Abstract: No resumo do artigo, so feitas referncias a vrios aspectos a

ter em conta acerca das antocianinas e sua formao, desenvolvimento e

funes. Ficamos a saber que estas so pigmentos flavonides, sintetizados
no citoplasma e armazenados em vacolos, sendo comuns a vrias plantas,
nas quais se verificam acumulaes densas de 3-10 um de dimetro, s
quais se chama incluses vacuolares de antocianinas (AVIs). Aps isto, fazse referncia ao trabalho do grupo, que fez vrias coisas, tais como analisar
a formao de AVIs em cotildones de Arabidopsis thaliana criada em
condies indutivas de antocianinas, e em Eustoma grandiorum. A partir
deste resumo, ficamos a saber que o grupo estudou mais
pormenorizadamente a invaginao destas acumulaes de pigmento em
vacolos, em particular o mtodo pelo qual isto acontece.

Introduction: acerca das antocianinas, j sabemos que estas so

pigmentos flavonides produzidos por muitas plantas como intermedirio da
via do fenilpropanoide, via responsvel pela produo de muitos metabolitos
secundrios. As antocianinas so derivadas das antocianidinas, que se
acumulam nos vacolos e conferem cores fortes como vermelho e roxo s
flores e frutos, cores estas que so importantes por exemplo para atrair
polinizadores. O mecanismo para o transporte das antocianinas no est
ainda bem esclarecido, e foi deste facto que partiu a investigao descrita
no artigo de que falamos hoje. Os autores falam em dois modelos existentes
para o modo como as antocianinas chegam ao vacolo: o primeiro, the
ligandin model, diz que as antocianinas citoplasmticas se ligam a GSTs (Stransferases especficas de glutationa), que as levam at ao tonoplasto
(membrana do vacolo), onde alguns transportadores de membrana as
inserem no lmen; o segundo, o modelo do transporte vesicular, postula
que as antocianinas entram no lmen do retculo endoplasmtico, e so
transportadas em vesculas para o vacolo. Esta segunda hiptese
baseada na observao de vesculas de RE contendo flavonides em
algumas clulas vegetais (Brassica napus), de vesculas de antocianinas no
citoplasma da folha da videira (Vitis vinfera) e da acumulao de
antocianinas no RE das clulas epidermais de Arabidopsis thaliana. Este
modelo suporta, ento, a teoria de que estes domnios de RE podero ser
endocitados por autofagossomas, e libertados no vacolo, o que nos leva a
um novo conceito, de autofagia.
A autofagia, que pode ser micro- ou macroautofagia, consiste no transporte
de material citoplasmtico, neste caso, para o vacolo. Na macroautofagia,
os autofagossomas, de membrana dupla, formam-se no citoplasma e, ao
fundir-se com a membrana do vacolo, libertam para o seu lmen um corpo
autofgico. Na microautofagia, a membrana vacuolar deforma-se
localmente para endocitar contedos citoplasmticos directamente a partir
deste conhece-se muito pouco sobre este processo nas plantas!!

Se as antocianinas forem realmente transportadas por macroautofagia, aps

a fuso do autofagossoma com o tonoplasto, estas ver-se-iam rodeadas por
duas membranas (a interna, do RE, e a externa, do autofagossoma). Estas
membranas seriam, depois, degradadas.
Podemos, depois desta descrio, problematizar o tpico: Como que
as antocianinas chegam ao vacolo? Neste artigo, descrito um
mtodo que permitiu identificar um mecanismo de microautofagia, em
Arabidopsis e no lisianto, que responde pergunta efectuada. Para o atingir,
utilizaram-se tcnicas bioqumicas e de microscopia.

Results: o primeiro facto que foi testado foi o nmero de membranas dos
AVIs, que se preveria que fossem 2, no caso da macroautofagia (uma
proveniente do RE e outra do autofagossoma), ou nenhuma, no caso da
microautofagia, em que se endocitam directamente pores de citoplasma.
Para determinar a presena de membranas em AVIs, os investigadores
usaram:
- plntulas selvagens, e mutantes tt4 e 5gt de Arabidopsis, criadas
em condies mAIC (5% sucrose) ao qual foi adicionado corante membranar
FM1-43. As mutaes tt4 e 5gt foram escolhidas pois permitem sincronizar a
sntese de antocianinas em incubao com naringenina (flavonide presente
na uva), aumentando bastante a produo de AVIs.
Detetou-se a colorao de FM1-43 em volta das membranas nos trs
gentipos, indicando que, em Arabodpsis, os AVIs so rodeados por
membranas. Analisou-se ainda o caso noutra espcie, o lisianto, que produz
tipicamente grandes quantidades de AVIs (ptalas roxas). Mais uma vez,
confirmou-se a presena de membranas aps incubao, por 48 horas.
Para determinar o nmero de membranas que rodeiam os AVIs analisaramse plntulas congeladas a alta presso do mutante 5gt em meio mAIC, com
o microscpio de transmisso de electres por este mtodo, detetou-se
uma nica membrana, com cerca de 12 nm de espessura.
O segundo facto a sofrer um teste foi o facto de a necessidade de
antocianinas no vacolo provocar a acumulao de antocianinas no RE.
Analisou-se ento a estirpe selvagem de Arabidopsis, com um marcador do
lmen do RE (GFP-HDEL), e os mutantes tt4 e 5gt com um marcador de
membrana do RE (CALNEXIN-GFP), todos em meio mAIC. Foram observados
AVIs nas clulas epidermais do cotildone, mas no foram detetados
depsitos associados ao RE. A relao entre a formao de AVIs e o RE foi
ainda desprezada por clculo do coeficiente da correlao de Pearson (que
nos d o grau de dependncia linear entre duas variveis). Para determinar
se a formao de AVIs depende do trfego vacuolar por endossomas,
testaram-se 16 mutantes, com mutaes em diferentes aspectos do trfego
endossoma-vacolo e na dinmica vacuolar. Incubando estirpes selvagens e
mutantes em meio mAIC durante 5 dias e aplicando ortovanadato de sdio
(estimula a acumulao de AVIs em plntulas selvagens) por 24 horas,

notou-se que todos os mutantes conseguiram formar AVIs em

concentraes comparveis s estirpes selvagens, o que sugere que a

funo de transporte endossoma/vacolo no essencial para

a formao de AVIs.
O terceiro teste que feito relativo ao modo como as antocianinas so
endocitadas pelo tonoplasto. Neste caso, apenas se utiliza o mutante 5gt,
que produz AVIs em maior quantidade. Obtendo imagens de microscopia
confocal das plntulas desta estirpe, marcados com o marcador de
tonoplasto TIP-CFP, assim como de seces em srie de 5gt em meio mAIC
por TEM (microscopia de transmisso de electres), detectaram-se
agregados de antocianinas fora do vacolo, muito prximos da face
citoplasmtica do tonoplasto, e foi observada a sua progresso atravs das
imagens obtidas:
- nas figuras 2A a 2F, os agregados citoplasmticos de antocianinas
esto pressionados contra o tonoplasto, o que parece envolver as
antocianinas numa membrana dupla. Eventualmente, a parte distal do
tonoplasto funde-se com a estrutura externa, e fecha, e as duas membranas
perdem continuidade. Em alguns casos, nas figuras 2E e 2F, a membrana do
AVI exposta ao lmen vacuolar parcialmente degradada. Para confirmar o
numero de camadas de tonoplasto associadas formao de AVIs, mediu-se
a intensidade da fluorescncia de TIP-CFP das clulas do cotildone de 5gt,
e verificou-se que esta era duas vezes mais elevada, o que confirmou a
presena de uma dupla membrana na zona dos agregados de antocianinas.
- num estgio mais avanado, a membrana exterior do tonoplasto
comea a separar-se da membrana interior do AVI nalgumas reas, gerando
um perfil lobado, como conseguimos ver nas imagens 2G a 2I. Finalmente,
quando as duas membranas se separam completamente, o AVI rodeado por
uma membrana simples libertado no lmen (figuras 2J a 2L). O grupo
confirmou que as membranas que rodeavam o AVI eram realmente
derivadas do tonoplasto por immunogold detection da protena da
membrana endgena do tonoplasto, TIP, em Arabidopsis 5gt (figuras 2M a
2P).
Para estudar a organizao do tonoplasto associado formao de AVIs,
analisaram-se reconstrues tridimensionais a partir de microscopia de
transmisso de electres, e concluiu-se que o tonoplasto, alm de rodear o
agregado de antocianinas, tambm forma algumas convolues no interior
do agregado, tal como podemos ver na figura 5.Estas observaes
mostram, portanto, que os agregados de antocianinas no citoplasma se
encontram associados ao tonoplasto, que depois os endocita num processo
semelhante microautofagia. Relativamente a esta semelhana, foi testado
se a protena essencial autofagia, ATG5, era necessria formao de
AVIs. Para isto, usou-se um mutante atg5 5gt e quantificaram-se os AVIs em
cotildones incubados em meio mAIC, tendo-se verificado que no havia
diferenas significativas entre os dois tipos de mutantes. Seguidamente,

testou-se o efeito do wortmannin, um inibidor da fosfatidilinositol-3-cinase,

no bloqueio da formao de AVIs num mutante duplo tt4 5gt, por exemplo
no permitindo que o tonoplasto se deformasse em volta de agregados de
antocianinas. Aps incubar os mutantes em meio mAIC, e de a produo de
AVIs se manter constante durante 6-7h, foi adicionado wortmannin, no se
detectando mudanas no numero de AVIs por unidade de rea em plntulas
tratadas com wortmannin (figura 6C). Conclui-se, portanto, que os AVIs se
formam por um mecanismo de microautofagia que no depende, nem de
ATG5, nem da actividade de fosfatidilinositol-3-cinase.
Procedeu-se, depois, comparao entre dois tipos de depsitos de
antocianinas: difusos e em AVIs, atravs da anlise das suas propriedades
de fluorescncia. Sabe-se que ambos os tipos de depsitos emitem numa
gama de 600-660nm quando excitados com luz verde, o que indica que a
compartimentalizao subcelular no afeta as propriedades espetrais.
Analisou-se o tempo de vida da fluorescncia, que uma propriedade
intrnseca dos fluorforos, independente da sua concentrao, espessura da
amostra ou intensidade da fluorescncia, mas que sensvel ao
microambiente molecular, associaes proteicas e lipdicas, modificaes
moleculares, mudanas conformacionais e de pH. Atravs da FLIM
(fluorescence lifetime imaging microscopy), geram-se imagens baseadas em
diferenas nos diferentes estados excitados de um fluorforo, o que se
reflecte em diferenas no seu microambioente ou conformaes
moleculares. Assim, tanto in vivo como in vitro, modelou-se este parmetro
atravs de uma funo exponencial dupla, sendo que a maioria dos fotes
exibia um tempo de vida de fluorescncia menor (ver esta parte!!!!!) O
facto de a fluorescncia se encontrar tanto in vivo como in vitro indica que
esta caracterstica intrnseca das antocianinas. Comparando a mdia
pesada dos dois componentes do tempo de vida de fluorescncia para as
antocianinas nos mutantes e na estirpe selvagem, verifica-se que os dois
tipos de agregados exibem diferenas significativas neste parmetro. Nos 3
gentipos, a mdia do tempo de vida de fluorescncia dos AVIs foi inferior
dos agregados difusos, resultados estes que so consistentes com o facto
de os dois tipos de agregados terem diferentes tipos de antocianinas e/ou
diferenas nos microambientes e nas interaces com outros factores
celulares.
O teste seguinte est relacionado com a biognese de AVIs na estirpe
selvagem e nos mutantes 5gt, que primeira vista, semelhante em
ambos. Para investigar mecanismos possveis de agregao de antocianinas
no citoplasma, analisou-se a composio qumica de AVIs e de agregados
solveis do lmen vacuolar. O mutante 5gt produz AVIs em muito maior
quantidade, acumulando C3G (cianidina-3-O-glucsido) e seus derivados.
Assim, extraram-se antocianinas de estirpes de 5gt removendo, primeiro,
os agregados difusos e solveis do vacolo, aquecendo as amostras em
gua a 70C durante 3s, seguido de uma extraco metanlica das
antocianinas remanescentes (AVIs). Analisando estas fraces por HPLC e
de seguida identificando os picos por espectrometria de massa ,

determinou-se que a poro difusa (solvel) rica em cyanindin-3sambubiose, enquanto que nos AVIs rica em coumarylated cyanidin-3sambubiose derivatives. A primeira apresenta um tempode vida de
fluorescncia maior do que a segunda, o que se poder dever s diferenas
na sua constituio nestes compostos.
Os flavonides podem ligar-se a membranas e, in vitro, a interaco das
antocianinas com lpidos neutros resulta na formao de estruturas
semelhantes a AVI. Para investigar a possibilidade dos lpidos neutros
participarem na agregao de antocianinas em corpos redondos no
citoplasma, testou-se a presena destes em AVIs do mutante 5gt utilizando
corantes especficos:
- O Nile Blue foi usado para detetar principalmente lpidos neutros;
- O Bodipy usado para leos e lpidos apolares.
Nenhum dos dois corantes acusou antocianinas em AVI, apesar de ambos os
corantes acusarem corpos lipdicos em ambos os tipos de clulas, o que
sugere que as antocianinas contidas em AVIs no esto associadas a lpidos
neutros.
Por ltimo, explorou-se a possibilidade de existir uma molcula de ligao
que possa afetar a solubilidade das antocianinas. Como dito anteriormente,
os GSTs (transferases de glutationa) tm um papel conhecido no transporte
e ligao s antocianinas. No caso da Arabidopsis, estes transportadores
so codificados pelo TT19, que consegue ligar cianidina e cianidina-3-Oglucsido in vitro, aumentando a sua solubilidade em gua. Deste modo, os
mutantes tt19 no conseguem acumular antocianinas no vacolo. Assim,
investigou-se o papel de TT19 na preveno da agregao de antocianinas
no citoplasma.
- Primeiro, analisou-se a distribuio de antocianinas em mutantes
tt19 que, apesar de no apresentarem grandes concentraes desta,
quando incubados em meio mAIC com suplemento de naringenina,
produziam pequenas quantidades de pigmento com um perfil semelhante
ao da antocianina (figs 9A e 9B). Ao observar cotildones desta estirpe
mutante, detetam-se agregados citoplasmticos de antocianinas e AVIs
rodeados de uma membrana, mas muito poucos agregados vacuolares
solveis no citoplasma (figura 9A novamente). Estes resultados sugerem
que TT19 necessrio para a manuteno das antocianinas solveis
citoplasmticas nas estirpes selvagens de Arabidopsis, e a sua ausncia
leva formao de agregados de antocianinas e AVIs no citoplasma.
Para testar se a sobreexpresso de TT19 pode reduzir a agregao de
antocianinas e formao de AVIs no mutante 5gt, pode sobreexpressar-se o
gene funcional GFP-tagged TT19, com o promotor constitutivo CaMV35S
esta sobreexpresso no reduz a densidade de agregados de antocianinas
nem de AVIs, o que sugere que o excesso de TT19 no reduz este processo.

Discussion:
AVI formation envolve um processo de micro-autofagia pouco convencional
porque, primeiro, no depende da maquinaria ATG(autophagy related),
segundo, independente da atividade phosphatidylinositol 3-cinase
(necessria deformao do tonoplasto, geralmente) e terceiro, porque a
prpria ligao da membrana do vacolo ao agregado antocinico parece
conduzir sua prpria deformao de modo a formar AVIs.
Nota: Em gentipos diferentes de Arabidopsis, a composio antocinica e a
disponibilidade de flavonoides relacionados com Glutationa S-trasnferases
afeta a frequncia de AVIs.
- Apesar do outcome da macro e da micro autofagia ser o mesmo, so dois
eventos que envolvem dinmicas membranares mto diferentes. A macro
envolve a formao de um autofagossoma no citoplasma para rodear o
contedo, a micro envolver deformao local da membrana vacuolar!
A microautofagia, apesar de pouco caracterizada em comparao com a
macro, j foi observada como sendo usada em Saccharomyces cerevisae
para o uptake de componentes citosolicos atravs de invaginaes
tubolares do tonoplasto, assim como tambm em processos de direta
absoro de componentes maiores como mitocndrias, endossomas e
fragmentos nucleares por parte de vacolos e de lisossomas. Em clulas
mamferas, o lissosoma usa o mesmo processo que os AVIs para incorporar
componentes citoplasmticos. No entanto, os AVIs no usam maquinaria
ATG como nos processos de incluso referidos e mais comuns.
Vacuolar bulbs: so complexas invaginaes locais do tonoplasto que
podem servir como reservatrios da membrana para rpidas mudanas do
volume vacuolar
Intravacuolar spherical structures: formadas naturalmente pelas plantas,
so invaginaes da dupla membrana do tono plasto
No entanto, ao contrrio destas 2 estruturas vacuolares, os AVIs formam-se
por evaginaes e no invaginaes do tonoplasto, como comprovado pelo
uso de mutaes no SNARE VTI11 e wortmannin que interferem na
formao dos bulbs mas no alterando a formao de AVIs em Arabidopsis.
aVelcrolikeassociationbetweenthesurfaceoftheanthocyaninaggregatesandthecyto
plasmicfaceofthetonoplast.Indeed,thisassociationissotightthatinsomeAVIsthetonoplast
formsaconvolutednetworkcloselyadheredtocrevicesinsidetheanthocyanincore(Fig.5)
Atualmente,aindasodesconhecidasasmolculasparticipantesnestainteraoantocianinas
tonoplasto,masfalasequeosflavonoidessocapazesdeseligaramembranas,podendo
interagircomotonoplastodiretamente.
Itispossiblethat,inspeciesthatproducesAVIs,anthocyaninsaggregateandbindthesurface
ofthevacuolarmembraneastheyarebeingsynthesized,inducinglocaldeformationsofthe
tonoplast.

Estemecanismoapresentadonesteartigoummecanismoalgorevolucionrio,contradizendo
muitaliteratura.
Densosdepsitosdeantocianinasforamobservadosdentrodecompartimentospre
vacuolares,pequenasvesculasevesculasnauva,arabidopsiselisianthus.
MuitasdestasestruturaspodemrespondercomointermediriosprimordiaisdosAVIs
AmembranadosAVIsprovenientedotonoplastopodeserdegradadacomotempo,podendo
haverAVIsquepercamparcialmenteassuasmembranasnovacolo.
AidentificaodefosfolpidostonoplsticosemAVIsdauva(Connetal.,2010)corroborama
hipteseapresentada.
NOTA:Esteestudofoioprimeiroausarcongelamentosobrealtaspressesdemodoa
preservarmelhorasmembranascelulares,paraquesejapossvelumaboaobservaoeanlise
dosvacolosedosAVIs,doquesefossemusadasapenastcnicasdefixaoqumicacomo
noutrosestudos.
Modelo:
1- Os agregados antocianicos citoplasmticos associam-se com o
tonoplasto e so rodeados por protuses tonoplsticas de dupla membrana.
No s rodeia os agregados como tambm se insere nos seus ncleos,
reforando ainda mais o abrao e a interao.
2- As duas membranas que rodeiam os agregados comeam a separar-se e
estes espaos comeam a encher-se de contedo vacuolar, de lmen
vacuolar, volta do agregado, formando o AVI.
3- As duas membranas separam-se completamente e o recente formado
AVI libertado para o lmen do vacolo, rodeado por uma membrana justa
derivada do tonoplasto.
Como que os agregados se formam no citoplasma ?
Alguns flavonoides agregam-se espontaneamente via interao pelos seus
glicosil e 3-deoxyanthocyanidins, organizando-se em agregados redondos
que se ligam e destabilizam a membrana plasmtica em caso de ataque
fngico por exemplo.
Similartograpevinebutdifferentfromlisianthus,the5gtmutantformsAVIsthatareenriched
inacylatedanthocyanins,suggestingarathercomplexandlikelyspeciesspecificconnection
betweenanthocyaninstructureandsequestrationintoAVIs.
AconcentraodeantocianinastmbinfluenciaaformaodeAVI.
OpapeldoTT19easuarelaocomasGSTsemantocianinastemsidoalgocontroversa,no
entanto,segundoesteestudo:
Ourresultsdemonstratethatthepatternofanthocyaninsintt19mutantsisequivalenttothatof
thewildtype(Figure9).However,tt19seedlingsproduceAVIsinhighdensity(Figure9)
despitethelowlevelsofanthocyanins,indicatingthatthelackofTT19triggerstheaggregation

ofanthocyaninsthatotherwisearesolubleinwildtypeplants.
TT19functionsbyincreasingthesolubilityofanthocyanin,preventingtheformationof
anthocyaninaggregates

Poderestemecanismoseraplicadoaoutrassubstncias?
InclusesvacuolaresdetaninostmbjforamobservadasnopinheirodocanadeemPinus
elliotti.
Emmutantesdearabidopsissemasenzimasnecessriasparasintetizarasantocianinas,foram
observadasestruturastipovesculascontendopercursoresdeproanthocyanidins.
AtnosprpriosAVIsdauvaforamjdetetadosproanthocyanidinsparaalmdeantocianinas.
Eoutrostantosjencontradoseminclusesdognero,podendoserformadaspelomesmo
mecaismo,emboraainformaodisponvelsobreestasoutrasinclusesintravacuolaresseja
poucaainda.