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LUS FERNANDO MERCIER FRANCO

ESTUDO DO EQUILBRIO SLIDO-LQUIDO DE SISTEMAS


CONTENDO AMINOCIDOS E PROTENAS

So Paulo
2012

LUS FERNANDO MERCIER FRANCO

ESTUDO DO EQUILBRIO SLIDO-LQUIDO DE SISTEMAS


CONTENDO AMINOCIDOS E PROTENAS

Dissertao apresentada Escola


Politcnica da Universidade de So
Paulo para obteno do ttulo de
Mestre em Engenharia

So Paulo
2012

LUS FERNANDO MERCIER FRANCO

ESTUDO DO EQUILBRIO SLIDO-LQUIDO DE SISTEMAS


CONTENDO AMINOCIDOS E PROTENAS

Dissertao apresentada Escola


Politcnica da Universidade de So
Paulo para obteno do ttulo de
Mestre em Engenharia

rea de Concentrao:
Engenharia Qumica

Orientador: Professor Livre-Docente


Pedro de Alcntara Pessa Filho

So Paulo
2012

Aos meus avs Zenaide e Antnio Srgio,


Marylande e Paulo Fernando (in memoriam);
a minha me, Priscila; ao papai,
Gilberto (in memoriam); e ao mano
Henrique dedico este trabalho.

AGRADECIMENTOS

, alm de mandatrio que eu o faa, mandatrio pela minha conscincia mais do


que pelo mero preenchimento de algumas linhas, um imenso prazer agradecer a
quem de algum modo contribuiu comigo durante a execuo deste trabalho.
O primeiro a quem devo e desejo agradecer o meu orientador Professor LivreDocente Pedro de Alcntara Pessa Filho. ele a quem devo tudo o que sei sobre
Termodinmica, desde os bancos acadmicos do terceiro ano de engenharia quando
aprendi os primeiros conceitos de equilbrio de fases; poca em que ainda eu no
sabia que isso seria objeto de investigao do meu mestrado. com imensa
gratido que agora me dirijo a ele dizendo-lhe que sem sua pacincia e
generosssima disponibilidade nada do que este texto contm lograria tal xito que
agora surde a necessidade, mais do que o dever, de apresentar.
Tambm agradeo aos amigos e colegas do Grupo de Engenharia de Bioprocessos
(GEnBio), antigo Laboratrio de Engenharia Bioqumica (LEB), do Departamento de
Engenharia Qumica da Escola Politcnica da Universidade de So Paulo cujas
discusses incessantes, sobre os mais diversos contedos, esto dispersas ainda
que de modo imperceptvel nas entrelinhas deste trabalho. Em particular, agradeo a
Kelly Cristina Nascimento Alves Cruvinel quem, alm de me haver fornecido alguns
dados experimentais que enriquecem a discusso dos modelos propostos neste
trabalho, sempre me apoiou desde os tempos em que eu era aluno de iniciao
cientfica.
Por fim, agradeo ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e
Tecnolgico (CNPq) e ao Departamento de Engenharia Qumica da Escola
Politcnica da Universidade de So Paulo, pois me concedendo uma bolsa para
cursar meu mestrado permitiram que eu o fizesse dignamente.

Deve-se escrever da mesma maneira como as lavadeiras l


de Alagoas fazem o seu ofcio. Elas comeam com uma
primeira lavada, molham a roupa na beira da lagoa ou do
riacho, torcem o pano, molham-no novamente, voltam a torcer.
Colocam o anil, ensaboam e torcem uma, duas vezes. Depois
enxguam, do mais uma molhada, agora jogando a gua com
a mo. Batem o pano na laje ou na pedra limpa, e do mais
uma torcida e mais outra, torcem at no pingar do pano uma
s gota. Somente depois de feito tudo isso que elas
dependuram a roupa lavada na corda do varal, para secar. Pois
quem se mete a escrever devia fazer a mesma coisa. A palavra
no foi feita para enfeitar, brilhar como ouro falso; a palavra foi
feita para dizer.
(Graciliano Ramos)

RESUMO

A modelagem termodinmica do equilbrio slido-lquido de sistemas que contm


aminocidos e protenas tem sido cada vez mais necessria para o desenvolvimento
de equaes que permitam um projeto mais racional e eficiente das operaes
unitrias encontradas nos processos de purificao destas molculas, tais como a
precipitao e a cristalizao. Neste trabalho, apresentada uma relao unvoca
entre a solubilidade de protenas e o pH; sendo necessrios como parmetros
apenas informaes sobre a estrutura primria e os valores das constantes de
ionizao de cada resduo na cadeia protica, considerando os diferentes estados
de ionizao que a protena assume em soluo. Esta relao foi aplicada a
sistemas de insulina suna a trs diferentes temperaturas, a sistemas de insulinas
mutantes e a sistemas de b-lactoglobulina a diferentes concentraes de cloreto de
sdio, resultando em uma bem sucedida correlao dos dados experimentais de
solubilidade destes sistemas. Estudou-se tambm a no-idealidade de sistemas
contendo aminocidos, partindo de consideraes sobre diferentes estados de
ionizao da molcula assim como feito para protenas, mas adicionando um termo
de no-idealidade, neste caso, um termo advindo do modelo de Pitzer para solues
eletrolticas. Os sistemas, cujas curvas de solubilidade em funo do pH foram
estudadas, so: DL-Alanina, DL-Metionina, L-Isoleucina, L-Leucina, DL-Fenilalanina,
tambm glicina e seus oligopeptdeos e molculas com grupos b-lactmicos tais
como a ampicilina, que um antibitico, e o cido 6-aminopenicilnico, que um
precursor na rota de produo da ampicilina. Uma interpretao atravs de
termodinmica estatstica para o parmetro de interao de Pitzer permitiu uma
anlise mais profunda dos resultados. Relaes entre o segundo coeficiente virial
osmtico, a solubilidade de protenas e a concentrao de agente precipitante foram
desenvolvidas e aplicadas a sistemas de lisozima, ovalbumina e imunoglobulina
humana. Os resultados desta aplicao mostraram quo profcua a abordagem
empregada.

Palavras-chave: Termodinmica Qumica. Equilbrio Slido-Lquido. Protenas.


Aminocidos.

ABSTRACT

The thermodynamic modeling of solid-liquid equilibrium of systems containing amino


acids and proteins has become increasingly necessary for a more rational and
efficient design of unit operations found in the downstream processing of these
molecules, such as precipitation and crystallization. In this work, an unequivocal
relationship between the protein solubility and the pH is presented. The resulting
equation accounts for the different ionization states that protein molecules may
assume in solution, and is written as a function of the primary structure and values of
the ionization constant of each residue in the protein chain. The model was applied to
the solid-liquid equilibrium of porcine insulin solutions at three different temperatures,
solutions of mutant insulin molecules and solutions of b-lactoglobulin at different
sodium chloride concentrations. A very successful correlation of the experimental
solubility data was obtained in all cases. The solubility of amino acids and b-lactam
compounds was also studied through a similar approach, but in this case the nonideality of the solutions was accounted for by introducing Pitzers model for
electrolyte solutions. The compounds whose solubility curves as a function of the pH
were modeled include the amino acids DL-Alanine, DL-Methionine, L-Isoleucine, LLeucine, DL-Phenylalanine, Glycine and its oligopeptides, and b-lactam compounds
such as ampicillin, which is an antibiotic, and 6-aminopenicillanic acid, which is a
precursor in the ampicillin production route. The interpretation of the binary
interaction parameter values through a statistical thermodynamic approach allowed a
deeper analysis of the results. Finally, equations relating the osmotic second virial
coefficient, the protein solubility and the concentration of precipitant agents such as
salts were developed. The resulting equations were successfully applied to solutions
containing lysozyme, ovalbumin and immunoglobulin, which shows that the
considered approach is promising.

Keywords: Chemical Thermodynamics. Solid-Liquid Equilibrium. Proteins. Amino


acids.

LISTA DE FIGURAS

Figura 3.1 - Estrutura primria da insulina suna: seqncia de aminocidos e pontes


de dissulfeto. Grupos ionizveis em negrito e distribuio de carga da configurao
neutra correspondente ao estado de ionizao preponderante.................................47
Figura 3.2 - Frao de molculas eletricamente neutras de insulina em funo do
pH. Dados de pKA de Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990). Linha contnua,
frao total. Linha pontilhada, frao preponderante.................................................47
Figura 3.3 - Solubilidade da insulina suna em funo do pH a 278,2 K em 10,0 mM
NaHCO3. Dados experimentais (), Tashima et al., (2009). Modelo proposto com
valores de pKA de Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990), linha contnua; com
valores de pKA de Stryer (1995), linha pontilhada. Modelo de Tashima et al. (2009),
linha semi-contnua....................................................................................................48
Figura 3.4 - Solubilidade da insulina suna em funo do pH a 288,2 K em 10,0 mM
NaHCO3. Dados experimentais (), Tashima et al., (2009). Modelo proposto com
valores de pKA de Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990), linha contnua; com
valores de pKA de Stryer (1995), linha pontilhada. Modelo de Tashima et al. (2009),
linha semi-contnua. ..................................................................................................49
Figura 3.5 - Solubilidade da insulina suna em funo do pH a 298,2 K em 10,0 mM
NaHCO3. Dados experimentais (), Tashima et al., (2009). Modelo proposto com
valores de pKA de Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990), linha contnua; com
valores de pKA de Stryer (1995), linha pontilhada. Modelo de Tashima et al. (2009),
linha semi-contnua....................................................................................................49
Figura 3.6 - Curva de solubilidade da insulina mutante B13-GluGln em funo do
pH em 0,1 M KCl a 23 oC. Dados experimentais (), Kaarsholm; Havelung e
Hougaard (1990). Equao (3 - 32), linha contnua...................................................52
Figura 3.7 - Curva de solubilidade da insulina mutante B9-SerAsp em funo do
pH em 0,1 M KCl a 23 oC. Dados experimentais (), Kaarsholm; Havelung e
Hougaard (1990). Equao (3 - 32), linha contnua...................................................53
Figura 3.8 - Curva de solubilidade da insulina mutante B25-PheHis em funo do
pH em 0,1 M KCl a 23 oC. Dados experimentais (), Kaarsholm; Havelung e
Hougaard (1990). Equao (3 - 32), linha contnua...................................................53
Figura 3.9 - Solubilidade da b-lactoglobulina bovina em soluo aquosa contendo

NaCl a 298,2 K. Dados experimentais (Grnwall, 1941): 0,001 mol L-1 NaCl (); 0,005
mol L-1 NaCl (); 0,01 mol L-1 NaCl (); 0,02 mol L-1 NaCl (). Modelagem: linha
contnua, 0,001 mol L-1; linha pontilhada, 0,005 mol L-1; linha semi-contnua, 0,01 mol
L-1; linha com travesses, 0,02 mol L-1.......................................................................56
Figura 4.1 - Valores de solubilidade da DL-Alanina a 298,15 K em soluo aquosa.
Dados experimentais (o), Tseng et al. (2009); soluo com NaOH ou HCl (),
Pradhan e Vera (1998); soluo com KOH ou HNO3 (), Pradhan e Vera (1998).
Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada). .........................70
Figura 4.2 - Valores de solubilidade de DL-Metionina a 303,0 K em soluo aquosa
(com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (), Fuchs et al. (2006).
Modelagem: soluo ideal, linha pontilhada; modelo proposto, linha contnua.........70
Figura 4.3 - Valores de solubilidade da L-Isoleucina a 298,15 K em soluo aquosa
(com HCl ou NaOH). Dados experimentais (o), Tseng et al. (2009). Modelo Proposto
(linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada). .....................................................71
Figura 4.4 - Valores de solubilidade da L-Leucina a 298,15 K em soluo aquosa
(com HCl ou NaOH). Dados experimentais (o), Tseng et al. (2009). Modelo Proposto
(linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada).......................................................71
Figura 4.5 - Valores de solubilidade da DL-Fenilalanina a 298,15 K em soluo
aquosa (com HCl ou NaOH). Dados experimentais (o), Tseng et al. (2009). Modelo
Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada)........................................72
Figura 4.6 - Valores de solubilidade da L-Serina 298,15 K em soluo aquosa (com
HCl ou NaOH). Dados experimentais (o), Tseng et al. (2009). Modelo Proposto (linha
contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada).................................................................72
Figura 4.7 - Valores de solubilidade da tirosina 298,15 K em soluo aquosa. Dados
experimentais (o), Hitchcock (1924). Modelo considerando o grupo R ionizvel (linha
contnua). Modelo considerando o grupo R no-ionizvel (linha pontilhada)............75
Figura 4.8 - Curva de solubilidade em soluo aquosa (com HCl ou NaOH) em
funo do pH. Dados experimentais de glicina (), de diglicina () e de triglicina (),
Lu et al. (2006). Modelagem - Equao (4 - 23) - com valores de l da Tabela 4.4:
glicina, linha contnua; diglicina, linha semi-contnua; triglicina, linha pontilhada......77
Figura 4.9 - Curva de solubilidade em soluo aquosa (com HCl ou NaOH) em
funo do pH. Dados experimentais de tetraglicina (), de pentaglicina () e de
hexaglicina (), Lu et al. (2006). Modelagem - Equao (4 - 23) - com valores de l
da Tabela 4.4: tetraglicina, linha contnua; pentaglicina, linha semi-contnua;

hexaglicina, linha pontilhada......................................................................................77


Figura 4.10 - Estrutura da ampicilina.........................................................................79
Figura 4.11 - Estrutura do cido 6-aminopenicilnico................................................79
Figura 4.12 - Valores de solubilidade da ampicilina 283,06 K em soluo aquosa
(com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o), Santana et al.
(2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada)...............80
Figura 4.13 - Valores de solubilidade da ampicilina 288,01 K em soluo aquosa
(com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o), Santana et al.
(2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada)...............81
Figura 4.14 - Valores de solubilidade da ampicilina 292,95 K em soluo aquosa
(com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o), Santana et al.
(2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada)...............81
Figura 4.15 - Valores de solubilidade da ampicilina 298,03 K em soluo aquosa
(com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o), Santana et al.
(2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada)...............82
Figura 4.16 - Valores de solubilidade do cido 6-aminopenicilnico 283,06 K em
soluo aquosa (com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o),
Santana et al. (2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha
pontilhada).................................................................................................................82
Figura 4.17 - Valores de solubilidade do cido 6-aminopenicilnico 288,01 K em
soluo aquosa (com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o),
Santana et al. (2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha
pontilhada).................................................................................................................83
Figura 4.18 - Valores de solubilidade do cido 6-aminopenicilnico 292,95 K em
soluo aquosa (com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o),
Santana et al. (2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha
pontilhada).................................................................................................................83
Figura 4.19 - Valores de solubilidade do cido 6-aminopenicilnico 298,03 K em
soluo aquosa (com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o),
Santana et al. (2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha
pontilhada).................................................................................................................84
Figura 4.20 - Valores de solubilidade da ampicilina 298,15 K em soluo aquosa em
funo do pH. Dados experimentais a diferentes fraes mssicas de metanol: (o)
0,0 %, () 15,0 %, () 30,0 % e () 50,0 %. Santana; Mattedi e Giordano (2010).

Modelo proposto: 0,0 % (linha contnua), 15,0 % (linha com travesses), 30,0 %
(linha semi-contnua) e 50,0 % (linha pontilhada)......................................................85
Figura 4.21 - Valores de solubilidade do cido 6-aminopenicilnico 298,15 K em
soluo aquosa em funo do pH. Dados experimentais a diferentes fraes
mssicas de metanol: (o) 0,0 %, () 15,0 %, () 30,0 % e () 50,0 %. Santana;
Mattedi e Giordano (2010). Modelo proposto: 0,0 % (linha contnua), 15,0 %(linha
com travesses), 30,0 % (linha semi-contnua) e 50,0 % (linha pontilhada).............86
Figura 5.1 - Solubilidade da lisozima da clara de ovo de galinha em funo da
molalidade de cloreto de sdio. Dados experimentais (), Watanabe (2007).
Equao de Cohn (linha contnua).............................................................................95
Figura 5.2 - Valores do segundo coeficiente virial osmtico em funo da molalidade
de cloreto de sdio em pH = 4,5. Dados experimentais obtidos em Curtis et al.
(2002). Lisozima nativa, modelo (linha contnua), dados experimentais (). Lisozima
D101F, modelo (linha pontilhada), dados experimentais ()......................................96
Figura 5.3 - Valores da solubilidade da lisozima em funo do segundo coeficiente
virial osmtico. Dados experimentais obtidos em Guo et al. (1999). Lisozima a 25 C
e pH = 4,2 com variaes na concentrao de cloreto de sdio (). Lisozima a 18 C
e pH = 4,5 com variaes na concentrao de cloreto de amnio (). Lisozima a 23
C e pH = 7,8 com variaes na concentrao de brometo de magnsio (). Modelo
de Haas; Drenth e Wilson (1999) com z = 3 e A = 0.001 (linha pontilhada). Modelo de
Guo et al. (1999) com Dm = 250 kJ mol -1 (linha semi-contnua). Modelo de Ruppert;
Sandler e Lenhoff (2001), (linha com travesses). Equao (5 23) (linha contnua).
...................................................................................................................................97
Figura 5.4 - Solubilidade da ovalbumina em solues de sulfato de amnio. Dados
experimentais (), Judge; Johns e White (1996). Equao de Cohn (linha contnua).
...................................................................................................................................98
Figura 5.5 - Segundo coeficiente virial osmtico da ovalbumina em solues de
sulfato de amnio a pH = 4,0. Dados experimentais (), Mehta; White e Litster
(2011). Equao (5 21) com Ks = 2,45 kg mol -1, (linha contnua)............................99
Figura 5.6 - Segundo coeficiente virial osmtico da imunoglobulina humana (IgG)
em solues de cloreto de sdio. Dados experimentais (), estes dados ainda no
foram publicados, mas foram cedidos por Kelly Cristina do Nascimento Alves
Cruvinel (comunicao pessoal). Equao (5 21), (linha contnua)......................100

LISTA DE TABELAS

Tabela 3.1 - Anlise da funo qjk...............................................................................45


Tabela 3.2 - Valores de pKA dos grupos ionizveis da insulina humana....................46
Tabela 3.3 - Valores de CQ [Equao (3 40)] e CQG [Equao (3 41)] entre os
modelos aplicados e os dados experimentais de solubilidade de insulina suna a
diferentes temperaturas.............................................................................................51
Tabela 3.4 - Valores de pKA e de nmero de resduo que se ionizam como ctions
(n+) para insulinas mutantes. Dados de Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990).. 52
Tabela 3.5 - Valores de pKA dos grupos ionizveis da b-lactoglobulina bovina..........55
Tabela 4.1 - Quadro-resumo de trabalhos sobre a no-idealidade de solues de
aminocidos...............................................................................................................60
Tabela 4.2 - Valores do parmetro de interao l e do CQ [Equao (3 40)] para
diversos conjuntos de dados experimentais de solubilidade de aminocidos em
funo do pH..............................................................................................................69
Tabela 4.3 - Valores de CQ [Equao (3 40)] em porcentagem para os diferentes
modelos aplicados aos conjuntos de dados de solubilidade de DL-Alanina, LIsoleucina, L-Leucina, DL-Fenilalanina e L-Serina a 298,15 K. Dados experimentais
de Tseng et al. (2009). ..............................................................................................73
Tabela 4.4 - Valores do parmetro de interao l e do CQ (Equao 3 - 40) para
diversos conjuntos de dados experimentais de solubilidade de glicina e seus
oligopeptdeos em funo do pH. Dados experimentais de Lu et al. (2006)..............76
Tabela 4.5 - Valores dos parmetros s, e e CQG para os sistemas contendo
ampicilina e cido 6-aminopenicilnico. Dados experimentais de Santana et al.
(2010).........................................................................................................................80
Tabela 5.1 - Comparao dos valores de CQ definido pela Equao (3 40) para o
sistema contendo lisozima.........................................................................................97
Tabela A.1 - Valores de pKA para aminocidos, peptdeos e molculas com grupos blactmicos estudados no captulo quatro.................................................................126

LISTA DE SMBOLOS E SIGLAS

Letras latinas

parmetro universal do Modelo de Pitzer

aH+

atividade do on H+

ai

atividade do componente i

aP0

atividade da molcula de protena eletricamente neutra

rea superficial do soluto


parmetro do modelo de Debye-Hckel

parmetro universal do modelo de Pitzer

Bij

segundo coeficiente virial osmtico para interao entre os componentes i e j

parmetro do modelo de Debye-Hckel

ck

carga total de uma molcula de protena em um estado de ionizao k

carga mdia das molculas de protena

parmetro do modelo de Debye-Hckel

C1

parmetro ajustvel para clculo do segundo coeficiente virial do modelo de


Pitzer

C2

parmetro ajustvel para clculo do segundo coeficiente virial do modelo de


Pitzer

ds

densidade do solvente

parmetro do modelo de Kirkwood

carga eltrica

fi

fugacidade do componente i

fi0

fugacidade do componente i no estado de referncia

gk

restrio de igualdade devido s leis de conservao

gEX

energia livre de Gibbs excedente

gij

parmetro de energia caracterstico da interao entre os componentes i e j

gij(.)

funo de distribuio radial

Gij

parmetro do modelo NRTL

fora inica

kB

constante de Boltzmann

Ks

constante de salting-out

Kk

constante do equilbrio de ionizao entre uma molcula de protena neutra e


uma molcula da mesma protena em um estado de ionizao k

L(.)

operador lagrangeano

nmero de componentes no sistema

mi

molalidade do componente i

mi0

molalidade do componente i no estado de referncia

m0

molalidade de molculas eletricamente neutras de protenas

msal

molalidade do sal

ction
nmero de conjuntos de dados experimentais

Ms

massa molecular do solvente

nmero total de resduos ionizveis de uma dada protena

nA

nmero de resduos carregados negativamente

nB

nmero de resduos negativos no carregados

nC

nmero de resduos carregados positivamente

nD

nmero de resduos positivos no carregados

n+

nmero de resduos positivos em uma dada protena

quantidade de matria do sistema


nmero de dados experimentais

NA

nmero de Avogadro

Ni

quantidade de matria total do componente i no sistema

Ni(a)

quantidade de matria do componente i na fase a

presso

P0
Pk

+c

protena eletricamente neutra


protena em um estado de ionizao k com carga total +c

coordenada radial

constante real dos gases

entropia
solubilidade

SA

solubilidade de um dado aminocido

temperatura

uij

potencial intermolecular entre os componentes i e j

energia interna do sistema

energia interna total do sistema

U(a)

energia interna da fase a

volume do sistema

volume total do sistema

V(a)

volume da fase a

ws

massa do solvente

Wij

potencial da fora mdia entre os componentes i e j

xi

frao molar do componente i em fase condensada

nion

yi

frao molar do componente i em fase gasosa

zi

carga eltrica do componente i

z+

carga eltrica do ction M

z-

carga eltrica do nion X

Letras gregas

aj

frao ionizada do resduo j

aij

parmetro de no-aleatoriedade na mistura

a+1

frao de grupos amina ionizados em sistemas contendo aminocidos

a-1

frao de grupos cido carboxlico ionizados em sistemas contendo


aminocidos

parmetro da equao de Cohn

tenso superficial do solvente

g0

tenso superficial da gua pura

gi

coeficiente de atividade do componente i

gA0

coeficiente de atividade de um aminocido eletricamente neutro

coeficiente de atividade inica mdio

parmetro de interao atrativa de van der Waals

e0

permissividade do vcuo

er

constante dieltrica

ejk

carga do resduo j em uma molcula de protena em um estado de ionizao


k

hj(.)

funo auxiliar que depende apenas do resduo j

qjk(.)

funo auxiliar que depende tanto do resduo j quanto do estado de


ionizao k

inverso do comprimento de Debye

ke

termo de correo no clculo da variao do potencial qumico devida


energia envolvida na formao de uma cavidade para alocar a molcula na
soluo

lk

multiplicador de Lagrange relativo restrio de igualdade gk

lij

segundo coeficiente virial do modelo de Pitzer para as interaes entre os


componentes i e j

l-1

segundo coeficiente virial do modelo de Pitzer entre as formas aninica e


zwitterinica de um dado aminocido

l+1

segundo coeficiente virial do modelo de Pitzer entre as formas catinica e


zwitterinica de um dado aminocido

l0

segundo coeficiente virial do modelo de Pitzer entre a forma zwitterinica e a


forma neutra no-zwitterinica de um dado aminocido

lzwitt

segundo coeficiente virial do modelo de Pitzer entre duas molculas


zwitterinicas de um dado aminocido

coeficiente de salting-in

Lijk

terceiro coeficiente virial do modelo de Pitzer para as interaes entre os


componentes i, j e k

md

momento de dipolo eltrico

mi

potencial qumico do componente i

miL

potencial qumico do componente i na fase lquida

miS

potencial qumico do componente i na fase slida

mi0

potencial qumico do componente i no estado de referncia

Dm*

potencial qumico de transferncia de uma molcula de protena do estado


de um gs hipottico para o interior de uma soluo

Dmcav variao do potencial qumico devida energia envolvida na formao de


uma cavidade para alocar a molcula na soluo

Dmelet contribuio eletrosttica variao do potencial qumico


DmvdW variao sofrida pelo potencial qumico devido as interaes atrativas de van
der Waals entre o solvente e o soluto.

nj

estado carregado do resduo j

n+

coeficiente estequiomtrico do ction M

n-

coeficiente estequiomtrico do nion X

nmero de fases no sistema

presso osmtica

ri

concentrao do componente i

raio de van der Waals mdio


incremento molal da tenso superficial

tij

parmetro do modelo NRTL

fA0

frao de molculas de aminocido eletricamente neutras

fk

frao de molculas de protena em um estado de ionizao k


coeficiente de fugacidade osmtico

fzwitt

frao de molculas de aminocido na forma zwitterinica

f0

frao de molculas de protenas eletricamente neutras


frao de molculas de aminocido eletricamente neutras na forma nozwitterinica

f-1

frao de molculas de aminocido na forma aninica

f+1

frao de molculas de aminocido na forma catinica

nmero de estados de ionizao possveis

yj

potencial eltrico do componente j

razo entre o coeficiente de salting-out e o incremento molal da tenso


superficial

Siglas
CQ

critrio quantitativo

CQG critrio quantitativo global


NRTL do ingls: Non-Random Two Liquids
pH

co-logaritmo decimal da atividade do on H+

pI

ponto isoeltrico

pKA

co-logaritmo decimal da constante de equilbrio de ionizao

SUMRIO

1 Introduo...............................................................................................................22
2 Elementos fundamentais da termodinmica de equilbrio de fases........................25
2.1 A equao fundamental em sua representao entrpica................................25
2.2 A equao de Gibbs-Duhem.............................................................................26
2.3 Os critrios de equilbrio de fases....................................................................27
2.4 Fugacidade, atividade e convenes...............................................................29
2.5 Modelos termodinmicos de energia livre de Gibbs excedente.......................31
2.6 Modelos termodinmicos para solues eletrolticas.......................................32
3 Efeito do pH na solubilidade de protenas..............................................................35
3.1 Introduo.........................................................................................................35
3.2 Desenvolvimento terico..................................................................................36
3.2.1 Clculo da frao de protena eletricamente neutra...................................39
3.2.2 Extenso teoria de Linderstrm-Lang e Grnwall...................................41
3.2.3 Equivalncia entre as duas abordagens....................................................44
3.3 Resultados e Discusses.................................................................................45
3.3.1 Solubilidade da insulina em funo do pH e da temperatura.....................45
3.3.2 Solubilidade da b-lactoglobulina em funo do pH e da fora inica.........54
4 No-idealidade de solues de aminocidos e compostos b-lactmicos...............57
4.1 Introduo.........................................................................................................57
4.2 Desenvolvimento terico..................................................................................61
4.2.1 Clculo das fraes eletricamente neutras e carregadas ..........................61
4.2.2 Modelo de Pitzer ........................................................................................63
4.2.3 Uma abordagem por termodinmica estatstica da no-idealidade...........66
4.3 Resultados e Discusses.................................................................................69
4.3.1 Solubilidade de aminocidos em funo do pH.........................................69
4.3.2 Solubilidade da glicina e de seus oligopeptdeos em funo do pH...........76
4.3.3 Solubilidade de compostos b-lactmicos em funo do pH, da temperatura
e do solvente.......................................................................................................78
5 Segundo coeficiente virial osmtico de protenas e suas relaes.........................87
5.1 Introduo.........................................................................................................87
5.2 Desenvolvimento terico..................................................................................89
5.2.1 Potencial qumico de referncia.................................................................90
5.2.2 Equao de Cohn.......................................................................................92
5.2.3 Modelo proposto.........................................................................................93

5.3 Resultados e Discusses.................................................................................94


5.3.1 Resultados para a lisozima........................................................................94
5.3.2 Resultados para a ovalbumina...................................................................98
5.3.3 Resultados para a imunoglobulina humana.............................................100
6 Concluses...........................................................................................................101
7 Referncias bibliogrficas.....................................................................................104
Apndice A Integrao do perfil de carga em funo do pH.................................110
Apndice B Cdigo-fonte do programa de clculo de solubilidade de protenas. .112
Apndice C Expresso para o coeficiente de atividade de um soluto no ensemble
de McMillan-Mayer...................................................................................................117
Apndice D Cdigo-fonte do programa de ajuste de parmetros para o clculo da
solubilidade de aminocidos e compostos b-lactmicos..........................................121
Anexo A Valores de pKA usados nos clculos do quarto captulo.........................126

22

1 Introduo

et si in tanta scriptorum turba mea fama in obscuro sit,


nobilitate ac magnitudine eorum me qui nomini officient
meo consoler
(Titus Livius, in Histria de Roma)

Apesar de muitos acreditarem ser a Termodinmica uma rea concluda do universo


cientfico, prova-se constantemente que, justamente por estar a Termodinmica
consolidada do ponto de vista formal da lgica matemtica e da interpretao fsica,
ela pode contribuir de modo nico para a descrio de fenmenos descritos apenas
recentemente. A revoluo biotecnolgica, que marca desde a segunda metade do
sculo XX at os dias correntes tanto os processos industriais quanto a pesquisa
acadmica, traz consigo desafios importantes para uma maior compreenso dos
sistemas ditos biolgicos, ou seja, sistemas que tm como alguns de seus
componentes molculas de algum modo originadas de seres vivos.
A importncia mais bvia da Termodinmica reside no fato de ela poder fornecer
uma imensa gama de informaes sobre o sistema com a necessidade de poucos
parmetros. Este fato tanto mais relevante quanto mais complexo for o sistema
estudado. Na verdade, a Termodinmica em sua forma mais primitiva prescinde
inclusive da hiptese atmica, o que a garante tal generalidade que ainda em uma
natureza na qual no houvesse tomos suas leis seriam vlidas e poderiam ser
aplicadas irrestritamente. Quanto a isso, notam-se na introduo de seu livro sobre
Termodinmica Estatstica as observaes de Terrell L. Hill:
[...] Although thermodynamics itself does not provide a molecular picture of
nature, this is not always a disadvantage. Thus there are many complicated
systems for which a molecular theory is not possible; but regardless of
complications on the molecular level, thermodynamics can still be applied to
such systems with confidence and exactness.[]
(HILL, 1986, p. 1)

A reside a explicao para a comunho entre a Termodinmica e todas as outras


cincias da natureza, sem considerar os aspectos filosficos muitas vezes

23
apropriados das leis da Termodinmica.
No h mais espao (se que antes houve algum) para a pesquisa cientfica que se
limite a uma nica rea do conhecimento. Dessarte, os profissionais de
Termodinmica tm na medida do possvel servido a comunidade cientfica como um
todo, com interpretaes, modelos e mesmo dados experimentais de propriedades
que auxiliam as pesquisas dedicadas s mais diversas reas.
No caso de sistemas que contm protenas, h uma grande e crescente demanda
por conhecimento devido s inmeras aplicaes, seja no setor farmacutico, seja
na indstria alimentcia. Aqui, estudar-se-o alguns destes sistemas. A abordagem
pretendida corresponde explorao dos limites da termodinmica clssica na
descrio destes sistemas.
Molculas de protena apresentam, entre outras, uma caracterstica que torna a sua
modelagem termodinmica um pouco mais complicada: a presena de ons na
cadeia. Pode-se dizer que a teoria de solues eletrolticas nasce, ou pelo menos,
ganha notoriedade com o trabalho de Petrus Debye e Erich Hckel, que no incio da
dcada de 1920, propuseram um mtodo de clculo da no-idealidade devida
presena de eletrlitos em soluo atravs da soluo linearizada e unidirecional da
equao de Poisson-Boltzmann. Mesmo assim, as solues contendo eletrlitos
ainda hoje so alvo de intensa pesquisa. At porque a prpria teoria de lquidos
ainda um captulo no qual h hoje muito esforo empregado. Quando se pensa em
protenas, que na verdade so polieletrlitos muito menos simples que polieletrlitos
de polmeros sintticos, a modelagem se apresenta repleta de simplificaes, sejam
de ordem geomtrica (tal como considerar a protena uma esfera), sejam de ordem
de distribuio de cargas, dotando a protena de uma carga lquida sem considerar
os diferentes estados de ionizao.
As principais intenes aqui pretendidas esto centradas em uma busca por uma
descrio termodinmica mais fiel na sua representao dos fenmenos estudados.
O segundo captulo ser dedicado a uma brevssima reviso dos conceitos
fundamentais de termodinmica de equilbrio de fases de modo a facilitar ao leitor,
desacostumado nomenclatura termodinmica, a compresso dos captulos
seguintes. Diferentemente do segundo captulo, os que o seguiro, com
pouqussimas excees que sero postas em relevo a medida que aparecerem,
integram os desenvolvimentos tericos inditos aqui propostos.
No terceiro captulo ser apresentado o desenvolvimento de uma relao terica

24
para a predio da curva de solubilidade de protenas em funo do pH
considerando que a fase slida nica e s contm molculas eletricamente neutras
de

protenas

pelo

princpio

de

eletroneutralidade

da

fase

em

equilbrio

termodinmico. Resultados para a insulina suna a diferentes temperaturas, algumas


insulinas mutantes e para a b-lactoglobulina a diferentes valores de fora inica
sero apresentados e discutidos tambm neste captulo. Tanto a modelagem quanto
os principais resultados deste captulo foram publicados em um artigo recente
(FRANCO; PESSA FILHO, 2011).
No quarto captulo, a equao deduzida no captulo terceiro ser modificada de
modo a ser aplicada a sistemas contendo aminocidos e molculas com grupos blactmicos incluindo para tanto um termo de no-idealidade calculado pelo modelo
de Pitzer para solues eletrolticas. Ao parmetro de interao introduzido pelo
modelo de Pitzer ser dada uma interpretao a partir da termodinmica estatstica
que permitir uma discusso mais robusta do ponto de vista cientfico.
No quinto captulo sero deduzidas relaes entre o segundo coeficiente virial, a
concentrao de agente precipitante (tipicamente sais) e a solubilidade de protenas.
Sero estudados sistemas com lisozima, ovalbumina e imunoglobulina G humana.
Outros modelos publicados na literatura sero comparados ao modelo proposto.
O sexto e derradeiro captulo ser dedicado exclusivamente a exposio das
concluses deste trabalho e a sugesto de trabalho futuros.
Todas estas contribuies visam a aprofundar e a discutir a fsico-qumica envolvida
em sistemas que contm aminocidos ou protenas do ponto de vista clssico da
termodinmica de equilbrio de fases. As relaes aqui desenvolvidas so de
utilidade no apenas da discusso cientfica, mas claramente da aplicao
tecnolgica.
Acaba-se, por fim, este introito com uma esperana sutil lanada pelo famoso
historiador romano, Tito Lvio, e aqui registrada sob a forma de epgrafe: a que os
trabalhos que a esse sucedam o superem, e este ser o consolo deste que o
escreve.

25

2 Elementos fundamentais da termodinmica de equilbrio de fases

,
(Pilatos, in Evangelho de So Joo)

O objetivo de despender algumas pginas com aspectos introdutrios aos


problemas de equilbrio de fases facilitar ao leitor desta dissertao alguns
conceitos sem os quais a compreenso do trabalho que se segue se tornaria
extremamente rdua e laboriosa. No h, todavia, algum intento aqui seno o de
expor exclusivamente o formalismo termodinmico necessrio s dedues que se
seguiro. Reitera-se que nada do que neste captulo est apresentado novo, nem
to pouco fruto da pesquisa a qual esta dissertao justifica sua existncia, todavia,
estas linhas que custaram mais de cem anos de pesquisa em termodinmica so
indispensveis ao entendimento das discusses que se seguiro.
A epgrafe, ainda que de alguma forma jocosa (em uma traduo livre: o que
escrevi, escrevi), pretende ilustrar a robustez da termodinmica quanto um ramo da
cincia consistente e inviolvel.

2.1 A equao fundamental em sua representao entrpica

Dado um sistema simples com m componentes, a equao fundamental descreve


completamente todos os estados de equilbrio. Em sua representao entrpica, a
equao fundamental dada explicitando a entropia, S, do sistema como funo da
energia interna, U, do volume, V, e da quantidade de matria, N, de cada
componente (MODELL; REID, 1983):
S=S(U ,V , N 1 ,... , N m )

(2 - 1)

A equao fundamental representa, assim, uma hipersuperfcie em um espao de


m+3 dimenses cujos pontos representam estados de equilbrio do dado sistema.

26
Sendo uma diferencial exata, a equao fundamental pode ser associada s duas
primeiras leis da termodinmica de modo que a variao infinitesimal de entropia do
sistema seja dada por:
dS(U ,V , N 1 ,... , N m )=

1
p
dU+ dV i dN i
T
T
i =1 T

(2 - 2)

Em que T a temperatura termodinmica:

( )

1
S
=
T
U

(2 3)

V ,N

p a presso do sistema:
p=T

( )
S
V

(2 4)

U ,N

E, mi o potencial qumico da espcie i:

i =T

( )
S
N i

(2 5)

U ,V , N j ,i j

2.2 A equao de Gibbs-Duhem

A equao fundamental expressa em sua forma entrpica pela Equao (2 1) pode


tambm ser, e assim comumente , escrita em sua representao energtica:
U=U (S , V ,N 1 , ... , N m)

(2 6)

Com sua diferencial exata dada por:


m

dU (S , V , N 1 , ..., N m )=T dSp dV + i dN i

(2 7)

i=1

Sendo

transformada

de

Legendre

total

de

uma

dada

funo

f ( x ): n / x =[x 1 , ... , x n ] , tem-se que:


n

T (f ( x ))=f ( x )

k =1

f (x)
xk
xk

(2 8)

E, aplicando-se essa transformada de Legendre total na funo definida na Equao


(2 6), tem-se que:

27
m

T (U (S , V , N 1 , ..., N m ))=U (S , V , N 1 , ... , N m)TS+pV i N i

(2 9)

i =1

Tomando a diferencial da Equao (2 9):


d T (U (S , V , N 1 , ... , N m ))=...
m

i=1

i =1

... dU (S ,V , N 1 ,... , N m )TdSSdT +pdV +Vdp i dN i N i d i

(2 10)

A equao de Gibbs-Duhem simplesmente dada pela condio de que a variao


infinitesimal da transformada de Legendre total da equao fundamental nula,
logo, observando-se a substituio da Equao (2 7) na Equao (2 10), tem-se:
m

SdT Vdp+ N i d i =0

(2 11)

i =1

Essa Equao (2 11) serve como uma restrio a ser respeitada por qualquer
modelagem termodinmica que se pretenda em equilbrio de fases. Na verdade, ela
usada como garantia de consistncia termodinmica a um dado modelo.

2.3 Os critrios de equilbrio de fases

Em geral, a apresentao que se faz dos critrios para os equilbrio de fases


perpassa caminhos matemticos e propostas de exemplos que acabam por dificultar
a compreenso.
Aqui, tentar-se- um mtodo pouco utilizado nas classes de termodinmica, mas que
segundo a percepo deste que escreve parece apresentar uma consistncia
matemtica que deve por fim isentar dvidas quanto a sua aplicao mais geral.
Tomemos para anlise um sistema isolado com m componentes e p fases; de
acordo com a segunda lei da termodinmica a entropia deste sistema isolado
sempre aumenta em uma dada transformao, logo no equilbrio sua entropia deve
ser mxima de modo que no haja nenhuma transformao que leve o sistema para
outro estado que no seja o de equilbrio.
Deve-se reescrever, ento, a equao fundamental expressa pela equao (2 1)
de modo a contemplar um sistema multifsico:

28
S=S(U , V , N 1 , ... ,N m)

(2 12)

Sendo os vetores definidos por coordenadas de cada fase do sistema:

U =[ U(1) ,U(2) ,...,U ( ) ]

(2 13)

V =[ V (1) ,V (2) ,...,V ( ) ]

(2 14)

(2)
( )
N i =[N (1)
i , N i , ... , N i ],

c o m i =1, 2, ... , m

(2 15)

Posto isto, tem-se que este um problema de maximizao de entropia sujeito s


restries de conservao energtica, espacial e material:
m a x S=S (U , V ,N 1 , ... , N m )
s.t. :

g 1( U )= U ( )U=0
=1

g 2 (V )= V ( )V =0
=1

g j (N i )= N (i )N i =0, i=1,... , m e j=3, ... ,m+2

(2 16)

=1

Assim, pode-se definir o lagrangeano da entropia como:


m+2

L(U ,V , N 1, ... ,N m , )=S (U , V , N 1, ... , N m) k g k

(2 17)

k =1

A condio de otimalidade dada pela condio de gradiente do lagrangeano da


entropia nulo:
L(U , V , N 1, ... ,N m , )=0

(2 18)

Com isso, ter-se-o (m+2)(p +1) equaes a serem satisfeitas:

L(U , V , N 1, ... ,N m , )

1
1=0, =1,... ,
U
T ( )
L (U , V , N 1, ... ,N m , ) p( )
= ( ) 2=0, =1,... ,
V ( )
T
()
L(U , V , N 1, ... , N m , )
i
=
i+2 =0, =1,... , e i =1,..., m
N(i )
T ( )
( )

(2 19)

29
Obviamente para completar as (m+2)(p +1) equaes a serem satisfeitas, devem-se
incluir as restries de igualdade que reaparecem nas derivada parciais do
lagrangeano pelo multiplicadores de Lagrange.
Logo, tem-se que para maximizar a entropia de um sistema isolado com m
componentes e p fases, devem-se obedecer as seguintes relaes:
1
(1)
(2)
( )
1 =T =T ==T

2
(1)
(2)
( )
1 =p =p ==p
i+2
(1)
(2)
( )
= i = i == i ,
1

i=1, ... , m

(2 20)

As equaes apresentadas em (2 20) representam os critrios do equilbrio de


fases: igualdade das temperaturas, das presses e dos potenciais qumicos de cada
componente.
Do ponto de vista de fenmenos de transporte possvel, e at talvez mais fcil,
imaginar que o equilbrio um caso particular do estado estacionrio para o qual a
fora motriz da grandeza responsvel pelo transporte constante e nula, id est, o
transporte s ocorre se h diferena de potencial, se o potencial trmico
(temperatura) for o mesmo em todas as fases do sistema no h transporte de calor,
se o potencial mecnico (presso) for igual em todas as fases do sistema no h
deslocamento de fronteira e, analogamente, se o potencial qumico de cada
componente for o mesmo em todas as fases no h transporte de massa. As
equaes fenomenolgicas mostram claramente como o fluxo dependente da
fora motriz de tal modo que se esta ltima for nula no h fluxo e o sistema est em
equilbrio. Ainda que se considerem acoplamentos, a situao de equilbrio aquela
em que todas as foras motrizes so nulas; portanto, mesmo os efeitos de
acoplamento no ocorrero.

2.4 Fugacidade, atividade e convenes

O potencial qumico tal como proposto por Gibbs na segunda metade do sculo XIX

30
(PRAUSNITZ; LICHTENTHALER; AZEVEDO, 1999) no de fcil assimilao,
porque no possvel sua percepo no mundo fsico real de modo to intuitivo
quanto o potencial trmico (temperatura) e o mecnico (presso). No entanto, a
definio de fugacidade d uma idia mais sensvel do fenmeno fsico. A
fugacidade, assim como definida por Lewis, substitui a presso no clculo do
potencial qumico de um processo isotrmico de um gs ideal de modo a contemplar
os efeitos no considerados no modelo de gs ideal:

i 0i
=exp
RT
f 0i
fi

(2 21)

em que fi a fugacidade do componente i, fi0 a fugacidade do componente i no


estado padro, mi o potencial qumico do componente i, mi0 o potencial qumico do
componente i no estado padro, R a constante real dos gases (R = 8,314 J mol-1 K1

), T a temperatura do sistema em K.

Pela sua definio possvel equivaler a igualdade de fugacidades de cada


componente em todas as fases do sistema como um critrio de equilbrio alternativo
ao da igualdade de potenciais qumicos expressa na Equao (2 20) sem perda de
generalidade.
Para um gs ideal puro, a fugacidade igual a presso e, para uma mistura de
gases ideais, igual a presso multiplicada pela frao molar: yip. A definio de
fugacidade assim completada pelo limite observvel a todos os sistemas puros ou
misturados no qual o comportamento destes sistemas se aproxima do de gs ideal
para presses muito baixas:
lim
p 0

fi
=1
yi p

(2 22)

em que yi a frao molar do componente i e p a presso do sistema.


Embora a definio de fugacidade ajude nos clculos de equilbrio de fases de
gases, sua aplicao a sistemas condensados um tanto quanto mais complicada.
Isto se deve ao fato de ter-se relacionado tudo a diferena entre o comportamento
do sistema real e o do gs ideal; e, portanto, isso exige dados experimentais a
temperatura e composio constante sobre todo o intervalo de densidades no se
excetuando a regio bifsica. Como na maioria das vezes no se dispe de tamanha
quantidade de informaes, usa-se alternativamente uma outra abordagem para
clculos da fase lquida. Definindo uma soluo ideal e calculando os desvios entre

31
a soluo real e essa soluo ideal pelas propriedades de excesso, que no caso da
energia livre de Gibbs de excesso ou ainda, energia livre de Gibbs excedente
est relacionada ao coeficiente de atividade. Assim, cabe definir a atividade de um
componente e o coeficiente de atividade deste componente. Da prpria definio de
fugacidade expressa pela Equao (2 21), define-se a atividade como:
ai=

fi

(2 23)

f 0i

De modo similar ao que est escrito em (2 22), surge a necessidade de se definir o


coeficiente de atividade, g, de um dado componente i como:

i=

ai
xi

(2 24)

Aqui cabe explicitar algo que ser necessrio: a conveno simtrica e a


assimtrica. Esta necessidade emerge a medida em que se arbitra qual o estado
padro (ou estado de referncia) com o qual se executar o clculo do potencial
qumico. Na conveno simtrica, o estado padro o mesmo para todos os
componentes; j na conveno assimtrica, no.

2.5 Modelos termodinmicos de energia livre de Gibbs excedente

O coeficiente de atividade est relacionado a energia livre de Gibbs excedente ou


seja, a diferena entre a energia livre de Gibbs de um sistema real e a energia livre
de Gibbs de uma mistura ideal pela seguinte equao:

ln i =

EX m

g
N
RT i =1 i
N i

(2 25)

T , p ,N j

A Equao (2 25) traz a possibilidade de ao se propor um modelo de energia livre


de Gibbs excedente, possa-se avaliar a no-idealidade de um dado componente em
soluo. Um dos modelos mais aplicados nos ltimos quarenta anos o famoso
NRTL (da sigla em ingls: Non-Random Two Liquids) que foi proposto em um artigo
de Renon e Prausnitz (1968). Na sua forma para sistemas multicomponentes, a

32
energia livre de Gibbs excedente dada por:
m

g EX
= x
RT i=1 i

ji G ji x j
j=1
m

(2 26)

Gli x l
l=1

em que, o parmetro tij dado pela diferena entre os parmetros de energia


caractersticos da interao de i e j, gij:

ji =

g ji g ii
RT

(2 27)

E, o parmetro Gij dado pela exponencial da multiplicao entre o parmetro tij e o


parmetro de no-aleatoriedade na mistura aij:
G ji =exp( ji ji ) , c om ji = ij

(2 28)

Em termos do logaritmo natural do coeficiente de atividade de um dado componente


i, tem-se que:
m

ji G ji x j
ln i =

j=1
m

Gli x l
l =1

+
j =1

x j G ij
m

G lj x l
l=1

x r rj Grj

ij r=1m

G li x l
l=1

(2 29)

Coube aqui apresentar mais pormenorizadamente este modelo em especial, para


ajudar a discusso de uma particular aplicao a sistemas contendo aminocidos
apresentada no captulo quarto. Evidentemente h outros tantos e to importantes
modelos que inclusive sero citados ao decorrer do texto, todavia como a aplicao
do modelo NRTL ser comparada a aplicao de um outro modelo neste trabalho,
considerou-se por bem apresentar sua formulao.

2.6 Modelos termodinmicos para solues eletrolticas

Enquanto a prpria teoria de lquidos ainda objeto de intensa pesquisa, no foi


abandonada durante o sculo passado, e nem nos prximos o ser, a modelagem
de solues que contenham eletrlitos. A natureza de tais solues traz

33
complicaes adicionais a este tipo de modelagem e restries antes no
consideradas tais como o princpio de eletroneutralidade da fase termodinmica em
equilbrio estvel.
A teoria de Debye-Hckel publicada no incio dos anos de 1920 foi pioneira no
tratamento de solues eletrolticas e at hoje constitui um trabalho de referncia na
maioria das publicaes relacionadas a este tema. Este teoria est baseada na
soluo linearizada e unidirecional da equao de Poisson-Boltzmann (HILL, 1986):
2 j=

zi e i
4 e
z i i 1 k T
i
B

(2 30)

em que y o potencial da espcie j, e a carga eltrica, e a permissividade do


vcuo, zi a carga eltrica da espcie i, ri a concentrao da espcie i, kB a
constante de Boltzmann e T a temperatura.
Pela soluo da Equao (2 30), e por algumas consideraes, chega-se ao
coeficiente de atividade de uma espcie inica no limite de altas diluies:
z 2j e2
ln j =
2 kB T

(2 31)

em que k o inverso do comprimento de Debye1:

2=

4 e2
i z i2

kBT i

(2 32)

Muitas vezes esta Equao (2 32) escrita em termos da fora inica, I, que
definida como:
I=

1
m i z 2i

2 i

(2 33)

em que mi a molalidade do componente i em mol por kilograma.


De fato este modelo um modelo limite a concentraes de eletrlitos muito baixas,
tipicamente limitado a fora inica da ordem de 0,01 mol kg-1 (PRAUSNITZ;
LICHTENTHALER; AZEVEDO, 1999). No decorrer do sculo passado outros
modelos foram propostos com o intento de ampliar a faixa de aplicao a sistemas
eletrolticos; um dos mais exitosos nesta empresa o modelo de Pitzer (PITZER,
1973). No fundo, este modelo pode ser dividido em dois termos principais: um de
1 O comprimento de Debye uma distncia de interao caracterstica associada ao potencial
eletrosttico blindado (PRAUSNITZ; LICHTENTHALER; AZEVEDO, 1999).

34
longo alcance que devido as interaes eletrostticas anlogas ao modelo de
Debye-Hckel, e um de curto alcance que uma expanso virial de modo a assumir
a hiptese que as interaes entre muitos corpos pode ser dividida em contribuies
de interaes de dois-a-dois, trs-a-trs e assim por diante. Este modelo tambm se
baseia em uma proposio para a energia livre de Gibbs excedente:
gEX
=f (I )+ m i m j ij (I)+ m i m j m k ijk +...
RTw s
i
j
i
j
k

(2 34)

em que ws a massa de solvente, f(I) uma funo dependente da fora inica, lij
o parmetro das interaes binrias (dois-a-dois) e Lijk o parmetro das interaes
ternrias (trs-a-trs).
Como as propriedades termodinmicas so usualmente medidas para eletrlitos
neutros e no espcies inicas individuais, convencionou-se escrever os modelos
para solues eletrolticas aplicando a restrio de eletroneutralidade em termos de
um coeficiente de atividade inica mdio que dado pela mdia geomtrica dos
coeficientes de atividade do ction e o do nion. Esta abordagem que para sistemas
salinos, por exemplo, muito interessante, no o para polieletrlitos, para os quais
algumas complicaes aparecem. Em termos do coeficiente de atividade inica
mdio, o modelo de Pitzer dado por:

1
e2
ln = z+ z -
3
0 r k B T

...+m

2 + ++ -

...+9m

){

(0)

2 +

( + - )

++ -

3/ 2

(2 d s N A )1/2 2
I +...
ln(1+b I )+
8
b
1+b I

[ (

]}

2 (1)
2I
1/ 2
1/ 2
1
1+

exp ( I ) +...
2
2
I

](

+ MMX + - MXX )

(2 35)

em que n+ e n- so respectivamente os coeficientes estequiomtricos do ction M e


do nion X. Os outros parmetros sero definidos no quarto captulo quando da
aplicao do modelo de Pitzer.

35

3 Efeito do pH na solubilidade de protenas

Si lon veut noncer le prncipe dans toute sa gnralit et en lappliquant lUnivers, on le voit pour
ainsi dire svanouir et il ne reste plus que ceci: il y a quelque chose qui demeure constant.
(Henri Poincar, in Thermodynamique)

3.1 Introduo

Os primeiros trabalhos relacionados modelagem da curva de solubilidade de


protenas em funo do pH datam do incio do sculo XX. Green (1931) props um
modelo para a curva de solubilidade da carboxihemoglobina eqina considerando
que esta protena se comportaria tanto como um cido bivalente quanto uma base
bivalente. J Grnwall (1941) atribuiu a Linderstrm-Lang o desenvolvimento de um
modelo capaz de predizer a curva de solubilidade a partir da integrao do perfil de
carga da protena. Este trabalho de Grnwall, apesar de esquecido, de extrema
importncia e relevncia tanto para o trabalho aqui apresentado quanto, e aqui um
motivo muito mais nobre, para o desenvolvimento de modelos a partir das
ferramentas da termodinmica clssica.
digno de nota o trabalho de Fredericq e Neurath (1950) no qual uma proposta de
equacionamento para uma correlao semi-emprica da curva de solubilidade de
insulina apresentada. No h, de fato, algo novo em relao modelagem do
efeito do pH na curva de solubilidade neste trabalho; no entanto, apesar de no
haver qualquer meno ou referncia quanto origem da equao proposta, nota-se
que uma aplicao direta da equao descrita por Grnwall (1941). H uma
hiptese implcita no trabalho de que o perfil de carga lquida da insulina em funo
do pH seja linear na regio do ponto isoeltrico, o que bastante plausvel para
muitas protenas. Assim, pela integrao da equao diferencial proposta por
Grnwall (1941), uma correlao semi-emprica quadrtica obtida. Refora-se o
uso da expresso semi-emprica devido natureza dual da equao: em parte
advinda de um desenvolvimento terico descrito por Grnwall (1941) e atribudo a
Linderstrm-Lang; e em parte pela necessidade de se obterem parmetros a partir

36
de um ajuste de um conjunto de dados experimentais.
Contudo, os trabalhos mais recentes se concentram na modelagem da curva de
solubilidade de aminocidos em funo do pH dando maior enfoque aos modelos
termodinmicos para solues no-ideais, tanto atravs de equaes de estado
como de modelos de energia livre de Gibbs excedente.
Entretanto, o primeiro trabalho dedicado exclusivamente modelagem e predio da
curva de solubilidade de protenas propriamente dita em funo do pH foi publicado
por Tjong e Zhou (2008). Neste trabalho, a solubilidade foi calculada a partir da
energia livre de transferncia da fase slida para a fase lquida. Para a execuo
deste clculo, a energia livre de transferncia foi dividida em duas contribuies:
uma de natureza eletrosttica, calculada pela mdia de 100 conformaes proticas
advindas da aplicao de dinmica molecular a pH constante; e outra, de natureza
no-eletrosttica, baseada na rea superficial acessvel ao solvente. Porm, o
esforo computacional requerido pelo modelo por eles proposto para calcular
apenas alguns pontos da curva no apresenta uma aplicabilidade razovel. Alm
deste trabalho, Tashima et al. (2009) propuseram uma modelagem termodinmica
para prever a curva de solubilidade especificamente da insulina suna aplicando o
modelo de Pitzer truncado aps o segundo coeficiente virial.
Aqui uma relao analtica entre a solubilidade de protenas em funo do pH ser
desenvolvida sob a hiptese de que a atividade da molcula de protena
eletricamente neutra permanece constante com o pH. Assim se entende a epgrafe
deste captulo e que encontrada no apenas neste mas em muitos
desenvolvimentos tericos: h alguma coisa que permanece constante.

3.2 Desenvolvimento terico

No caso do equilbrio slido-lquido, no qual a fase slida nica e contm apenas


molculas de um soluto i, a condio do equilbrio de fases expressa na Equao (2
20) supondo a igualdade de presses e temperaturas das fases a priori dada
simplesmente por:

Li ( T , p , x )= Si (T , p)

(3 1)

37
em que miL o potencial qumico do soluto na fase lquida e miS o potencial qumico
do soluto na fase slida. Desprezando-se os efeitos da presso sobre o clculo do
potencial qumico, hiptese comum a sistemas que no envolvam fase gasosa, temse que para um processo isotrmico no h variao do potencial qumico da fase
slida j que sua composio fixa; portanto, o potencial qumico do soluto na fase
lquida tambm no se altera em tal processo. Posto isto, conclui-se que mudanas
nas condies da fase lquida tais como variao de pH no alteram o potencial
qumico do soluto nesta fase.
A solubilidade de um soluto em fase lquida a concentrao de equilbrio deste
componente nesta fase. Assim, se a solubilidade do soluto for suficientemente
diminuta, para um processo isotrmico desprezando-se os efeitos da presso, podese adotar a considerao de uma soluo ideal segundo a lei de Henry e expressar
o potencial qumico deste soluto na fase lquida em termos de molalidade como:

Li (m)= 0i (m 0 )+RT ln

mi
m0i

(3 2)

em que:
m 0 =[0, 0, ... , 0, m0i =1, 0, ..., 0]

(3 3)

Sendo mi a molalidade do soluto na fase lquida, ou ainda a solubilidade do soluto


em termos de molalidade; e, mi0(m0) o potencial qumico de referncia do soluto. Este
estado de referncia escolhido o estado de referncia de uma soluo ideal de
concentrao unitria, ou seja, uma soluo hipottica na qual o soluto tem uma
molalidade mi0 = 1,0 mol kg-1, mas experimenta as mesmas interaes que se
estivesse em uma soluo a infinita diluio.
Quando o soluto uma protena, outros pormenores devem ser levados em conta. A
molcula de protena um polieletrlito biolgico e, sendo assim, esta se ioniza em
soluo aquosa. Isto se deve ao fato de que alguns aminocidos que compem a
protena tm grupos polares que participam de equilbrios qumicos com o on H+.
Para grupos alcalinos, o equilbrio de ionizao :
NH +3 NH 2+H+

(3 4)

Todavia, para grupos cidos, o equilbrio de ionizao :


COOH COO-+H+

(3 5)

38
A partir destes equilbrios qumicos possvel notar que as molculas de protena
em uma soluo tm diferentes estados de protonao, e, portanto, distintos valores
de carga eltrica. Porm, a solubilidade determinada experimentalmente a soma
da concentrao de todas as molculas de protenas.
Sendo a fase slida composta apenas por protena e sendo uma fase em equilbrio
estvel, pelo princpio de eletroneutralidade nela deve haver somente molculas
eletricamente neutras. Isto significa que o equilbrio de fases se estabelece apenas
entre molculas de protena eletricamente neutras. Logo, a Equao (3 2) no
vlida para qualquer molcula de protena, mas apenas e to-somente para as
molculas de protena eletricamente neutras. E, por conseqncia do critrio de
equilbrio de fases expresso na Equao (3 1), a molalidade das molculas de
protena eletricamente neutras na fase lquida deve permanecer inalterada com a
variao do pH da soluo. A molalidade destas molculas uma frao da
solubilidade da protena nesta soluo. Assim pode-se escrever:
m 0 = 0 (pH )S (pH)

(3 6)

em que m0 a molalidade das molculas de protena eletricamente neutras da fase


lquida, f0 a frao de molculas de protena eletricamente neutras da fase lquida
e S a solubilidade da protena na fase lquida. Contudo, conforme afirmado
anteriormente, m0 deve ser constante com a variao do pH, assim ao se aplicar a
Equao (3 6) no ponto isoeltrico, pode-se escrever que:
m 0 = 0( pI ) S( pI )

(3 7)

Logo, pela simples comparao entre as Equaes (3 6) e (3 7), chega-se


seguinte relao:
S( pH)=

0( pI )S (pI )
0( pH )

(3 8)

A Equao (3 8) descreve a curva de solubilidade de uma dada protena em


soluo em funo do pH. Apesar de ser uma equao simples, resta ainda a
dificuldade de se calcular a frao de molculas de protena eletricamente neutras
na fase lquida.

39
3.2.1 Clculo da frao de protena eletricamente neutra

Para o clculo da frao de molculas de protena eletricamente neutras


indispensvel considerar que todos os resduos efetivamente ionizveis da protena,
inclusive os grupos amina e cido carboxlico terminais, podem estar eletricamente
carregados ou no devido aos equilbrios qumicos expressos nas Equaes (3 4)
e (3 5). Sendo n o nmero total de resduos ionizveis de uma dada protena, o
nmero de estados de ionizao possveis, y, :
n

()

n!
= n =2n
=0 ( n )! ! =0

(3 9)

Dentre estes estados, alguns representam molculas de protena cuja carga total
seja nula. A carga de uma molcula de protena dada pela soma da carga
individual de cada resduo j em um dado estado de ionizao k:
n

c k = jk

(3 10)

j =1

em que ejk a carga individual de cada resduo j em um dado estado de ionizao k


e pode ser expressa como:

jk =

1, para grupos cidos carregados


0, para quaisquer grupos neutros
+1, para grupos bsicos carregados

(3 11)

Considerando que a equao de Henderson-Hasselbach vlida para cada grupo j


e que o equilbrio qumico estabelecido entre o grupo j e o on H+ independente de
qualquer outro equilbrio qumico desta natureza que ocorra nesta mesma molcula
de protena, tem-se que a frao ionizada deste grupo j dada por:

j ( pH)=

1
pH pK
1+10

Aj

)[

( 1+ j ) ( j 1) pH pK

10
2
2

Aj

(3 12)

em que pKAj o co-logaritmo decimal da constante de equilbrio qumico do grupo j e

nj o estado carregado do grupo j (-1, para grupos cidos e, +1, para grupos
alcalinos).
Assim, a frao de molculas de uma dada protena em um dado estado de
ionizao k dada pelo produtrio da frao do grupo j com a carga especfica

40
associada ao estado de ionizao k:
n

k (pH )= 'j ( pH)

(3 13)

i=1

Sendo que:

'j ( pH)=

j ( pH) , se jk 0
1 j ( pH ), se jk =0

(3 14)

Logo, substituindo a Equao (3 12) na Equao (3 14) e a resultante na


Equao (3 13), ter-se- que a frao de molculas de protena eletricamente
neutras em um dado estado de ionizao k dada simplesmente por:
n

k (pH )=
j=1

{(

1
1+10pH pK

Aj

)[(

1+ j
1
jk 10pH pK j
jk
2
2
Aj

)]}

(3 15)

Sujeita seguinte restrio de eletroneutralidade:


n

jk =0

(3 16)

j=1

Apesar de a frao de molculas de protena eletricamente neutras de um dado


estado de ionizao k depender do pH, a razo entre esta frao e a frao de
molculas de protena eletricamente neutras em outro estado de ionizao qualquer
l no depende do pH. Pode-se demonstrar por argumentos de equilbrio qumicos
entre molculas eletricamente neutras em diferentes estados de ionizao que esta
razo dada por (FRANCO; PESSA FILHO, 2011) :
log

k (pH ) n
= pK Aj ( jk jl )
l ( pH ) j =1

(3 17)

Assim, indiferente qual estado de ionizao que resulte em uma molcula


eletricamente neutra de protena utilizado para efetuar o clculo da Equao (3
8). Combinando as Equaes (3 8) e (3 15), tem-se que a curva de solubilidade
de uma dada protena em funo do pH dada por:

S( pH)=S ( pI)
j =1

pH pK Aj

1+10
pIpK
1+10

Aj

[(
)
[(

)
)

(
(

1+ j
1
jk 10 pIpK j
jk
2
2
Aj

)]
)]

1+ j
1
jk 10 pHpK j
jk
2
2
Aj

(3 18)

41
para qualquer estado de ionizao k que respeite a restrio imposta na Equao (3
16). Basicamente a Equao (3 18) uma expresso para a predio da curva
de solubilidade de uma dada protena em funo do pH da soluo e requer como
parmetros apenas a solubilidade no ponto isoeltrico e informaes a respeito da
estrutura primria da protena, ou seja, a seqncia de aminocidos que a compe e
as respectivas constantes de equilbrio de ionizao. Isto torna esta abordagem
extremamente relevante e de fcil aplicao.

3.2.2 Extenso teoria de Linderstrm-Lang e Grnwall

fato que as primeiras tentativas de se prever a curva de solubilidade de uma


protena, em funo seja do pH seja da concentrao de agente precipitante, datam
da primeira metade do sculo passado, quando ainda muito poucas informaes
estruturais sobre protenas eram conhecidas. Ainda assim, clebres trabalhos como
o de Cohn (1925) e o de Green (1931) so ainda hoje referncias abundantemente
citadas e prepararam de certo modo o caminho trilhado neste quase um sculo de
dedicao pesquisa sobre a fsico-qumica de sistemas proticos. Infelizmente
alguns trabalhos de no menor importncia ficaram esquecidos. Este o caso do
trabalho de Grnwall (1941). Neste trabalho Grnwall atribui a Linderstrm-Lang o
desenvolvimento de uma teoria para o clculo da solubilidade de protenas em
funo do pH atravs da integrao do perfil de carga lquida da protena em funo
do pH.
As hipteses desta teoria apresentada por Grnwall (1941) so: i) o equilbrio slidolquido se estabelece com as molculas eletricamente neutras de protena em
soluo; ii) a variao do pH da soluo no altera a atividade das molculas
eletricamente neutras de protena em soluo.
Assim, poder-se-ia reconstituir a formulao de Linderstrm-Lang e Grnwall
partindo do seguinte equilbrio entre uma molcula de protena eletricamente neutra
e uma molcula ionizada em um dado estado de ionizao k com uma carga total c:
P 0 +cH + P+c
k

cuja relao de equilbrio dada por:

(3 19)

42
K k=

aP

+c
k

a P a cH

(3 20)
+

em que Kk a constante de equilbrio referente a Equao qumica (3 19), aPk a


atividade da molcula de protena de carga total c em um estado de ionizao k, aP0
a atividade da molcula de protena eletricamente neutra e aH+ a atividade do on
H+. Todavia, a atividade de um componente o produto entre sua concentrao e o
coeficiente de atividade deste componente (g) Equao (2 24). Assim, a
molalidade da molcula de protena com carga total c e em um estado de ionizao
k dada por:
c

aP a H
m k =K k
k

(3 21)

J a solubilidade da protena a soma das concentraes de todos os estados de


ionizao possveis, mesmo de cargas totais distintas:
a P a cH
S= m k = K k
k

(3 22)

k =1

k =1

Derivando a Equao (3 22) com respeito atividade do on H+ e assumindo que a


atividade da molcula de protena eletricamente neutra permanece constante:
dS
=a P
daH
+

ca
k =1

c 1
H+

Kk
k a P

a cH
k =1

Kk d k
2k d a H

(3 23)
+

O segundo termo do lado direito da Equao (3 23) pode ser simplificado do


seguinte modo:

aP

k =1

c
H+

Kk d k
=a P
2k d a H
+

a
k =1

c
H+

K k d ln k
d ln k
k d a = m k d a
k =1
H
H
+

(3 24)

Considerando que os coeficientes de atividade da gua e do on H+ so constantes a


Equao (3 24) deve ser nula para que a equao de Gibbs-Duhem seja satisfeita
(uma deduo para a equao de Gibbs-Duhem est apresentada no seo 2.2 do
segundo captulo). Assim, a Equao (3 23) pode ser reescrita como:

( )

a
d ln S
= H
S
d ln a H
+

K
c a cH kk

d S k =1
=
d aH
+

k =1

c
+
H

Kk
k

c mk

= k =1

mk
k =1

=c

(3 25)

43
em que

c a carga mdia das molculas de protena conforme proposta de

Linderstrm-Lang (1924). Reescrevendo a Equao (3 25) em termos de pH:


d log S
=c
d pH

(3 26)

A Equao (3 26) descreve a curva de solubilidade da protena em funo do pH


pela integrao da carga mdia da protena. Esta equao foi primeiramente
derivada por Grnwall (1941). Entretanto, o nico mtodo de aplicao desta
equao encontrado na literatura era realizado pela aproximao linear do perfil de
carga na regio do ponto isoeltrico e a integrao da reta resultante. Contudo,
pode-se relacionar a carga mdia da protena com as informaes da estrutura
primria da mesma atravs da seguinte equao:
n

c ( pH)= j j ( pH )

(3 27)

j=1

Inserindo a Equao (3 12) na Equao (3 27), tem-se que:


n

1
1
c ( pH)=
2 j=1 1+10 pH pK

Aj

[ 1+

(1 j ) 10pH pK

Aj

(3 28)

Logo, substituindo a Equao (3 28) na Equao (3 26):


n

d log S
1
1
=
d pH
2 j=1 1+10 pHpK

Aj

[ 1+

(1 j ) 10pH pK

Aj

(3 29)

A Equao (3 29) pode ser integrada de um pH de referncia at o pH no qual se


deseja calcular a solubilidade da protena. Tomando como pH de referncia o ponto
isoeltrico, pI:
log S(pH )

log S(pI)

pH

1
d log S=
2 pI

{(
n

j =1

1
1+10pH pK

Aj

[ 1+

(1 j )10pH pK

Aj

d pH

(3 30)

Fazendo a integrao como apresentado no Apndice A, chega-se a:


n

[ (

S ( pH)
1+10 pHpK
log
= log
S (pI ) j =1
1+10pIpK

Aj

Aj

(1+ j )
( pHpI )
2

(3 31)

Ou ainda:
n

log

[ (

S ( pH)
1+10 pH pK
=n+( pI pH )+ log
S (pI )
1+10 pIpK
j =1

Aj

Aj

)]

(3 32)

44
em que n+ o nmero total de grupos alcalinos na molcula de protena.
A Equao (3 32) relaciona a solubilidade da protena com a variao do pH da
soluo. A prxima subseo dedicada a provar que tanto a Equao (3 18)
quanto a Equao (3 32) so equivalentes.

3.2.3 Equivalncia entre as duas abordagens

Apesar das formulaes aparentemente distintas, tanto a integrao do perfil de


carga mdia da protena quanto o desenvolvimento exposto em 3.2.1 so anlogos.
Ao se tomar o logaritmo decimal da Equao (3 18), tem-se que:
log

S ( pH) n
1+10pH pK
= log
S ( pI ) j=1
1+10 pI pK

...+ log
j=1

[(
[(

Aj

Aj

)
)

+...

(
(

1+ j
1
jk 10 pIpK j
jk
2
2
Aj

)]
)]

1+ j
1
jk 10pH pK j
jk
2
2
Aj

(3 33)

Pelo bem da simplicidade, definir-se-o duas funes:

j ( pH)=log

jk ( pH )=log

1+10pH pK
1+10pI pK

Aj

Aj

[(
[(

)
)
)

(3 34)

(
(

1+ j
1
jk 10pIpK j
jk
2
2
Aj

)]
)]

1+ j
1
jk 10pH pK j
jk
2
2
Aj

(3 35)

Fica evidente pela observao das Equaes (3 34) e (3 35) que a funo hj no
depende do estado de ionizao k, enquanto a funo qjk depende. Assim, pode-se
analisar cada possibilidade. Esta anlise da funo e qjk est na Tabela 3.1.

45

nj
-1
-1
+1
+1

ejk
-1
0
+1
0

Tabela 3.1 - Anlise da funo qjk.


qjk
pI - pH
0
0
pI - pH

Nmero de resduos
nA
nB
nC
nD

Pela Tabela 3.1, possvel inferir que a Equao (3 33) pode ser escrita como:
log

n
S ( pH)
=(n A +nD )( pIpH )+ j ( pH)
S (pI )
j =1

(3 36)

Entretanto, a Equao (3 36) deve tambm satisfazer a restrio expressa na


Equao (3 16), assim:
n

jk =0 n A=nC

(3 37)

j=1

Portanto, de acordo com a restrio de eletroneutralidade advinda da Equao (3


37), tem-se que:
(n A +n D)=(n C +nD )=n+

(3 38)

Logo, a Equao (3 36) respeitando a restrio de eletroneutralidade pode ser


escrita como:
n
S ( pH)
log
=n+( pI pH )+ j ( pH)
S (pI )
j =1

(3 39)

Assim fica provada a identidade entre as Equaes (3 18) e (3 32).

3.3 Resultados e Discusses

3.3.1 Solubilidade da insulina em funo do pH e da temperatura

A Tabela 3.2 apresenta os valores de pKA dos grupos ionizveis da insulina humana
para o clculo da curva de solubilidade desta protena em funo do pH de acordo
com a Equao (3 32). H na Tabela 3.2 dois conjuntos de valores de pKA: um
chamado isolado que o valor do pKA do aminocido livre obtido pela titulao

46
potenciomtrica do aminocido, e outro que o valor do pKA na cadeia protica e
obtido pela titulao potenciomtrica da protena.
Tabela 3.2 - Valores de pKA dos grupos ionizveis da insulina humana.
Aminocido
Grupo
Nmero
pKA(isolado)a
pKA(cadeia)b
Gly

-NH2 (terminal)

9,80

7,38

Glu

-COOH

4,30

4,37

Tyr

Fenol-OH

10,90

10,20

Asn

-COOH (terminal)

2,00

3,45

Phe

-NH2 (terminal)

910

7,38

His

Imidazol-NH2

6,00

5,98

Arg

Guanidina-NH2

12,50

11,10

Lys

-NH2

10,80

8,52

Ala

-COOH (terminal)

2,30

3,45

Stryer (1995).

Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990).

De fato, os dados que sero correlacionados aqui so de insulina suna; entretanto,


a diferena entre a insulina suna e a insulina humana de apenas um aminocido
em termos de estrutura primria, logo bastante razovel considerar que os valores
de pKA na cadeia da insulina humana so praticamente iguais aos valores do pKA na
cadeia da insulina suna.
O cdigo-fonte do programa de clculo dos diversos estados de ionizao bem
como do clculo da curva de solubilidade est apresentado no Apndice B.
Como a insulina possui ao todo 16 grupos ionizveis, o nmero de estados de
ionizao possveis : y = 65536. Destes, 8008 estados tem carga nula. A frao
total , pois, a soma das fraes destes 8008 estados cuja carga total seja nula. Na
Figura 3.1, ilustra-se a estrutura primria da insulina suna destacando-se os grupos
ionizveis e a distribuio de carga da molcula eletricamente neutra cuja frao
preponderante. Deve-se notar que o estado de ionizao correspondente a molcula
eletricamente neutra que prepondera aquele no qual h maior possibilidade de
resduos eletricamente carregados que ainda resultam em uma molcula neutra,
exceo da tirosina (Tyr), estarem carregados positiva ou negativamente nesta
configurao.

47

Figura 3.1 - Estrutura primria da insulina suna: seqncia de aminocidos e pontes de


dissulfeto. Grupos ionizveis em negrito e distribuio de carga da configurao neutra
correspondente ao estado de ionizao preponderante.

Na Figura 3.2, so apresentadas as curvas de frao de molculas de insulina


eletricamente neutras em funo do pH na regio do ponto isoeltrico. H neste
grfico duas curvas: uma que a soma de todas as fraes neutras, chamada
frao total; e, outra que representa o estado de ionizao neutro preponderante da
insulina.

0,6
0,5
0,4

0,3
0,2
0,1
0,0
4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

pH
Figura 3.2 - Frao de molculas eletricamente neutras de
insulina em funo do pH. Dados de pKA de Kaarsholm; Havelung
e Hougaard (1990). Linha contnua, frao total. Linha pontilhada,
frao preponderante.

48
Observa-se pela Figura 3.2 que as fraes de molculas de protena eletricamente
neutras alcanam um ponto mximo exatamente no ponto isoeltrico, ponto este que
pode ser definido como pH no qual a carga lquida mdia das molculas de protena
nula. Ou seja, o ponto mximo da frao de molculas neutras corresponde ao
ponto de mnima solubilidade.
J as Figuras 3.3, 3.4 e 3.5 apresentam o resultado da modelagem para trs
diferentes temperaturas para a curva de solubilidade da insulina suna em funo do
pH. Comparam-se o modelo proposto calculado com diferentes valores de pKA
valores de pKA isolados; e, valores de pKA na cadeia com o modelo proposto por
Tashima et al. (2009).

32,0
28,0

20,0

Solubilidade x 10 / mol.kg

-1

24,0

16,0
12,0
8,0
4,0
0,0
4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

pH

Figura 3.3 - Solubilidade da insulina suna em funo do pH a


278,2 K em 10,0 mM NaHCO3. Dados experimentais (), Tashima et
al., (2009). Modelo proposto com valores de pKA de Kaarsholm;
Havelung e Hougaard (1990), linha contnua; com valores de pKA
de Stryer (1995), linha pontilhada. Modelo de Tashima et al.
(2009), linha semi-contnua.

49

28,0

20,0

16,0

Solubilidade x 10 / mol.kg

-1

24,0

12,0

8,0

4,0

0,0
4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

pH

Figura 3.4 - Solubilidade da insulina suna em funo do pH a


288,2 K em 10,0 mM NaHCO3. Dados experimentais (), Tashima et
al., (2009). Modelo proposto com valores de pKA de Kaarsholm;
Havelung e Hougaard (1990), linha contnua; com valores de pKA
de Stryer (1995), linha pontilhada. Modelo de Tashima et al.
(2009), linha semi-contnua.

15,0

9,0

Solubilidade x 10 / mol.kg

-1

12,0

6,0

3,0

0,0
4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

pH

Figura 3.5 - Solubilidade da insulina suna em funo do pH a


298,2 K em 10,0 mM NaHCO3. Dados experimentais (), Tashima et
al., (2009). Modelo proposto com valores de pKA de Kaarsholm;
Havelung e Hougaard (1990), linha contnua; com valores de pKA
de Stryer (1995), linha pontilhada. Modelo de Tashima et al.
(2009), linha semi-contnua.

50
Deve-se notar que a validade do modelo restrita a regio prxima ao ponto
isoeltrico; j que para valores de pH distantes deste ponto a curva de frao de
molculas neutras tende a zero, resultando pela Equao (3 8) em uma
solubilidade infinita que fisicamente inverossmil.
Para uma anlise comparativa mais elaborada entre os modelos, um critrio
quantitativo necessrio. No entanto, a escolha de um critrio arbitrria e, por
isso, um tanto quanto subjetiva, mas mesmo assim este deve permitir uma
comparao equitativa entre os modelos. Aqui o critrio escolhido o seguinte:

calc
N
S exp
1
i S i
CQ=100
Sexp
N i =1
i

(3 40)

em que N o nmero de pontos experimentais a uma dada temperatura.


Da forma como foi definido, o critrio quantitativo (CQ) adimensional e mede o
desvio quadrtico entre o valor da solubilidade experimental (Siexp) e o valor da
solubilidade calculado por um dado modelo (Sicalc) ponderando este desvio pelo
inverso do quadrado do valor experimental da solubilidade. Este critrio
interessante no caso em tela, pois dado o formato da curva de solubilidade de
protenas em funo do pH, os pontos em valores de pH um pouco mais distantes
do ponto isoeltrico mas ainda dentro da regio de validade do modelo podem
ser at uma ordem de grandeza maior do que os pontos prximos ao pI. Para de
certa forma normalizar estes desvios que o critrio quantitativo foi definido assim
de modo a atribuir menores pesos a valores de solubilidade absolutos maiores.
Como h dados a diferentes temperaturas, pode-se estender o critrio quantitativo
de modo a avaliar globalmente a eficincia dos modelos na correlao dos dados
experimentais. Uma possibilidade de extenso que aqui ser utilizada a seguinte:

Nj

exp

calc

M
S ij S ij
1
1
CQG=100

M j N j i =1
Sexp
ij

)]
2

(3 41)

em que M nmero total de conjuntos de dados e j refere-se a um dado conjunto de


dados a uma dada temperatura.
A Tabela 3.3 apresenta os valores obtidos do CQ e do CQG para os modelos
aplicados aos sistemas contendo insulina.

51
Tabela 3.3 - Valores de CQ [Equao (3 40)] e CQG [Equao (3 41)] entre os modelos
aplicados e os dados experimentais de solubilidade de insulina suna a diferentes
temperaturas.
Modelo proposto com
Modelo proposto com
valores de pKA de
Modelo de Tashima et
T/K
valores de pKA de
Kaarsholm; Havelung
al. (2009)
Stryer (1995).
e Hougaard (1990)
278,2

25,1 %

32,5 %

26,7 %

288,2

19,8 %

27,8 %

26,9 %

298,2

27,4 %

23,9 %

15,4 %

Global

24,3 %

28,3 %

23,6 %

Pela Tabela 3.3 possvel afirmar que a abordagem aqui proposta to eficaz na
correlao dos dados experimentais de solubilidade de insulina suna quanto o
modelo de Tashima et al. (2009), no entanto, no exigiu nenhum ajuste de
parmetros. Outra importante meno deve ser feita no tangente a escolha do
conjunto de dados de pKA na execuo do clculo: embora os valores de pKA na
cadeia resultem em uma melhor descrio do fenmeno, no h perda siginificativa
de preciso ao se utilizarem os dados de pKA de aminocidos isolados. Esse
resultado muito importante, porque rarssimos so os dados completos de pKA em
uma dada cadeia protica.
Alm da insulina suna que foi bastante bem correlacionada pelo modelo proposto,
ao menos na regio do ponto isoeltrico, h dados na literatura de solubilidade de
trs tipos de insulina mutante. Este dados foram publicados por Kaarsholm;
Havelung e Hougaard (1990) junto aos valores de pKA ajustados a partir da curva de
titulao potenciomtrica de cada tipo de insulina mutante.
A Tabela 3.4 apresenta os valores de pKA para estes trs tipos de insulina mutante.
Nesta tabela tambm so apresentados os nmeros de resduos que se ionizam na
forma catinica, esses nmeros so aqueles que corresponderam ao melhor ajuste
da Equao (3 32) aos dados de solubilidade das insulinas mutantes. Apesar dos
autores (KAARSHOLM; HAVELUNG; HOUGAARD, 1990) terem feito uma discusso
a respeito da determinao dos valores de pKA atravs do ajuste da curva de
titulao potenciomtrica de cada protena mutante, no fica claro qual resduo
especfico possui aquele valor de pKA. Portanto, no to trivial especificar o
nmero de resduos que se ionizam na forma catinica, at porque as formas
mutantes podem ter estruturas tercirias distintas da insulina nativa o que favorece a
blindagem de alguns resduos antes expostos ao solvente.

52
Tabela 3.4 - Valores de pKA e de nmero de resduo que se ionizam como ctions (n+) para
insulinas mutantes. Dados de Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990).
B13-GluGln
B9-SerAsp
B25-PheHis
Grupos
N
pKA
n+
N
pKA
n+
N
pKA
n+
1

3,40

3,52

4,66

6,85

3,63

4,28

3,99

5,56

4,74

7,85

6,82

6,18

9,33

7,05

7,24

9,83

8,23

7,61

11,23

9,74

8,62

10,12

10,00

11,00

11,03

A Figura 3.6 apresenta os resultados para a insulina mutante B13-GluGln.

100,0

% protena em soluo

80,0

60,0

40,0

20,0

0,0
3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

pH

Figura 3.6 - Curva de solubilidade da insulina mutante B13GluGln em funo do pH em 0,1 M KCl a 23 oC. Dados
experimentais (), Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990).
Equao (3 - 32), linha contnua.

As Figuras 3.7 e 3.8 apresentam os resultados para as insulinas mutantes B9SerAsp e B25-PheHis, respectivamente.

53

100,0

% protena em soluo

80,0

60,0

40,0

20,0

0,0
3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

pH

Figura 3.7 - Curva de solubilidade da insulina mutante B9SerAsp em funo do pH em 0,1 M KCl a 23 oC. Dados
experimentais (), Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990).
Equao (3 - 32), linha contnua.

100,0

% protena em soluo

80,0

60,0

40,0

20,0

0,0
3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

pH

Figura 3.8 - Curva de solubilidade da insulina mutante B25PheHis em funo do pH em 0,1 M KCl a 23 oC. Dados
experimentais (), Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990).
Equao (3 - 32), linha contnua.

54
H uma primeira observao que deve ser feita: a mudana de apenas um resduo
na cadeia protica j produz efeitos notveis tais como a mudana do ponto
isoeltrico e o formato da curva de solubilidade. Dessarte possvel imaginar que
uma pequena mudana da estrutura primria pode causar alteraes significativas
na estrutura terciria da protena a ponto de alterar o acesso do solvente a um
determinado resduo, isso fica evidente ao se compararem os valores de pKA da
insulina nativa e suas respectivas mutantes.
Alm disso, importante notar que o modelo aqui proposto foi bastante exitoso tanto
na correlao dos dados da insulina suna quanto nos dados das insulinas mutantes.
Observam-se porm duas importantes constataes: se por um lado no caso da
insulina mutante B13-GluGln o modelo menos preciso na regio acima do ponto
isoeltrico, por outro no caso da mutante B25-PheHis o modelo menos preciso
na regio abaixo do ponto isoeltrico. Provavelmente isso se deve aos erros
associados a determinao dos valores de pKA. Um modo de contornar esse
problema ajustar o valor de pKA de um dos grupos. Aqui isso no ser feito, pois
no pertence ao escopo deste trabalho o ajuste de curvas, mas sim a proposio de
um modelo e a verificao de suas limitaes ao contrast-lo aos dados
experimentais.
H que se explicar que a ordenada dos grficos expostos nas Figuras 3.6, 3.7 e 3.8
no correspondem propriamente a solubilidade, mas sim a porcentagem de protena
em soluo, que relativa a quantidade de protena inicialmente colocada no
sistema no experimento de determinao de solubilidade. Assim, os patamares
observados em valores de pH distantes do ponto isoeltrico e correspondentes a
100 % de protena em soluo no esto relacionados a solubilidade naquele valor
de pH, significam apenas que toda a protena introduzida ao sistema foi solubilizada,
mas essa concentrao no corresponde a concentrao de equilbrio para essa
protena nesse pH.

3.3.2 Solubilidade da b-lactoglobulina em funo do pH e da fora inica

A Tabela 3.5 apresenta os dados de pKA isolados para a molcula de blactoglobulina bovina. E a Figura 3.9 apresenta o resultado da modelagem das

55
curvas de solubilidade da b-lactoglobulina bovina em funo do pH para quatro
diferentes valores de concentrao de cloreto de sdio. Observa-se que apesar do
aumento da fora inica o modelo consegue descrever com grande preciso as
curvas de solubilidade. H que se dizer que os dados de pKA isolados no
reproduzem o valor experimental do ponto isoeltrico; deste modo, ajustou-se o
valor do pKA dos cidos glutmicos para efetuar o clculo da curva de solubilidade.
O valor ajustado foi de 5,14. A diferena entre o valor relatado na literatura e o
ajustado da mesma ordem de magnitude que as diferenas entre os valores de
pKA de aminocidos isolados e na cadeia de insulina.

Tabela 3.5 - Valores de pKA dos grupos ionizveis da -lactoglobulina bovina.


Aminocido

Grupo

Nmero

pKA(isolado)a

Leu

-NH2 (terminal)

9,60

Glu

-COOH

16

4,25

Tyr

Fenol-OH

10,07

Cys

b-SH

8,18

His

Imidazol-NH2

6,00

Arg

Guanidina-NH2

12,48

Asp

b-COOH

11

3,65

Lys

-NH2

15

10,53

Ile

-COOH (terminal)

2,36

Cox e Nelson (2003).

Pela Figura 3.9 possvel observar que o modelo descrito pela Equao (3 32) foi
bastante eficiente na representao das curvas de solubilidade da b-lactoglobulina
nas diferentes concentraes de cloreto de sdio.
H que se mencionar que as curvas apresentadas na Figura 3.9 representam
tambm um fenmeno aqui ainda no discutido e que ser objeto de um breve
estudo na captulo cinco: o efeito da concentrao de sal na solubilidade da
protena. Claramente, no caso destas curvas v-se que o aumento da concentrao
de sal implicou no aumento da solubilidade da protena, logo estas curvas se
localizam na regio se salting-in do diagrama de fases da b-lactoglobulina.

56

5,0

Solubilidade / g.L

-1

4,0

3,0

2,0

1,0

0,0
4,5

4,8

5,1

5,4

5,7

6,0

pH

Figura 3.9 - Solubilidade da -lactoglobulina bovina em soluo


aquosa contendo NaCl a 298,2 K. Dados experimentais (Grnwall,
1941): 0,001 mol L-1 NaCl (); 0,005 mol L-1 NaCl (); 0,01 mol L-1
NaCl (); 0,02 mol L-1 NaCl (). Modelagem: linha contnua, 0,001
mol L-1; linha pontilhada, 0,005 mol L-1; linha semi-contnua, 0,01
mol L-1; linha com travesses, 0,02 mol L-1.

Outra importante observao que o incremento do agente precipitante, o cloreto de


sdio neste caso, no alterou nem o ponto isoeltrico nem o formato da curva de
solubilidade significativamente indicando que sua atuao reside apenas na
mudana da interao entre a molcula de protena e o solvente, mas no em um
equilbrio qumico entre algum resduo da cadeia protica e um on salino. Assim, no
clculo da Equao (3 32) apenas a solubilidade do ponto isoeltrico alterada.

57

4 No-idealidade de solues de aminocidos e compostos b-lactmicos

Erst kommt das Fressen, dann die Moral.


(Bertolt Brecht, in Dreigroschenoper)

4.1 Introduo

Ao se modelar as curvas de solubilidade de aminocidos ou compostos b-lactmicos


em funo do pH, o aspecto mais importante a modelagem da fase lquida, j que
a fase slida pode ser considerada nica e constituda apenas por molculas de
soluto. Uma questo especfica envolvendo aminocidos devido ao fato de eles se
dissociarem em soluo aquosa, de modo que um nico aminocido pode ser
encontrado em trs diferentes estados: como um ction, como um nion e como um
zwitterion (a espcie neutra no-polar virtualmente inexistente em soluo). Dada
a diferena de ordens de grandeza entre a solubilidade no ponto isoeltrico e a
solubilidade em outros valores de pH, pode ser necessria em certos sistemas a
considerao de no-idealidade da soluo. Muitas estratgias tm sido propostas
para calcular os coeficientes de atividade de aminocidos na fase lquida: atravs da
equao de Poisson-Boltzmann (KIRKWOOD, 1934), atravs de modelos de energia
livre de Gibbs excedente (NASS, 1998; CHEN; ZHU; EVANS, 1989; RODRGUEZRAPOSO; FERNNDEZ-MRIDA; ESTESO, 1994; KHOSHKBARCHI; VERA,
1996b; PRADHAN; VERA, 1998; XU; PINHO; MACEDO, 2004 e TSENG et al.,
2009), atravs de modelos de contribuio de grupos (GUPTA; HEIDEMANN, 1990 e
PINHO; SILVA; MACEDO, 1994), atravs de abordagens via termodinmica
estatstica (KHOSHKBARCHI; VERA, 1996c) e atravs de equaes volumtricas de
estado (PARK; YOO; LEE, 2003; FUCHS et al., 2006 e SEYFI et al., 2009).
O primeiro modelo, pelo mais que se sabe, a predizer a curva de solubilidade de um
aminocido em funo do pH foi baseado inteiramente em consideraes sobre
dissociao qumica (HITCHCOCK, 1924), sem considerar a no-idealidade da fase
lquida. Nesse trabalho, a curva de solubilidade da tirosina em soluo aquosa em
funo do pH foi calculada com grande preciso quando comparada aos dados

58
experimentais. O trabalho de Kirkwood (1934) est entre um dos primeiros
dedicados modelagem de solues zwitterinicas. A abordagem foi baseada na
soluo analtica da equao linearizada de Poisson-Boltzmann considerando as
trs direes do operador laplaciano para um zwitterion esfrico2. O autor obteve
uma expresso que relaciona o logaritmo do coeficiente de atividade de um on a
uma srie matemtica; o primeiro termo desta srie anlogo teoria de DebyeHckel, sendo nulo para zwitterions, porque eles no tm carga. Com algumas
simplificaes, o autor tambm mostrou a aplicao desta abordagem para um
zwitterion elipsoidal (KIRKWOOD, 1939).
Nass (1988) modelou a solubilidade de aminocidos em funo do pH assumindo
que a energia livre de Gibbs excedente dada pela soma de uma contribuio
qumica e uma fsica. A contribuio qumica foi calculada atravs de consideraes
sobre a dissociao dos aminocidos, de equaes de balano material e de
condies de equilbrio de fases, enquanto a contribuio fsica foi calculada pela
equao de Wilson (WILSON, 1964) para a mistura binria de gua e aminocido.
Embora os dados experimentais tenham sido bem correlacionados pelo modelo
proposto, o nmero de parmetros ajustveis pode ser muito alto at dez
parmetros foram usados para correlacionar uma nica curva de solubilidade. Chen;
Zhu e Evans (1989) consideraram que a energia livre de Gibbs excedente pode ser
dividida em trs termos: dois deles relacionados a interaes de longo alcance,
videlicet um termo de Pitzer-Debye-Hckel e um termo de Born, e um para levar em
conta interaes de curto alcance, o modelo NRTL. Para o coeficiente de atividade
de zwitterions, a contribuio Pitzer-Debye-Hckel nula. Os autores mostraram
que os dados experimentais de solubilidade foram correlacionados satisfatoriamente
com apenas um ou dois parmetros ajustveis para cada componente.
O trabalho de Gupta e Heidemann (1990) lanou as bases da maioria dos trabalhos
que foram publicados a posteriori. A equao desenvolvida por eles, que relaciona a
dissociao qumica de aminocidos e a condio de equilbrio slido-lquido, tem
sido usada por quase todos os autores para quem esta a principal questo. A noidealidade de solues aquosas de aminocidos nativos e modificados foi calculada
atravs do modelo UNIFAC (do ingls: UNIversal Functional Activity Coefficient)
modificado de Larsen; Rasmussen e Fredenslund (1987) com novos grupos tais
2 Este o principal avano em relao teoria de Debye-Hckel e apresentada na seo 2.6 porque
considera de certa forma a anisotropia das interaes.

59
como glicina e prolina. Seguindo este trabalho, Pinho; Silva e Macedo (1994)
propuseram um modelo UNIFAC combinado com um termo de Debye-Hckel para
calcular os coeficientes de atividade de aminocidos; estes autores modelaram a
solubilidade da glicina em funo do pH em acordo com os dados experimentais.
Entretanto, alguns autores questionam a introduo do termo de Debye-Hckel
neste caso (KHOSHKBARCHI; VERA, 1996b, 1996c). Rodrguez-Raposo et al.
(1994) ajustaram coeficientes osmticos de glicina em soluo aquosa usando a
equao de Pitzer e calcularam o coeficiente de atividade da glicina em soluo
aquosa com excelente preciso quando comparados aos dados experimentais.
Khoshkbarchi e Vera (1996b), para calcular o coeficiente de atividade de
aminocidos em soluo contendo um eletrlito, dividiram a energia livre de Gibbs
excedente em contribuies de interaes de curto e longo alcances. Eles testaram
para a contribuio de interaes de longo alcance os modelos de Bromley
(BROMLEY, 1973) e o deles mesmos (KHOSHKBARCHI; VERA, 1996a), e para o
termo de curto alcance o modelo NRTL, cuja formulao est explicitada no captulo
2, e o modelo de Wilson (WILSON, 1994). Para qualquer modelo escolhido, foram
necessrios somente dois parmetros, e foi possvel correlacionar com preciso os
dados experimentais de sistemas binrios gua-aminocido e ternrios guaeletrlito-aminocido. Ainda que a equao bsica para a predio da solubilidade
de glicina em funo do pH usada por Khoshkbarchi e Vera (1996c) siga a
abordagem de Gupta e Heidemann (1990), eles introduziram o uso da teoria de
perturbao para calcular a no-idealidade de aminocidos em soluo aquosa.
Santana et al. (2010) mostraram que este modelo falha na predio quantitativa da
solubilidade do antibitico b-lactmico ampicilina, da DL-fenilglicina e do cido 6aminopenicilnico.
Pradhan e Vera (1998) usaram uma equao similar quela proposta por Gupta e
Heidemann (1990) e aplicaram a equao NRTL para o cmputo da no-idealidade
da fase lquida; assim, eles conseguiram calcular a solubilidade da DL-Alanina em
funo do pH em excelente acordo com os dados observados experimentalmente na
regio do ponto isoeltrico. Park; Yoo e Lee (2003) correlacionaram o coeficiente de
atividade da valina, do cido a-aminobutrico, da alanina, da glicina e da glicilglicina
em soluo aquosa pela aplicao da equao de estado de fluidos reticulados por
pontes de hidrognio sem considerar a dissociao qumica do aminocido na gua.
Xu; Pinho e Macedo (2004) propuseram uma modificao no modelo de Wilson para

60
calcular a energia livre excedente de Gibbs de solues de aminocidos. Eles
assumiram que todas as molculas de aminocidos esto na forma zwitterinica em
gua pura, o que de algum modo restringe a aplicao do modelo deles ao clculo
da solubilidade de aminocidos em valores de pH na regio prxima ao ponto
isoeltrico.
Usando a equao de estado PC-SAFT (do ingls: Perturbed-Chain Statistical
Associating Fluid Theory) e levando em conta a dissociao de aminocidos em
soluo, Fuchs et al. (2006) descreveram as curvas de solubilidade em funo do
pH para a glicina, para a DL-Alanina e para a DL-Metionina em soluo aquosa com
boa preciso quando comparadas aos dados experimentais. Do mesmo modo, Seyfi
et al. (2009), seguindo Gupta e Heidemann (1990) e aplicando a equao de estado
SAFT, predisseram a curva de solubilidade da DL-Metionina em funo do pH e da
temperatura com grande acurcia. Tseng et al. (2009) investigaram a solubilidade da
DL-Alanina, L-Leucina, L-Isoleucina, L-Serina e DL-Fenilalanina em funo do pH
em soluo aquosa. Considerando a dissociao de aminocidos em soluo
aquosa e usando o modelo NRTL, eles obtiveram resultados satisfatrios com dois
parmetros ajustados. Em suma, a reviso da literatura mostra que enquanto os
modelos diferem consideravelmente em suas formulaes do modelo do coeficiente
de atividade, o clculo do equilbrio cido-base permanece uma etapa crucial na
descrio da curva de solubilidade. A Tabela 4.1 apresenta um quadro-resumo no
intuito de mapear as diferentes estratgias para o clculo da no-idealidade de
solues contendo aminocidos.
Tabela 4.1 - Quadro-resumo de trabalhos sobre a no-idealidade de solues de aminocidos.
Equao de PoissonBoltzmann

Energia Livre de Gibbs


Excedente

Contribuio de Grupos

Kirkwood (1934)

Nass (1988)

Kirkwood (1939)

Chen; Zhu e Evans (1989) Pinho; Silva e Macedo


(1994)

Park; Yoo e Lee (2003)

Rodrguez-Raposo;
Fernndez-Mrida e
Esteso (1994)

Fuchs et al. (2006)

Khoshkbarchi e Vera
(1996a)

Seyfi et al. (2009)

Pradhan e Vera (1998)


Xu; Pinho e Macedo
(2004)
Tseng et al. (2009)

Gupta e Heidemann
(1990)

Termodinmica
Estatstica
Khoshkbarchi e Vera
(1996b)

61

4.2 Desenvolvimento terico

Do mesmo modo que foi feito para protenas no captulo anterior, para aminocidos
ao longo da curva de solubilidade vale a afirmao de que, com a variao do pH da
soluo, no se altera o potencial qumico da fase slida e, pelo critrio de equilbrio,
permanece inalterado o potencial qumico das molculas neutras de aminocido na
fase lquida. Supondo que a variao do potencial qumico de referncia desta
espcie na fase lquida seja desprezvel, a atividade das molculas eletricamente
neutras de aminocido deve ser constante com o pH:
a A ( pH)=constante

(4 1)

Assim, pode-se escrever que:


ln

(pI )
S A ( pH )
=ln A
+ln A ( pI)ln A ( pH)
S A ( pI )
A ( pH)
0

(4 2)

em que SA a solubilidade do aminocido, fA a frao de aminocido


eletricamente neutro e gA o coeficiente de atividade do aminocido eletricamente
neutro.
O clculo de fA exatamente anlogo ao clculo da frao de molculas de protena
eletricamente neutras exposto na subseo 3.2.1.

4.2.1 Clculo das fraes eletricamente neutras e carregadas

Considerando-se os seguintes equilbrios qumicos de ionizao de um aminocido


cujo grupo R seja apolar (na seo de resultados e discusses, seo 4.3,
apresentar-se- uma formulao para aminocidos cujo grupo R seja ionizvel) em
soluo aquosa:
NH +3 RCOO- NH 2 RCOO-+H +

(4 3)

NH +3 RCOOH NH +3 RCOO-+H +

(4 4)

e, suas respectivas constantes de equilbrio:

62
[NH 2 RCOO- ][H +]
K A1=
[NH +3 RCOO -]

(4 5)

[NH +3 RCOO - ][H+]


K A2 =
[NH +3 RCOOH ]

(4 6)

Sendo que as fraes das formas ionizadas dos aminocidos so dadas pela
equao de Henderson-Hasselbach:
10pH pK
1 ( pH )=
pH pK
1+10
A1

+1 ( pH )=

1
1+10pH pK

(4 7)
A1

A2

(4 8)

Assim, tem-se que as fraes de cada uma das espcies de aminocido em soluo
bem como suas respectivas cargas lquidas c so dadas por:

1 (pH)= 1 (pH )[1 +1 ( pH)], c =1

(4 9)

+1 ( pH)=[1 1 ( pH)] +1 ( pH) , c =+1

(4 10)

0 (pH)=[1 1 ( pH)][1 +1 ( pH )], c=0

(4 11)

zwitt (pH)= 1 (pH ) +1 (pH ), c=0

(4 12)

Uma observao importante que, assim como para protenas, a razo entre duas
fraes de configuraes de molculas eletricamente neutras distintas invarivel
com pH, logo indiferente qual configurao de molculas eletricamente neutras se
utiliza na Equao (4 2). Obviamente, a forma zwitterinica muito mais comum, e
sua utilizao evita problemas numricos. Para ilustrar isto, considere-se um
aminocido hipottico para o qual os valores de pKA1, pKA2 e pI sejam
respectivamente: 2,35; 9,87 e 6,11. Para este aminocido, no ponto isoeltrico, a
frao de molculas na forma zwitterinica ser de 0,9997 enquanto a frao de
molculas neutras na forma no-zwitterinica ser de 3,019 x 10-8. Ou seja, ao se
executar o clculo da solubilidade com a forma neutra no-zwitterinica, trabalharse- com nmeros em ordens de grandeza inferiores a 10-8. Alm disso, este clculo
feito ilustra tambm porque a forma neutra no-zwitterinica virtualmente
inexistente em soluo.

63
4.2.2 Modelo de Pitzer

Usualmente o modelo de Pitzer para solues eletrolticas empregado para


solues salinas nas quais a no-idealidade depende das concentraes e das
cargas dos ons dissolvidos. No entanto, do modo como, tradicionalmente, este
modelo de energia de livre de Gibbs proposto por Pitzer formulado (vide seo
2.6), no possvel aplic-lo a sistemas de polieletrlitos. Para contemplar estes
sistemas, uma nova formulao do modelo foi desenvolvida por Pessa Filho e
Maurer (2008). Esta nova formulao mais adequada para aplicao a
aminocidos cuja forma eletricamente neutra predominante a forma zwitterinica.
Assim, tem-se que para um soluto i em soluo aquosa eletroltica, o logaritmo
natural do coeficiente de atividade dado pela soma de um termo para interaes
de longo alcance (LR, do ingls long range) e um termo para interaes de curto
alcance (SR, do ingls short range):
SR
ln i =ln LR
i +ln i

(4 13)

Com o termo de longo alcance dado por uma extenso ao modelo de Debye-Hckel
apresentado no captulo segundo:
2
ln LR
i =A z i

2
I
ln(1+b I )+
b
1+b I

(4 14)

Sendo:

1
e2
A =
3 0 r kB T

3/2

1/ 2

( 2d s N A )
8

(4 15)

Na qual e0 a permissividade do vcuo (8,8541878 x 10-12 A2 s4 kg-1 m-3), er a


constante dieltrica, ds a densidade do solvente, NA o nmero de Avogadro
(6,0221415 x 1023), e a carga eletrnica (1,60217646 x 10-19 A s), kB a constante
de Boltzmann (1,3806503 x 10-23 m2 kg s-2 K-1), zi a carga da espcie i e b um
parmetro universal igual a 1,2 kg1/2 mol-1/2 (PRAUSNITZ; LICHTENTHALER;
AZEVEDO, 1999).
E o termo de curto alcance escrito em sua formulao para polieletrlitos (PESSA
FILHO; MAURER, 2008) dado por:

64
ln SR
i =2 ij ( I ) m j +3 ijk m j m k +...
j s k s

js

...z 2i M s 1ij
j s k s

[ (

a I
1
1 1+a (I )+
exp(a I) m j mk
2 2
2
a I

(4 16)

No qual Ms a massa molar do solvente em kg.mol -1, a outro parmetro universal


igual a 2,0 kg1/2mol -1/2, Lijk o parmetro devido s interaes trs-a-trs, e lij o
parmetro devido s interaes por pares que depende da fora inica:
(1)
ij (I )= (0)
ij + ij

2
a 2 I2

[ 1(1+a ( I )) exp(a I)]

(4 17)

Com a fora inica definida como:


I=

1
m i z 2i
2 i

(4 18)

No caso de aminocidos, quatro espcies podem ser encontradas na soluo, duas


formas neutras sendo uma forma zwitterinica; e duas formas no neutras, uma
carregada positivamente e outra negativamente. Para a descrio do equilbrio de
fases, apenas uma das formas neutras necessria para o clculo. Assim, arbitrarse- a forma zwitterinica como configurao neutra para o clculo do equilbrio de
fases. Tendo a molcula zwitterinica carga lquida nula, o termo de longo alcance
nulo e apenas o termo de curto alcance entra no cmputo da no-idealidade. De
fato, como observado por Scatchard e Kirkwood (1932), para aminocidos alifticos
no foi encontrada nenhuma dependncia entre o logaritmo natural do coeficiente de
atividade e a raiz quadrada da fora inica. O prprio modelo de Kirkwood (1934),
que prope uma soluo analtica para a equao linearizada de Poisson-Boltzmann
em coordenadas esfricas, tem seu primeiro termo para o potencial de interao da
srie obtida idntico ao modelo Debye-Hckel e nulo como conseqncia da carga
lquida nula do zwitterion. Isto corrobora com o fato de aqui o termo de longo alcance
do modelo de Pitzer, que nada mais do que uma extenso ao modelo de DebyeHckel (PITZER, 1973), ser nulo.
Alm disso, na tentativa de diminuir os parmetros ajustveis, considerar-se-o
apenas as interaes binrias e no se considerar a dependncia do parmetro lij
com a fora inica, mas apenas sua variao com a temperatura. Adotar-se- a
equao proposta por Pitzer e Peiper (1984) com o menor nmero de parmetros

65
possvel (na seo seguinte, dar-se- uma justificativa terica para a forma desta
equao atravs de termodinmica estatstica):

ij (T )=C1+

C2
T

(4 19)

Assim, para aminocidos, pode-se reescrever a Equao (4 2) utilizando o modelo


de Pitzer para calcular a no-idealidade devido a presena de cargas eltricas em
soluo como:
ln

S A ( pH )
( pI )
=ln zwitt
+2 1 [ 1 ( pI )S A ( pI ) 1 ( pI ) S A ( pH )]+...
S A ( pI )
zwitt ( pH)

...+2 +1 [ +1 ( pI )S A ( pI ) +1 ( pI )S A ( pH )]+2 0 [ (pI) S A ( pI) 0 ( pI )S A ( pH)]+...


...+2 zwitt [ zwitt ( pI )S A ( pI ) zwitt ( pI )S A ( pH )]

(4 20)

Sendo a curva experimental de solubilidade de um aminocido em funo do pH


simtrica em relao ao ponto isoeltrico possvel inferir que as interaes entre
as molculas neutras deste aminocido e as molculas carregadas so
indistinguveis, ou seja, a molcula eletricamente neutra de aminocido interage da
mesma forma com a molcula carregada positiva ou negativamente. Esta hiptese
implica na seguinte igualdade a priori:

1 = +1= 0 = zwitt =

(4 21)

evidente que se tal simetria no for observada na curva experimental esta


hiptese perde sua validade. Assim, a equao do modelo pode ser escrita como:
ln

S A ( pH )
( pI )
=ln zwitt
+2 [ S A ( pI )S A ( pH ) ]
S A ( pI )
zwitt ( pH)

(4 22)

Uma deficincia deste modelo poderia ser encontrada no seguinte fato: a Equao
(4 22) pode ser obtida da mesma forma se a configurao neutra escolhida no
fosse a zwitterinica, isso significa que a interao entre as molculas carregadas e
as molculas neutras so iguais ainda que a molcula na forma zwitterinica se
comporte como uma molcula altamente polar ao contrrio da outra configurao
neutra. Mas apesar desta aparente inconsistncia, o fato que para qualquer efeito
prtico a frao de molculas neutras na configurao no-zwitterinica nula.
Pela direta substituio das Equaes (4 7) a (4 10) e (4 12) na Equao (4
22), tem-se uma relao explcita entre a solubilidade de aminocidos e o pH

66
apenas sendo necessrias informaes da estrutura primria, a solubilidade no
ponto isoeltrico e o parmetro de interao:

] [

S A ( pH)
(1+10pH pK )
(1+10pH pK )
log
=pI pH+log
+log
+...
pI pK
pIpK
S A (pI )
(1+10
)
( 1+10
)
...+

A1

A1

A2

A2

2
[ S A ( pI )S A ( pH) ]
ln 10

(4 23)

A exceo do termo de no-idealidade a Equao (4 23) um caso particular da


Equao (3 32) em que o nmero de resduos ionizveis dois. Poder-se-ia
tambm incluir este mesmo termo de no-idealidade a Equao (3 32) assumindo
as mesmas simplificaes, apesar disso no parecer necessrio ao menos nos
sistemas estudados no captulo anterior.

4.2.3 Uma abordagem por termodinmica estatstica da no-idealidade

A epgrafe que est no caput deste captulo no faz sentido seno com esta seo
que intencionada a aprofundar o estudo das interaes que at agora foram
resumidas em um nico parmetro de ajuste sem uma interpretao fsica mais
profunda. A frase de Brecht (a grosso modo traduzida como: primeiro vem a comida,
depois a moral) resume o esprito desta seo, findado o trabalho propriamente de
engenharia qumica, o trabalho prtico de desenvolver um mtodo de clculo de
uma propriedade de interesse que est dado pela Equao (4 22) - ou em sua
outra representao (4 23) - pode-se agora dar-se ao trabalho de compreender
melhor as interaes responsveis pela no-idealidade de aminocidos em soluo.
Far-se- isso empregando uma abordagem que at o presente momento foi
ignorada neste texto: a termodinmica estatstica.
Pela teoria de gases imperfeitos, possvel escrever o logaritmo do coeficiente de
atividade como uma expanso virial desde que o potencial de interao possa ser
dividido em contribuies de interaes dois-a-dois, trs-a-trs e assim por diante.
Do mesmo modo, pela teoria de McMillan-Mayer possvel emular do ponto de vista
da modelagem termodinmica a situao dada pela no-idealidade de gases para a
situao de um soluto em um solvente lquido (HILL, 1986). No Apndice C esto

67
apresentados argumentos de um modo mais pormenorizado e rigoroso desta teoria.
Aqui, assumir-se- que isso possvel de tal modo que o logaritmo natural do
coeficiente de atividade da molcula zwitterinica seja escrito como:
ln zwitt =2 j B j , zwitt

(4 24)

em que Bj,zwitt o segundo coeficiente virial osmtico e rj a nmero de molculas


do componente j por unidade de volume.
Sabendo que o segundo coeficiente virial osmtico pode ser relacionado ao
potencial da fora mdia de interao entre os solutos no dado solvente no limite de
baixas concentraes de soluto, tem-se que (NEAL et al., 1999):
2 2 2

+
1
Bij=
e
2
16 0 0 0 0 0 0

W ij (r )
kB T

)1 ]r

sen sen dr d d d d d

(4 25)

Considerando que o potencial de fora mdia seja dado pela contribuio de trs
potenciais: o de esferas rgidas (WHS), o potencial atrativo devido s foras de van
der Waals (WvdW) e o potencial devido s interaes eletrostticas (Welet) tal como a
teoria DLVO (Derjagun, Landau, Verwey e Overbeeck) sugere:
W ij (r )=W HS (r )+W vdW ( r)+W elet ( r )

(4 26)

Pode-se ento escrever este potencial do modo mais simples como:

+ ,
2 (r )

W ij (r )= z i z j e e

r (1+ )
r

6,

( )

(4 27)

em que zi a carga da molcula i, zj a carga da molcula j, e a carga eletrnica,

s o raio de van der Waals mdio das molculas i e j, e o parmetro de interao


entre as molculas i e j.
Considerando aqui que qualquer configurao de uma molcula de aminocido
possui o mesmo raio de van der Waals, s, hiptese razovel j que a mxima
diferena de estrutura entre elas de um prton. Assumir-se- tambm que o valor
do parmetro de interao de van der Waals entre a forma zwiterinica e as demais
formas o mesmo, o que razovel para molculas de estrutura qumica to
semelhante como as formas ionizadas de um aminocido.
No caso do soluto i ser o zwitterion, o termo eletrosttico nulo e o segundo
coeficiente virial osmtico para um sistema de interaes isotrpicas fica sendo

68
apenas:
Bij=2

[e

1 ] r dr+ e
2


k BT r

( )

1 r dr

(4 28)

Considerando a expanso em srie de Taylor truncada para o segundo termo


exponencial:
e


k BT r

( )

1+
kBT r

( )

(4 29)

Tem-se, ento, que o segundo coeficiente virial osmtico dado por:


Bij=2

r 2 dr
0

6
1
2 3
dr
=
1

4
k BT r
3
k BT

(4 30)

Assim, o logaritmo do coeficiente de atividade do zwitterion pode ser escrito como:


ln zwitt =

4 3
1
3
kB T

(4 31)

Substituindo a Equao (4 31) na Equao (4 2), para solubilidade dada em


unidades molais:
S A ( pH )
zwitt ( pI ) 4 3 N A
ln
=ln
+
1
S A (pI )
zwitt ( pH)
3
kBT

) [ S ( pI )S ( pH )]
A

(4 32)

A semelhana entre as Equaes (4 32) e (4 22) notvel e torna a aplicao do


modelo mais consistente. A partir desta comparao, as constantes de ajuste do
parmetro de interao do modelo de Pitzer apresentadas na Equao (4 19)
ganham um significado fsico mais forte:
C1=

2 3 N A
3

C2=C1
k BT

(4 33)

(4 34)

69

4.3 Resultados e Discusses

4.3.1 Solubilidade de aminocidos em funo do pH

A Equao (4 23) por ser uma equao transcendental exige na sua aplicao
uma soluo numrica. Como a derivada analtica desta equao de simples
obteno, foi utilizado o mtodo de Newton-Raphson para o clculo da solubilidade
em um dado pH pela Equao (4 23). Alm disso, o parmetro de interao l deve
ser ajustado ao conjunto de dados experimentais. Para tanto utilizou-se o mtodo de
Nelder e Mead (1965) que apesar de ser um mtodo para otimizao de funes
multivariveis reduz-se a um simples mtodo de busca unidirecional no caso de uma
funo monovarivel. A funo objetivo considerada foi o prprio critrio quantitativo
expresso na Equao (3 40). A Tabela 4.2 apresenta o resultado do ajuste do
parmetro de interao para os sistemas de aminocidos estudados. Os dados de
pKA dos aminocidos estudados neste captulo esto tabelados no Anexo A.
Tabela 4.2 - Valores do parmetro de interao l e do CQ [Equao (3 40)] para diversos
conjuntos de dados experimentais de solubilidade de aminocidos em funo do pH.
Aminocidos
CQ
Ref. Dados Exp.
l / kg mol-1
DL-Alanina

0,0267

2,0 %

Tseng et al. (2009)

DL-Metionina

0,0935

6,8 %

Fuchs et al. (2006)

L-Isoleucina

0,234

5,2 %

Tseng et al. (2009)

L-Leucina

0,273

9,4 %

Tseng et al. (2009)

DL-Fenilalanina

3,95

2,9 %

Tseng et al. (2009)

0,0165

4,6 %

Tseng et al. (2009)

L-Serina

As Figuras 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5 e 4.6 apresentam os resultados da aplicao de tais
modelos aos sistema de DL-Alanina, DL-Metionina, L-Isoleucina, L-Leucina, DLFenilalanina e L-Serina, respectivamente.

70

3,5

Solubilidade / mol.kg

-1

3,0

2,5

2,0

1,5
0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

pH

Figura 4.1 - Valores de solubilidade da DL-Alanina a 298,15 K em


soluo aquosa. Dados experimentais (o), Tseng et al. (2009);
soluo com NaOH ou HCl (), Pradhan e Vera (1998); soluo
com KOH ou HNO3 (), Pradhan e Vera (1998). Modelo Proposto
(linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada).

1,0

Solubilidade / mol.kg

-1

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0
0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

pH

Figura 4.2 - Valores de solubilidade de DL-Metionina a 303,0 K em


soluo aquosa (com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados
experimentais (), Fuchs et al. (2006). Modelagem: soluo ideal,
linha pontilhada; modelo proposto, linha contnua.

71

3,0

Solubilidade / mol.kg

-1

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0
0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

pH

Figura 4.3 - Valores de solubilidade da L-Isoleucina a 298,15 K em


soluo aquosa (com HCl ou NaOH). Dados experimentais (o),
Tseng et al. (2009). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo
Ideal (linha pontilhada).

3,0

Solubilidade / mol.kg

-1

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0
0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

pH

Figura 4.4 - Valores de solubilidade da L-Leucina a 298,15 K em


soluo aquosa (com HCl ou NaOH). Dados experimentais (o),
Tseng et al. (2009). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo
Ideal (linha pontilhada).

72

0,4

Solubilidade / mol.kg

-1

0,3

0,2

0,1

0,0
0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

pH

Figura 4.5 - Valores de solubilidade da DL-Fenilalanina a 298,15 K


em soluo aquosa (com HCl ou NaOH). Dados experimentais (o),
Tseng et al. (2009). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo
Ideal (linha pontilhada).

12,0

Solubilidade / mol.kg

-1

10,5

9,0

7,5

6,0

4,5

3,0
0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

pH

Figura 4.6 - Valores de solubilidade da L-Serina 298,15 K em


soluo aquosa (com HCl ou NaOH). Dados experimentais (o),
Tseng et al. (2009). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo
Ideal (linha pontilhada).

73
Pelas Figuras 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5 e 4.6 possvel afirmar que a aplicao do
modelo proposto uma abordagem profcua no tratamento termodinmico do
equilbrio slido-lquido destes sistemas dado o sucesso na correlao de dados
experimentais de diversos aminocidos. Tambm possvel observar que, apesar da
vasta literatura dedicada modelagem da no-idealidade de solues contendo
aminocidos, por vezes a considerao de soluo ideal suficiente para uma
descrio razoavelmente precisa da curva de solubilidade de aminocidos.
Para uma comparao quantitativa da aplicao dos modelos, a Equao (3 40) foi
usada como um critrio de validao. Alm do modelo proposto e do modelo
considerando soluo ideal, tambm foram comparados os resultados de Tseng et
al. (2009) que aplicaram o modelo NRTL (vide seo 2.5) para calcular a noidealidade considerando a interao entre as molculas de aminocidos DLAlanina, L-Isoleucina, L-Leucina, DL-Fenilalanina e L-Serina e as molculas do
solvente, no caso gua.
A Tabela 4.3 apresenta os valores do critrio quantitativo (CQ) dos trs modelos
avaliados.
Tabela 4.3 - Valores de CQ [Equao (3 40)] em porcentagem para os diferentes modelos
aplicados aos conjuntos de dados de solubilidade de DL-Alanina, L-Isoleucina, L-Leucina, DLFenilalanina e L-Serina a 298,15 K. Dados experimentais de Tseng et al. (2009).
Aminocido

Modelo proposto
Modelo proposto com
Modelo NRTL (TSENG
considerando soluo
valores de l da
et al., 2009)
ideal (l = 0)
Tabela 4.2

DL-Alanina

2,4 %

2,0 %

2,2 %

L-Isoleucina

24,9 %

5,2 %

6,3 %

L-Leucina

32,3 %

9,4 %

13,3 %

DL-Fenilalanina

62,5 %

2,9 %

3,0 %

L-Serina

6,0 %

4,6 %

5,1 %

A Tabela 4.3 mostra claramente que o modelo proposto na Equao (4 23) na sua
forma completa, isto , incluindo o termo de no-idealidade conseguiu correlacionar
os dados experimentais de solubilidade destes aminocidos com grande preciso.
Uma ressalva que deve ser feita que apesar dos desvios do modelo NRTL utilizado
por Tseng et al. (2009) serem apenas ligeiramente superiores, este modelo exige o
ajuste de no mnimo dois parmetros (considerando fixo o fator de no-aleatoriedade
na mistura, aij = 0,3).

74
importante notar tambm que tanto para a DL-Alanina quanto para a L-Serina a
considerao de soluo ideal uma hiptese razovel e que traz a vantagem de
no necessitar de nenhum ajuste de parmetros.
Interessante notar que o desvio em relao a considerao de soluo ideal
aumenta com o aumento da massa molecular destes aminocidos. Tendo por base a
interpretao dada ao parmetro de interao de Pitzer na seo 4.2.3, pode-se
inferir que o aumento da no-idealidade est diretamente ligado ao aumento do
efeito de volume excludo. No ensemble de McMillan-Mayer, o termo referente a
idealidade, assim como no gs ideal, considera partculas pontuais que no
interagem. O modelo de interao de van der Waals inclui um termo que considera
um volume molecular (no fundo, alm do termo atrativo de van der Waals, h um
termo de esferas rgidas que responsvel pelo aparecimento de um termo de
volume excludo) e, aqui, parece fazer sentido que quanto mais pesada a molcula,
maior seu volume; e, por conseqncia, maior o termo de no-idealidade devido ao
volume excludo. Essa observao contribui para a consistncia da modelagem aqui
desenvolvida. A abordagem mais precisa seria considerar a no-idealidade nos
equilbrios qumicos de ionizao, j que a constante de equilbrio o produtrio das
atividades

dos

componentes

elevadas

aos

correspondentes

coeficientes

estequiomtricos. Assim, uma sutileza at agora no mencionada que ao se


adotarem as equaes de Henderson-Hasselbach se est considerando soluo
ideal. Logo, a incluso da no-idealidade a posteriori um modo menos rigoroso do
ponto de vista do formalismo termodinmico, mas ainda assim vlido. Essa
estratgia tem sido usada amplamente em modelagem de equilbrio de fases nas
quais h que se considerar uma srie de equilbrios qumicos. Mas isso coloca uma
questo importante, parte da informao sobre a no-idealidade do sistema j est
nos valores de pKA. Isso ajuda a compreender por que alguns sistemas qui
necessitam de um modelo de no-idealidade.
H ainda que se estender este modelo a aminocidos que possuam um grupo R
ionizvel (por exemplo: a tirosina, a cistena, a histidina, o cido glutmico, o cido
asprtico, a lisina e a asparagina).
De fato, havendo mais um grupo ionizvel, no total de trs, segue-se pela Equao
(3 9) que haver oito formas distintas, em termos de distribuio de cargas, deste
aminocido em soluo. Portanto, a Equao (4 20) teria ao invs de quatro
parmetros de interao, oito. Um parmetro de interao entre cada forma de

75
aminocido e a forma zwitterinica. Se se adotar por hiptese que estes parmetros
so iguais, de fcil demonstrao que a forma final da equao do modelo seria:

] [

S A ( pH)
(1+10pH pK )
(1+10pH pK )
log
=pI pH+log
+log
+...
pI pK
pIpK
S A (pI )
(1+10
)
( 1+10
)

...+log

A1

A1

A2

A2

(1+10 pHpK )
2
+
[ S A ( pI )S A ( pH) ]
pIpK
ln 10
(1+10
)
A3

A3

(4 35)

Os dados de solubilidade de aminocidos com trs resduos ionizveis so poucos;


aqui, usar-se-o dados de solubilidade de tirosina publicados a quase um sculo
atrs em um artigo (HITCHCOCK, 1924) que tambm apresentava, possivelmente, a
primeira modelagem para a curva de solubilidade de aminocidos em funo do pH
considerando soluo ideal. A tirosina apesar de apresentar um terceiro resduo
ionizvel aparece geralmente na literatura especializada como um aminocido
apolar. Sendo assim, interessante comparar qual o efeito de considerar ou no a
ionizao do grupo R da tirosina na modelagem da curva de solubilidade. Neste
caso, considerar-se- apenas a situao de soluo ideal, ou seja, l = 0. A Figura
4.7 apresenta o resultado desta modelagem.

40,0

Solubilidade / mol.kg

-1

30,0

20,0

10,0

0,0
0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

pH

Figura 4.7 - Valores de solubilidade da tirosina 298,15 K em


soluo aquosa. Dados experimentais (o), Hitchcock (1924).
Modelo considerando o grupo R ionizvel (linha contnua).
Modelo considerando o grupo R no-ionizvel (linha pontilhada).

76
Pela Figura 4.7 possvel afirmar que a considerao do equilbrio qumico de
ionizao do grupo R da tirosina melhora a descrio do equilbrio slido-lquido.
Tambm observa-se que a hiptese de l = 0 razovel a este sistema.

4.3.2 Solubilidade da glicina e de seus oligopeptdeos em funo do pH

Tambm foram investigados alguns sistemas com peptdeos tendo apenas os


resduos terminais com grupos ionizveis. A Tabela 4.4 apresenta os valores do
parmetro de interao l e o valor de CQ definido na Equao (3 40) para a
glicina, diglicina, triglicina, tetraglicina, pentaglicina e hexaglicina. Apesar da glicina
ser um aminocido, para efeito de comparao da sua curva de solubilidade com a
de seus oligmeros, apresentam-se seus resultados nesta seo. Os dados de pKA
da glicina e de seus oligmeros esto tambm relacionados no Anexo A.

Tabela 4.4 - Valores do parmetro de interao l e do CQ [Equao (3 - 40)] para diversos


conjuntos de dados experimentais de solubilidade de glicina e seus oligopeptdeos em funo
do pH. Dados experimentais de Lu et al. (2006).
Molcula
CQ
l / kg mol-1
Glicina

0,200

11,1 %

Diglicina

3,26

6,9 %

Triglicina

13,8

9,8 %

Tetraglicina

93,6

1,7 %

Pentaglicina

238,8

4,7 %

Hexaglicina

258,2

7,9 %

A Figura 4.8 traz as curvas de solubilidade calculadas pelo modelo Equao (4


23) e os dados experimentais para a glicina, a diglicina e a triglicina, e a Figura 4.9
traz os mesmos resultados para os sistemas de tetraglicina, de pentaglicina e de
hexaglicina.

77

7,0

6,0

Solubilidade / mol.kg

-1

5,0

4,0

3,0

2,0

1,0

0,0
0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

pH

Figura 4.8 - Curva de solubilidade em soluo aquosa (com HCl


ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais de glicina (),
de diglicina () e de triglicina (), Lu et al. (2006). Modelagem Equao (4 - 23) - com valores de l da Tabela 4.4: glicina, linha
contnua; diglicina, linha semi-contnua; triglicina, linha
pontilhada.

0,05

Solubilidade / mol.kg

-1

0,04

0,03

0,02

0,01

0,00
2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

pH

Figura 4.9 - Curva de solubilidade em soluo aquosa (com HCl


ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais de tetraglicina
(), de pentaglicina () e de hexaglicina (), Lu et al. (2006).
Modelagem - Equao (4 - 23) - com valores de l da Tabela 4.4:
tetraglicina, linha contnua; pentaglicina, linha semi-contnua;
hexaglicina, linha pontilhada.

78
Tanto pela observao dos valores de CQ da Tabela 4.4, quanto pela observao
das curvas do modelo contrastadas aos dados experimentais de solubilidade
apresentadas nas Figuras 4.8 e 4.9, possvel afirmar que o modelo foi exitoso na
reproduo da curva de solubilidade em funo do pH da glicina e de seus
oligopeptdeos.
Interessante notar que a magnitude do parmetro de interao l aumenta
consistentemente com o aumento da cadeia do peptdeo. Retomando a
interpretao via termodinmica estatstica dada ao parmetro de interao l, temse que:

2 3
N A 1
3
kB T

(4 36)

De certo modo, o parmetro e carrega parte da no-idealidade entre o soluto e o


solvente, j que se tratando de um potencial da fora mdia, as interaes
solventes-solutos esto sob a forma de mdia no cmputo das interaes solutosoluto. Assim, de se supor que o aumento da cadeia apolar em um soluto em gua
cause um aumento do valor de e, todavia o que se observa que o valor de l fica
cada vez mais positivo a medida que se aumenta a cadeia apolar do soluto. Assim,
provavelmente esse aumento de l deve estar relacionado ao aumento de s, ou seja,
do efeito de volume excludo.

4.3.3 Solubilidade de compostos b-lactmicos em funo do pH, da temperatura e


do solvente

Os compostos que contm grupos b-lactmicos apresentam uma caracterstica


comum aos aminocidos: um grupo amina e um grupo cido carboxlico
participantes de equilbrios de protonao. Essa caracterstica comum faz com que a
modelagem do equilbrio slido-lquido desenvolvida para aminocidos possa ser
aplicada a molculas que possuem grupos b-lactmicos.
A Figura 4.10 apresenta a estrutura da ampicilina e a Figura 4.11 a estrutura do
cido 6-aminopenicilnico.

79

NH2

H H

H
N
H

S
CH3
CH3
OH

N
O
O

Figura 4.10 - Estrutura da ampicilina.

H H
S

H2N

CH3
CH3
OH

N
O
O

Figura 4.11 - Estrutura do cido


6-aminopenicilnico.

H especial interesse nestas molculas, pois algumas delas so antibiticos, como a


ampicilina, assim h um claro objetivo industrial na produo de tais molculas. Em
particular a ampicilina, que hoje produzida em um processo muito agressivo ao
meio ambiente, ganhou nos ltimos anos ateno no que tange a sua produo por
uma rota biossinttica. Esta rota exige modelos termodinmicos para o equilbrio
slido-lquido confiveis para a otimizao do processo reacional no qual o
antibitico deve ser precipitado e retirado do reator (SANTANA et al, 2010).
Aqui sero investigadas algumas molculas importantes neste processo: a
ampicilina, obviamente; e, o cido 6-aminopenicilnico envolvido na produo de
ampicilina. Variveis importantes para esse processo so: pH, temperatura e
concentrao de metanol do meio. Apesar de, recentemente, dados de solubilidade
nas diversas condies terem sido publicados (SANTANA et al., 2010), a modelagem
ainda algo que precisa ser melhorado.
O modelo usado o dado pela Equao (4 23); entretanto, como h
disponibilidade de dados de solubilidade em funo do pH e da temperatura, foi
possvel ajustar dois parmetros C1 e C2 que esto relacionados aos parmetros s
e e . O ajuste foi realizado atravs da minimizao da funo definida pela Equao
(3 41) pelo mtodo de Nelder e Mead (1965) com duas variveis a serem

80
ajustadas. Os dados de pKA usados no clculo esto apresentados no Anexo A. O
cdigo-fonte do programa de clculo no ajuste de parmetros est apresentado no
Apndice D.
A Tabela 4.5 apresenta os valores de s e e ajustados bem como os valores de CQG
definido na Equao (3 41) tanto para a ampicilina quanto para o cido 6aminopenicilnico.
Tabela 4.5 - Valores dos parmetros s, e e CQG para os sistemas contendo ampicilina e cido
6-aminopenicilnico. Dados experimentais de Santana et al. (2010).
Molcula
CQG
s/
e/kB / K
Ampicilina

5,25

299,8

8,2 %

cido 6-aminopenicilnico

2,68

275,6

12,0 %

As Figuras 4.12, 4.13, 4.14 e 4.15 apresentam as curvas de solubilidade da


ampicilina em funo do pH s temperaturas de 283,06 K; 288,01 K; 292,95 K e
298,03 K respectivamente. J as Figuras 4.16, 4.17, 4.18 e 4.19 as curvas de
solubilidade do cido 6-aminopenicilnico s temperaturas de 283,06 K; 288,01 K;
292,95 K e 298,03 K respectivamente.

60,0

Solubilidade / mmol.L

-1

50,0

40,0

30,0

20,0

10,0

0,0
5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

pH

Figura 4.12 - Valores de solubilidade da ampicilina 283,06 K em


soluo aquosa (com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados
experimentais (o), Santana et al. (2010). Modelo Proposto (linha
contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada).

81

60,0

Solubilidade / mmol.L

-1

50,0

40,0

30,0

20,0

10,0

0,0
5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

pH

Figura 4.13 - Valores de solubilidade da ampicilina 288,01 K em


soluo aquosa (com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados
experimentais (o), Santana et al. (2010). Modelo Proposto (linha
contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada).

60,0

Solubilidade / mmol.L

-1

50,0

40,0

30,0

20,0

10,0

0,0
5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

pH

Figura 4.14 - Valores de solubilidade da ampicilina 292,95 K em


soluo aquosa (com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados
experimentais (o), Santana et al. (2010). Modelo Proposto (linha
contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada).

82

60,0

Solubilidade / mmol.L

-1

50,0

40,0

30,0

20,0

10,0

0,0
5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

pH

Figura 4.15 - Valores de solubilidade da ampicilina 298,03 K em


soluo aquosa (com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados
experimentais (o), Santana et al. (2010). Modelo Proposto (linha
contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada).

600,0

Solubilidade / mmol.L

-1

450,0

300,0

150,0

0,0
5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

pH

Figura 4.16 - Valores de solubilidade do cido 6aminopenicilnico 283,06 K em soluo aquosa (com HCl ou
NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o), Santana et al.
(2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha
pontilhada).

83

600,0

Solubilidade / mmol.L

-1

450,0

300,0

150,0

0,0
5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

pH

Figura 4.17 - Valores de solubilidade do cido 6aminopenicilnico 288,01 K em soluo aquosa (com HCl ou
NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o), Santana et al.
(2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha
pontilhada).

600,0

Solubilidade / mmol.L

-1

450,0

300,0

150,0

0,0
5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

pH

Figura 4.18 - Valores de solubilidade do cido 6aminopenicilnico 292,95 K em soluo aquosa (com HCl ou
NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o), Santana et al.
(2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha
pontilhada).

84

600,0

Solubilidade / mmol.L

-1

450,0

300,0

150,0

0,0
5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

pH

Figura 4.19 - Valores de solubilidade do cido 6aminopenicilnico 298,03 K em soluo aquosa (com HCl ou
NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o), Santana et al.
(2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha
pontilhada).

Diferentemente do que foi observado para os aminocidos de modo geral, h um


grande desvio em relao a idealidade, isto , a considerao de soluo ideal no
apropriada para estes sistemas da ampicilina e do cido 6-aminopenicilnico
principalmente para valores de pH distantes do ponto isoeltrico nos quais a
concentrao de molculas de soluto maior do que no ponto isoeltrico e, portanto,
a interao entre elas no pode ser desprezada. De fato, o modelo proposto com a
considerao de no-idealidade do modo como exposto na Equao (4 23)
consegue representar com bastante preciso a curva obtida experimentalmente. No
artigo no qual esto publicados estes dados experimentais (SANTANA et al., 2010),
a modelagem que foi objeto de aplicao modelo de Khoshkbarchi e Vera (1996c)
no conseguiu representar os dados seno de modo qualitativo, inclusive no caso
dos sistemas contendo cido 6-aminopencilnico este modelo tentado violou uma
restrio destas curvas: a de que o ponto de mnima solubilidade ocorre no ponto
isoeltrico.
Para evitar ajuste de mais parmetros a variao da concentrao de metanol no
sistema foi negligenciada no termo de no-idealidade bem como nos valores de pKA.

85
Mesmo assim, considerando apenas a variao da solubilidade do ponto isoeltrico
com a variao da concentrao de metanol no sistema foi possvel correlacionar os
dados experimentais de solubilidade de ampicilina e do cido 6-aminopenicilnico
com grande acurcia como pode ser visto nas Figuras 4.20 e 4.21.
As Figuras 4.20 e 4.21 apresentam os resultados da modelagem para os sistemas
contendo ampicilina e cido 6-aminopenicilnico, respectivamente, em diferentes
concentraes de metanol.
digno de ateno o fato de que o efeito da presena de metanol no sistema to
logo diminua a constante dieltrica do solvente alterando a magnitude da
concentrao de soluto em equilbrio na fase lquida no altera o formato da curva
de solubilidade o que coaduna com a hiptese de o termo de no-idealidade e os
valores de pKA permanecerem inalterados.
No entanto, ao assumir tal hiptese deixa-se de se discutir uma questo em aberto
na Termodinmica no ensemble de McMillan-Mayer: como devem ser tratadas as
misturas de solventes e at que ponto um componente deve ser tratado como cosoluto ou como co-solvente. No fazendo parte do escopo deste trabalho tratar
deste tema, ele apenas mencionado.

40,0
35,0

Solubilidade / mmol.L

-1

30,0
25,0
20,0
15,0
10,0
5,0
0,0
5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

pH

Figura 4.20 - Valores de solubilidade da ampicilina 298,15 K em


soluo aquosa em funo do pH. Dados experimentais a
diferentes fraes mssicas de metanol: (o) 0,0 %, () 15,0 %, ()
30,0 % e () 50,0 %. Santana; Mattedi e Giordano (2010). Modelo
proposto: 0,0 % (linha contnua), 15,0 % (linha com travesses),
30,0 % (linha semi-contnua) e 50,0 % (linha pontilhada).

86

600,0

Solubilidade / mmol.L

-1

500,0

400,0

300,0

200,0

100,0

0,0
5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

pH

Figura 4.21 - Valores de solubilidade do cido 6aminopenicilnico 298,15 K em soluo aquosa em funo do pH.
Dados experimentais a diferentes fraes mssicas de metanol:
(o) 0,0 %, () 15,0 %, () 30,0 % e () 50,0 %. Santana; Mattedi e
Giordano (2010). Modelo proposto: 0,0 % (linha contnua), 15,0 %
(linha com travesses), 30,0 % (linha semi-contnua) e 50,0 %
(linha pontilhada).

87

5 Segundo coeficiente virial osmtico de protenas e suas relaes

The sciences, not yet split by nineteenth-century academicism into a superior 'pure' and an inferior
'applied' branch, devoted themselves to the solution of productive problems: the most striking
advances of the 1780s were those of chemistry, which was by tradition most closed linked to
workshop practice and the needs of industry.
(Eric Hobsbawm, in The Age of Revolution)

5.1 Introduo

O clebre trabalho de George et al. (1997) revelou uma importante interface entre as
teorias termodinmicas a respeito das foras de interao entre protenas e os
processos de cristalizao das mesmas, interface esta embasada na relao entre
os valores do segundo coeficiente virial osmtico e as condies de nucleao de
diversas protenas. Esta notvel observao da janela de cristalizao motivou uma
srie de pesquisas tanto de cunho experimental na determinao de valores de
segundo coeficiente virial osmtico quanto trabalhos de vis fundamentalmente
terico na proposio de modelos de potencial da fora mdia, como Lima et al.
(2009), e de equaes de estado (MOLLERUP; BREIL, 2009ab) no intuito de
calcular

valor

deste

parmetro

comparar

com

os

dados

obtidos

experimentalmente.
Segundo Prausnitz (2003) h pelo menos quatro mtodos bem estabelecidos para a
determinao experimental do segundo coeficiente virial osmtico: osmometria,
espalhamento de luz, medida do ponto de nuvem e fluorescncia anisotrpica.
Alm destes, Tessier; Lenhoff e Sandler (2002) empregaram a cromatografia de
auto-interao para determinar o valor do segundo coeficiente virial osmtico da
lisozima e do quimiotripsinognio; possvel relacionar a reteno relativa de
protenas na coluna cromatogrfica com o segundo coeficiente virial osmtico.
Mesmo assim, h poucos dados disponveis na literatura comparado ao nmero de
protenas de interesse industrial e a infinitude de condies a que estas protenas
podem ser submetidas. Por essa razo, a relao entre o segundo coeficiente virial

88
osmtico e a solubilidade de protena j apontada no trabalho de George et al.
(1997) tem atrado especial ateno na proposio de modelagens termodinmicas
que fundamentam esta observao at ento emprica.
H pelo menos trs trabalhos publicados que apresentam relaes tericas com
distintas formulaes: Guo et al. (1999), Haas; Drenth e Wilson (1999) e Ruppert;
Sandler e Lenhoff (2001). O primeiro aplica a teoria de McMillan-Mayer e a equao
de Gibbs-Duhem a fim de obter uma equao para o potencial qumico da protena
em soluo e assim relacionar o segundo coeficiente virial osmtico com a
solubilidade, ajustando a diferena entre o potencial qumico de referncia da
protena em soluo e o potencial qumico da protena no cristal (GUO et al., 1999).
Apesar da relao terica proposta, nenhuma aplicao concreta foi apresentada.
No trabalho de Haas; Drenth e Wilson (1999) foi desenvolvida uma relao entre o
segundo coeficiente virial e a solubilidade de protena partindo da definio do
segundo coeficiente virial dada pela termodinmica estatstica. Haas; Drenth e
Wilson (1999) fizeram tambm consideraes sobre a anisotropia das interaes
entre molculas no-esfricas e aplicaram o potencial de poo quadrtico e o
potencial de Yukawa para sistemas hipotticos. Por fim, o trabalho de Ruppert;
Sandler e Lenhoff (2001), considerando a lei de Henry e uma proposta de converso
do segundo coeficiente virial osmtico experimental para o segundo coeficiente virial
osmtico limite de McMillan-Mayer, chegaram a uma relao entre o segundo
coeficiente virial osmtico determinado experimentalmente e a solubilidade de
protena, porm com a necessidade de parmetros como o incremento do ndice de
refrao. Ruppert; Sandler e Lenhoff (2001) aplicaram esta relao a alguns
sistemas de lisozima e de ovalbumina.
H que se fazer meno tambm ao trabalho de Allahyarov et al. (2002) que
calcularam valores do segundo coeficiente virial em funo da concentrao de sal
para sistemas hipotticos de protenas atravs de dinmica molecular e concluram
que a dependncia entre estes parmetros no monotnica como aquela prevista
pela teoria de Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek.
No trabalho aqui apresentado, uma nova relao baseada exclusivamente em
termodinmica clssica proposta. Contudo, o desenvolvimento terico percorrido
permite em primeiro plano uma relao entre o segundo coeficiente virial osmtico e
a concentrao do agente precipitante, neste caso, sais; a partir da equao de
Cohn (COHN, 1925), obtm-se uma relao entre o segundo coeficiente virial

89
osmtico e a solubilidade de protena na regio de salting-out para variaes na
concentrao de sal.

5.2 Desenvolvimento terico

De fato, como observado por Watanabe (2007), a fase slida pode conter sais e
gua alm de molculas de protena; no entanto, os ons salinos esto de tal forma
ligados a resduos da cadeia protica que tal complexo on-gua-protena se
comporta como um nico componente eletricamente neutro.
Considerando, ainda, que o potencial qumico da molcula eletricamente neutra de
protena da fase lquida possa ser escrito, para um processo isotrmico no qual o
efeito da presso sobre o potencial qumico seja desprezvel, como uma expanso
virial truncada aps o segundo coeficiente virial osmtico3, tem-se que:

L0 ( m)= 0* (m * )+RT ln

m0
m0
*
*
+2 RTBS
* +2RTB m i = 0 (m )+RT ln
m0
m *0
i

(5 1)

Derivando a expresso acima em relao a molalidade de sal na fase lquida:


L0 (m) *0 (m *)
ln m 0
S
B
=
+RT
+2 RTB
+2RTS
m sal
m sal
m sal
msal
m sal

(5 2)

em que m0 a molalidade de molculas neutras de protena na fase lquida e pode


ser calculada pelo produto entre a frao de molculas de protena eletricamente
neutras na fase lquida e a prpria solubilidade (S) da protena conforme a Equao
(3 6). Substituindo a Equao (3 6) na Equao (5 2) e com alguma
manipulao algbrica, pode-se mostrar que:

*
*
L
1 0 (m ) RT ln 0 ln S
ln B lnS
1 0 ( m)
+
+
+2 RT
+
=
(5 3)
S B m sal
S B msal m sal
msal msal
S B m sal

Pode-se considerar ainda que o sistema esteja em uma regio do diagrama de fases
onde no h variao do potencial qumico da fase slida; esta hiptese coerente
3 Outro modo de pensar a Equao (5 1) seria considerar a Equao (C 14), desenvolvida no Apndice C,
para o clculo do logaritmo natural do coeficiente de atividade de uma dada molcula neutra de protena e
assumindo por hiptese que os segundos coeficientes viriais entre as diversas configuraes proticas so
iguais.

90
com o trabalho publicado por Watanabe (2007) no qual fica evidente que o diagrama
de fases da lisozima da clara de ovo de galinha apresenta no mximo dois
precipitados verdadeiros em regies distintas do diagrama de fases. Pelo mesmo
critrio de equilbrio estabelecido na Equao (3 1), tem-se que o potencial
qumico da protena eletricamente neutra da fase lquida invariante e, por
conseqncia, a Equao (5 3) pode ser reescrita como:

*
*
1 0 (m ) RT ln 0 ln S
ln B lnS
+
+
+2 RT
+
=0
S B m sal
S B msal m sal
msal msal

(5 4)

A Equao (5 4) uma relao terica entre o segundo coeficiente virial, a


solubilidade da protena na fase lquida e a molalidade de sal na mesma fase desde
que se estabelea como o potencial qumico de referncia deve variar com a
molalidade de sal e como deve se calcular a frao de molculas de protena
eletricamente neutras. As prximas subsees sero dedicadas a estas questes.

5.2.1 Potencial qumico de referncia

De acordo com Sinanolu e Abdulnur (1965), e com Melander e Horvth (1977), a


variao do potencial qumico de uma molcula de protena no estado de um gs
hipottico e o potencial qumico de uma molcula de protena no interior de uma
soluo, ou seja, a energia livre de transferncia entre estados de referncia, pode
ser escrita por:
*

= cav + elet + vdW +RT ln

( )
RT
pV

(5 5)

em que Dm* o potencial qumico de transferncia de uma molcula de protena do


estado de um gs hipottico para o interior de uma soluo, Dmcav a variao do
potencial qumico devida energia envolvida na formao de uma cavidade para
alocar a molcula na soluo, Dmelet a contribuio eletrosttica variao do
potencial qumico, DmvdW expressa a variao sofrida pelo potencial qumico devido
as interaes atrativas de van der Waals entre o solvente e o soluto. O ltimo termo
da Equao (5 5) mede a mudana no volume livre.
Outra importante considerao : quando somente a concentrao de sal no

91
solvente aquoso alterada e no h alteraes significativas nas interaes entre a
protena e o sal, assume-se que o processo de transferncia de energia afetado
somente por mudanas em Dmcav e Dmelet. J que os outros termos permanecem
inalterados com a variao da concentrao de sal, suficiente avaliar apenas estes
dois termos que sofrem alteraes. Sendo que, assim como proposto por Melander
e Horvth (1977):
cav =[N A A+4.8 N 1/A 3 ( e1)V 2/ 3 ]

(5 6)

em que NA o nmero de Avogadro, A a rea superficial molar do soluto, ke um


termo de correo, V o volume molar e g a tenso superficial do solvente cuja
expresso como funo da molalidade de sal , em geral, aproximada por um
relao linear:

= 0 + m sal

(5 7)

em que g0 a tenso superficial da gua pura e s uma constante chamada de


incremento molal da tenso superficial.
J para o clculo da componente eletrosttica, pode-se combinar a teoria de DebyeHckel, que uma lei limite para baixos valores de fora inica, com o modelo de
Kirkwood para o dipolo da protena, que vlido para valores mais elevados de
fora inica. Assim, tem-se que:
elet =A

B m sal
D d m sal
1+C m sal

(5 8)

Considerando, por outro lado, um estado de referncia infinita diluio para uma
molalidade de sal de equilbrio m1, e outro estado de referncia infinita diluio
para uma molalidade de sal de equilbrio m2, tem-se que a diferena entre os
potenciais qumicos destes estados igual a diferena de entre as energias livres
molares de transferncia entre estes estados e o estado de uma gs hipottico, tal
que:

2 * 1*= 2 * 1*=( cav + elet )2( cav + elet )1

(5 9)

Dividindo a Equao (5 9) pela diferena entre as molalidades de sal entre os dois


estados e aplicando o limite no qual tal diferena tende a zero, tem-se que:
lim
m 2 m1 0

( cav + elet )2( cav + elet )1


2 * 1*
= lim
m 2 m 1 m m 0
m2m1
2

(5 10)

92
Portanto, a Equao (5 10) pode, evidentemente, ser reescrita em termos
diferenciais como:
* cav elet
=
+
m sal
m sal
m sal

(5 11)

Na regio de salting-out, regio na qual a adio de um co-solvente diminui a


solubilidade da protena, as molalidades salinas so suficientemente elevadas para
que a seguinte aproximao possa ser vlida no clculo da derivada de Dmelet em
relao molalidade do sal atravs da Equao (5 8):
C m sal 1

elet
D d =RT
msal

(5 12)

em que L um coeficiente de salting-in relacionado a interaes eletrostticas.


Por outro lado, diferenciando-se a Equao (5 6) com respeito a molalidade salina,
tem-se que:
cav
e
2/3
=[N A A+4.8 N 1/3
] =RT
A ( 1) V
m sal

(5 13)

em que Ws o coeficiente de salting-out relacionado a interaes hidrofbicas.


Assim, tem-se que a variao do potencial qumico de referncia da molcula de
protena na fase lquida em relao molalidade de sal dada por:
*
=RTK s
m sal

(5 14)

Sendo Ks a constante de salting-out, a mesma que aparece na equao de Cohn


que ser tratada na prxima subseo, descrita como:
K s =

(5 15)

5.2.2 Equao de Cohn

A famosa equao de Cohn (COHN, 1925) uma equao fundamentalmente


emprica que correlaciona linearmente o logaritmo da solubilidade de protenas e a
molalidade de sal na regio de salting-out. O fato de Melander e Horvth (1977)

93
terem proposto um embasamento terico para justificar a forma da equao de Cohn
no a torna uma equao terica, apenas apresenta uma formulao interpretativa
dos parmetros desta equao.
A equao de Cohn, por sua grande capacidade de descrever diversos sistemas
com to poucos parmetros, ganhou notoriedade e ainda hoje bastante utilizada
no estudo de operaes unitrias fundadas na precipitao de protenas. Aqui, usarse- a equao de Cohn para facilitar a compreenso do que representa a Equao
(5 4).
Esta equao pode ser escrita como (COHN, 1925):
lnS = K s m sal

(5 16)

Portanto, a derivada do logaritmo natural da solubilidade de protena em relao


molalidade de sal simplesmente:
ln S
=K s
m sal

(5 17)

Deve-se observar que teoricamente Ks no depende do pH da soluo.

5.2.3 Modelo proposto

Substituindo as Equaes (5 14) e (5 17) na Equao (5 4), tem-se que:


1 ln 0
ln B ln S
+2
+
=0
S B m sal
m sal msal

(5 18)

A Equao (5 18) acima escrita uma equao geral que relaciona o segundo
coeficiente virial, a solubilidade da protena e a molalidade do sal. A frao de
molculas neutras de protenas funo da molalidade de sal, do pH, da
temperatura, dos valores de pKA e das constantes de equilbrio qumico que
envolvem os ons salinos e os resduos polares da cadeia protica. Esta descrio
no trivial e nem geral, pois depende do tipo de sal usado. Para tanto aqui se
assumir a hiptese de que na regio do salting-out pode-se admitir que:
ln 0
0
m sal

(5 19)

94
Assim, a Equao (5 18) reduz-se a:
ln B
=K s
m sal

(5 20)

Integrando-se a Equao (5 20), tem-se que:


ln

( )

B
*
* =K s ( m sal m sal )
B

(5 21)

A Equao (5 21) relaciona o segundo coeficiente virial com a molalidade de sal,


tendo apenas um ponto da curva e a constante de salting-out como parmetros.
Do mesmo modo, pode-se observar que pela equao de Cohn e pela Equao (5
20) possvel escrever que:
ln B ln S
+
=0
m sal msal

(5 22)

E, finalmente, integrando a Equao (5 22) encontra-se uma relao entre o


segundo coeficiente virial e a solubilidade de protena na regio do salting-out para
uma variao da molalidade de sal:
S=

B* S*
B

(5 23)

de importante meno que a Equao (5 23) tem sua validade restrita a valores
de solubilidade de protena em funo do segundo coeficiente virial para diferentes
valores de molalidade de sal, ou seja, mudanas em pH e em temperatura a priori
no esto contempladas neste modelo.

5.3 Resultados e Discusses

5.3.1 Resultados para a lisozima

Um primeiro resultado que servir, na verdade, para comparao e validao das


Equaes (5 21) e (5 23) a curva de solubilidade da lisozima em funo da
concentrao de cloreto de sdio na regio de salting-out. Essa curva nestas

95
condies deve seguir a equao de Cohn Equao (5 16) e dela pode-se
obter o valor da constante de salting-out, Ks, por simples regresso linear. A Figura
5.1 apresenta esses resultados a partir de dados experimentais obtidos por
Watababe (2007).

3,0

2,0

1,0

ln S

0,0

-1,0

-2,0

-3,0

-4,0
0,0

1,0

2,0

3,0

mNaCl / mol.kg

4,0

5,0

6,0

-1

Figura 5.1 - Solubilidade da lisozima da clara de ovo de galinha


em funo da molalidade de cloreto de sdio. Dados
experimentais (), Watanabe (2007). Equao de Cohn (linha
contnua).

O valor de Ks para este sistema foi calculado como 0,93 kg mol-1e servir de base
para comparao com o valores de Ks ajustados pela Equao (5 21).
A Equao (5 21) foi aplicada a um conjunto de dados experimentais publicados
por Curtis et al. (2002). Nesse trabalho foram apresentados os valores do segundo
coeficiente virial osmtico em funo da molalidade de cloreto de sdio para a
lisozima nativa cujo resduo de nmero 101 um cido asprtico e para uma
variante da lisozima cujo resduo 101 uma fenilalanina. Esta variante da lisozima
ser referenciada no texto como lisozima D101F. Os valores do segundo coeficiente
virial osmtico foram obtidos por espalhamento de luz.
A Figura 5.2 apresenta os resultados da aplicao da Equao (5 21) aos dados
de Curtis et al. (2002).

96

-0,5

ln (B/B )

0,0

-1,0

-1,5
0,0

0,5

1,0

mNaCl / mol.kg

1,5

2,0

-1

Figura 5.2 - Valores do segundo coeficiente virial osmtico em


funo da molalidade de cloreto de sdio em pH = 4,5. Dados
experimentais obtidos em Curtis et al. (2002). Lisozima nativa,
modelo (linha contnua), dados experimentais (). Lisozima
D101F, modelo (linha pontilhada), dados experimentais ().

Os valores das constantes de salting-out para a lisozima nativa e para lisozima


mutante D101F obtidos pelo ajuste da Equao (5 21) foram 0,70 e 1,93 kg mol -1
respectivamente. Pode-se observar assim que a abordagem aqui pretendida
reproduz resultados coerentes com aquilo que tem sido reportado na literatura.
O fato de a alterao de apenas um resduo na cadeia protica ser responsvel por
uma elevao to grande no valor de Ks mostra a importncia que a estrutura
primria e, por conseqncia, a estrutura terciria tem para a modelagem
termodinmica de sistemas contendo protenas, no podendo, portanto, serem
ignoradas. H que se registrar tambm que o ponto de referncia B* foi escolhido
arbitrariamente dentre os dados experimentais, mas poderia ter sido ajustado.
J a Equao (5 23) foi tambm aplicada a sistemas contendo lisozima. A Figura
5.3 mostra o resultado desta aplicao e a comparao com outros modelos
publicados por outros autores no intento de propor uma relao terica entre a
solubilidade da protena e o segundo coeficiente virial osmtico. Intento esse
motivado pela hiptese de George et al. (1997), que apresentam uma correlao
entre os dados experimentais de ambas as propriedades.

97

60,0

50,0

Solubilidade / g.L

-1

40,0

30,0

20,0

10,0

0,0
-10,0

-7,5

-5,0

-2,5
4

0,0

B x 10 / mol.mL.g

2,5

5,0

-2

Figura 5.3 - Valores da solubilidade da lisozima em funo do


segundo coeficiente virial osmtico. Dados experimentais
obtidos em Guo et al. (1999). Lisozima a 25 C e pH = 4,2 com
variaes na concentrao de cloreto de sdio (). Lisozima a
18C e pH = 4,5 com variaes na concentrao de cloreto de
amnio (). Lisozima a 23 C e pH = 7,8 com variaes na
concentrao de brometo de magnsio (). Modelo de Haas;
Drenth e Wilson (1999) com z = 3 e A = 0.001 (linha pontilhada).
Modelo de Guo et al. (1999) com Dm = 250 kJ mol-1 (linha semicontnua). Modelo de Ruppert; Sandler e Lenhoff (2001), (linha
com travesses). Equao (5 23) (linha contnua).

A Tabela 5.1 apresenta a comparao entre os modelos considerando o valor de CQ


definido pela Equao (3 40).
Tabela 5.1 - Comparao dos valores de CQ definido pela Equao (3 40) para o sistema
contendo lisozima.
Modelos
CQ
Modelo Proposto Equao (5 - 23)

39,6 %

Modelo de Guo et al. (1999)

58,4 %

Modelo de Haas; Drenth e Wilson (1999)

44,2 %

Modelo de Ruppert; Sandler e Lenhoff (2001)

27,7 %

Observa-se pela Tabela 5.1 que todos os modelos so pouco eficientes para uma
avaliao quantitativa, no entanto pela Figura 5.3 observa-se que os modelos

98
conseguem ao menos representar qualitativamente o fenmeno estudado. Alm
disso, a modelagem proposta se equipara aos modelos j publicados na literatura no
que tange a eficcia de representao dos dados experimentais; sendo, todavia, que
esta nova modelagem resulta em uma equao muitssimo mais simples e que exige
muito menos parmetros.
H uma ressalva, no entanto, ao uso das Equaes (5 21) e (5 23). Sendo a
regio do diagrama de fases aquela de salting-out, as equaes so vlidas apenas
para valores negativos do segundo coeficiente virial osmtico, ou seja, para foras
intermoleculares atrativas entre as molculas de protena (PRAUSNITZ, 2003), que
fisicamente o que acontece na cristalizao e na precipitao de protenas.

5.3.2 Resultados para a ovalbumina

A Figura 5.4 apresenta a aplicao da equao de Cohn aos dados experimentais


de solubilidade de ovalbumina em solues de sulfato de amnio. O valor de Ks
ajustado por regresso linear 2,45 kg mol-1.

4,0

3,0

ln S

2,0

1,0

0,0

-1,0

-2,0
4,0

4,5

5,0

5,5

I / mol.kg

6,0

6,5

-1

Figura 5.4 - Solubilidade da ovalbumina em solues de sulfato


de amnio. Dados experimentais (), Judge; Johns e White
(1996). Equao de Cohn (linha contnua).

99
Usando a equao de Cohn para ajustar o valor de Ks com os dados de solubilidade
de ovalbumina em solues de sulfato de amnio, foi possvel predizer sem nenhum
ajuste de parmetro adicional a relao entre o segundo coeficiente virial osmtico e
a fora inica (no fundo, a concentrao de sulfato de amnio) pela Equao (5
21).
A Figura 5.5 traz os resultados desta modelagem para os dados do segundo
coeficiente virial osmtico da ovalbumina.

5,0

2,5

ln (B/B )

0,0

-2,5

-5,0

-7,5

-10,0
0,0

1,0

2,0

3,0

I / mol.kg

4,0

5,0

6,0

-1

Figura 5.5 - Segundo coeficiente virial osmtico da ovalbumina


em solues de sulfato de amnio a pH = 4,0. Dados
experimentais (), Mehta; White e Litster (2011). Equao (5 21)
com Ks = 2,45 kg mol-1, (linha contnua).

De fato, apesar do valor de Ks ter sido ajustado a partir de um conjunto de dados de


solubilidade obtidos em um pH ligeiramente distinto daquele nos quais foram obtidos
os valores do segundo coeficiente virial osmtico, observa-se que ele foi capaz de
predizer juntamente a Equao (5 21) com grande preciso os valores do segundo
coeficiente virial osmtico.
O fato de ter se trocado na equao de Cohn a molalidade do agente precipitante
pela fora inica no traz nenhuma alterao s relaes propostas desde que se
observe certo zelo em qual formulao da equao de Cohn foi calculada a
constante de salting-out, Ks.

100
5.3.3 Resultados para a imunoglobulina humana

Por fim, verificou-se, tambm, a validade da relao expressa na Equao (5 21)


aplicando-a a sistemas contendo imunoglobulina humana. Esta por sua vez
constituda de uma populao de protenas e apresenta em sua modelagem
situaes ainda de difcil tratamento tal como o clculo do ponto isoeltrico. De
qualquer modo, as relaes aqui propostas levam em conta a identidade da protena
apenas no parmetro Ks, assumindo que tal populao de protenas obedea a
equao de Cohn, pode-se supor que as relaes aqui apresentadas devem ser
obedecidas do mesmo modo. E isso pode ser verificado na Figura 5.6 para dados do
segundo coeficiente virial osmtico para a imunoglobulina humana em funo da
frao mssica de cloreto de sdio. Os dados experimentais deste sistema ainda
no foram publicados, mas foram gentilmente cedidos por Kelly Cristina do
Nascimento Alves Cruvinel (comunicao pessoal).

0,2

0,0

ln (B/B )

-0,2

-0,4

-0,6

-0,8
0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

w NaCl

Figura 5.6 - Segundo coeficiente virial osmtico da


imunoglobulina humana (IgG) em solues de cloreto de sdio.
Dados experimentais (), estes dados ainda no foram
publicados, mas foram cedidos por Kelly Cristina do Nascimento
Alves Cruvinel (comunicao pessoal). Equao (5 21), (linha
contnua).

101

6 Concluses

Terminada a exposio dos principais desenvolvimentos, cabe agora reunir aqui os


pontos fundamentais tratados neste trabalho. Talvez a maior contribuio desta
pesquisa seja a considerao de que uma dada protena em soluo no se
encontrando em uma forma nica, mas como uma populao de molculas com
distintas configuraes de carga eltrica ao longo de suas cadeias, deva ter um
tratamento termodinmico que leve em conta este fato. E que a analogia para
molculas menores tais como aminocidos e compostos b-lactmicos total.
Com certeza um dos maiores xitos deste projeto tenha sido o desenvolvimento de
uma relao explcita e unvoca entre a solubilidade de protenas e o pH da soluo.
Esta relao foi aplicada a sistemas de insulina suna e algumas mutantes de
insulina bem como a sistemas de b-lactoglobulina com um resultado bastante
expressivo no que tange a preciso na representao dos dados experimentais.
Pela natureza prpria da equao proposta, a necessidade de dados de pKA uma
realidade desafiadora, pois a escassez de informaes a respeito destes dados na
literatura ainda um impedimento a uma aplicao mais ampla do modelo.
Ainda assim, tanto quanto foi possvel verificar na literatura aberta, a primeira vez
que uma tal relao, fundada em argumentos tericos de fsico-qumica bsica,
entre a solubilidade de protenas e o pH apresentada na literatura aberta.
A extenso deste modelo ao caso de sistemas contendo aminocidos e grupos blactmicos abriu uma possibilidade de aprofundar a discusso da no-idealidade
destes sistemas. A possibilidade, no entanto, de aplicao deste modelo somado as
consideraes de no-idealidade a sistemas de aminocidos imensa j que os
dados de pKA destas molculas esto disponveis na literatura para uma vasta gama
de molculas.
Uma interpretao via termodinmica estatstica para o parmetro de interao de
Pitzer permitiu, tambm, uma discusso mais minuciosa desta questo. A relao
entre o tamanho da molcula e o aumento do desvio da idealidade para os sistemas
analisados, inclusive para a glicina e seus oligopeptdeos nos quais isto fica
evidente, concorre a interpretao dada ao parmetro de interao de Pitzer e tem
profunda relao com o potencial de esferas rgidas que associado ao efeito de

102
volume excludo.
H no captulo dedicado a este tema uma seo que contempla uma aplicao
tecnolgica bastante interessante do ponto de vista de engenharia: a modelagem do
equilbrio slido-lquido de sistemas que contm molculas com grupos blactmicos, por exemplo a ampicilina, cujo interesse industrial notrio dada a sua
funo antibitica.
Em termos de processo a dependncia da solubilidade com o pH crucial em
operaes como a precipitao isoeltrica, ainda assim parmetros como
temperatura e composio do solvente foram avaliados no caso da ampicilina e do
cido 6-aminopenicilnico com grande sucesso na correlao dos dados
experimentais.
Alm disso, foram desenvolvidas relaes entre o segundo coeficiente virial
osmtico, a concentrao de agente precipitante e a solubilidade de protenas.
Neste campo, alguns modelos foram desenvolvidos, mas a necessidade de ajuste
de parmetros e de informaes que estes modelos requerem evocam a
necessidade de relaes to precisas quanto, mas de mais fcil implementao.
Pde-se observar que os modelos at hoje desenvolvidos incluindo o que aqui se
apresenta conseguem descrever a relao entre o segundo coeficiente virial
osmtico e a solubilidade da protena ao menos em termos qualitativos. Contudo, os
prprios dados experimentais, por serem raros, limitam uma maior explorao da
validade dos modelos.
Ficou tambm evidente a caracterstica que o segundo coeficiente virial osmtico
tem de representar a magnitude das foras de interao entre as molculas de
protena, ou seja, quanto mais negativo ele o for, mais atrativas so as foras entre
as molculas de protena facilitando a agregao e diminuindo a solubilidade em
soluo. Este fato pode ser visualizado em todos os modelos.
Como sugestes a trabalhos futuros possvel elencar algumas questes que
permanecem em aberto tanto na rea experimental quanto em termos de
modelagem termodinmica: i) determinao experimental dos valores de pKA na
cadeia protica para diferentes protenas e em diferentes condies tais como
temperatura e composio do solvente; ii) determinao de curvas de solubilidade
de protenas em funo do pH em diversas condies a fim de consolidar a
validao do modelo proposto; iii) determinao experimental de curvas de
solubilidade de aminocidos com trs resduos ionizveis e estudo de como

103
contemplar a questo da no-idealidade nestes sistemas; iv) estudo de como levar
em conta o fato de uma dada protena em um dado pH ser de fato uma populao
de molculas com distintos estados de ionizao no cmputo do potencial da fora
mdia de protenas a fim de prever o diagrama de fases com uma abordagem mais
realstica; v) estudo da possvel relao entre uma dada configurao protica em
um estado de ionizao e a atividade biolgica desta protena; possvel supor que
sabendo qual esta configurao haja uma relao entre a curva da frao desta
configurao e a curva de atividade biolgica da protena em funo do pH.

104

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excess Gibbs energy of aqueous electrolyte systems to aqueous
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soro bovino com o uso de sais; Faculdade de Engenharia Qumica,
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energy of mixing, J. Am. Chem. Soc., v. 86, p. 127-130, 1964
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in water by the modified Wilson model, Ind. Eng. Chem. Res., v. 43, p. 32003204, 2004

110

Apndice A Integrao do perfil de carga em funo do pH

Para se chegar Equao (3 31) a partir da Equao (3 29) preciso integrar o


perfil de carga lquida da protena em funo do pH. Assim, tem que se calcular a
seguinte integral:
pH

pH

c ( pH) d pH=
pI

2 pI

{(
n

j=1

1
1+10 pH pK

Aj

)[

1+ j (1 j )10 pH pK

Aj

d pH

(C 1)

Para isso, deve-se fazer a seguinte substituio de variveis a fim de tornar o


desenvolvimento mais simples de se compreender:
y=10 pH pK

Aj

(C 2)

Assim, ter-se- que:


log y= pH pK Aj

(C 3)

E, que:
d pH =

1 1
dy
ln10 y

(C 4)

Portanto, substituindo as Equaes (C 3) e (C 4) na Equao (C 1), tem-se


que:
pH

c ( pH)d pH=

2y
0

pI

{ ( )[
n

j=1

1
1+y

1+ j (1 j ) y ]

( )

1 1
dy =...
ln 10 y

( )

1
1
1
y
1
...=
(1+ j )
dy (1 j )
dy =...

2ln 10 j=1
1+y y
1+y y
y
y

...=

{ [( )

1
( 1+ j )
2ln 10 j=1
n

...=

y0

{ [

( )

( )

1
1
1
dy
dy (1 j )
dy =...
y
1+y
1+y
y
y
0

1
y
(1+y )
(1+y )
( 1+ j ) ln 0 ln

0 (1 j ) ln
2ln 10 j=1
y
( 1+y )
(1+y 0)

(C 5)

Pode-se reescrever a Equao (C 5) em termos do logaritmo decimal tal que:

111
pH

c ( pH)d pH= 12
j =1

pI

(1+ j ) log

(1+y )
(1+y )
y
=...
0 ( 1+ j )log
0 (1 j ) log
y
( 1+y )
(1+y 0 )

...=

n
(1+y )
1
y
(1+ j )log 0 [( 1+ j )+(1 j ) ] log
=...

2 j=1
y
(1+y 0 )

...=

n
(1+y )
1
y
( 1+ j )log 0 2 log

2 j=1
y
(1+y 0)

(C 6)

Substituindo as variveis originais a Equao (C 6):


pH

c ( pH)d pH=
j =1

pI

...=
j=1

(1+ j )
10 pHpK
log
2
10 pIpK

Aj

Aj

(1+10pH pK )
log
=...
(1+10 pIpK )
Aj

Aj

(1+ j )
(1+10pH pK )
( pHpI )log
=...
pI pK
2
(1+10
)
Aj

Aj

...=(pHpI )
j =1

] [

n
(1+ j )
( 1+10pH pK )
log
pI pK
2
j=1
(1+10
)
Aj

Aj

(C 7)

Entretanto:
n

j=1

(1+ j )
=n+
2

(C 8)

Por fim, substituindo a Equao (C 8) na Equao (C 7):


pH

c ( pH)d pH=n+(pHpI )
pI

j =1

(1+10 pH pK )
pIpK
(1+10
)
Aj

log

Aj

(C 9)

112

Apndice B Cdigo-fonte do programa de clculo de solubilidade de


protenas

/*****************************************************************************/
/* Escola Politcnica da Universidade de So Paulo
*/
/* Departamento de Engenharia Qumica
*/
/* Grupo de Engenharia de Bioprocessos (GenBio)
*/
/* Programa de clculo da solubilidade de protenas em funo do pH
*/
/* Lus Fernando Mercier Franco & Pedro de Alcntara Pessa Filho
*/
/*****************************************************************************/

/******************************************************************************/
1) Para usar este programa um arquivo de entrada requerido. A extenso deste
arquivo precisa ser .txt e este arquivo deve ser salvo nos mesmos diretrio e
pasta do executvel. Abaixo um exemplo para a insulina suna a 298.2 K, dados de
Tashima et al. (2009).
Nome_da_protena:
Insulina_suina
Nmero_de_resduos:
16
(Aminocidos,nu[j],pKA):
G
1
7.38
E
-1
4.37
Y
-1
10.20
E
-1
4.37
Y
-1
10.20
N
-1
3.45
F
1
7.38
H
1
5.98
H
1
5.98
E
-1
4.37
Y
-1
10.20
E
-1
4.37
R
1
11.10
Y
-1
10.20
K
1
8.52
A
-1
3.45
(pI,pIsol):
5.4 0.0000222
Nmero_de_dados_de_solubilidade:
8
Dados_de_solubilidade(pH,sol):
4.6 0.0000941
4.7 0.0000569
4.8 0.0000441
5.0 0.0000307
5.3 0.0000246
5.4 0.0000222
5.6 0.0000259
5.7 0.0000502
2) Um arquivo chamado "_helpfile.txt" criado durante a execuo do programa.
Este arquivo contm os valores dos parmetros discretos epsilon[j,k] para todos os
resduos e para todas as configuraes neutras possveis.
3) Os autores no tm qualquer responsabilidade sobre o uso deste programa.
/******************************************************************************/

113
#include
#include
#include
#include
#include

<stdio.h>
<stdlib.h>
<math.h>
<string.h>
<time.h>

#define MAX 100


#define MIN 50
#define NUM 40
int main(){
/* Descrio das variveis */
int i;
/* contador do vetor pH
int j;
/* contador de grupos ionizveis
int k;
/* contador de configuraes
int n;
/* nmero de grupos ionizveis
int nexp;
/* nmero de pontos experimentais
int nu[MIN];
/* vetor de grupos ionizveis
int M;
/* nmero total de configuraes
int npos;
/* nmero de grupos que tm nu[j] = +1
int count;
int epsm[MIN];
/* carga de cada grupo na configurao k
int aux;
int rem;
int quot;
int eps;
int c;
int AS;
int BS;
int pmc;
/* posio da configurao mais comum
int epsmc[MIN];
/* carga de cada grupo na configurao mais comum
double pH[MAX];
/* vetor de pH
double pKA[MIN];
/* vetor de pKA
double ex;
double ex0;
double pI;
/* pI: ponto isoeltrico
double sexp[MIN];
/* solubilidade experimental
double pIsol;
/* solubilidade no pI
double Z[MAX];
/* carga lquida da protein em um dado pH
double s18[MAX];
/* solubilidade calculada pela Equao(3 18)
double s32[MAX];
/* solubilidade calculada pela Equao(3 32)
double mc;
double frac;
double auxiliar;
double phimc[MAX];
/* frao da configurao mais comum
double phitot[MAX];
/* frao total de molculas neutras
double prod;

*/
*/
*/
*/
*/
*/
*/
*/
*/

*/
*/
*/
*/

*/
*/
*/
*/
*/
*/

*/
*/

char name[NUM];
char res[NUM];
char nfile[NUM];
char get[NUM];
time_t t1, t2;
FILE *ARQUI, *HELPFILE;
(void) time(&t1);
printf("-----------------------------------------------------------------");
printf("\n");
printf("\n\t ESCOLA POLITECNICA DA UNIVERSIDADE DE SAO PAULO\n");
printf("\n\t
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUIMICA\n");
printf("\n\t
GRUPO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS\n");
printf("\n\t
............................................. ");
printf("\n\t
: SOLUBILIDADE DE PROTENAS EM FUNO DO pH : ");
printf("\n\t
:...........................................:\n");
printf(" \n\t Desenvolvido por Luis Fernando Mercier Franco");

114
printf(" \n\t & Pedro de Alcantara Pessoa Filho");

printf("\n Data input:\n");


printf(" Data file name: ");
scanf("%s", &nfile);
/**************************************************************************/
/* Lendo o arquivo (.txt) que contm os valores de entrada
*/
/**************************************************************************/
ARQUI = fopen(nfile, "r");
fscanf(ARQUI, "%S", get);
fscanf(ARQUI, "%s", &name);
fscanf(ARQUI, "%S", get);
fscanf(ARQUI, "%d", &n);
fscanf(ARQUI, "%S", get);
for (j = 0; j < n; j++){
fscanf(ARQUI, "%s", &res[j]);
fscanf(ARQUI, "%d", &nu[j]);
fscanf(ARQUI, "%lf", &pKA[j]);
}
fscanf(ARQUI, "%S", get);
fscanf(ARQUI, "%lf", &pI);
fscanf(ARQUI, "%lf", &pIsol);
fscanf(ARQUI, "%S", get);
fscanf(ARQUI, "%d", &nexp);
fscanf(ARQUI, "%S", get);
for (k = 0; k < nexp; k++){
fscanf(ARQUI, "%lf", &pH[k]);
fscanf(ARQUI, "%lf", &sexp[k]);
}
fclose(ARQUI);
/**************************************************************************/
/**************************************************************************/
/**************************************************************************/
/* Clculo do perfil de carga pela Equao (3 28)
*/
/**************************************************************************/
for (i =
Z[i] =
for (j
ex =
AS =
BS =
Z[i]
}
}

0; i < nexp; i++){


0.0;
= 0; j < n; j++){
pow(10.0, pH[i] - pKA[j]);
1 + nu[j];
1 - nu[j];
= Z[i] + 0.5 * (1.0 * AS - 1.0 * BS * ex) / ex;

/**************************************************************************/
/* Clculo da solubilidade da protena pela Equao (3 18)
*/
/**************************************************************************/
/* Clculo de configuraes neutras */
HELPFILE = fopen("_helpfile.txt", "w");
count = 0;
M = pow(2, n);
for (k = 0; k < M; k++){
aux = k;
c = 0;
for (j = 0; j < n; j++){
rem = aux % 2;
quot = aux / 2;
epsm[j] = rem;
aux = quot;

115
c = c + epsm[j] * nu[j];
}
if (c == 0){
for (j = 0; j < n; j++){
eps = epsm[j] * nu[j];
fprintf(HELPFILE, "%d ", eps);
}
count = count + 1;
}
}
fclose(HELPFILE);
pH[nexp] = pI;
/* Clculo da frao total e da mais comum */
for (i = 0; i <= nexp; i++){
frac = 0;
mc = 0;
HELPFILE = fopen("_helpfile.txt", "r");
for (k = 0; k < count; k++){
prod = 1.0;
for (j = 0; j < n; j++){
ex = pow(10.0, pH[i] - pKA[j]);
fscanf(HELPFILE, "%d", &eps);
AS = (1 + nu[j]) / 2 - eps;
BS = (nu[j] - 1) / 2 - eps;
prod = prod * (1.0 / (1.0 + ex)) * (1.0 * AS * ex - 1.0 * BS);
}
auxiliar = prod;
if (k > 0 && auxiliar > mc){
mc = auxiliar;
pmc = k;
}
frac = frac + prod;
}
fclose(HELPFILE);
phimc[i] = mc;
phitot[i] = frac;
}
HELPFILE = fopen("_helpfile.txt", "r");
for (k = 0; k < count; k++){
for (j = 0; j < n; j++)
fscanf(HELPFILE, "%d", &eps);
if(k == pmc - 1)
for (j = 0; j < n; j++)
fscanf(HELPFILE, "%d", &epsmc[j]);
}
fclose(HELPFILE);
/* Clculo da solubilidade */
for (i = 0; i < nexp; i++)
s18[i] = pIsol * phitot[nexp] / phitot[i];
/**************************************************************************/
/**************************************************************************/

/**************************************************************************/
/* Clculo da solubilidade da protena pela Equao (3 32)
*/
/**************************************************************************/
for (i = 0; i < MAX; i++){
/* Clculo da funo eta[j] - Equao (3 - 34) */
prod = 1;
npos = 0;

116
for (j = 0; j < n; j++){
ex = 1.0 + pow(10.0, pH[i] - pKA[j]);
ex0 = 1.0 + pow(10.0, pI - pKA[j]);
prod = prod * (ex / ex0);
npos = npos + (1 + nu[j]) / 2;
}
/* Clculo da solubilidade */
s32[i] = pIsol * pow(10.0, (1.0 * npos) * (pI - pH[i])) * prod;
}
/**************************************************************************/
/**************************************************************************/

/**************************************************************************/
/* Impresso dos resultados na tela
*/
/**************************************************************************/
printf("\n\n RESULTADOS:\n\n");
printf(" Proteina: %s\n\n", name);
printf(" Tabela 1 Parametros de calculo\n\n");
printf(" Residue | nu[j] | eps[j,k*] | pKA\n");
printf(" ---------------------------------------------\n");
for (j = 0; j < n; j++){
if (nu[j] > 0)
printf("
%c |
%d |", res[j], nu[j]);
else
printf("
%c | %d |", res[j], nu[j]);
if (epsmc[j] < 0)
printf("
%d
|", epsmc[j]);
else
printf("
%d
|", epsmc[j]);
if (pKA[j] < 10.0)
printf(" %.2lf\n", pKA[j]);
else
printf(" %.2lf\n", pKA[j]);
}
printf(" *Refere-se a configuracao mais comum.\n\n");
printf("\n\n Tabela 2 Carga e fracao de moleculas neutras\n");
printf("\n pH |
Z
| phimc | phitot\n");
printf(" ------------------------------------------------\n");
for (i = 0; i < nexp; i++)
printf(" %.2lf | %.2e | %.2e | %.2e\n", pH[i], Z[i], phimc[i],
phitot[i]);
printf("\n\n Tabela 3 Valores de solubilidade\n");
printf("\n pH |
s18
|
s32
| sexp\n");
printf(" ------------------------------------------------\n");
for (i = 0; i < nexp; i++)
printf(" %.2lf | %.2e | %.2e | %.2e\n", pH[i], s18[i], s32[i],
sexp[i]);
(void) time(&t2);
printf("\n\n Tempo de execuo = %d segundos\n", (int) t2-t1);
printf("---------------------------------------------------------------\n");
/**************************************************************************/
/**************************************************************************/
return 0;
}

117

Apndice C Expresso para o coeficiente de atividade de um soluto no


ensemble de McMillan-Mayer

De fato, o ensemble de McMillan-Mayer parece ser o mais apropriado para


aplicaes como a que se pretende neste trabalho: sistemas solventes-solutos. Do
ponto de vista formal da Termodinmica este ensemble poderia ser pensado
simplesmente como uma transformada de Legendre da equao fundamental
Equao (2 7) muito particular na qual so permutadas: as seguintes
coordenadas conjugadas: entropia e temperatura; e, quantidade de matria do
solvente e potencial qumico de solvente de modo a definir uma nova funo de
estado caracterstica deste ensemble cujas variveis seriam: temperatura, volume,
potencial qumico do solvente e quantidade de matria do soluto (MOLLERUP;
BREIL, 2009a). H claro outras formas de se estabelecer formalmente e de forma
consistente a existncia deste ensemble, mas o que o torna importante o fato de
se ter uma separao no sistema do que solvente e o que soluto. A caracterstica
principal deste ensemble ter como variveis fixas do sistema macroscpico o
potencial qumico do solvente e a quantidade de matria do soluto.
Deste modo, sendo possvel imaginar tal ensemble e estabelec-lo de tal modo
consistente com os outros ensembles: microcannico, cannico, grande cannico,
etc.; a validade desta teoria no a restringe a um limite da concentrao de solutos,
outrossim as aproximaes que se seguiro no tratamento do problema acabaro
por limitar a aplicao a solues diludas.
Uma aproximao comumente empregada e, to comumente empregada que por
vezes sua identidade de aproximao negligenciada a hiptese de que podese representar os problemas de interao entre muitos corpos de modo a somar
contribuies devidas s interaes de dois corpos, trs corpos e assim em diante
(HILL, 1986).
No caso de sistemas solventes-solutos, a hiptese da teoria de McMillan-Mayer
(McMILLAN; MAYER, 1945) que as interaes entre as molculas de soluto no
interior de um solvente podem ser tratadas de modo anlogo ao clssico problema
de gases imperfeitos, por exemplo, usando uma expanso virial da presso
osmtica o que introduz as limitaes prprias de uma expanso virial.

118
Partindo, ento, da teoria de McMillan-Mayer e truncando a expanso virial da
presso osmtica aps o segundo coeficiente, tem-se que (PITZER, 1973):
= k B T

( )

u ij
1
3

g ij (r ) 4 r dr

i
j
6 i j
r
0

(C 1)

em que P a presso osmtica, r a densidade, ri a concentrao do soluto i, rj


a concentrao do soluto j, uij o potencial de interao entre os solutos i e j e gij(r)
a funo de distribuio radial que est diretamente relacionada ao potencial da
fora mdia. Ou ainda em termos do segundo coeficiente virial osmtico entre os
solutos i e j, Bij:
= +
i j B ij
kB T
i
j

(C 2)

Ou ainda em termos de nmero de molculas:


m

=N+ 1
N N B ,
k B T V V 2 i j i j ij

sendo N = N i

(C 3)

i =1

Por simples clculo de propriedades de afastamento, possvel calcular o


coeficiente de fugacidade, fk, de um dado componente k atravs de uma equao de
estado, em termos osmticos:

( ) ]

1
N

ln k =
kB T N k
v

dv ln

T , ,N l k

kBT

(C 4)

Para calcular este coeficiente de fugacidade, deve-se primeiro avaliar a derivada


parcial interna a integrao:

( )

]}

(N i N j )
N

1
1
= +
B ij

k B T N k
v N v2 i j
Nk

(C 5)

Logo:
v

ln k =

...=

1
V

(N i N j )
1 1
1


Bij dv ln
=...
2
v v Nv i j
Nk
kB T

(N i N j )

B ij ln
N k
kB T

Resta ainda avaliar a derivada parcial do duplo somatrio:

(C 6)

119

] [

( Ni N j )
( N 1 N 1)
(N 1 N k )
(N 1 N m )
B ij =
B 11+...+
B 1k +...+
B 1m+...
Nk
Nk
N k
Nk

(N k N 1)
(N k N k )
( N k N m)
B k1+...+
B kk +...+
Bkm +...
Nk
Nk
N k

(N m N 1)
(N m N k )
(N m N m )
Bm1 +...+
B mk +...+
B mm
N k
N k
Nk

...+

...+

(C 7)

Contudo:

0, se ik , jk
(N i N j ) N j , se i=k , j k
=
Nk
N i , se i k , j =k
2N i , se i=k , j=k

(C 8)

Portanto:

( Ni N j )
B ij =0+...+N 1 B 1k +...+0+... N 1 B k1+...+2 N k B kk +...
Nk

...+N m Bkm +...+0+...+N m B mk +...+0

(C 9)

Considerando ainda que Bij = Bji, ou seja, a matriz de interaes simtrica j que
por uma hiptese bastante razovel o modo e a intensidade da interao de i com j
deve ser o mesmo que de j com i, tem-se que:

( Ni N j )
B ij =2 N j B jk
Nk
j

(C 10)

Assim, tem-se que o logaritmo natural do coeficiente de fugacidade de um soluto k :


ln k =

2
V

N j B jk ln( k T )
j

(C 11)

Isto implica que:


ln

k
=2 j B jk
kB T
j

Ou ainda ,em termos de fugacidade:

(C 12)

120
ln

fk
=2 j B jk
k kB T
j

(C 13)

E, portanto, o coeficiente de atividade do soluto k pode ser escrito como:


ln k =2 j B jk
j

(C 14)

121

Apndice D Cdigo-fonte do programa de ajuste de parmetros para o


clculo da solubilidade de aminocidos e compostos b-lactmicos

/******************************************************************************/
/* ESCOLA POLITCNICA DA UNIVERSIDADE DE SO PAULO
*/
/* DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA
*/
/* GRUPO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS
*/
/* SOLUBILIDADE DE AMINOCIDOS
*/
/******************************************************************************/
#include
#include
#include
#include
#include
#define
#define
#define
#define

<stdlib.h>
<stdio.h>
<math.h>
<string.h>
<dirent.h>

NPM 100
MAX 100
NITERMAX 1000
VEC 40

double FO(double par[MAX], int n, char dfn[VEC]);


int main(){
int i, N, LS;
double X1[NPM], X2[NPM], X3[NPM], XK[NPM], XMIN[NPM], XMAX[NPM], EMAX[NPM];
double EFAC, Y, Y1, YSTAR, YTEST, YBASE;
char nfile[VEC], dfn[VEC], get[VEC];
FILE *ENT;
/******************************************************************************/
1) Para usar este programa dois arquivos de entrada so requeridos. A extenso
destes arquivos precisa ser .txt e estes arquivos devem ser salvos nos
mesmos diretrio e pasta do executvel.
2) O primeiro arquivo deve conter as estimativas iniciais dos parmetros a serem
ajustados bem como seus limites inferior e superior:
Numero_de_parametros:
2
Estimativa_inicial:
0.032
-16.0
Valores_mnimo_e_mximo:
0.0
100.0
-100.0
0.0

3) O segundo arquivo deve conter os valores de temperatura, de pKA, do pI e da


solubilidade no pI bem como os dados experimentais de solubilidade com os
quais se pretende ajustar os parmetros do modelo. Abaixo um exemplo para a
ampicilina, dados de Santana et al. (2010):

ndata:
4
AMP1
Temperature(K):
283.06
pKA1_pKA2:
2.27
7.66

122
pI_solpI:
5.5
nexp:
5
pH_sexp:
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5

13.45

13.45
14.07
15.96
18.73
39.59

AMP2
Temperature(K):
288.01
pKA1_pKA2:
2.24
7.61
pI_solpI:
5.5
14.75
nexp:
5
pH_sexp:
5.5
14.75
6.0
16.35
6.5
17.19
7.0
19.29
7.5
47.00
AMP3
Temperature(K):
292.95
pKA1_pKA2:
2.14
7.45
pI_solpI:
5.5
16.88
nexp:
5
pH_sexp:
5.5
16.88
6.0
17.17
6.5
18.50
7.0
27.48
7.5
49.80
AMP4
Temperature(K):
298.03
pKA1_pKA2:
2.14
7.31
pI_solpI:
5.5
20.89
nexp:
5
pH_sexp:
5.5
20.89
6.0
21.61
6.5
22.27
7.0
28.39
7.5
51.37

4) Os autores no tm qualquer responsabilidade sobre o uso deste programa.


/******************************************************************************/
printf("-----------------------------------------------------------------");
printf("\n");
printf("\n\t ESCOLA POLITECNICA DA UNIVERSIDADE DE SAO PAULO \n");
printf("\n\t
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUIMICA
\n");

123
printf("\n\t
GRUPO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS
\n");
printf("\n\t
............................................. ");
printf("\n\t
:
SOLUBILIDADE DE AMINOACIDOS
: ");
printf("\n\t
:...........................................: \n");
printf(" \n\t Desenvolvido por Luis Fernando Mercier Franco");
printf(" \n\t & Pedro de Alcantara Pessoa Filho");

/**************************************************************************/
/* Leitura do nome do arquivo e da estimativa inicial
*/
/**************************************************************************/
printf(" Nome do arquivo com estimativa inicial = ");
scanf("%s", nfile);
strcat(nfile, ".txt");
ENT = fopen(nfile, "r");
fscanf(ENT, "%s", get);
fscanf(ENT, "%d", &N);
fscanf(ENT, "%s", get);
for (i = 0; i < N; i++)
fscanf(ENT, "%lf", &X1[i]);
fscanf(ENT, "%s", get);
for (i = 0; i < N; i++){
fscanf(ENT, "%lf", &XMIN[i]);
fscanf(ENT, "%lf", &XMAX[i]);
}
fclose(ENT);
printf(" Nome do arquivo com parametros de entrada = ");
scanf("%s", dfn);
strcat(dfn, ".txt");
/**************************************************************************/
/* Minimizao da funo objetivo (3 - 41) SIMPLEX (NELDER E MEAD, 1965)*/
/**************************************************************************/
EFAC = pow(10, -6);
Y = FO(X1, N, dfn);
printf(" Y(0) = %e\n", Y);
for (i = 0; i < N; i++){
XK[i] = 1.0;
EMAX[i] = 0.01 * (XMAX[i]-XMIN[i]);
X2[i] = X1[i];
X3[i] = X1[i];
}
YSTAR = Y;
LS = 0;
P100:
YTEST = YSTAR;
for (i = 0; i < N; i++){
if (X1[i] >= XMAX[i] && XK[i] > 0.0) goto P1010;
if (X1[i] <= XMIN[i] && XK[i] < 0.0) goto P1010;
X2[i] = X1[i] + XK[i] * EMAX[i];
if (X2[i] > XMAX[i]) X2[i] = XMAX[i];
if (X2[i] < XMIN[i]) X2[i] = XMIN[i];
Y1 = FO(X2, N, dfn);
if (Y1 >= YTEST) goto P1010;
XK[i] = 2.0 * XK[i];
if (XK[i] > 1.0) XK[i] = 1.0;
if (XK[i] < -1.0) XK[i] = -1.0;
goto P103;
P1010:
if (X1[i] <= XMIN[i] && XK[i] > 0.0) goto P1011;
if (X1[i] >= XMAX[i] && XK[i] < 0.0) goto P1011;
X2[i] = X1[i] - XK[i] * EMAX[i];
if (X2[i] < XMIN[i]) X2[i] = XMIN[i];
if (X2[i] > XMAX[i]) X2[i] = XMAX[i];
Y1 = FO(X2, N, dfn);
if (Y1 >= YTEST) goto P1011;
XK[i] = -1.0 * XK[i];
goto P103;

124
P1011:
X2[i] = X1[i];
XK[i] = 0.5 * XK[i];
if (XK[i] < 0.0) goto P1015;
if (XK[i] < 0.5 * EFAC) XK[i] = 0.5 * EFAC;
goto P1018;
P1015:
if (fabs(XK[i]) < 0.5 * EFAC) XK[i] = -0.5 * EFAC;
P1018:
Y1 = YTEST;
P103:
YTEST = Y1;
}
if (LS == 1) goto P350;
YBASE = YTEST;
if (YBASE < YSTAR) goto P300;
for (i = 0; i < N; i++)
if (fabs(XK[i]) > 0.5 * EFAC) goto P100;
goto P600;
P300:
for (i = 0; i < N; i++){
X1[i] = X3[i] + 2.0 * (X2[i] - X3[i]);
if (X1[i] < XMIN[i]) X1[i] = XMIN[i];
if (X1[i] > XMAX[i]) X1[i] = XMAX[i];
X3[i] = X2[i];
X2[i] = X1[i];
}
YSTAR = FO(X1, N, dfn);
LS = 1;
goto P100;
P350:
LS = 0;
if (YTEST >= YBASE) goto P500;
YBASE = YTEST;
goto P300;
P500:
for (i = 0; i < N; i++){
X1[i] = X3[i];
X2[i] = X1[i];
}
YSTAR = YBASE;
goto P100;
P600:
Y = FO(X1, N, dfn);
/**************************************************************************/
/* Impresso dos resultados
*/
/**************************************************************************/
printf("\n\n Valor otimo da funcao objetivo: %.3lf\n\n", Y);
printf("\t\t
Variaveis
| Valores de otimo\n");
printf("\t\t ---------------------------------\n");
for (i = 0; i < N; i++)
printf("\t\t
XOTM[%d]
|
%e\n", i + 1, X1[i]);
printf("-----------------------------------------------------------------\n");
return 0;
}
double FO(double par[MAX], int n, char dfn[VEC]){
int i, j, k, ndata, nexp;
int cont[MAX];
double pI, spI, pKA1, pKA2, exp, aminus, aplus, tau;
double fipI, lnf, dtau, FUN, tol, lam, T, penalty;
double fi[MAX], sol[NITERMAX], sexp[MAX], pH[MAX], s[MAX], F[MAX];
char get[MAX];
FILE *ENT;
tol = pow(10.0, -6.0);

125
penalty = 1000000.0;
FUN = 0.0;
ENT = fopen(dfn, "r");
fscanf(ENT, "%s", get);
fscanf(ENT, "%d", &ndata);
for (k = 0; k < ndata; k++){
fscanf(ENT, "%s", get);
fscanf(ENT, "%s", get);
fscanf(ENT, "%lf", &T);
fscanf(ENT, "%s", get);
fscanf(ENT, "%lf", &pKA1);
fscanf(ENT, "%lf", &pKA2);
fscanf(ENT, "%s", get);
fscanf(ENT, "%lf", &pI);
fscanf(ENT, "%lf", &spI);
fscanf(ENT, "%s", get);
fscanf(ENT, "%d", &nexp);
fscanf(ENT, "%s", get);
for (i = 0; i < nexp; i++){
fscanf(ENT, "%lf", &pH[i]);
fscanf(ENT, "%lf", &sexp[i]);
}
lam = par[0] + par[1] / T;
exp = pow(10.0, pI - pKA1);
aminus = exp / (1.0 + exp);
exp = pow(10.0, pI - pKA2);
aplus = 1.0 / (1.0 + exp);
fipI = aminus * aplus;
F[k] = 0.0;
cont[k] = 0;
for (i = 0; i < nexp; i++){
exp = pow(10.0, pH[i] - pKA1);
aminus = exp / (1.0 + exp);
exp = pow(10.0, pH[i] - pKA2);
aplus = 1.0 / (1.0 + exp);
fi[i] = aminus * aplus;
lnf = log(fipI / fi[i]);
sol[0] = spI;
/* Mtodo de Newton-Raphson para clculo da Equao (4 - 23) */
for (j = 0; j < NITERMAX; j++){
tau = log(sol[j]/spI)-lnf+lam*(sol[j]-spI);
dtau = 1.0 / sol[j] + lam;
sol[j+1] = sol[j] - tau / dtau;
if (fabs(sol[j+1] - sol[j]) < tol){
s[i] = sol[j+1];
cont[k] = cont[k] + 1;
j = NITERMAX + 1;
}
}
F[k] = F[k] + pow(((sexp[i] - s[i]) / sexp[i]), 2.0);
}
F[k] = F[k] + penalty * (nexp - cont[k]);
FUN = FUN + F[k];
}
fclose(ENT);
FUN = sqrt(FUN / (1.0 * ndata * nexp));
return FUN;
}

126

Anexo A Valores de pKA usados nos clculos do quarto captulo

No captulo quatro foram calculadas curvas de solubilidade para diversos


aminocidos, alguns peptdeos e duas molculas com grupos b-lactmicos. Para
tanto foram utilizados valores de pKA destas molculas que esto publicados na
literatura. A Tabela A.1 apresenta estes valores e suas respectivas referncias.

Tabela A.1 - Valores de pKA para aminocidos, peptdeos e molculas com grupos -lactmicos
estudados no captulo quatro.
Molcula
T/K
pKA1
pKA2
Referncias
DL-Alanina

298,15

2,35

9,87

Tseng et al. (2009)

DL-Metionina

298,15

2,12

9,28

Fuchs et al. (2006)

L-Isoleucina

298,15

2,32

9,76

Tseng et al. (2009)

L-Leucina

298,15

2,33

9,74

Tseng et al. (2009)

DL-Fenilalanina

298,15

2,58

9,24

Tseng et al. (2009)

L-Serina

298,15

2,21

9,15

Tseng et al. (2009)

298,15

2,20

9,11

Greenstein e Winitz (1961)

Glicina

298,15

2,34

9,60

Greenstein e Winitz (1961)

Diglicina

298,15

3,12

8,17

Greenstein e Winitz (1961)

Triglicina

298,15

3,26

7,91

Greenstein e Winitz (1961)

Tetraglicina

298,15

3,05

7,75

Greenstein e Winitz (1961)

Pentaglicina

298,15

3,05

7,70

Greenstein e Winitz (1961)

Hexaglicina

298,15

3,05

7,60

Greenstein e Winitz (1961)

Ampicilina

283,1

2,27

7,66

Santana et al. (2010)

288,1

2,24

7,61

Santana et al. (2010)

293,1

2,14

7,45

Santana et al. (2010)

298,1

2,14

7,31

Santana et al. (2010)

283,1

1,98

5,34

Santana et al. (2010)

288,1

2,04

5,25

Santana et al. (2010)

293,1

2,10

5,18

Santana et al. (2010)

298,1

2,20

4,83

Santana et al. (2010)

Tirosina

cido 6-aminopenicilnico

O valor do pKA3 da tirosina utilizado foi 10,07 (GREENSTEIN; WINITZ, 1961).