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RBCCV 44205-749
Resumo
Objetivo: Estudo experimental com o objetivo de
desenvolver e avaliar a viabilidade das tcnicas de transplante
experimental cardaco heterotpico abdominal vascularizado
e cutneo em camundongos, criando um instrumento para
investigao da eficcia de solues de preservao, novas
drogas imunossupressoras, agentes biolgicos, terapia gnica
e induo de tolerncia imunolgica.
Mtodo: Para este estudo, as tcnicas utilizadas foram
descritas previamente por Corry et al. e Billingham et al.
Resultados: O tempo cirrgico total para a realizao dos
transplantes cardacos (n=20) foi, em mdia, 60,36,3 minutos
e para os transplantes cutneos (n=20), 17,750,71 minutos.
A mdia de sobrevida dos aloenxertos cutneos (n=34) e
cardacos (n=24) foi, respectivamente, 7 e 11 dias, enquanto
que os isoenxertos sobreviveram por mais de 100 dias.
Concluses: Ambas as tcnicas se caracterizaram pela fcil
Trabalho realizado na Universidade Federal do Rio Grande do Sul Faculdade de Medicina, Hospital de Clnicas de Porto Alegre. Porto
Alegre, RS.
Endereo para correspondncia: David Saitovitch. Hospital So Lucas.
Av. Ipiranga, 6690, conj.204. Porto Alegre, RS, Brasil. CEP: 90610000 Tel: (51) 3336-6046
E-mail: dsaitov@terra.com.br
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Abstract
Objective: This is an experimental study which aims at
developing and evaluating the feasibility of experimental
techniques of vascularized and cutaneous abdominal
heterotopic heart transplant in mice, creating an instrument
of investigation for the effectiveness of prservation solutions,
INTRODUO
Atualmente, o transplante de rgos a forma teraputica
mais eficaz para pacientes com disfuno orgnica terminal. O
ndice de sucesso do transplante renal tal que a sobrevida
dos pacientes e de seus enxertos superior a 90 e 80%,
respectivamente, no final do primeiro ano, na maioria dos centros
transplantadores de referncia do mundo [1]. Estas cifras
representam um grande avano quando comparadas quelas
obtidas desde o incio da era moderna dos transplantes de
rgos, nos anos 50 at o incio dos anos 80 [2].
Contudo, esta opo teraputica continua sendo um
desafio clnico-cirrgico, uma vez que muitas questes
relevantes ainda permanecem pendentes nesta rea. A
manuteno do aloenxerto requer o uso permanente de
drogas imunossupressoras, que aumentam a incidncia de
tumores e infeces oportunistas, mas no impedem
completamente o processo de rejeio que continua sendo
a principal causa de perda tardia do enxerto. Uma alternativa
mais atraente seria a forma de imunossupresso especfica
que tornasse o receptor tolerante aos antgenos do doador,
sem necessidade de imunossupresso contnua.
H mais de um sculo, experimentos em animais deram
incio aos transplantes de rgos [3]. Aplicando tcnicas
originais, Carrel [4], em 1908, obteve brilhantes resultados
no transplante de vasos sangneos, rgos e membros,
quando desenvolveu a tcnica da anastomose vascular,
possibilitando o transplante de rgos slidos
vascularizados como os rins e corao.
Embora as tcnicas de transplante de diferentes rgos
e tecidos estejam muito bem estabelecidas, o grande desafio
continua sendo a barreira imunolgica, motivando os
cientistas a procurarem novos desafios no campo dos
xenotransplantes, dos transgnicos, da farmacologia e do
desenvolvimento de mtodos de induo de tolerncia
imunolgica.
Buscando entender e contornar os processos da rejeio,
investigaes feitas a partir dos anos 50 demonstraram a
importncia dos camundongos isognicos no estudo da
imunologia bsica, da imunopatologia de transplantes e
Preparao do doador
Com o animal em decbito dorsal, j anestesiado, a
abordagem abdominal foi idntica do receptor. Na VCI, foi
infundida uma soluo de heparina sdica (Liquemine,
Roche Brasil), 10UI/10g de peso corporal, diluda em soluo
salina. Aps a retirada da agulha (24G), a exanginao
ocorreu pelo orifcio deixado pela mesma.
Para expor amplamente a cavidade torcica, com uma
tesoura fez-se abertura e resseco da parede anterior
mediante seco paraesternal bilateral, seguida de luxao
manual das articulaes costovertebrais e inciso
diafragmtica bilateral.
Individualmente, VCI distal, veia cava superior proximal
(VCS) e veia zigos foram ligadas com fio de sutura 7-0 e
seccionadas com microtesoura reta. A aorta foi seccionada
anteriormente artria braquioceflica, j a artria pulmonar
foi seccionada anteriormente bifurcao.
Para completar a liberao do corao, atou-se, em bloco,
com fio 7-0 (Prolene, Ethicon), as veias pulmonares, tendose o cuidado para que ficassem livres aorta e AP, deixando
um fio de reparo para auxiliar neste manejo. O corao foi
gentilmente destacado do trax do doador e colocado em
um Becker (50ml) com soluo salina a 0,9% a 4C. Para
manter a temperatura, enquanto o receptor estava sendo
remanejado, o Becker foi mantido em gelo seco.
Implantao do enxerto cardaco
O corao do doador foi retirado da soluo salina e
acomodado no abdome do receptor, de maneira que a
ligadura em blocos fosse mantida, durante a operao,
cranialmente ao receptor. Durante a implantao do enxerto
cardaco, o mesmo foi permanentemente gotejado com
soluo salina (4C) para sua proteo.
Iniciou-se pela anastomose trmino-lateral da aorta do
doador com a do receptor (Figura 1). Um ponto foi feito na
extremidade proximal da aortotomia e outro na extremidade
distal, a partir do qual foi iniciada a sutura simples contnua
de um lado da elipse formada, terminando na extremidade
proximal. Repetiu-se o mesmo procedimento no outro lado
da elipse. A mesma tcnica foi empregada anastomose da
Fig. 1 Transplante cardaco: implantao do enxerto cardaco anastomose trmino-lateral da aorta do doador com a do receptor
e anastomose trmino-lateral da artria pulmonar do doador com
a veia cava inferior do receptor (16 X)
Preparao do doador
No doador, foi realizada a eutansia realizando-se o
deslocamento cervical preconizado pela Lei 714, de 20 de
junho de 2002, que dispe sobre procedimentos e mtodos
de eutansia em animais e outras providncias, do Conselho
Federal de Medicina Veterinria, e pelo Colgio Brasileiro
de Experimentao Animal (COBEA) [10,11].
A pele da base da cauda do animal foi seccionada
transversalmente, com lmina de bisturi n24 (Solidor) e,
aps, longitudinalmente. Com o auxlio de uma pina de
disseco, esta foi tracionada distalmente (base-ponta),
retirada do animal e submersa em soluo salina 0,9% a 4C.
Implantao do enxerto cutneo
Na regio tricotomizada do receptor, com uma pina n3
e uma tesoura fina reta para ris, foi retirado 1 cm2 de tecido
cutneo. Com a lmina de bisturi, foi seccionado 1 cm2 da
pele total da cauda do doador. Com uma pina, o fragmento
de pele caudal foi distribudo no seu leito receptor e mantido
com sutura simples transfixante nas quatro extremidades do
quadrado cutneo enxertado (Figura 2). Os receptores
ficaram em gaiolas individuais, mantendo o manejo rotineiro
adotado pelo biotrio da CPEA.
Diariamente, os animais foram observados, at 100 dias do
transplante, e a rejeio foi confirmada diante da observao
da combinao de algumas caractersticas: cianose, eritema,
eroso e, finalmente, perda total do enxerto cutneo.
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Anlise estatstica
Para anlise da curva de sobrevida, utilizou-se o mtodo
de Kaplan-Meier.
Transplante cutneo
Para a preparao do receptor do enxerto cutneo, a
mdia de tempo dispensado, observada em uma amostra
aleatria (n=20), foi de 7,00,9 minutos; entre a eutansia e
a retirada da pele da cauda do doador o tempo utilizado foi
de 5,000,8 minutos e a implantao do enxerto cutneo,
5,750,71 minutos, perfazendo uma mdia de tempo total de
operao de 17,750,71 minutos.
Nos 30 isotransplantes cutneos realizados no houve
rejeio. Entretanto, dos 34 alotransplantes, nove (27%)
enxertos foram rejeitados no 6dia, doze(35%), no 7 dia e
treze (38%) enxertos cutneos rejeitados no 8dia (Figura 4).
RESULTADOS
Transplante cardaco heterotpico abdominal
vascularizado
Analisando uma amostra de animais (n=20) escolhidos
aleatoriamente, observamos que o tempo operatrio total
para a realizao dos transplantes foi, em mdia, 60,36,3
minutos, sendo dispensado para preparao do receptor
22,93,1 minutos, para liberao do corao do doador,
11,11,5 minutos e para confeco das anastomoses,
26,33,6 minutos.
Do total de 22 isotransplantes cardacos realizados, por
meio de palpao direta, observou-se que, 4 horas aps o
transplante, um (4%) dos animais no apresentava o
batimento do enxerto, morrendo 5 horas aps a constatao.
Em outro, houve paraplegia, observada aps o trmino do
efeito anestsico. Embora o batimento do enxerto fosse
percebido, em virtude desta paralisia e o sofrimento
apresentado, a eutansia, nestes casos, foi indicada e
realizada 48 horas aps o transplante. Os demais
camundongos (20 animais) e seus respectivos enxertos
(91%) sobreviveram por mais de 100 dias aps a operao.
Entretanto, dos 24 alotransplantes cardacos realizados,
constatou-se ausncia de batimento do enxerto cardaco
em oito animais no 10 dia aps o transplante; em doze
animais, no 11 dia e em quatro animais, no 12 dia (Figura 3).
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COMENTRIOS
O camundongo o animal experimental de escolha em vrias
reas, por ser de fcil criao e manipulao, ter uma reproduo
rpida, comportamento dcil, resistncia a infeces e traumas
cirrgicos, larga diversidade gentica, grande similaridade
biolgica e disposio anatmica das estruturas internas,
quando comparadas espcie humana. Alm disso, estima-se
que a homologia do DNA codificador, entre estas duas espcies,
esteja compreendida entre 70 e 90% [5].
As linhagens isognicas, pelo cruzamento entre irmos
durante, pelo menos, 20 geraes, originando populaes
de camundongos geneticamente idnticos, constituem uma
das maiores vantagens no uso deste modelo para o estudo
dos mecanismos imunolgicos [5].
Assim sendo, os animais de laboratrio, em especial os
camundongos, so utilizados de forma exponencial no
desenvolvimento de modelos experimentais de transplante,
principalmente cardaco, renal e de ilhotas pancreticas.
Os pesquisadores Robert Corry Henry Winn e Paul
Russell [7], em 1973, reconhecendo a importncia do uso de
linhagens isognicas para a compreenso de eventos
imunolgicos, desenvolveram um modelo experimental
sendo demonstrado que aloenxertos cardacos novascularizados so rejeitados mais lentamente (e, s vezes,
at mesmo no so rejeitados) do que enxertos cutneos
entre a mesma combinao de linhagens [15]. Sendo assim,
a diferena no modo de vascularizao no parece ser a
nica diferena na sobrevida dos enxertos cutneo (7 dia)
e cardaco (11 dia).
As diferenas entre as tcnicas no se limitam s
complexidades metodolgicas ou vascularizao, mas
principalmente aos mecanismos efetores, suscetibilidade
rejeio ou resistncia induo de tolerncia
imunolgica [21-23].
A existncia de uma hierarquia na suscetibilidade
rejeio de deferentes aloenxertos (pele, ilhotas pancreticas
e corao) est bem definida, contudo, os mecanismos
responsveis so desconhecidos. Embora o enxerto cardaco
estimule a ativao de um nmero muito maior de clulas T
alorreativas do que o enxerto cutneo, a pele apresenta maior
suscetibilidade rejeio e maior resistncia induo de
tolerncia [15]. Por outro lado, Sun et al. [24] demonstraram
que quanto maior a massa aloenxertada, maior pode ser a
sua sobrevida. Um nico corao ou rim transplantado, entre
diferentes linhagens de ratos, sofre rejeio aguda em curto
espao de tempo; entretanto, o transplante simultneo de
dois coraes ou dois rins em um nico receptor resulta em
uma maior sobrevida destes aloenxertos.
Estudos sugerem que o microambiente e a carga
antignica do enxerto podem ter um importante papel na
determinao da suscetibilidade rejeio de um aloenxerto
e resistncia a induo de tolerncia imunolgica [25]. Alm
disso, outra explicao para a maior suscetibilidade da pele
rejeio (e menor induo de tolerncia) a presena de
antgenos tecido-especficos, para os quais a tolerncia
central (tmica) no foi desenvolvida pelo receptor [25].
exatamente esta maior dificuldade na induo de
tolerncia imunolgica do enxerto cutneo, aliada facilidade
de sua realizao, que o torna um modelo experimental
interessante e com maior relevncia clnica, quando
comparado a modelos vascularizados.
Infelizmente, ainda no existem meios seguros e
reproduzveis de se induzir tolerncia imunolgica, no
contexto dos transplantes, em seres humanos. Embora
apresentem limitaes, os modelos experimentais murinos,
desenvolvidos neste estudo, constituem ferramentas
importantes para o avano do conhecimento dos
mecanismos
imunolgicos
envolvidos
no
aloreconhecimento e produo de tolerncia.
AGRADECIMENTOS
Ao financiamento da Fundao de Amparo Pesquisa
do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS), colaborao
180
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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