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Introduo

Enzimas so substncias normalmente de natureza proteica que agem como


catalisadoras em reaes que normalmente levariam muito tempo para ocorrer, ou at
no ocorreriam. Esta funo de catlise ocorre pois a enzima consegue reduzir a
energia de ativao necessria para que uma reao ocorra. A maior parte das
enzimas conhecidas est presente no organismo dos seres vivos, participando de seu
metabolismo, no entanto a capacidade cataltica de certas enzimas torna-as
adequadas para a utilizao em processos industriais. As enzimas so extremamente
especficas em relao reao na qual elas atuam devido sua estrutura especial,
que contm um centro ativo onde o substrato interage com a enzima.

A habilidade da enzima de se ligar a um substrato denominada atividade


biolgica e depende principalmente da estrutura tridimensional da enzima e da
natureza do substrato. Devido essa dependncia da estrutura tridimensional, as
enzimas possuem uma sensibilidade grandes variaes de temperatura ou pH, que
podem causar sua desnaturao e a inativao de suas funes biolgicas.

A velocidade com que a reao catalisada por uma enzima ir ocorrer depende de
diversos fatores: a concentrao do substrato assim como a da enzima, o pH e a
temperatura do meio. Geralmente um aumento n as concentraes t anto do substrato
como da enzima geram um aumento na velocidade da re ao. No entant o, caso a
concentrao de substrato seja muito elevada em relao de enzima, p ossvel
que as enzimas fiquem saturad as, tendo todos os seus stios ativos ocupados em
determinado instante. A partir deste ponto um aumento n a concentrao de
substrato, sem aumento na con centrao de enzima, no ir au me ntar a velocidade
da reao.

Alm disso, a at ividade enzimtica n ormalmente restringe -se a uma pequena faixa
de pH. Isto se deve ao fato de que as mudanas n o pH geram variaes no estado de
ionizao dos componentes da enzima. Geralmente as enzimas possuem muitos grupos
ionizveis, e f ora do seu pH timo d e atuao a ionizao destes grupos inativa
os stios de ligao com o substrato.

A temperatura influencia as reaes enzimticas de duas maneiras: primeiramente


ocorre um aumento de velocidade proporcional ao aumento de temperatura, porm isso
tambm gera um aumento na instabilidade da protena, levando desnaturao e
consequente perda d a atividade enzimtica. Toda enzima possui uma temperatura
tima na q ual atinge a atividade mxima, em temperaturas maiores a velocidade da
reao comea a cair devido ao processo de desnaturao.

Tambm existe m substncias d enominadas inibidores que t em como funo reduzir a


velocidade de determinada reao. No caso de reaes catalisadas por enzimas, os
inibidores geralmente atuam de alguma forma na enzima, reduzindo sua atividade. Os
inibidores podem ser d e dois tipos principais, reversveis ou irreversveis.
Dentre os inibidores reversveis, existem quatro tipos: inibidores competitivos,
no competitivos, acompetitivos e mistos.

Os inibidores competitivos possuem estrutura semelhante a do substrato e reduzem a


velocidade da reao ao ligarem-se nos stios ativos das enzimas, impedindo assim
com que ela se ligu e ao substrato. J os no competitivos ligam - se a radicais
que no p ertencem ao grupo ativo da enzima, essa ligao gera uma mudana
estrutural que inviabiliza a catlise.

Os inibidores acompetitivos t ambm ligam -se a radicais que no pertencem ao grupo


ativo da enzima, no en tanto, enquanto que os no compet itivos pod em ligar -se
tanto enzima ou ao complexo enzima -substrato, os inibidores acompetitivos s
ligam-se ao complexo enzima-substrato. A inibio mista assemelha-se inibio no
competitiva, p orm neste caso o complexo enzima-inibidor-substrato possui
atividade enzimtica residual.

Os inibidores irreversveis ligam-se ao centro ativo da enzima e formam ligaes


covalentes ou peptdicas com ele, inativando permanentemente a enzima.

Material

? Soluo padro de p-nitrofenol (PNP) 0,1 mM em tampo Tris -HCl pH 9,5


? Soluo de p-nitro-fenil-fosfato (PNPP) 1 mM tampo Tris- HCl pH 9,5
? Soluo tampo Tris-HCl 0,2 M, pH 7,5, 8,5 e 9,5
? Soluo de Na2HPO4 0,4 mM em t ampo Tris-HCl 0,2 M, pH 9,5 (sol. tampo Tris-Pi-
HCl)
? Solues tampo borato-NaOH 0,3 M, pH 9,5, 10,5 e 11,5
? Solues tampo citrato HCl 0,2 M, pH 5,5, 6,5 e 7,5
? Soluo de NaOH 2 M
? Soluo de enzima: fosfatase alcalina 2 ?g/mL (Sigma Fine Chemicals - EC 3.1.3.1)

? Pipetador automtico 20 - 200 ?L (Gilson)


? 2 Pipetas de 1 mL
? 2 Pipetas de 2 mL
? Pipeta de 5 mL
? 2 Pipetas de 10 mL
? 2 Pr-pipetes
? 22 Tubos de ensaio
? Vortex (QL-901)
? Banho de gelo (0 oC)
? Banho-maria (37 oC) (Biomatic)
? Banho-maria (68 oC) (Tisatom)
? 16 Cubetas
? Espectrofotmetro (Biospectro Espectrofotmetro SP -220)

Mtodos

A) Construo da curva padro de PNP:

Utilizando-se a pipeta de 2 mL com o auxlio do pr -pipete foi f eita a


transferncia de alquotas da soluo de PNP para t ubos de ensaio numerados de 1 a
6 nesta sequncia: 0,3 mL; 0,6 mL; 0,9 mL; 1,2 mL; 1,5 mL e 1,8 mL. Em seguida,
utilizando-se uma p ipeta de 5 mL, adicion ou-se uma alquota de 3,2 mL de tampo
Tris-HCl ao tub o id entificado como B (branco) e as seguintes alquotas do mesmo
tampo aos tubos numerados de 1 a 6: 2,9 mL; 2,6 mL; 2,3 mL; 2,0 mL; 1,7 mL e 1,4
mL. En to utilizando-se a pipeta de 1 mL adicionou- se u ma alquota de 1,0 mL da
soluo de NaOH a cada um dos tubos.

Utilizou-se o vrtex para a homogeneizao d as solues e em seguida foi feita a


leitura da absorbncia utilizando-se o espectrofotmetro.

B) Curso temporal:

Transferiu-se, com o auxlio de uma pip eta de 10 ,0 mL e um pr -pipete, as


seguintes alquotas para um Erlenmeyer de 100,0 mL:

- 20,0 mL de tampo Tris-HCl


- 10,0 mL de PNPP

Em seguida incubou-se o Erle nmeyer contendo a soluo result ante em um banho-


maria a 37 oC por 5 minutos e ap s este tempo adicionou -se 2,0 mL de enzima
fosfatase alcalina. Retirou-se uma alquo ta de 3,2 mL da solu o que foi colocada
no tubo marcado como B (branco) e novamente in cubou- se o Erlenmeyer no banho-
maria a 37 oC.

Iniciou-se a contagem do tempo e ret iraram-se alquotas de 3,2 mL d a soluo para


ser colocada nos tubo s de 1 a 8 no s seguintes tempos: 3 minutos, 6 min utos, 9
minutos, 12 minutos, 15 minutos, 20 minuto s, 30 minutos e 45 minutos. Aps a
retirada de cada alquota adicionou -se 1,0 mL da solu o de NaOH no tubo. Assim
que foi retirada a ltima alquota e f oi adicionado NaOH a ela foi feit a a
leitura dos valores de absorbncia no espectrofotmetro, utilizando o tubo branco
para a calibrao do
aparelho.

C) Influncia do pH:

Transferiu-se, com o auxlio da pipeta e do pr -pipete, alquotas das solues


indicadas para os tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo:

Tab.1

Incubou-se os tubos em banho -maria a 37 oC durante 5 minutos e, aps este tempo,


utilizando-se um pipetador automtico, adicionou- se 0,2 mL de enzima a cada um dos
tubo s marcados de 1 a 9, com intervalo de 30 segundos. Em seguida u tilizou -se o
vrtex p ara homogeneizar os t ubos e foram incubados e m banho- maria a 37 oC por
15 minutos.

Aps o trmino destes 15 minutos, utilizando- se u ma pipeta e um pr -pipete,


adicionou-se uma alquota de 1,0 mL de NaOH a cada um do s tubos marcados de 1 a 9,
com intervalo de 30 segundos entre cada tubo. Ento adicion ou-se a mesma alquot a
de NaOH aos tubos brancos, desta vez sem intervalo entre cada tubo, seguido pela
adio de 0,2 mL da enzima utilizando-se o pipetador automtico.

Em seguida homogeneizou-se todos os tubos e procedeu -se a leitura


espectrofotomtrica, utilizando os tubos brancos de cada tampo como referncia
para calibrao do aparelho.

D) Influncia da temperatura:

Transferiu-se, com auxlio d a pipeta e do pr-pipete, alquotas de 2,0 mL da


soluo de tampo Tris-HCl e 1,0 mL da soluo de PNPP para tubos de en saio
rotulados de 1 a 4 e de B1 (primeiro tubo branco) a B4. Os tu bos f oram colocados
em incubao durante 5 minutos em diferentes temperaturas para cada tubo:

1 e B1 0 oC
2 e B2 temperatura ambiente
3 e B3 37 oC
4 e B4 68 oC

Aps a incubao, utilizando-se o pipetador automtico adicionou -se 0,2 mL d e


enzima a cada um dos tu bos de 1 a 4, em intervalos de 30 segundos. Foi feita a
homogeneizao dos tubos com o vrtex em seguida e colocou- se novamente os tubos
em suas respectivas temperaturas por 15 minutos.

Ao trmino destes 15 minutos adicionou -se uma alq uota de 1,0 mL de NaOH a cada
um dos tubos utilizando-se a pipeta e um pr-p ipete. Nos tubos brancos tambm foi
adicionado 0,2 mL de enzima aps a adio do NaOH. Realizou -se a homogeneizao
dos tubos no vrtex novamente e foi feita a leitura no espectrofotmetro.

E) Curva de Substrato

Transferiram-se, com o auxlio da pipeta e do pr-pip ete, alquotas das solues


de tampo Tris-HCl e PNPP para tubos de en saio devidamente rotulados seg undo a
tabela abaixo:

Tab.2

Em seguida os tubos foram incubado s a 37 oC durante 5 minutos. Aps este tempo


utilizou-se um pipetador auto mtico para adicionar 0,2 mL de enzima aos tubos
numerados de 1 a 9 com intervalos de 30 segund os entre cada tubo. Ao ad icionar a
enzima ao ltimo tubo eles foram homogeneizados com o vrtex e novamente colocados
no banho-maria a 37 oC por 15 minutos.

Ao trmino destes 15 min utos, adicionou -se 1,0 mL de NaOH a cada um dos tubos com
intervalos de 30 segundo s e tambm adicionou -se 0,2 mL da enzima ao tubo branco
aps ter sido adicionado o NaOH. Em seguida foi realizada a homogeneizao dos
tubos novamente e a leitura dos dados espectrofotomtricos.

F) Influncia do inibidor:

Com o auxlio de uma pipeta e um pr -pipete retiraram-se alquotas das solues de


tamp o Tris-PI-HCl e PNPP que foram colocadas em t ubos de ensaio rotulados
segundo a tabela abaixo:

Tab.3

Em seguida os tubos foram incubados em banho -maria a 37 oC durante 5 minutos. Ap


s este tempo utilizou-se um pipetador automtico para adicionar 0,2 mL de enzima
aos tub os numerados de 1 a 9 com intervalos de 30 segundos entre cada tubo. Ao ad
icionar a enzima ao ltimo tubo eles foram homogeneizados com o vrtex e novamente
colocados no banho- maria a 37 oC por 15 minutos.

Ao trmino destes 15 min utos, adicionou -se 1,0 mL de NaOH a cada um dos tubos com
intervalos de 30 segundo s e tambm adicionou -se 0,2 mL da enzima ao tubo branco
aps ter sido adicionado o NaOH. Em seguida foi realiz ada a homogeneizao dos
tubos novamente e a leitura dos dados espectrofotomtricos.

Objetivos

Observar o efeito de fatores fsicos (pH e temperatura) e qumicos (concentrao e


presena de inibidor) sobre uma reao catalisada pela enzima fosfatase alcalina.

Resultados

Os resultados obtidos na prtica, foram organizados nas seguintes tabelas:

Construo de uma curva padro de PNP

Calculo de n nmoles de PNP

[PNP] = 0,1mM = 1,0 x10^5 nM


1,0 x 10^5 nmoles PNP ----- 1000mL
X ----- VPNP mL
X = VPNP x 10^2

Tab.4

Influencia do pH

Tab.5
Como y = a x , onde y a absorbncia, a 4,43 x 10-3 e x o n de nmoles de
PNP, pode ser calculado o n de nmoles de PN P presente em cada tubo aps a
paralisao da reao enzimtica:

Tubo 1 : ABS = 0,056


0,056 = 4,43 x10-3 . x1 ? x1 = 12,64
Tubo 2: ABS = 0,070
0,070 = 4,43 x10-3 . x2 ? x2 = 15,80
Tubo 3 : ABS = 0,061
0,061 = 4,43 x10-3 . x3 ? x3 = 13,77
Tubo 4 : ABS = 0,147
0,147 = 4,43 x10-3 . X4 ? x4 = 33,18
Tubo 5 : ABS = 0,254
0,254 = 4,43 x10-3 . x5 ? x5 = 57,33
Tubo 6 : ABS = 0,452
0,452 = 4,43 x10-3 . x6 ? x6 = 102,03
Tubo 7 : ABS = 0,061
0,061 = 4,43 x10-3 . x7 ? x7 = 13,77
Tubo 8 : ABS = 0,059
0,059 = 4,43 x10-3 . x8 ? x8 = 13,32
Tubo 9 : ABS = 0,031
0,031 = 4,43 x10-3 . x9 ? x9 = 7,00

Sabendo o nmero de nmoles de PNP pode ser calculad a a velocidade da reao,


dividindo o numero de nmoles pelo tempo. O tempo usado no clculo foi de 16
minutos. Foi acrescentado 1 minuto a mais alm do tempo de reao terico para
contar o tempo que foi u sado p ara o transporte dos tubos at o banho maria e
qualquer eventual atraso que ocorreu na prtica:

Tubo 1 : Vo = n nmoles de PNP / tempo


Vo = 12,64 / 16 ? Vo = 12,64
Tubo 2 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 15,80 / 16 ? Vo = 9,88 x10-1
Tubo 3 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 13,77 / 16 ? Vo = 8,61 x10-1
Tubo 4 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 33,18 / 16 ? Vo = 20,7 x10-1
Tubo 5 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 57,33 / 16 ? Vo = 35,8 x10-1
Tubo 6 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 102,06 / 16 ? Vo = 63,7 x10-1
Tubo 7 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 13,77 / 16 ? Vo = 8,61 x10-1
Tubo 8 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 13,32 / 16 ? Vo = 8,33x10-1
Tubo 9 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 7,00 / 16 ? Vo = 4,38 x10-1

Influencia da temperatura

Tab.6

Como y = a x , onde y a absorbncia, a 4,4 3 x 10-3 e x o n de nmoles de


PNPP, p ode ser calculado o n de n moles de PNP P presente em cada tubo aps a
paralisao da reao enzimtica:

Tubo 1 : ABS = 0,112


0,112 = 4,43 x10-3 . x1 ? x1 = 25,28
Tubo 2: ABS = 0,285
0,285 = 4,43 x10-3 . x2 ? x2 = 64,33
Tubo 3 : ABS = 0,400
0,400 = 4,43 x10-3 . x3 ? x3 = 90,29
Tubo 4 : ABS = 0,158
0,158 = 4,43 x10-3 . X4 ? x4 = 35,67

Sabendo o n mero de nmoles de PNP pode ser calculad a a velocidade da reao,


dividindo o numero de nmoles pelo tempo. O tempo usado no clculo foi de 16
minutos. Foi acrescentado 1 minuto a mais alm do tempo de reao terico para
contar o tempo que foi u sado p ara o transporte dos tubos at o banho maria e
qualquer eventual atraso que ocorreu na prtica:

Tubo 1 : Vo = n nmoles de PNP / tempo


Vo = 25,28 / 16 ? Vo = 15,80 x10-1
Tubo 2 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 64,33 / 16 ? Vo = 40,21x10-1
Tubo 3 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 90,29 / 16 ? Vo = 56,43 x10-1
Tubo 4 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 35,67 / 16 ? Vo = 22,30 x10-1

Curso temporal

Como y = a x , onde y a absorbncia, a 4,4 3 x 10-3 e x o n de nmoles de


PNPP, p ode ser calculado o n de n moles de PNP P presente em cada tubo aps a
paralisao da reao enzimtica:

Tubo 1 : ABS = 0,056


0,056 = 4,43 x10-3 . x1 ? x1 = 12,64
Tubo 2: ABS = 0,138
0,138 = 4,43 x10-3 . x2 ? x2 = 31,15
Tubo 3 : ABS = 0,205
0,205 = 4,43 x10-3 . x3 ? x3 = 46,95
Tubo 4 : ABS = 0,235
0,235 = 4,43 x10-3 . X4 ? x4 = 53,05
Tubo 5 : ABS = 0,294
0,294 = 4,43 x10-3 . X4 ? x5 =66,37
Tubo 6 : ABS = 0,380
0,380 = 4,43 x10-3 . X4 ? x6 = 85,78
Tubo 7 : ABS = 0,557
0,557 = 4,43 x10-3 . X4 ? x7 = 125,73
Tubo 8 : ABS = 0,782
0,782 = 4,43 x10-3 . X4 ? x8 = 176,52

Curva de substrato

Como y = a x , onde y a absorbncia, a 4,4 3 x 10-3 e x o n de nmoles de


PNPP, p ode ser calculado o n de n moles de PNP P presente em cada tubo aps a
paralisao da reao enzimtica:

Tubo 1 : ABS = 0,147


0,147 = 4,43 x10-3 . x1 ? x1 = 33,18
Tubo 2: ABS = 0,284
0,284 = 4,43 x10-3 . x2 ? x2 = 64,11
Tubo 3 : ABS = 0,354
0,354 = 4,43 x10-3 . x3 ? x3 = 79,91
Tubo 4 : ABS = 0,376
0,376 = 4,43 x10-3 . X4 ? x4 = 84,88
Tubo 5 : ABS = 0,450
0,450 = 4,43 x10-3 . X4 ? x5 =101,58
Tubo 6 : ABS = 0,536
0,536 = 4,43 x10-3 . X4 ? x6 = 120,99
Tubo 7 : ABS = 0,553
0,553 = 4,43 x10-3 . X4 ? x7 = 124,83
Tubo 8 : ABS = 0,591
0,591 = 4,43 x10-3 . X4 ? x8 = 133,41
Tubo 9 : ABS = 0,636
0,636 = 4,43 x10-3 . X4 ? x9 = 143,57
Tubo 10 : ABS = 0,663
0,663 = 4,43 x10-3 . X4 ? x10 = 149,66
Tubo 11 : ABS = 0,646
0,646 = 4,43 x10-3 . X4 ? x11 = 145,82
Tubo 12 : ABS = 0,695
0,695 = 4,43 x10-3 . X4 ? x12 = 156,88
Tubo 13 : ABS = 0,676
0,676 = 4,43 x10-3 . X4 ? x13 = 152,60

Sabendo o nmero de nmoles de PNP pode ser calculada a velocidade da reao,


dividindo o numero de nmoles pelo tempo. O tempo usado no clculo foi de 16
minutos. Foi acrescentado 1 minuto a mais alm do tempo de reao terico para
contar o tempo que foi u sado p ara o transporte dos tubos at o banho maria e
qualquer eventual atraso que ocorreu na prtica:

Tubo 1 : Vo = n nmoles de PNP / tempo


Vo = 33,18 / 16 ? Vo = 20,74 x10-1
Tubo 2 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 64,11 / 16 ? Vo = 40,07 x10-1
Tubo 3 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 79,91 / 16 ? Vo = 49,94 x10-1
Tubo 4 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 84,88 / 16 ? Vo = 53,05 x10-1
Tubo 5 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 101,58 / 16 ? Vo = 63,49 x10-1
Tubo 6 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 120,99 / 16 ? Vo = 75,62 x10-1
Tubo 7 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 124,83 / 16 ? Vo = 78,02 x10-1
Tubo 8 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 133,41 / 16 ? Vo = 83,38 x10-1
Tubo 9 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 143,57 / 16 ? Vo = 89,73 x10-1
Tubo 10 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 149,66 / 16 ? Vo = 93,54 x10-1
Tubo 11 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 145,82 / 16 ? Vo = 91,14 x10-1
Tubo 12 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 156,88 / 16 ? Vo = 98,05 x10-1
Tubo 13 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 152,60 / 16 ? Vo = 95,37 x10-1

A concentrao do substrato presente, foi calculada da seguinte forma para todos os


volumes adicionados:

Volume total de 4,2 mL

Tubo 1 : 1 mmol - 1000mL 1x10-4 mmol 4,2 mL


X - 0,1 mL Y --- 1000 mL
X = 1x10-4 mmol de substrato Y= 2,38 x10-2 mmol = 2,38 x 104 nmol /L
Tab.7

Influencia do inibidor

Tab.8

Como y = a x , onde y a absorbncia, a 4,43 e x o n de nmoles de


PNPP, pode ser calculado o n de nmoles de PNP P presente em cada tubo ap s a
paralisao da reao enzimtica:

Tubo 1 : ABS = 0,039


0,039 = 4,43 x10-3 . x1 ? x1 = 8,80
Tubo 2: ABS = 0,057
0,057 = 4,43 x10-3 . x2 ? x2 = 12,87
Tubo 3 : ABS = 0,076
0,076 = 4,43 x10-3 . x3 ? x3 = 17,16
Tubo 4 : ABS = 0,116
0,116 = 4,43 x10-3 . X4 ? x4 = 26,18
Tubo 5 : ABS = 0,140
0,140= 4,43 x10-3 . X4 ? x5 =31,60
Tubo 6 : ABS = 0,182
0,182= 4,43 x10-3 . X4 ? x6 = 41,08
Tubo 7 : ABS = 0,230
0,230= 4,43 x10-3 . X4 ? x7 = 51,92
Tubo 8 : ABS = 0,260
0,260= 4,43 x10-3 . X4 ? x8 = 58,70
Tubo 9 : ABS = 0,332
0,332= 4,43 x10-3 . X4 ? x9 = 74,94
Tubo 10 : ABS = 0,411
0,411= 4,43 x10-3 . X4 ? x10 = 92,78
Tubo 11 : ABS = 0,448
0,448= 4,43 x10-3 . X4 ? x11 = 101,13
Tubo 12 : ABS = 0,519
0,519= 4,43 x10-3 . X4 ? x12 = 117,16
Tubo 13 : ABS = 0,563
0,563= 4,43 x10-3 . X4 ? x13 = 127,09

Sabendo o nmero de nmoles de PNP pode ser calculada a velocidade da reao,


dividindo o numero de nmoles pelo tempo. O tempo usado no clculo foi de 16
minutos. Foi acrescentado 1 minuto a mais alm do tempo de reao terico para
contar o tempo que foi u sado p ara o transporte dos tubos at o banho maria e
qualquer eventual atraso que ocorreu na prtica:

Tubo 1 : Vo = n nmoles de PNP / tempo


Vo = 8,80/ 16 ? Vo = 5,50 x10-1
Tubo 2 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 12,87/ 16 ? Vo = 8,04 x10-1
Tubo 3 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 17,16/ 16 ? Vo = 10,72 x10-1
Tubo 4 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 26,18/ 16 ? Vo = 16,36 x 10-1
Tubo 5 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 31,60 / 16 ? Vo = 1,975
Tubo 6 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 41,08/ 16 ? Vo = 2,56
Tubo 7 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 51,92/ 16 ? Vo = 3,24
Tubo 8 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 58,70 / 16 ? Vo = 3,67
Tubo 9 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 74,94/ 16 ? Vo = 4,68
Tubo 10 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 92,78/ 16 ? Vo = 5,80
Tubo 11 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 101,13/ 16 ? Vo = 6,32
Tubo 12 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 117,16/ 16 ? Vo = 7,32
Tubo 13 : Vo = n nmoles de PNP / tempo
Vo = 127,09/ 16 ? Vo = 7,94

A concentrao de substrato nos tubos da prtica de curva de substrato com inibidor


a mesma concentrao nos tubos da prtica de curva de substrato sem inibidor j
que o volume de reagentes adicionados ao tubo obrigatoriamente o mesmo.

Discusso:

Os grficos construdos partir dos dados obtidos na prtica esto anexados no


final do relatrio.

Influencia do pH

Com base nos resultados ob tidos e com a construo do grfico, pode -se concluir
que o tampo de pH ideal para a reao da enzima usada o tampo Tris-HCl de pH
9,5 j que foi onde houve a maior medida de absorbncia, por ter sido onde a maior
q uantidade d e produtos foi gerada comparado aos o utros tampes de pH
diferentes.Pode-se discutir tambm quem o on do tampo utilizado tambm influencia
na reao j qu e a solu o com o t ampo Borato -NaOH de pH 9,5 apresentou uma ab
sorbncia baixa, logo uma baixa form ao de produto.

Vemos ento que tanto a faixa de pH do t ampo quanto o on primrio do tampo


influenciam diretamente na formao de produto da reao.

Influencia da temperatura

A temperatura ideal da enzima usada ( fosfatase alcalina ) de 37C por ter sido
onde houve a maior medid a de absorbncia, indicando que foi quando a maior
quantidade do p roduto PNP foi gerada na reao.Pode -se refletir ento q ue esta
reao catalisada pela enzima atinge sua maior velocidade na temperatura corprea,
demonstrando como a enzima fosfatase alcalina importante para as reaes de
remoo de fosfato no corpo.

Curso temporal

Baseado na absorbncia medida, percebeu -se que quanto maior o tempo de reao
entre PNPP com a enzima fosfatase alcalina, maior a quantidade de produto PNP f
ormado.Sabe-se que ap s determinado tempo de reao, est a no p ossui nenhum
aumento em sua velo cidade, isto , sua velocidade torna -se praticamente
constante. No foi observado tal zona de estagnao, ento podemos concluir q ue a
a velocidade mxima da reao atingida aps 45 minutos.

Curva de substrato

Baseando-se nos resultados obtidos pode -se concluir q ue a velocidade da reao


proporcional concentrao d e substrato at certo ponto, no qual toda a enzima
presente n a soluo est saturada e a velocidade permanecer a mesm a a n o ser
qu e seja adicionada mais enzima. No grfico construdo partir dos dad os obtidos
na prtica no foi possvel visualizar o momento de velocidade mxima da reao de
forma clara porm estima -se que este moment o tem o seu princpio partir do p
onto onde a concentrao d o subst rato 42,86 x 10 -5 mol/L e a velocidade da
reao 9,538 (mais precisamente n a soluo do tubo 13).A partir desse ponto
possvel ver uma rea onde o valor da velocidade cai e sobe para depois cair
novamente.

Influencia do inibidor

Com base nos resultados, perceb eu-se que q uanto menor era a quantidade de
inibidor presente no meio, maior era a medida da absorbncia, ou seja, maior era a
quantidade de produto PNP formada a partir da reao de PNPP com a enzima fosfatase
alcalina.

notrio tambm que p artir de um determinado ponto a diferena entre as medidas


de absorbncia da cu rva de substrato sem inibidor em comparao com as medida da
curva de substrato com inibidor diminuiam, isto , as velocidades ficavam cada vez
mais prximas. Esse detalhe mostra que o momento de velo cidade mxima da reao se
aproxima, de forma q ue, em certo p onto, independente da presena de inibidor ou
no, a re ao vai atingir sua velocidade mxima graas al t a concentrao
de substrato na soluo.

Grfico do mtodo Duplo Recproco , Velocidade mxima e o Km

Foi construdo o grfico do mtodo Duplo Recproco u sando os valores de 1/V0 e 1/


[Substrato]. O grfico f oi construdo de t al forma que o eixo y apresen tava os
valores de 1/V0 e o eixo x os valores de 1/[Substrato]. Os valores foram os
seguintes

Curva de substrato sem inibidor


1/V0 (nmoles / min) 1/[Substrato] (nMol/L)
0,4822 4,20 x 10-5
0,2496 2,10 x 10-5

Curva de substrato com inibidor


1/V0 (nmoles / min) 1/[Substrato] (nMol/L)
1,82 4,20 x 10-5
1,24 2,10 x 10-5

Aps confeccionado o grfico pode-se montar uma funo linear para cada uma das
curvas, no intuito de descobrir a velocidade mxima e o Km de cada curva.

A funo de cada curva foi obtida utilizando o programa de computador Microsoft


Excel 2011.As funes foram :

Funo da curva de substrato s/inibidor Funo da curva de substrato


c/inibidor
Y = 9,01 x 103 * X + 0,0861 Y = 4,40 x 104 * X + 0,1309

Sabe-se que o inverso da velocidade mxima p ode ser calculado achando o valor de Y
o nde o valor de x = 0 (quan do a reta corta o eixo Y).Dessa forma, t endo como
modelo a funo Y = AX + B , Y = B, logo:

Para a curva de substrato sem inibidor:


1 / Vmax = B = 0,0861
Vmax = 1 / 0,0861
Vmax = 11,61 nmoles/min

Para curva de substrato com inibidor:


1 / Vmax = B = 0,1309
Vmax = 1 / 0,1309
Vmax = 7,64 nmoles/min

J para calcularmo s o valor de Km, ou seja, a con centrao n ecessria para se


chegar metade da velocidade mxima, n ecessrio achar o mdulo do inverso do
valor de X onde o valor de Y = 0 (quando a reta corta o eixo x). Temos ento que :

Para a curva de substrato sem inibidor:


|1/Km| = X = -0,0861 / 9,01 x 103 = - 9,56 x 10-6
Km = 1/9,56 x 10-6
Km = 10,46 x 105 nMol/L

Para curva de substrato com inibidor:


|1/Km| = X = -0,1309 / 4,40 x 104 = - 2,98 x 10-6

Km = 1/2,98 x 10-6
Km = 3,36 x 105 nMol/L

Vemos ento que tanto a velocidade mxima quanto o Km diminuem com a adio do
inibidor na reao

Concluso:

Nesta prtica analisou -se a influncia de agentes qumicos (concentrao de


substrato e presena do inibidor), fsicos(pH e temperatura) e d o tempo de reao
em uma reao enzimtica.

No caso do pH, observou -se que quanto maior o pH do tampo cid o ,maior a
velocidade da reao, logo mais p roduto f oi formado .No entanto, nem semp re um
tampo de p H alto ir benef iciar a formao de produto.O tampo de pH alt o Borat
o-NaOH no contribui para a reao.

A temperatura tambm um fator fundamental, pois a velocidade d a reao aumenta


de acordo com a t emperatura at alcanar a sua temperatura ideal, pois ao passar
dela, a velocidade regride, logo, menos formao de produto.Vale notar que a
temperatura ideal da enzima a temperatura corporal, fato q ue demonstra a
importante eficincia da enzima na catalizao das reaes no nosso corpo.

O tempo de rea o tambm influencia na re ao pois quanto maior o tempo de


reao, maior a quantidade de produto formado.No entanto, em um certo po nto, no
haver mais formao de produto.Vimos que esse ponto se encontra aps os 45 minutos
de reao porque at os 45 ainda h produo de PNP.

possvel observar tambm que o inibidor exerce uma forte interao na velocidade
da reao.Este diminui a velocidade da reaao por concentrao de substrato usado
na mesma e tambm diminuia a velocidade mxima e o Km da reao. Pode-se concluir
ento que ele um inibidor acompetitivo.

Bibliografia

?
http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/lista_exerc/cinetica_enzimatica.pd
f
? http://www2.bioqmed.ufrj.br/enzimas/inibidores.htm
? NELSON, D.L.; COX, M.M.;Princpios d a Bioqumica de Lehninger. 5 edio.
Editora Sarvier/ Artmed. So Paulo. 2010.