diferentes fontes de carbono e nitrognio e
variadas relaes C/N. Observaram que a utilizao de nitrato de sdio como fonte de
nitrognio e glicerol como fonte de carbono, sob diferentes relaes C/N, levou a uma
maior produtividade, em comparao com a utilizao de sulfato de amnio como fonte de
nitrognio. Este resultado sugere que a limitao de nitrognio leva ao aumento da
produtividade do bioprocesso, uma vez que a assimilao de nitrato como fonte de
nitrognio mais lenta que a assimilao de ons amnio.

Similarmente, a adio de ferro e mangans no meio de cultura foi reportada por

aumentar a produo de biossurfactantes por Bacillus subtilis (WEI et al., 2003). Por outro
lado, a adio de metais ao meio no afeta a produo de surfactantes por Torulopsis
bombicola, Corynebacterium lepus e Nocardia amarae (AMZCUA-VEGA et al., 2007).

Diversos estudos tambm apontam a importncia de alguns sais sobre a produo

de biossurfactantes. GUERRA-SANTOS et al. (1986), por exemplo, constataram em
fermentaes contnuas de Pseudomonas aeruginosa que, para a obteno de altas
concentraes de raminolipdeos foram necessrias condies limitantes de sais de
magnsio, clcio, potssio, sdio e elementos traos. Neste trabalho, foram estabelecidos
valores de pH (6,2 a 6,4) e temperatura (32C a 34C) onde a produtividade mxima de
biossurfactante foi obtida.

KIM et al. (1997), ao estudarem a produo e propriedades do lipopeptdeo

produzido por Bacillus subtilis C9 verificaram uma maior produo do biossurfactante em
concentraes mais altas de fosfato, o que estava diretamente relacionado com a preveno
do decrscimo do pH durante o cultivo pelos ons fosfato.

ESPUNY et al. (1996) tambm avaliaram a influncia da adio de tampo fosfato

sobre a produo de surfactantes por Rhodococcus. Valores entre 1,5-2,5 g/L de tampo
fosfato de potssio foram considerados timos para a produo de glicolipdeos por esta
bactria. A substituio de sulfato de amnio por nitrato de sdio como fonte de nitrognio
tambm resultou num aumento da produtividade e estabilizao do pH da cultura ao longo

29

do tempo; fundamental tanto para uma produo eficiente de biossurfactantes quanto para
o crescimento bacteriano.

Vrios autores vm retratando a influncia da fonte de carbono utilizada sobre a

produo, composio e propriedade dos biossurfactantes (RAPP et al., 1979; ESPUNY et
al., 1996; PIROG et al., 2004). Ao investigar a produo de biossurfactantes por
Rhodococcus erythropolis em substratos hidroflicos e hidrofbicos, por exemplo, PIROG
et al. (2004) verificaram que o surfactante produzido em substrato hidrofbico apresentou
menor tenso superficial e pouca atividade emulsificante, ao passo que o surfactante
produzido em substrato hidroflico apresentou tenso superficial mais alta, embora sua
atividade emulsificante tenha sido satisfatria (60-68%).

SANTOS et al. (2002) observaram que a utilizao de diferentes fontes de carbono

resultam

na

produo

de

vrias

propores

diferentes

de

raminolipdeos

(monoraminolipdeos e diraminolipdeos). Quando glicerol utilizado com fonte de

carbono, por exemplo, observa-se um maior percentual de diraminolipdeos. Esta diferena
de proporo pode representar uma importante mudana nas caractersticas do
biossurfactante produzido, afetando parmetros como a CMC e a tenso interfacial.

Suplementos como extrato de levedura tambm exercem influncia sobre a

produo e propriedade de biossurfactantes. AMZCUA-VEGA et al. (2006) observaram
uma menor tenso superficial quando extrato de levedura foi adicionado ao meio de cultura
para produo de biossurfactantes por Candida ingens. Resultados semelhantes foram
observados por KIM et al. (1997) para a produo de biossurfactantes por Bacillus subtilis.
A maior produo de biossurfactantes foi observada quando 0,5 g/L de extrato de levedura
foi adicionado ao meio de cultura.

As razes de diferentes elementos, como C/N, C/P, C/Fe e C/Mg tambm afetam a
produo de biossurfactantes e sua otimizao a aumenta. AMZCUA-VEGA et al. (2007)
observaram mxima produo de biossurfactantes por Candida ingens quando altas razes
C/Fe e C/P foram combinadas, levando ao aumento da concentrao de biossurfactantes
em 3,42 vezes. Em contraste, ESPUNY et al. (1996) observaram uma maior produo de
glicolipdeo por Rhodococcus sp 51T7 quando uma menor razo C/Fe foi utilizada.

30

A razo C/N tima para a produo de raminolipdeos mostrou variar

significativamente de acordo com a fonte de carbono utilizada, em experimentos feitos
com Pseudomonas aeruginosa cepa EM1. A melhor razo C:N foi 26 e 52, para culturas
contendo glicose e glicerol como nica fonte de carbono, respectivamente (WU et al.,
2008). De modo semelhante, foi verificado por SANTOS et al. (2002) que melhores
resultados para a produo de raminolipdeos por P. aeruginosa PA1 so observados
utilizando-se altas relaes C/N. Comparando-se a produtividade obtida quando nitrato de
sdio ou sulfato de amnio so utilizados como fonte de nitrognio e glicerol utilizado
como fonte de carbono, pde-se perceber que a influncia da razo C/N dependente da
rota metablica utilizada para a assimilao da fonte de nitrognio pelo microrganismo.

As condies fisiolgicas que levam ao aumento da produo de polissacardeos

contendo raminose tambm foram estudadas em Klebsiella I-714 por FARRS et al.
(1997). Maiores concentraes de polissacardeo foram obtidas quando altas razes C:N e
fontes complexas de nitrognio foram utilizadas. A reduo da concentrao de fosfato
presente no meio tambm favoreceu o aumento da concentrao de polissacardeo.

2.5.1 Otimizao de processos: a melhor combinao de fatores essenciais

A maximizao da produtividade ou minimizao dos custos de produo demanda

o uso de estratgias de otimizao de processos que envolvem mltiplos fatores. Um
clssico mtodo de otimizao de meios envolve a mudana de uma varivel de cada vez,
enquanto outras so mantidas num nvel fixo. Entretanto, este mtodo muito laborioso,
demanda muito tempo e no garante a determinao de uma condio tima para a
produo de um metablito. Por outro lado, realizar experimentos com todas as
combinaes fatoriais possveis torna-se impraticvel devido ao grande nmero de
experimentos requerido (MURKHERJEE et al., 2006).

Para resolver este problema e tornar a otimizao de processos mais fcil, uma
estratgia de otimizao estatstica baseada na metodologia de superfcie de resposta
(RSM) tem sido utilizada por vrios pesquisadores. Numa primeira seleo de variveis,
recomendvel avaliar o resultado e estimar os efeitos principais de acordo com um modelo

31

linear. Aps esta avaliao, as variveis que apresentam influncia significativa sobre o
resultado so selecionadas para novos estudos. Assim, um grande nmero de variveis
podem ser investigadas sem aumentar o nmero de experimentos ao extremo
(MURKHERJEE et al., 2006).

Este mtodo foi usado com sucesso, por exemplo, para determinar condies
timas de meio, inculo e condies ambientais para aumentar a produo de surfactina
por Bacillus subtilis. A Tabela 2.4 apresenta uma comparao entre a produo de
surfactina antes e aps a otimizao do processo (MURKHERJEE et al., 2006).

Tabela 2.4 Produo de surfactina antes e aps a otimizao das condies nutricionais e
ambientais. RSM baseada na estratgia de otimizao multifatorial (MURKHERJEE et al.,
2006).
Condies do processo de fermentao

Produo de

% de aumento

surfactina (CMC-1)

da produo

Meio de cultivo e condies no otimizadas

36

Meio otimizado

45

25

Meio + condies ambientais otimizadas

54

50

Meio + condies ambientais + tamanho e idade

58

61,1

62

72,2

do inculo otimizados (batelada simples)

Meio + condies ambientais + tamanho e idade
do inculo otimizados (processo contnuo)

A RSM tambm foi aplicada para aumentar a produo de biossurfactantes por

Pseudomonas aeruginosa AT10, a cepa probitica de Lactococcus lactis e Streptococcus
thermophilus, e por Bacillus licheniformis para a concomitante produo de
biossurfactantes e protease RG1, utilizando como fonte de carbono resduos da
agroindstria (MUKHERJEE et al., 2006).

32

Alm da aplicao com o intuito de aumentar a produtividade, a RSM tambm

uma ferramenta de grande utilidade para a otimizao das metodologias de aplicao do
biossurfactante obtido.

SANTA ANNA (2005) verificou a atuao dos raminolipdeos de Pseudomonas

aeruginosa PA1 na remediao de solos impactados por leo cru. As variveis
concentrao de raminolipdeos, tempo de contato do biossurfactante, nmero de lavagens
e a relao do volume de meio em relao concentrao de solo impactado foram
analisadas por meio de planejamento experimental. Foi encontrada significncia estatstica
para as variveis concentrao de raminolipdeos e nmero de lavagens, observando-se um
percentual de remoo de leo de at 33,5%. Num experimento posterior, onde o objetivo
foi avaliar o comportamento de remoo de diferentes tipos de leo da areia impactada, as
variveis concentrao de raminolipdeos e de leo foram analisadas, variando de 3,6 a
9g/L e 5 a 10%, respectivamente. Desta vez, os valores de remoo de leo chegaram a
91% utilizando 6,3g/L de raminolipdeos e 10% m/m de leo, nos experimentos realizados
com leo de caractersticas aromticas. No caso do leo com caractersticas parafnicas, o
melhor resultado obtido foi de 79,7% de remoo de leo, utilizando 7,23g/L de
raminolipdeos e 9,3%m/m de leo parafnico.

Estes mtodos de otimizao podero auxiliar as indstrias no desenvolvimento de

meios melhores, utilizar substratos mais baratos e encontrar as condies ambientais mais
favorveis para aperfeioar tanto a produo de biossurfactantes quanto sua aplicao.

2.6 Biossurfactantes na remediao de solos impactados por leo

Com o aumento do interesse em processos de remediao ambiental, vrias
alternativas tm sido propostas para o tratamento de locais contaminados com
hidrocarbonetos. Dentre estes mtodos de tratamento, a lavagem do solo tem sido uma
tecnologia promissora devido ao seu potencial para o tratamento no s de solos
contaminados com leo, mas tambm daqueles impactados com metais pesados. A
lavagem do solo uma tcnica mais rpida, quando comparada com a biorremediao e a

33

fitorremediao, as quais so amplamente afetadas por fatores climticos (URUM et al.,

2004).

Hidrocarbonetos policclicos aromticos (PAHs) so compostos hidrofbicos

amplamente difundidos no ambiente. Quanto maior o nmero de anis na estrutura
molecular, menor a solubilidade em gua e o coeficiente de partio octanol/ gua aumenta.
Devido ao alto coeficiente de partio, estes compostos podem ser fortemente adsorvidos
na superfcie de partculas e depositados no solo (SHIN et al., 2006).

O uso de surfactantes na lavagem de solos contaminados uma rea de aplicao

ainda pouco explorada. Nos ltimos anos, muitas pesquisas tm sido desenvolvidas
utilizando estes sistemas, como reflexo da ineficcia das tcnicas tradicionais em restaurar
solos contaminados com leo at um padro aceitvel de contaminao, segundo as
legislaes vigentes (URUM et al., 2003).

Muitos autores aplicaram surfactantes com sucesso na lavagem de solos

contaminados com compostos hidrofbicos. Alm disso, recentes pesquisas tm
examinado a possibilidade do aumento da biodisponibilidade de compostos de baixa
solubilidade e alta adsoro pela adio de agentes solubilizantes ao sistema (SHIN et al.,
2006).

A introduo de surfactantes no solo pode levar a preocupaes com contaminao.

Deste modo, a toxicidade do surfactante e seu potencial de remoo de hidrocarbonetos
precisam ser cuidadosamente analisados antes da seleo do surfactante a ser utilizado no
processo de lavagem do solo. Surfactantes produzidos biologicamente ocorrem
naturalmente no solo e sua utilizao em processos de remediao podem ser mais
aceitveis segundo este ponto de vista (SHIN et al., 2006).

Estudos acerca da utilizao de solues de biossurfactantes na remoo de leo

indicam que a mesma ocorre tanto em concentraes acima quanto abaixo da CMC. Assim,
dois mecanismos tm sido propostos para a remoo de leo promovida por
biossurfactantes. O mecanismo de mobilizao ocorre abaixo da CMC devido reduo da
tenso interfacial entre o leo e a gua, o que causa a reduo na fora capilar que mantm

34

aderido o leo e o solo. O mecanismo de solubilizao ocorre em concentraes acima da

CMC, onde os biossurfactantes se agrupam e formam agregados dinmicos conhecidos
como micelas (URUM et al., 2003).

HARVEY et al. (1990), frente ao vazamento de leo do navio Exxon Valdez,

testaram o glicolipdeo produzido por Pseudomonas aeruginosa quanto sua habilidade
em remover leo de amostras de solo do Alasca contaminadas com o referido
contaminante. Vrias condies foram testadas, incluindo concentrao de surfactante,
tempo de contato, temperatura de lavagem e presena ou ausncia de goma xantana. Os
resultados demonstraram a habilidade do surfactante microbiano em remover
significativamente mais leo (2 ou 3 vezes) que a gua sozinha, particularmente
temperatura igual ou superior a 30C.

VAN DYKE et al. (1993) avaliaram diversos biossurfactantes quanto sua

habilidade em remover compostos hidrofbicos do solo. Os surfactantes produzidos por P.
aeruginosa UG2 e Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 mostraram os melhores resultados
de recuperao de PHAs do solo.

IVSHINA et al. (1998) verificaram a produo de biossurfactantes por diversas

cepas de Rhodococcus sp. crescendo em n-alcanos, bem como sua habilidade em remover
leo associado a solos contaminados. R. ruber mostrou ser uma espcie promissora, a qual
produziu surfactantes de baixa toxicidade, efetivos na remoo de leo de superfcies,
chegando a 99,2% de remoo utilizando 2g/L de surfactante.

URUM et al. (2003) avaliou as condies timas para a lavagem de solos

contaminados com leo utilizando solues de vrios biossurfactantes. Verificou a
influncia de diferentes variveis sobre a remoo de leo, sendo elas a temperatura de
lavagem, o volume e a concentrao da soluo de biossurfactante, a velocidade de
agitao e o tempo de lavagem. Resultados mostraram que a temperatura e a concentrao
da soluo de surfactante foram os parmetros que mais influenciaram sobre a remoo de
leo. A remoo de leo mxima observada para raminolipdeos e saponina foi em torno
de 80%. Por apresentarem baixa toxicidade e fcil biodegradabilidade, obtiveram

35

preferncia sobre o SDS, o qual apresentou 95% de remoo, mas trata-se de um

surfactante qumico extremamente txico.

Num estudo posterior, URUM et al. (2006) realizaram um estudo comparativo,

investigando a eficincia de raminolipdeos, saponina e SDS sobre a remoo de leo de
solos contaminados. A eficincia dos surfactantes foi quantificada e posteriormente a
anlise por GC/MS foi conduzida para investigar a distribuio de hidrocarbonetos
remanescentes da lavagem. Os resultados mostraram que SDS removeu a maior parte do
leo, seguido de raminolipdeo e saponina. A anlise por GC/MS indicou que os diferentes
surfactantes apresentaram preferncias quanto aos componentes do leo que removeram do
solo. SDS removeu mais hidrocarbonetos alifticos que aromticos, enquanto saponina
removeu os hidrocarbonetos aromticos preferencialmente. Desta forma, estes dados
forneceram importantes informaes para a seleo de surfactantes a serem utilizados para
a remoo de leo de solos contaminados.

KUYUKINA et al. (2005) comparou a capacidade de remoo de leo de solos

contaminados por biossurfactantes produzidos por Rhodococcus ruber e pelo surfactante
comercial Tween 60. O biossurfactante apresentou capacidade de remoo 1,4 - 2,3 vezes
maior que o surfactante comercial. O aumento da mobilizao de leo promovida pelo
biossurfactante estava diretamente relacionado com a temperatura, sendo mais lenta a 15C
que a 22 28C. Um modelo matemtico construdo para simular o processo de penetrao
do leo atravs do solo indicou uma forte correlao entre a penetrao do surfactante
atravs do solo contaminado e a atividade de remoo de leo. Biossurfactantes foram
menos adsorvidos para os componentes do solo que os surfactantes sintticos, penetrando,
deste modo, rapidamente atravs do solo e removendo 65 82% do leo.

SHIN et al. (2006) estudaram a utilizao de biossurfactantes para remediar solos

contaminados com fenantreno pela combinao dos processos de solubilizao e
biodegradao. Nos experimentos para avaliar a solubilizao, observou-se que 150mg/L
de raminolipdeos produzidos por Sphingomonas sp. permitiram um percentual de remoo
de fenantreno de 17,3% e 9,5% em pH 5 e 7, respectivamente. Posteriormente, as amostras
de solo foram monitoradas por 10 dias para o acompanhamento da degradao do
fenantreno.

concentrao

de

fenantreno

nas

amostras

de

solo

decresceu

36

significativamente durante a etapa de biodegradao, com exceo dos experimentos

conduzidos a pH 4. O percentual de remoo do fenantreno alcanado com as duas
tcnicas combinadas chegou a 44% em pH 6. Estes resultados sugerem a eficincia de uma
ao combinada das tcnicas de solubilizao e biodegradao para aumentar a eficincia
de remoo deste contaminante.

2.7 Consideraes gerais

A reviso bibliogrfica apresentou uma viso geral acerca do potencial de aplicao
dos biossurfactantes, sobretudo aqueles produzidos por bactrias do gnero Rhodococcus.
A importncia dos suplementos adicionados ao meio de cultivo do microrganismo sobre o
processo produtivo, bem como sobre as caractersticas do biossurfactante obtido foram
destacadas.

Uma grande vantagem dos surfactantes biolgicos sobre aqueles de origem qumica
est na reduzida toxicidade ao meio ambiente e na possibilidade de produo a partir de
substratos renovveis. A utilizao de glicerol como fonte de carbono durante este estudo
se enquadra nesta perspectiva, visando dar um destino a este subproduto, gerado a partir da
produo de biodiesel. Preocupaes ambientais associadas com a disposio de glicerol
tm se tornado constantes, medida que a produo de biodiesel se intensifica
mundialmente.

A influncia de diferentes suplementos adicionados ao meio de cultivo sobre a

produo e caractersticas fsico-qumicas do biossurfactante foram apresentadas,
enfocando a importncia da fonte de carbono, da abundncia ou limitao de ons ferro,
nitrato, magnsio, cloro e outros nutrientes, de acordo com o microrganismo estudado. As
peculiaridades de cada microrganismo tornam necessria a otimizao do processo
produtivo caso a caso.

Diversos estudos j reportados na literatura enfocando a produo de

biossurfactantes por Rhodococcus sp. foram apresentados, destacando que no Brasil
poucos so os trabalhos dedicados ao processo de produo realizado por estas bactrias.

37

Uma breve descrio acerca de ferramentas estatsticas teis na otimizao de insumos

para a obteno de produtos biotecnolgicos foi feita, exemplificando trabalhos utilizando
a metodologia de superfcie de resposta para a produo de biossurfactantes por diferentes
microrganismos.

A utilizao de biossurfactantes na remediao de solos impactados por leo

complementa a abordagem realizada, apresentando as vantagens da utilizao de
biossurfactantes como agentes de lavagem de solos contaminados com hidrocarbonetos.

38

3. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
A humanidade tem transformado a Terra e sustentado um crescimento populacional
que acentuar sua influncia sobre o ambiente. Como resultado, as preocupaes
relacionadas proteo ambiental tm aumentado recentemente sob um ponto de vista
global e as indstrias qumicas e farmacuticas vm antecipando sua reestruturao dentro
deste contexto. Muitas indstrias tm reconhecido a necessidade do gerenciamento seletivo
de resduos, reciclagem de energia e conservao ambiental. A indstria do petrleo, frente
aos casos de derramamento de leo, tem buscado solues eficazes para o reparo dos danos
ambientais causados.

A utilizao de biossurfactantes tem atrado ateno por promover a dissoluo de

hidrocarbonetos e suas aplicaes tm sido grandemente estendidas nas ltimas dcadas
como

alternativa

biodegradabilidade.

aos

surfactantes

qumicos,

principalmente

devido

sua

39

Apesar de suas inmeras vantagens, biossurfactantes so, atualmente, incapazes de

competir economicamente com surfactantes quimicamente sintetizados presentes no
mercado devido ao seu alto custo produtivo. Torna-se necessrio, deste modo, o
desenvolvimento de estudos que levem otimizao de sua produo com a utilizao de
substratos mais baratos, o desenvolvimento de processos tecnolgicos que permitam uma
maior recuperao do produto e o aumento do conhecimento e habilidade na manipulao
do metabolismo do microrganismo produtor.

Seguindo essa perspectiva, o presente trabalho apresentou como objetivo geral a

otimizao das condies de cultivo para incrementar a produo de biossurfactantes por
Rhodococcus erythropolis.

Os objetivos especficos foram:

Verificar a atuao de diferentes concentraes de tampo fosfato na manuteno
do pH, bem como sua influncia na produo de biossurfactantes por Rhodococcus
erythropolis;

Avaliar a influncia de diferentes concentraes de glicerol, nitrato de sdio, sais
minerais e elementos traos na produo de biossurfactantes, por meio de
ferramentas estatsticas de planejamento experimental;

Confirmar os resultados obtidos conduzindo o processo produtivo em biorreatores
de bancada;

Aplicar o biossurfactante para a lavagem ex situ de sedimento impactado com borra
oleosa oriunda do processamento de petrleo pela Petrobras.

40

4. MATERIAIS E MTODOS
4.1 Microrganismo
Rhodococcus erythropolis ATCC 4277 foi obtida do banco de cepas do
Departamento de Microbiologia da Universidade de So Paulo SP.

4.2 Meios de cultivo e condies de crescimento

4.2.1 Inculo

Pr-inculos foram crescidos em frascos Erlenmeyer de 500mL contendo 150mL

do meio de cultivo (Tabela 4.1). O crescimento se deu a 30C em agitador rotatrio a
200rpm durante 24 horas. Ao final deste perodo, o meio contendo crescimento microbiano
foi inoculado em novos frascos Erlenmeyer de 1L contendo 300mL do meio de

41

crescimento bacteriano, descrito na Tabela 4.1. Os frascos foram novamente incubados

durante 24h, sob as mesmas condies descritas. As clulas foram recuperadas por
centrifugao a 9000 x g por 15 minutos, lavadas com soluo salina contendo cloreto de
sdio 0,9%, novamente centrifugadas e usadas como inculo. Foram utilizadas
concentraes de inculo variando de 0,5 a 1,0 g/L.

Tabela 4.1 Descrio dos componentes do meio de crescimento bacteriano

Componente

Concentrao (g/L)

Extrato de levedura

3,0

Peptona de carne

15,0

Glicerol

1,0

4.2.2 Experimentos em frascos agitados

Para a produo de biossurfactantes foi utilizado o meio mineral cuja composio

est descrita na Tabela 4.2 (Adaptado de PHILP et al., 2002). Glicerol foi utilizado como
fonte de carbono a uma concentrao inicial de 2% m/v e nitrato de sdio foi utilizado
como fonte de nitrognio, baseado nos estudos realizados por CIAPINA et al. (2007). O
meio de cultura esterilizado por 15 min, 1 atm, 121oC.

Tabela 4.2 Descrio dos componentes do meio mineral para a produo de

biossurfactantes
Componente
KH2PO4
K2HPO4
NaNO3
NaCl
MgSO4.7H2O
CaCl2.2H2O
FeCl3.7H2O
Glicerol

Concentrao (g/L)
2,0
2,0
3,4
1,0
0,2
0,02
0,01
20

42

Inculos variando de 0,08 a 0,18 g foram adicionados a frascos Erlenmeyer de

500mL contendo 150mL de meio mineral, os quais foram mantidos por 4 a 8 dias em
agitador rotatrio a 200 rpm e temperatura 37C (CIAPINA et al., 2007).

4.2.3 Ensaios em biorreator

O bioprocesso em batelada simples foi conduzido em biorreator do modelo

Biostat (B. Braun Biotech International - Alemanha), aerado e agitado mecanicamente
com volume til de 1,5 L (Figura 4.1). A saturao de oxignio foi mantida a 20 %, sendo
controlada pela intensidade de agitao, em rpm. O pH foi mantido em 7,0 por adio de
HCl 2,0 mol/L e NaOH 2,0 mol/L e a temperatura foi mantida em 37 C durante o
processo.

Figura 4.1 Biorreator operando em batelada simples para a produo de biossurfactantes

por Rhodococcus erythropolis

43

4.3 Planejamento experimental

A metodologia de superfcie de resposta (RSM) foi utilizada para a anlise da
influncia de diferentes variveis sobre a produo de biossurfactantes e sobre as
propriedades do produto obtido.

4.3.1 Planejamento experimental fatorial fracionado

A influncia das variveis glicerol, nitrato de sdio, cloreto de sdio, sulfato de

magnsio, cloreto frrico, cloreto de clcio, extrato de levedura e soluo de elementos
traos foram testadas em frascos agitados. Num planejamento experimental fatorial
fracionado 28-4, com 8 fatores e 2 nveis, as variveis acima foram analisadas, conforme a
Tabela 4.3, gerando 16 experimentos mais 4 pontos centrais. A soluo de elementos
traos utilizada era constituda dos suplementos apresentados na Tabela 4.4.

Tabela 4.3 Variveis analisadas e seus nveis de acordo com o planejamento

experimental fatorial fracionado 28-4
Variveis

Inferior

Ponto Central

Superior

(-1)

(0)

(+1)

Glicerol (g/L)

10

20

30

Nitrato de Sdio (g/L)

3,4

5,8

Cloreto de Sdio (g/L)

Sulfato de Magnsio (g/L)

0,1

0,2

Cloreto Frrico (g/L)

0,01

0,02

Cloreto de Clcio (g/L)

0,02

0,04

Extrato de Levedura (g/L)

0,1

0,2

Elementos traos (mL/L)

0,5

44

Tabela 4.4 Constituio da soluo de elementos traos (RAPP et al., 1979)

Suplemento

Concentrao (g/L)

ZnSO4 . 7H2O

11

MnSO4 . H2O

FeSO4 . 7H2O

CoSO4 . 7H2O

0,3

CuSO4 . 5H2O

0,04

H3BO3

0,06

KI

0,01

EDTA

4.3.2 Planejamento experimental composto central rotacional

Para descrever a natureza da superfcie de resposta na regio tima, um

planejamento experimental composto central rotacional 23 com 3 fatores e 2 nveis foi
realizado, totalizando 14 experimentos mais 4 pontos centrais, conforme ilustra a Tabela
4.5. Nesta etapa, foram avaliadas as variveis glicerol, nitrato de sdio e extrato de
levedura.

Tabela 4.5 Variveis analisadas e seus nveis de acordo com o planejamento

experimental composto central 23
Variveis

Nveis
-1,68

-1

+1

+1,68

Glicerol (g/L)

3,3

7,5

10

11,7

Nitrato de Sdio (g/L)

0,2

0,6

1,27

Extrato de Levedura (g/L)

0,13

0,2

0,3

0,4

0,47

A anlise estatstica dos resultados foi realizada utilizando-se o software Statistica

verso 6.0.

45

4.4 Mtodos analticos

4.4.1 Concentrao de biomassa

A concentrao celular nas culturas submersas de Rhodococcus erythrpopolis foi

calculada em massa seca (g/L) pela medida da absorvncia a 600 nm e sua correlao
obtida atravs de curva padro com a massa seca.

4.4.2 Recuperao e quantificao de biossurfactante

Estudos desenvolvidos no Laboratrio de Desenvolvimento de Bioprocessos em

paralelo com a presente dissertao mostraram que Rhodococcus sp capaz de produzir
predominantemente biossurfactantes do tipo polissacardeo na presena de glicerol como
fonte de carbono. Deste modo, polissacardeos foram recuperados do meio fermentado a
37oC livre de clulas mediante a extrao por etanol 95% (3 vezes o volume da amostra)
(KUMAR et al., 2004). Aps extrao, os acares totais foram quantificados pelo mtodo
colorimtrico Fenol-cido Sulfrico (DUBOIS et al., 1956), utilizando-se glicose 1 g/L
para a construo da curva padro. Todo experimento de extrao foi realizado em
triplicata.

4.4.3 Quantificao de glicerol

O teor de glicerol foi avaliado pelo mtodo enzimtico-colorimtrico para a

determinao de triglicerdeos GPO-POD (CELM Brasil).

4.4.4 Quantificao de nitrato

Para quantificao de nitrato foi utilizado mtodo cido sulfrico-brucina. Em

resumo, 2,0 mL de soluo de brucina (0,6g/L de sulfato de brucina em cido sulfrico a
80% (v/v)) foram adicionados a 0,5 mL de amostra e a mistura aquecida em gua fervente

46

por 15 minutos. A reao foi imediatamente paralisada por resfriamento em banho de gelo
e realizada leitura de absorvncia a 410nm. Os valores de absorvncia foram convertidos
em concentrao (g/L) por meio do uso de curva-padro com concentraes conhecidas de
nitrato de sdio. Este mtodo sensvel para amostras contendo entre 1 e 50 mg/L de
NaNO3. (Adaptado de Colorimetry and Turbidimetry - Reagent Chemicals 9a Ed. ACS
Specifications. 2000, 2000 American Chemical Society).

4.4.5 Determinao do ndice de Emulsificao (E24)

O ndice de emulsificao foi determinado pela adio de 2mL de n-hexadecano

para 2mL do sobrenadante previamente precipitado e ressuspenso no mesmo volume de
meio, sendo posteriormente misturado em alta velocidade por dois minutos. Aps 24 horas,
o ndice de emulsificao (IE24) foi medido, sendo determinado pela altura da camada
emulsificada dividida pela altura total, multiplicada por 100 (COOPER & GOLDENBERG,
1987).

4.4.6 Medida da tenso superficial

A tenso superficial do meio livre de clulas foi determinada utilizando o tensimetro

modelo K100 (KRSS - Alemanha), temperatura ambiente pelo mtodo de Du Nouy
(ASTM D971 99 Standard Test Method for Interfacial Tension of oil Against Water by
the Ring).

4.4.7 Medida do pH

O pH do meio livre de clulas foi determinado utilizando o potencimetro da Marca

Digimed, modelo MS-21, na temperatura de 25C.

47

4.5 Ensaios de remoo de leo de solos arenosos

4.5.1 Caractersticas da borra oleosa

Foram utilizados, neste trabalho, resduos oleosos provenientes do separador gualeo (SAO) da Unidade de Negcios de Explorao & Produo de Sergipe e Alagoas
(UN-SEAL) da Petrobrs, Campo de Produo de Carmpolis, da Estao Coletora de
Nova Magalhes.

As caractersticas da borra oleosa foram obtidas a partir de caracterizaes prvias

realizadas por MELO (2004) e encontram-se discriminadas na Tabela 4.6.

Tabela 4.6: Caractersticas do resduo oleoso de fundo de separador O/A de Unidade de

Explorao & Produo da Petrobrs em Sergipe e Alagoas. (MELO, 2004)
Parmetro
Ponto fulgor
gua livre
pH
Cinzas
Sdio
Mangans
Ferro
Cloreto
Cromo total
Mercrio
Chumbo
leos e Graxas
TPHs
PAHs

Borra SAO
118 C
20 % (m/m)
6,7
200 mg/Kg
550 mg/L
0,19 mg/L
0,05 mg/L
860 mg/L
260 mg/Kg
8,4 mg/Kg
130 mg/Kg
91100 mg/Kg
50000 mg/Kg
68 mg/Kg

Limite NBR 10004

----2< pH <12,5
--200 mg/L
0,1 mg/L
0,3 mg/L
250 mg/L
--100 mg/Kg
1.000 mg/Kg
5% em massa
-----

48

4.5.2 Preparao da areia contaminada

A areia utilizada foi lavada e esterilizada por trs vezes a 121C, 15 min, 1 atm e
depois seca a 60C. A uma amostra deste solo foi adicionada gua destilada e o material
misturado alta velocidade em vrtex. O sobrenadante resultante foi adicionado em placas
de Petri, contendo meio de crescimento bacteriano conforme descrito na Tabela 4.1,
acrescido de 2% de gar e mantido a 30C por 24 horas para controle da esterilidade da
areia.

Uma massa fixa de areia (100g) foi impactada com a borra oleosa acima descrita,
resultando em um nvel de impactao de 55 mg de leo por grama de areia (URUM et al.,
2003). A areia impactada foi mantida em um frasco hermeticamente fechado a fim de
evitar a evaporao de componentes volteis.

4.5.3 Mtodo de lavagem

Os ensaios de remoo de leo (lavagem) utilizando o polissacardeo precipitado a

partir do meio fermentado foram realizados em frascos Erlenmeyer com capacidade de
50mL. O mtodo de lavagem foi adotado baseado em experimentos preliminares realizados
para determinar diferentes parmetros e as concentraes que mais afetam o sistema
biossurfactante/borra oleosa (MELO, 2005). As concentraes de biossurfactantes
utilizadas foram escolhidas baseadas na CMC do mesmo, determinada como 0,45 g/L
atravs de experimentos realizados durante tese de doutorado em desenvolvimento no
Laboratrio de Desenvolvimento de Bioprocessos, em paralelo com a realizao desta
dissertao.

Os frascos foram incubados a 30C sob agitao a 300 rpm por 120 minutos. A
razo slido:lquido utilizada foi de 5 g de areia impactada:25 mL de meio (MELO, 2005).
Aps o perodo de lavagem, os frascos ficaram em repouso por 3 minutos para facilitar a
separao e remoo da fase aquosa por decantao (Figura 4.2). Alquotas de 1 mL foram

49

retiradas de 5 pontos diferentes do sobrenadante de cada frasco para assegurar a

homogeneidade da amostra.

Figura 4.2 Frascos contendo o sistema areia : soluo de biossurfactantes imediatamente

antes da lavagem

Do volume total obtido, foi retirado 1 mL de amostra do sobrenadante proveniente

da lavagem, o qual passou por 6 extraes sucessivas com 1 mL de n-hexano por vez at
que a fase orgnica apresentasse absorvncia zero (MELO, 2005). A frao hexnica
contendo hidrocarbonetos removidos para o meio aquoso por ao dos biossurfactantes foi
analisada a 294 nm em espectrofotmetro DU70 (Beckman, Germany) (MELO, 2005;
URUM et al., 2004)

50

5. RESULTADOS E DISCUSSO
Nesta etapa so apresentados os resultados dos ensaios voltados para a produo de
biossurfactantes por Rhodococcus erythropolis ATCC 4277, bem como de avaliao da
remoo de leo de solos arenosos utilizando o biossurfactante purificado.

No processo de produo de biossurfactantes em frascos agitados buscou-se, a

princpio, avaliar a influncia de diferentes concentraes de tampo fosfato sobre a
manuteno do pH prximo neutralidade ao longo de todo o processo produtivo.
Posteriormente, por meio de ferramentas estatsticas, foi avaliado o efeito de diferentes
suplementos sobre a produo de biossurfactantes. Ao final de cada etapa do planejamento
experimental realizado, os resultados obtidos foram validados por meio da conduo do
bioprocesso em biorreatores de bancada.

Nos ensaios de remoo de leo de solos arenosos atravs da aplicao do

biossurfactante concentrado objetivou-se avaliar a eficincia de remoo do contaminante
pelo biossurfactante, em solos com diferentes tempos de impactao.

51

5.1 Avaliao do efeito da concentrao de Tampo Fosfato de Potssio

No decorrer dos ensaios realizados, esbarrou-se com a dificuldade de continuidade
da produo de biossurfactantes devido queda acentuada do pH do meio de cultivo aps
cerca de 48 horas. Tanto em frascos agitados quanto em biorreatores, a queda acentuada do
pH inibe o crescimento bacteriano e a produo de biossurfactantes, tornando necessria a
adio de um grande volume de hidrxido de sdio ao meio de cultivo, o que acarreta uma
grande variao no volume total de meio.

Com o objetivo de corrigir este problema, a influncia de diferentes concentraes

de tampo fosfato de potssio sobre a produo de biossurfactantes e a manuteno do pH
ajustado foi analisada em frascos agitados. Foram utilizadas concentraes de tampo
variando de 30 mmol/L a 300 mmol/L, segundo uma proporo de K2HPO4 e KH2PO4 1:1.
Na Tabela 5.1 esto expressos os valores observados, aps 5 dias, para o pH, a
biomassa, o ndice de emulsificao aps 24 horas (IE24) e a tenso superficial, para cada
uma das concentraes de tampo fosfato estudadas. Observa-se que, em comparao com
a tenso superficial da gua, cujo valor encontrado foi de 71 mN/m, bem como em relao
tenso superficial do meio de cultura antes de inocular as bactrias, de 68 mN/m,
observou-se a reduo da tenso superficial em todos os experimentos, sendo encontrados
valores mais satisfatrios com a adio de 150 mmol/L de tampo fosfato, onde foi obtida
uma reduo da tenso superficial para 34,28 mN/m.

Tabela 5.1 Valores observados para o pH, biomassa, IE24 e tenso superficial aps 5 dias
de cultivo
Concentrao
pH
(mmol/L)
5,3 0,14
30

Biomassa
(g/L)
1,2 0,35

IE24 (%)
25 5,7

Tenso Superficial
(mN/m)
51,99 4,13

60

6,6 0,03

1,86 0,43

31 4,2

46,46 5,08

100

6,6 0,28

2,35 0,45

36 8,5

44,83 3,62

150

6,8 0,14

2,55 0,53

36 5,6

34,28 3,25

300

6,8 0,03

3,41 0,28

10 7,1

49,64 5,71

52

Pode-se perceber atravs da Tabela 5.1 que concentraes iguais ou superiores a

60mmol/L de tampo fosfato foram suficientes para manter o pH do meio de cultivo
prximo neutralidade ao longo de todo o experimento. Embora concentraes maiores
favoream o aumento da biomassa, os resultados sugerem que concentraes mais elevadas
de fosfato de potssio levam alterao das propriedades surfactantes do produto obtido. A
300 mmol/L, observa-se uma reduo no ndice de emulsificao (IE24) do biossurfactante
produzido, bem como uma reduo menos expressiva da tenso superficial.

A Figura 5.1 apresenta a produo de biossurfactantes pela bactria e o fator de

rendimento de produto por biomassa (YP/X) sob diferentes concentraes de tampo fosfato
aps 5 dias de cultivo; tempo no qual foi observada uma maior produo de
biossurfactantes. O experimento foi feito em duplicata e em cada frasco o inculo inicial
foi de 0,7g/L.

350

Biossurfactante (mg/L)
YP/X (mg/g)

300
250
200

Biossurfactante
Yp/x

150
100
50
0
30

60

100

150

300

Tampo Fosfato de Potssio (mmol/L)

Figura 5.1 Efeito de diferentes concentraes de Tampo Fosfato de Potssio sobre a

produo de biossurfactantes e sobre YP/X

53

A concentrao de tampo fosfato de potssio exerceu influncia direta sobre a

produo de biossurfactantes pela bactria, conforme observado na Figura 5.1, sendo
observada uma produo crescente de biossurfactantes at a concentrao de 150 mmol/L.
A partir deste valor, entretanto, o aumento da concentrao de tampo fosfato passou a
exercer um efeito inibitrio sobre o processo produtivo, embora seu efeito sobre a
biomassa permanecesse positivo (Tabela 5.1).

A produo mxima de biossurfactantes, na concentrao de 150 mmol/L de

tampo fosfato de potssio, atingiu 285,0 7,07mg/L. Nestas condies, o rendimento de
produto por biomassa (YP/X) tambm alcanou valores mximos, atingindo 112 mg de
biossurfactante/g de clula. O valor da tenso superficial encontrada foi de 34 mN/m, o
qual comparvel com outros valores citados na literatura (ESPUNY et al., 1996;
WHYTE et al., 1999; PHILP et al., 2002). Aps a precipitao do meio de cultivo em
etanol para a recuperao de biossurfactantes do tipo polissacardeos e ressuspend-los em
gua destilada, obteve-se uma tenso superficial de 40 mN/m, demonstrando que
biossurfactantes do tipo polissacardeo exercem alguma influncia sobre as propriedades
surfactantes observadas no meio de cultivo. Estes resultados nos levaram a optar pela
fixao desta concentrao de fosfato de potssio durante os experimentos subseqentes de
otimizao do meio de cultivo para a produo de biossurfactantes por Rhodococcus
erythropolis.

O comportamento observado durante estes ensaios vem ao encontro de estudos j

realizados por KIM et al. (1997), em relao influncia positiva de fosfato de potssio
sobre a produo de biossurfactantes por Bacillus subtilis. Outros autores, entretanto,
reportam que a adio de altas concentraes de tampo fosfato inibem a produo de
tensoativos por alguns microrganismos, como Pseudomonas aeruginosa (BAZIRE et al.,
2005).

54

5.2 Efeito da adio de nutrientes sobre a produo de biossurfactantes

O efeito da adio de diferentes suplementos ao meio para a produo de
biossurfactantes foi analisado por meio da Metodologia de Superfcie de Resposta (RSM).
Esta metodologia composta por um conjunto de ferramentas estatsticas teis para a
modelagem e anlise de problemas, nos quais a resposta de interesse influenciada por
vrias variveis.

Inicialmente, foi realizada uma seleo de variveis por meio de um planejamento

experimental fatorial fracionado para, posteriormente, definir valores mais precisos para as
variveis significativas por meio de um planejamento experimental composto central.

5.2.1 Planejamento experimental fatorial fracionado

Para identificar quais componentes do meio apresentam efeito significativo sobre a

produo de biossurfactantes, um primeiro passo da otimizao foi desenvolvido. A
influncia de diferentes suplementos nutricionais reportados por favorecer a produo de
biossurfantantes tanto por Rhodococcus quanto por outros microrganismos foi analisada
por meio de um planejamento experimental fatorial fracionado 28-4, com 8 fatores e 2
nveis, alm de 4 pontos centrais (PC).

O objetivo desta etapa experimental foi realizar uma seleo de variveis para a
determinao daquelas que exercem um efeito significativo sobre a produo de
biossurfactantes por Rhodococcus erythropolis. Em cada frasco, foi fixada a concentrao
de fosfato de potssio em 150 mmol/L, variando-se a concentrao dos demais nutrientes,
sendo eles Glicerol (Glic), NaNO3, NaCl, MgSO4, FeCl3, CaCl2, extrato de levedura (EL)
e a soluo de elementos traos (El Tr).

A Tabela 5.2 apresenta os resultados obtidos em cada combinao de variveis para

o fator de rendimento do produto em relao biomassa (YP/X) e para o fator de
rendimento do produto em relao ao substrato (YP/S), ambos expressos em mg/g. Os
frascos foram mantidos sob agitao durante 4 dias, tempo no qual o glicerol presente no
meio havia sido completamente consumido naqueles ensaios cuja concentrao inicial era

55

mais baixa. Os smbolos + e indicam as concentraes utilizadas nos nveis superior e

inferior, respectivamente, conforme descrito na Tabela 4.3.

Tabela 5.2 Variveis analisadas e resultados obtidos para YP/X e YP/S no planejamento
experimental fatorial fracionado 28-4 com 8 fatores e 2 nveis

Ensaio Glic NaNO3 NaCl MgSO4 FeCl3 CaCl2

EL El Tr

YP/S

YP/X

9,7

146,5

11,5

191

11,1

157,9

5,1

46,7

19,0

207,5

9,0

131,4

8,5

117,1

4,3

122,8

5,3

40,5

10

3,9

64,1

11

5,1

76,7

12

4,3

104,1

13

14,5

189,5

14

0,8

14,5

15

5,3

43,4

16

2,1

40,2

PC

4,6 1,3 70 23,1

Atravs da Tabela 5.2 pode-se observar que um maior fator de rendimento, tanto
em relao ao substrato (YP/S) quanto em relao biomassa (YP/X), foi obtido no ensaio 5,
onde glicerol e nitrato de sdio foram adicionados de acordo com as concentraes
descritas para o nvel inferior e cloreto de sdio, cloreto frrico, cloreto de clcio e extrato
de levedura foram adicionados ao meio segundo as concentraes descritas para o nvel

56

superior. Neste ensaio, YP/S e YP/X alcanaram os valores de 19 e 207,5 mg/g,

respectivamente. A concentrao de biossurfactantes produzida foi de 120mg/L (dado no
mostrado).

No ensaio 13, onde glicerol e nitrato de sdio tambm foram adicionados segundo
seu nvel inferior de concentrao, valores maiores para YP/S e YP/X tambm foram obtidos,
alcanando 14,5 e 189,5 mg/g, respectivamente. Deste modo, observa-se que atravs do
planejamento experimental, foram encontrados valores mais altos para o fator de
rendimento de produto por biomassa (YP/X), em comparao com aqueles obtidos no
experimento anterior, onde YP/X alcanou o valor mximo de 112 mg de biossurfactante/ g
de clula (Figura 5.1).

Para orientar a discusso dos resultados, os dados obtidos foram analisados

empregando-se o software Statistica verso 6.0 e expressos no grfico de Pareto
apresentado na Figura 5.2. Esta figura apresenta o efeito quantitativo estimado de cada
uma das variveis sobre o rendimento de produto por substrato (YP/S) e o rendimento de
produto por biomassa (YP/X), segundo um nvel de significncia de 0,1.
Nos casos de planejamentos fatoriais fracionados, informaes importantes acerca
dos efeitos principais e das interaes de primeira ordem entre as variveis podem ser
obtidas. Entretanto, efeitos das interaes de segunda ordem e superiores so aceitas como
desprezveis. Em outras palavras, embora esta seja uma ferramenta de grande importncia
quando se deseja analisar a influncia de um grande nmero de variveis sobre
determinada resposta, o fracionamento do planejamento experimental e a reduo do
nmero de experimentos realizados acarretam perdas quanto anlise da influncia de
interaes entre as variveis de estudo sobre a resposta de interesse.

Deste modo, utilizou-se nesta etapa um intervalo de confiana de 90% para a

anlise estatstica dos dados, visando minimizar erros (do tipo II), ou seja, evitar que
variveis que favoream o processo produtivo sejam descartadas e, conseqentemente, no
estejam includas durante o planejamento completo realizado posteriormente.

57

Pelo grfico de Pareto, percebe-se que as variveis que exercem efeito significativo
sobre YP/S e YP/X so as concentraes de glicerol, nitrato de sdio, sulfato de magnsio e
extrato de levedura. Em ambos os casos, o efeito do extrato de levedura positivo,
enquanto o efeito do glicerol, nitrato de sdio e sulfato de magnsio negativo, ou seja,
maiores concentraes de extrato de levedura e menores concentraes de glicerol, nitrato
de sdio e sulfato de magnsio levam a melhores resultados para ambas as variveis de
resposta analisadas.

Conforme apresentado na Figura 5.2 A, as variveis que exercem maior efeito sobre
YP/S so as concentraes de glicerol e sulfato de magnsio, seguida de uma menor
influncia da concentrao de nitrato de sdio e do extrato de levedura. Em relao ao YP/X,
a concentrao de sulfato de magnsio exerce uma maior influncia sobre esta varivel de
resposta, seguida das concentraes de extrato de levedura, nitrato de sdio e glicerol
(Figura 5.2 B).

(1)Glic

-3,01213

(4)MgSO4

-2,96316

(2)NaNO3

-2,25305

(7)EL

1,888483

(8)ElTr

1,047124

(3)NaCl

(6)CaCl2

(5)FeCl3

,6103201

-,365803

,1600086

p=,1
Effect Estimate (Absolute Value)

Figura 5.2A - Grfico de Pareto do Planejamento Experimental Fatorial Fracionado 28-4

para a seleo de variveis que exercem influncia sobre YP/S

58

(4)MgSO4

-3,83947

(7)EL

2,84173

(2)NaNO3

-1,9356

(1)Glic

-1,8522

(8)ElTr

1,750391

(5)FeCl3

-1,61517

(6)CaCl2

-1,57867

(3)NaCl

,2730897

p=,1
Effect Estimate (Absolute Value)

Figura 5.2B Grfico de Pareto do Planejamento Experimental Fatorial Fracionado 28-4

para a seleo de variveis que exercem influncia sobre YP/X

Embora nesta primeira etapa de otimizao do meio de cultivo o objetivo estivesse

focado somente na seleo de variveis que exeram efeito significativo sobre o processo
produtivo, percebe-se a tendncia obteno de valores de rendimento mais satisfatrios
quando so utilizadas relaes de carbono:nitrognio (C/N) mais altas. De acordo com o
grfico de Pareto e considerando a presena de 10,5% de nitrognio total contido no
extrato de levedura, obteve-se um melhor rendimento numa relao C/N de 21.

A porta de entrada para o nitrognio no metabolismo do carbono o glutamato, o

qual formado pela aminao redutiva do -cetoglutarato. Existem dois mecanismos
bioqumicos atravs dos quais isto pode ocorrer. O primeiro trata-se de uma reao
catalizada pela glutamato desidrogenase, que efetiva em ambientes onde h amnia em
abundncia. O segundo mecanismo, no qual a glutamina um intermedirio, utilizado em
condies nas quais a concentrao de amnia baixa, como no caso das condies
utilizadas neste experimento. Este segundo mecanismo leva as clulas a utilizar a energia
livre atravs da hidrlise de adenosina trifosfato (ATP), fazendo com que a glutamina

59

sintetase possa assimilar a amnia presente no ambiente. Alm disso, como os

biossurfactantes por si s ajudam na assimilao da fonte de carbono em condies nas
quais o nitrognio limitante, a via da enzima glutamina sintetase ativada, requerendo
consequentemente uma grande produo de ATP. Deste modo, um grande consumo da
fonte de carbono para suportar esta nova demanda de energia necessrio, levando a um
ciclo que estimula a sntese de biossurfactantes (SANTOS et al., 2002).

O comportamento observado est de acordo com aquele encontrado por LIN &
CHEN (2007) em estudos realizados com Antrodia cinnamomea, no qual observaram que
altas relaes C/N prximas a 40 favoreceram tanto o aumento da biomassa quanto a
produo de exopolissacardeos pelo fungo. SANTOS et al. (2002) observaram que altas
relaes C/N, variando de 20 a 60, levaram a melhores resultados para a produo de
raminolipdeos por Pseudomonas aeruginosa PA1, utilizando-se glicerol como fonte de
carbono e nitrato de sdio como fonte de nitrognio. De um modo similar, WU et al. (2008)
observaram uma maior produo de raminolipdeos por P. aeruginosa utilizando as
mesmas fontes de carbono e nitrognio, numa relao C/N de 52. Neste caso, entretanto,
um aumento da relao C/N para 130 levou ao decrscimo da produo de raminolipdeos.

5.2.2 Produo de biossurfactantes em biorreator instrumentado condies

previstas pelo planejamento experimental fatorial fracionado

A fim de validar os dados obtidos no planejamento experimental fatorial, o

processo produtivo foi conduzido em biorreator instrumentado, no qual foram utilizadas as
concentraes significativamente mais favorveis produo de biossurfactantes, segundo
os experimentos conduzidos em frascos agitados. A composio do meio de cultivo
mineral utilizado para a produo de biossurfactantes, durante este experimento, est
descrita na Tabela 5.3, apresentando em sua constituio glicerol, nitrato de sdio, extrato
de levedura e tampo fosfato de potssio.

O experimento, realizado em duplicata, foi conduzido em biorreator com volume

til de 1,5 L operando sob aerao superficial, controlada pela agitao mecnica.

60

Tabela 5.3 Composio do meio mineral para a produo de biossurfactantes em

biorreator instrumentado segundo o planejamento experimental fatorial fracionado

Suplemento

Concentrao

Tampo Fosfato de Potssio

150 mmol/L

Glicerol

10g/L

Nitrato de Sdio

1g/L

Extrato de Levedura

0,2

A Figura 5.3 apresenta o perfil cintico da produo de biossurfactantes conduzida

em batelada simples. A saturao de oxignio foi mantida em 20% e o pH foi monitorado e
ajustado para 7,0 com soluo de NaOH (2 mol/L) ou HCl (2 mol/L).

10

0,8
300

0,7

1,6

250

0,6

1,2

5
4

1,0

0,5
Glicerol (g/L)

Biomassa (g/L)

0,4
0,3

Nitrato de Sdio (g/L)

7
1,4

200

150

100

0,2

0,8

Biossurfactante (mg/L)

1,8

2
1

0,6

0
0

10

20

0,1
0,0

50

30

Tempo (h)

Figura 5.3 Perfil cintico da sntese de biossurfactantes por Rhodococcus erythropolis em

um meio mineral de composio descrita na Tabela 5.3

61

De acordo com a Figura 5.3, observa-se que a produo de biossurfactantes foi

semi-associada ao crescimento microbiano, alcanando 271 mg/L. O crescimento
exponencial iniciou-se aproximadamente aps 7 horas de cultivo, com taxa especfica de
crescimento ( x) de 0,035 h-1, mantendo-se at, aproximadamente, 27 horas.
A anlise do perfil cintico apresentado permite observar que, durante o incio da
produo de biossurfactantes, a relao C/N foi de aproximadamente 30. Este resultado
valida aqueles obtidos em frascos agitados, os quais indicam que uma alta relao C/N
favorece a produo de biossurfactantes por Rhodococcus erythropolis, sob estas
condies de cultivo.

A Tabela 5.4 apresenta os resultados finais de crescimento da biomassa,

biossurfactantes, rendimento de produto em relao biomassa (YP/X), ao substrato (YP/S),
produtividade volumtrica (QP), taxa especfica de crescimento, ndice de emulsificao
(IE24) e tenso superficial.
Tabela 5.4 Parmetros analisados a partir do bioprocesso apresentado na Figura 5.3

Parmetros do bioprocesso
Biomassa final

1,61 g/L

Produo de biossurfactantes

271mg/L

YP/X

301mg/g

YP/S

40,2mg/g

QP

8,2 mg/L.h

0,032 h-1

IE24

40%

Tenso superficial

38mN/m

A anlise dos parmetros obtidos indica que o biossurfactante recuperado por

precipitao em etanol apresenta propriedades tensoativas, alcanando um ndice de
emulsificao de 40%. Do mesmo modo, o meio de cultivo livre de clulas apresentou
tenso superficial de 38 mN/m. Aps precipitar o polissacardeo em etanol e ressuspender

62

em gua destilada, a tenso superficial subiu para 43 mN/m, indicando que este tipo de
biossurfactante presente no meio de cultivo apresenta alguma contribuio para as
propriedades surfactantes encontradas no bioprocesso realizado.

5.2.3 Planejamento experimental composto central rotacional

O planejamento experimental composto central uma das mais importantes

metodologias utilizadas em estudos de otimizao de processos. O objetivo deste segundo
planejamento foi desenvolver um modelo emprico para o processo e obter valores mais
precisos para as condies timas, de acordo com os fatores analisados.

Para descrever a natureza da superfcie de resposta na regio tima, um

planejamento experimental composto central rotacional 23 com 3 fatores e 2 nveis foi
realizado, totalizando 14 experimentos mais 4 pontos centrais (Tabela 4.5). As
concentraes de cada varivel analisada durante esta etapa foram determinadas baseadas
na tendncia observada a partir do planejamento fatorial fracionado realizado
preliminarmente.

A Tabela 5.5 apresenta os resultados obtidos para cada ensaio realizado. Foram
avaliados o rendimento de produto por substrato (YP/S, expresso em mg/g), a concentrao
de biossurfactante (Biossurf., expresso em mg/L) e o ndice de emulsificao (IE24) para
um sistema binrio hexadecano-gua.

63

Tabela 5.5 - Variveis analisadas e resultados obtidos para YP/S, biossurfactantes e IE24 no
planejamento experimental composto central 23 com 3 fatores e 2 nveis

Ensaios

Glicerol

NaNO3

EL

YP/S

Biossurf.

IE24 (%)

-1

-1

-1

20,8

100,3

20

-1

-1

+1

39,9

199,4

44

-1

+1

-1

6,3

31,3

-1

+1

+1

11,3

56,3

19

+1

-1

-1

29,8

209,4

44

+1

-1

+1

24,1

179,5

31

+1

+1

-1

13,6

89,2

19

+1

+1

+1

10,3

102,4

25

-1,68

12,7

41,2

13

10

+1,68

15,4

156,7

31

11

-1,68

27,4

128,6

25

12

+1,68

13,2

98,1

31

13

-1,68

20,5

125,3

25

14

+1,68

18,0

132,8

25

PC

27,4 0,68 205,2 5,2 45 3,13

Pode-se destacar por meio da Tabela 5.5 os ensaios 2 e 5, bem como os pontos
centrais, onde se obtiveram valores mais altos para as trs variveis de resposta analisadas.
Para o ensaio 2 foram obtidos YP/S de 39,9 mg/g, 199,4 mg/L de biossurfactantes e um
ndice de emulsificao (IE24) de 44%. No ensaio 5, YP/S foi 29,8 mg/g, a produo de
biossurfactantes obtida foi de 209,4 mg/L e o ndice de emulsificao (IE24) foi de 44 %.
Em relao aos pontos centrais, obteve-se YP/S de 27,4 0,68 mg/g, 205,2 5,2 mg/L de
biossurfactantes e um IE24 de 45 3,13%. O baixo desvio padro obtido para os pontos
centrais, bem como o coeficiente de determinao (R2) relativamente alto contriburam
para viabilizar uma melhor anlise dos resultados obtidos por meio de ferramentas
estatsticas.

64

A avaliao da significncia estatstica das variveis de resposta estudadas foi

realizada empregando-se o software Statistica verso 6.0, conforme expresso nos grficos
de Pareto apresentados nas Figuras 5.4, 5.5 e 5.6. As referidas figuras apresentam o efeito
quantitativo estimado de cada uma das variveis sobre o rendimento de produto por
substrato YP/S, a concentrao de biossurfactantes e o ndice de emulsificao IE24,
respectivamente, segundo um nvel de significncia de 0,05. Neste caso, foram includos
todos os efeitos: lineares (L), quadrticos (Q) e as possveis interaes entre as duas
variveis.

A anlise das Figuras 5.4 e 5.5 permite destacar que as variveis de maior
influncia sobre YP/S e sobre a produo de biossurfactantes so o efeito linear (L) do
nitrato de sdio, seguido do efeito quadrtico (Q) do glicerol. Para o ndice de
emulsificao (IE24) observa-se que as variveis de maior influncia so os efeitos
quadrticos do glicerol e do extrato de levedura (Figura 5.6).

Em todos os casos analisados, entretanto, as variveis dependentes de maior

influncia apresentaram melhores efeitos quando utilizadas em concentraes segundo
seus nveis inferiores, sugerindo que aumentos em sua concentrao criariam condies
adversas para a obteno de valores satisfatrios para YP/S, para a produo de
biossurfactantes e para IE24.
Cabe destacar que os fatores correspondentes ao efeito quadrtico de todas as
variveis mostraram significncia estatstica (p < 0,05), do mesmo modo que a maioria dos
fatores lineares.

65

(2)Nitrato de sdio(L)

-38,4471
-21,9947

Glicerol(Q)

-17,1131

1Lby3L

-12,5259

Extr. levedura.(Q)

-10,493

Nitrato de sdio(Q)

6,804831

1Lby2L

-6,04863

2Lby3L
(3)Extr. levedura.(L)
(1)Glicerol(L)

4,281848
1,676043

p=,05
Effect Estimate (Absolute Value)

Figura 5.4 Diagrama de Pareto para o fator de rendimento de produto por substrato
(YP/S, expresso em mg/g). Erro puro: 0,46 R2= 0,89

(2)Nitrato de sdio(L)

-23,8775

Glicerol(Q)

-23,7323

Nitrato de sdio(Q)

-20,194

(1)Glicerol(L)

20,11689

Extr. levedura(Q)

-16,4603

1Lby3L

-9,5516

(3)Extr. levedura(L)
2Lby3L
1Lby2L

6,226837
-2,10717
1,000171

p=,05
Effect Estimate (Absolute Value)

Figura 5.5 Diagrama de Pareto para a produo de biossurfactantes (mg/L).

Erro puro: 27,15

R2= 0,86

66

Glicerol(Q)

-8,88842
-7,63076

Extr. levedura.(Q)
-6,3525

Nitrato de sdio(Q)
(1)Glicerol(L)

5,32828

(2)Nitrato de sdio(L)

-5,13951
-4,80833

1Lby3L
2,597741

(3)Extr. levedura.(L)
2Lby3L

,8485281

1Lby2L

,8485281

p=,05
Effect Estimate (Absolute Value)

Figura 5.6 Diagrama de Pareto para o ndice de emulsificao (IE24).

Erro puro: 9,76

R2= 0,78

Devido grande variabilidade inerente aos bioprocessos que envolvem

microrganismos, considera-se bom o coeficiente de determinao (R2), nos casos do fator
de rendimento de produto por substrato YP/S (R2= 89%) e da produo de biossurfactantes
(R2= 86%). No caso do ndice de emulsificao IE24, foi obtido um coeficiente de
determinao de 0,78. O erro puro obtido foi de 0,46 para Yp/s, 27,15 para a produo de
biossurfactantes e 9,76 para o IE24.
Na Figura 5.7A mostrada a superfcie de resposta do fator de rendimento de
produto por substrato YP/S em funo das concentraes de nitrato de sdio e glicerol, as
quais possuem maior efeito sobre o processo, mantendo-se constante na condio tima a
concentrao de extrato de levedura. A superfcie apresentou valores mximos para
concentraes mais baixas de nitrato de sdio, at 0,2 g/L, e concentraes mdias de
glicerol, variando aproximadamente entre 5,5 e 8,5 g/L.

De modo similar, o perfil da superfcie de resposta de YP/S em relao variao

das concentraes de glicerol e extrato de levedura, mantendo-se na condio tima a

67

concentrao de nitrato de sdio, est descrito na Figura 5.7B. Observam-se nesta figura,
novamente, valores mais altos para YP/S quando so utilizadas concentraes mdias de
glicerol, variando aproximadamente de 5,5 a 8,5 g/L, combinadas com concentraes de
extrato de levedura variando aproximadamente entre 0,25 e 0,45 g/L.

Figura 5.7 Superfcie de resposta de YP/S em funo das concentraes de nitrato de

sdio e glicerol (A) e glicerol e extrato de levedura (B).

68

Na Figura 5.8A est representada a superfcie de resposta da concentrao de

biossurfactantes em funo das concentraes de glicerol e nitrato de sdio, variveis tais
que apresentaram maior efeito sobre o processo produtivo (Figura 5.5). Observa-se, por
meio da figura 5.8, a presena de um mximo absoluto para a produo de biossurfactantes,
que consiste na regio onde a concentrao de glicerol encontra-se, aproximadamente,
entre 7 e 10 g/L e a concentrao de nitrato de sdio encontra-se entre 0,1 e 0,6 g/L.

Similarmente, na Figura 5.8B a superfcie de resposta da concentrao de

biossurfactantes em funo das concentraes de nitrato de sdio e extrato de levedura
indica a presena de um mximo absoluto para a varivel de resposta analisada, que
consiste na regio onde a concentrao de nitrato de sdio encontra-se, aproximadamente,
entre 0,2 e 0,5 g/L, enquanto o extrato de levedura encontra-se entre 0,25 e 0,35 g/L.

A superfcie de resposta para o ndice de emulsificao em funo das

concentraes de glicerol e extrato de levedura est representada na Figura 5.9. Estas
variveis foram aquelas que mostraram ter maior efeito sobre o IE24. Novamente, ficou
definida a presena de um mximo absoluto para a varivel de resposta, onde maiores
percentuais de IE24 so obtidos quando concentraes de glicerol aproximadamente entre 7
e 9,5 g/L e concentraes de extrato de levedura entre 0,25 e 0,35 g/L so utilizadas.

Figura 5.8A Superfcie de resposta da concentrao de biossurfactantes em funo das

concentraes de nitrato de sdio e glicerol.

69

Figura 5.8B Superfcie de resposta da concentrao de biossurfactantes em funo das

concentraes de nitrato de sdio e extrato de levedura.

Figura 5.9 Superfcie de resposta do ndice de emulsificao IE24 em funo das

concentraes de glicerol e extrato de levedura.

70

De um modo geral, as concentraes de glicerol e nitrato de sdio foram as

variveis que apresentaram maior efeito sobre as respostas analisadas, observando-se
melhores resultados quando ambas estavam presentes em concentraes mdias ou
inferiores. Em todos os casos, melhores valores para YP/S, produo de biossurfactantes e
IE24 foram obtidos combinando-se altas relaes C/N, variando aproximadamente de 27 a
63, considerando-se um percentual de nitrognio total presente no extrato de levedura de
10,5%.

No que diz respeito ao extrato de levedura, seu efeito quadrtico destaca-se como a
segunda varivel de maior efeito sobre o ndice de emulsificao, mostrando que a adio
deste suplemento favorece a manuteno das propriedades fsico-qumicas do produto
obtido.

Aps realizada a otimizao do meio de cultivo observa-se que, embora no tenha

sido verificada alterao significativa na concentrao de biossurfactantes produzidos por
Rhodococcus erythropolis, houve um expressivo aumento no fator de rendimento de
produto por biomassa (YP/X), o qual atingiu 323 mg/g no ensaio 5.

5.2.4 Produo de biossurfactantes em biorreator instrumentado condies

previstas pelo delineamento composto central rotacional

Uma vez definidas as superfcies de resposta que determinam as concentraes

ideais das variveis adicionadas ao meio para a produo de biossurfactantes, o
bioprocesso foi conduzido em biorreator de bancada a fim de confirmar os dados obtidos
atravs do delineamento composto central rotacional, realizado em frascos agitados.

Foram realizadas duas cinticas de crescimento e produo em biorreatores,

utilizando diferentes concentraes de glicerol, nitrato de sdio e extrato de levedura
presentes no mximo absoluto para a produo de biossurfactantes, apontado pelo
delineamento composto central rotacional.

71

A composio do meio de cultivo mineral utilizado para a produo de

biossurfactantes em cada um dos reatores est descrita na Tabela 5.3. Os experimentos
foram conduzidos em biorreator com volume til de 1,5 L operando sob aerao superficial,
controlada pela agitao mecnica (Figura 5.10). O reduzido volume til do biorreator foi
utilizado com o objetivo de minimizar os efeitos da formao de espuma sobre a aerao
do sistema.

Tabela 5.6 Composio do meio mineral para a produo de biossurfactantes em

biorreator instrumentado segundo o delineamento composto central rotacional
Suplemento

Concentrao
Biorreator 1

Biorreator 2

Tampo Fosfato de Potssio

150 mmol/L

150 mmol/L

Glicerol

9,5

8,5

Nitrato de Sdio

0,3

0,5

Extrato de Levedura

0,3

0,3

Figura 5.10 Produo de biossurfactantes por R. Erythropolis em batelada simples

72

A Figura 5.11 apresenta o perfil cintico da produo de biossurfactantes conduzida

em batelada simples segundo as concentraes dos biorreatores 1 e 2. A saturao de
oxignio foi mantida em 20% e o pH foi monitorado e ajustado para 7,0 com soluo de
NaOH (2 mol/L) ou HCl (2 mol/L).

10

0,40

300

1,5
0,35

1,4

250

1,1
1,0

0,25
0,20
0,15

0,9

200

150

100

0,10
0,8

Biossurfactante (mg/L)

Glicerol (g/L)

Biomassa (g/L)

1,2

Nitrato de sdio (g/L)

0,30

1,3

50
0,05

0,7
0,6

0
0

10

20

0,00

30

Tempo (h)

1,8

0,7

300

0,6

1,6

250

1,2
4

0,4

0,3

1,0
0,2

200

150

100

Biossurfactante (mg/L)

6
Glicerol (g/L)

Biomassa (g/L)

1,4

Nitrato de Sdio (g/L)

0,5

2
0,8

0,6
0

10

20

30

0
40

0,1

50

0,0

Tempo (h)

Figura 5.11 - Perfil cintico da sntese de biossurfactantes por Rhodococcus erythropolis

em um meio mineral conforme a composio descrita para o biorreator 1 (A) e para o
biorreator 2 (B)

73

Observa-se atravs da Figura 5.11, que o tempo total dos experimentos foi de 38
(Figura 5.11A) e 40 horas (Figura 5.11B). No caso do experimento realizado conforme a
composio descrita para o biorreator 1 (Figura 5.11A) a fase exponencial apresentou taxa
de crescimento especfico (x) de 0,018 h-1. A produo de biossurfactantes foi associada
ao crescimento bacteriano, atingindo um perfil constante aps aproximadamente 20 horas,
quando a fonte de nitrognio presente no meio atingiu valores consideravelmente baixos. A
biomassa final foi de 1,47 g/L e a produo de biossurfactantes alcanou 247 mg/L.

De modo semelhante ao observado no perfil cintico descrito na Figura 5.3, altas

relaes C/N favoreceram a produo de biossurfactantes sob as condies de cultivo
previstas para o biorreator 1 (Tabela 5.6). No incio do processo produtivo, observa-se uma
relao C/N de 60, a qual mantm valores altos at o final do experimento. Aps
aproximadamente 23 horas, entretanto, houve o esgotamento de nitrognio, o que impediu
a continuidade do processo produtivo. Neste momento, a relao C/N atingiu valores
consideravelmente altos (aproximadamente 145) e a concentrao de biossurfactantes se
manteve com valores constantes, permanecendo deste modo at o final do experimento.

No experimento realizado conforme a composio descrita para o biorreator 2

(Figura 5.11B), a fase lag teve durao de aproximadamente 12 horas, quando iniciou a
fase exponencial, com taxa de crescimento especfica (x) de 0,023 h-1. Nota-se que a
biomassa atingiu 1,63 g/L e que a produo de biossurfactantes foi semi-associada ao
crescimento bacteriano, alcanando 266 mg/L ao final do experimento.

Novamente, altas relaes C/N mostraram favorecer a produo de biossurfactantes.

No incio do processo produtivo, aproximadamente aps 6 horas, observou-se uma razo
C/N de 28, a qual se manteve entre 28 e 75 at que a concentrao de biossurfactantes
atingiu valores mximos. A partir de aproximadamente 30 horas, de modo anlogo ao
observado no perfil cintico da Figura 5.11A, a concentrao de nitrognio alcanou
valores muito prximos ao esgotamento, o que impediu a continuidade do bioprocesso.
Neste momento, deixou de ser verificado o aumento na concentrao de biossurfactantes,
que se manteve constante at o final do experimento.

74

A Tabela 5.7 sumariza alguns parmetros obtidos para os perfis cinticos

apresentados na Figura 5.11.

Tabela 5.7 Parmetros obtidos para os bioprocessos presentes na Figura 5.11

Parmetros do bioprocesso

Biorreator 1

Biorreator 2

Biomassa final

1,47 g/L

1,63 g/L

Produo de biossurfactantes

247 mg/L

266 mg/L

YP/X

396,8 mg/g

336,7 mg/g

YP/S

50,5 mg/g

58,6 mg/g

QP

7,72 mg/L.h

7,6 mg/L.h

0,02 h-1

0,02 h-1

IE24

47 %

53 %

Tenso superficial

42 mN/m

39 mN/m

A anlise dos parmetros obtidos indica a presena de propriedades tensoativas no

meio de cultivo, alcanando um ndice de emulsificao mdio de 50 4,2 % (Figura
5.12). Do mesmo modo, a tenso superficial obtida para o meio de cultivo foi de 40,5
2,12 mN/m. Aps precipitar o meio de cultivo em etanol para separar os polissacardeos,
seguido de ressuspenso em gua destilada, a tenso superficial foi de 45 mN/m no caso do
biorreator 1 e 43 mN/m no caso do biorreator 2, confirmando a contribuio dos
polissacardeos para as propriedades surfactantes encontradas nos bioprocessos realizados.

Figura 5.12 IE24 obtido atravs do biossurfactante purificado do meio de cultivo do

biorreator 1 (A) e do biorreator 2 (B)

75

A observao de valores semelhantes para diversos parmetros analisados, alm de

ressaltar a reprodutibilidade da linhagem de estudo, confirma os dados obtidos atravs dos
experimentos realizados em frascos agitados, nos quais as composies de meios de
cultivo utilizadas em ambos os perfis cinticos analisados encontravam-se na faixa de
maior produo de biossurfactantes por R. erythropolis, sob estas condies de cultivo.

A Tabela 5.8 apresenta uma comparao entre os fatores de rendimento de produto

por biomassa (YP/X) encontrados antes e aps a otimizao do meio de cultivo para a
produo de biossurfactantes por R. erythropolis. Embora no tenha havido diferena
significativa no que diz respeito concentrao de biossurfactantes antes e aps a
otimizao do meio de cultivo, esta tabela ressalta a relevante contribuio, sob o ponto de
vista metablico, fornecida pelo processo de otimizao. Observa-se um aumento
gradativo em YP/X ao longo de cada etapa, chegando a apresentar, ao final do processo de
otimizao, valores 8,5 vezes maiores que aqueles encontrados no meio no otimizado.

Tabela 5.8 Fator de rendimento de produto por biomassa (YP/X) antes e aps a otimizao
das condies nutricionais para a produo de biossurfactantes por R. erythropolis

Condies do processo de fermentao

YP/X (mg/g)

Meio de cultivo no otimizado

46

Concentrao de Tampo Fosfato otimizada

112

1 etapa da otimizao de suplementos (planejamento

207

fatorial fracionado)
Conduo do processo referente 1 etapa em biorreator

301

(batelada simples)
2 etapa da otimizao de suplementos (planejamento

323

composto central rotacional)

Conduo do processo referente 2 etapa em biorreator
(batelada simples)

397

76

5.3 Ensaios de remoo de leo de sedimentos arenosos

Muitos trabalhos tm discutido a utilizao de biossurfactantes na remoo de leo
de solos impactados. A eficincia de remoo tem mostrado variar consideravelmente com
o tempo de contato e a concentrao de biossurfactante utilizada, indicando que a remoo
de leo ocorre quando solues de biossurfactantes so utilizadas tanto em concentraes
acima quanto abaixo da CMC (URUM et al., 2003).

Com o intuito de avaliar a eficincia do biossurfactante produzido segundo as

concentraes de nutrientes descritas no planejamento composto central, diferentes
concentraes de biossurfactantes foram utilizadas no processo de remoo de leo de
sedimentos arenosos. O meio contendo biossurfactantes foi centrifugado, precipitado
overnight em etanol e quantificado pelo mtodo do fenol-sulfrico (DUBOIS et al., 1956).
As concentraes utilizadas foram baseadas na CMC do biossurfactante, determinada
atravs de experimentos realizados durante tese de doutorado em desenvolvimento no
Laboratrio de Desenvolvimento de Bioprocessos, nos quais obteve-se uma CMC de
0,45g/L.

A eficincia de remoo de leo pelo biossurfactante foi avaliada atravs de

solues com concentraes equivalentes CMC, duas vezes abaixo da CMC, duas vezes
acima da CMC e quatro vezes acima da CMC (0,45 g/L, 0,23 g/L, 0,9 g/L e 1,8 g/L,
respectivamente). A atividade emulsificante do produto utilizado nos ensaios de remoo
de leo est representada na Figura 5.13, onde 0,23 g/L, 0,45 g/L e 0,9 g/L do
biossurfactante purificado em etanol permitiram alcanar um ndice de emulsificao IE24
de 27, 40 e 65 %, respectivamente.

77

Figura 5.13 IE24 obtido a partir de solues de biossurfactantes com concentraes duas
vezes abaixo da CMC (A), na CMC (B) e duas vezes acima da CMC (C)

Com o objetivo de mostrar a atuao dos biossurfactantes produzidos em solos com

diferentes tempos de impactao, solues com variadas concentraes de biossurfactantes
foram utilizadas para a remoo de leo de sedimentos arenosos imediatamente aps a
impactao ou aps um perodo de impactao de 1 ou 2 meses.

A Figura 5.14 apresenta o percentual de remoo de leo obtido sob as diferentes

condies descritas. Nota-se que imediatamente aps a contaminao do sedimento, a
eficincia de remoo de leo pelo biossurfactante alcanou nveis prximos a 100% em
todas as concentraes utilizadas. Neste momento, a capacidade de remoo de leo por
solues aquosas na ausncia de biossurfactantes tambm alcanou um percentual alto,
permitindo a remoo de 78% do leo presente na areia.

Aps um perodo de 1 ms de contaminao, entretanto, observa-se que a atuao

apenas da gua sobre o processo de remoo reduz consideravelmente, permitindo que
apenas 7 % do leo fossem removidos do sedimento arenoso. Em contraste, concentraes
crescentes de biossurfactantes presentes em soluo aquosa permitiram percentuais mais
altos de remoo de leo da areia, chegando a 97,6 e 99% quando utilizadas as
concentraes de 0,9 e 1,8 g/L de biossurfactantes, respectivamente. A Figura 5.15
apresenta os frascos aps a agitao para a remoo de leo. Percebe-se claramente o

78

processo de remoo de leo promovido pelos biossurfactantes atravs da turbidez da

soluo de lavagem, em contraste com a transparncia do frasco no qual apenas gua foi

Remoo de leo (%)

utilizada para a remoo de leo.

100
80
Imediato
60

1 ms
2 meses

40
20
0
0

0,23

0,45

0,9

1,8

Concentrao de Biossurfactante (g/L)

Figura 5.14 Percentual de remoo de leo de sedimentos arenosos por diferentes
concentraes de biossurfactantes, imediatamente aps a contaminao e aps um perodo
de impactao de 1 ou 2 meses

Figura 5.15 - Frascos contendo o sistema areia : soluo de biossurfactantes imediatamente

aps a lavagem com gua (A) e biossurfactantes nas concentraes 0,23 g/L (B), 0,45 g/L
(C), 0,9 g/L (D) e 1,8 g/L (E), num perodo de contaminao de 1 ms

79

Aps 2 meses de contaminao, observa-se que a eficincia de remoo de leo do

sedimento arenoso reduz grandemente, mesmo nos frascos cuja concentrao de
biossurfactantes utilizada foi maior, atingindo no mximo 18% de remoo de leo. Este
resultado sugere que o tempo um fator limitante para a atuao dos surfactantes
produzidos, possivelmente devido a uma maior adsoro do leo ao solo arenoso. Torna-se
necessrio, deste modo, a utilizao de concentraes maiores de biossurfactante ou
mesmo a padronizao de condies de lavagem diferenciadas para solos cujo tempo de
contaminao maior, tais como maior agitao, temperatura ou tempo de contato do
sedimento com o biossurfactante.

Os resultados obtidos atravs deste trabalho confirmam aqueles encontrados por

MELO (2005) em estudos de remoo de hidrocarbonetos de borras oleosas atravs dos
biossurfactantes produzidos por Rhodococcus erythropolis ATCC 4277. Foi verificado que
4 g/L de biossurfactantes, quantificados diretamente pelo mtodo de DUBOIS et al (1956)
sem a precipitao do meio em etanol, foram capazes de remover 96% de hidrocarbonetos
da borra oleosa.

Os resultados apresentados tambm esto de acordo com o observado por URUM et

al. (2004). Os autores estudaram o efeito de raminolipdeos na remoo de leo de solos
imediatamente aps sua contaminao em laboratrio, bem como em solos 14 dias aps a
contaminao e submetidos a aquecimento a 50C, a fim de mimetizar o efeito de
aquecimento natural do ambiente.

Foi observado que medida que o tempo de impactao persiste, a natureza

qumica e fsica do solo modificada, quando comparada com amostras de solo
imediatamente aps a impactao. Este fato deve-se perda de componentes volteis e
hidrocarbonetos de mais baixa massa molecular, o que foi confirmado por URUM et al.
(2006). Os autores observaram que hidrocarbonetos com nmero de carbono inferior a C15
so perdidos. Como resultado, observa-se um leo de maior densidade e viscosidade, o que
leva a sua maior adsoro ao solo, dificultando a interao da soluo de biossurfactante
com o leo.

80

5.4 Consideraes finais

Este captulo apresentou resultados experimentais atravs dos quais foram
selecionados diferentes suplementos nutricionais responsveis por incrementar a produo
de biossurfactantes por Rhodococcus erythropolis ATCC 4277.

Inicialmente, tendo em vista a necessidade de manuteno do pH prximo

neutralidade, fundamental para o crescimento bacteriano e a produo de biossurfactantes,
a influncia de diferentes concentraes de tampo fosfato sobre o processo produtivo foi
analisada. Posteriormente, com o objetivo de desenvolver um meio otimizado para a
produo de biossurfactantes pela bactria, ferramentas estatsticas de planejamento
experimental foram utilizadas, a fim de avaliar a influncia de diferentes concentraes de
glicerol, nitrato de sdio, sais minerais e elementos traos sobre a produo de
biossurfactantes.

Resultados experimentais obtidos em frascos agitados e confirmados atravs da

conduo do bioprocesso em biorreatores de bancada apontaram formulaes de meio de
cultivo bastante simples e, consequentemente, de custo reduzido. Ensaios de remoo de
leo de sedimentos arenosos demonstraram a habilidade do biossurfactante produzido em
remover leo de solos contaminados mesmo aps 1 ms de impactao. Aps este perodo,
a eficincia de remoo de leo torna-se bastante reduzida, sugerindo que a maior adsoro
do leo ao solo arenoso um fator limitante para a atuao dos surfactantes produzidos.

81

6. CONCLUSES
 Nos ensaios de produo de biossurfactantes por Rhodococcus erythropolis ATCC
4277 em frascos agitados, observou-se que concentraes crescentes de tampo
fosfato de potssio favorecem o aumento da produo de biossurfactantes at a
concentrao de 150 mmol/L. Concentraes superiores a esta, entretanto,
passaram a exercer um efeito inibitrio sobre o processo produtivo.
 Utilizando-se 150 mmol/L de tampo fosfato de potssio foram obtidos 285,0 7,1
mg/L de biossurfactantes, bem como uma reduo da tenso superficial do meio
para 34 mN/m. Aps a precipitar o meio de cultivo em etanol e ressuspender em
gua destilada, obteve-se uma tenso superficial de 40 mN/m, demonstrando que
biossurfactantes do tipo polissacardeo contribuem para as propriedades
surfactantes observadas no meio de cultivo.
 A seleo de variveis realizada em frascos agitados atravs de um planejamento
experimental fatorial fracionado indicou que concentraes de glicerol, nitrato de
sdio, sulfato de magnsio e extrato de levedura apresentam efeito significativo
sobre o bioprocesso analisado. A presena de nitrato de sdio, glicerol e sulfato de

82

magnsio, segundo concentraes apresentadas para o nvel inferior, bem como a

presena de extrato de levedura segundo concentraes apresentadas para o nvel
superior mostraram favorecer os fatores de rendimento em produto (YP/S) e
biomassa (YP/X). Obtiveram-se valores at 19mg/g para YP/S e 207,5 mg/g para YP/X
atravs dos ensaios realizados.
 A conduo do bioprocesso em biorreatores de bancada segundo as concentraes
preditas pelo planejamento experimental fatorial apresentou uma cintica de
produo associada ao crescimento bacteriano. Os resultados obtidos confirmaram
aqueles encontrados em frascos agitados, os quais indicaram o favorecimento da
produo de biossurfactantes na presena de altas relaes C/N. As propriedades
surfactantes do produto obtido foram mantidas, encontrando-se um ndice de
emulsificao de 40% e a reduo da tenso superficial para 38 mN/m.
 O delineamento composto central rotacional indicou superfcies de resposta com
mximos absolutos para a produo de biossurfactantes, YP/S e IE24 em funo das
concentraes de glicerol, nitrato de sdio e extrato de levedura. Valores mximos
incluem YP/S de aproximadamente 20 mg/g, concentrao de biossurfactantes de
200 mg/L e IE24 de 40 %.
 As concentraes de glicerol e nitrato de sdio foram as variveis que, de um modo
geral, apresentaram maior efeito sobre os parmetros analisados, sendo encontrados
melhores resultados quando ambas estavam presentes em concentraes mdias ou
inferiores. O efeito quadrtico do extrato de levedura mostrou ter maior relevncia
sobre o ndice de emulsificao, demonstrando que a adio deste suplemento
favoreceu as propriedades fsico-qumicas do produto obtido.
 A conduo do processo produtivo em biorreatores de bancada segundo as
concentraes preditas como ideais pelo planejamento composto central rotacional
confirmou os dados obtidos em frascos agitados. O produto obtido apresentou
atividade emulsificante, com um IE24 de 50 4,2 %, alm da reduo da tenso
superficial do meio para 40,5 2,1 mN/m.

83

 Embora no tenha sido verificada alterao significativa na concentrao de

biossurfactantes produzidos por Rhodococcus erythropolis aps a otimizao das
condies nutricionais, houve um expressivo aumento no fator de rendimento de
produto por biomassa (YP/X), o qual atingiu valores 8,5 vezes maiores que no meio
no otimizado.
 Ensaios de lavagem de sedimentos arenosos demonstraram a habilidade do
biossurfactante produzido em remover leo de solos contaminados. Em casos de
remoo imediatamente aps a impactao do sedimento, concentraes duas vezes
abaixo da CMC j foram capazes de remover 97% do leo.
 Nos ensaios de lavagem do sedimento arenoso aps 1 ms de contaminao
observou-se que concentraes crescentes de biossurfactantes presentes em soluo
aquosa permitiram percentuais mais altos de remoo de leo da areia, chegando a
97,6 e 99% quando utilizadas as concentraes duas e quatro vezes a CMC,
respectivamente. Aps 2 meses de contaminao, entretanto, a eficincia de
remoo foi significativamente menor, sugerindo que a perda de componentes
volteis e hidrocarbonetos de mais baixa massa molecular tenham levado ao
aumento da densidade e da viscosidade, com uma maior adsoro do leo ao solo.

84

7. PERSPECTIVAS
A fim de dar continuidade linha de pesquisa na qual se insere este estudo, so
sugeridas algumas perspectivas, com o intuito de aumentar a eficincia do processo
produtivo, bem como de suas aplicabilidades na indstria qumica e em processos de
remediao:
 Otimizao do inculo utilizado para a produo de biossurfactantes em
biorreatores, a fim de aumentar a eficincia do processo produtivo;
 Estudo e seleo do modo de conduo do processo em biorreatores de bancada,
incluindo bateladas alimentadas de nitrognio e carbono, buscando manter taxas
C/N favorveis produo de biossurfactantes. A determinao do coeficiente
volumtrico de transferncia de oxignio (KLa) tambm faz-se necessria, com o
objetivo de estabelecer diferentes condies de aerao a serem utilizadas no
processo produtivo;

85

 sabido que bactrias do gnero Rhodococcus produzem grande variedade de

compostos. Deste modo, possvel que valores obtidos para o processo produtivo
descrito

nesta

dissertao

estejam

subestimados,

tornando

necessria

caracterizao da estrutura do polissacardeo obtido, a fim de definir processos de

purificao mais eficientes;
 Padronizar condies de lavagem mais eficientes para a remoo de leo de
sedimentos com maior tempo de impactao e maior adsoro do contaminante ao
solo. Esta padronizao inclui a utilizao de maiores concentraes de
biossurfactante, alm de condies diferenciadas de agitao, temperatura e tempo
de contato do sedimento com o biossurfactante;
 Avaliar o comportamento do biossurfactante como agente acelerador da
biodegradao de borras oleosas e solos impactados por derivados do petrleo;
 Avaliar o resduo da produo de biodiesel como substrato para o bioprocesso.

86

8. REFERNCIAS
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