M01 - Biosseguranca e Manutencao de Equipamentos em Laboratorio de Microbiologia Medica PDF

MICROBIOLOGIA CLNICA PARA O
CONTROLE DE INFECO RELACIONADA

ASSISTNCIA SADE
Mdulo 1: Biossegurana e Manuteno de Equipamentos em
Laboratrio de Microbiologia Clnica
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria | Anvisa

AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA ANVISA
MICROBIOLOGIA CLNICA PARA

O CONTROLE DE INFECO
RELACIONADA ASSISTNCIA SADE
Mdulo 1: Biossegurana e Manuteno
de Equipamentos em Laboratrio de
Microbiologia Clnica
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1 edio 2010
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Projeto Grfico e Diagramao:

All Type Assessoria Editorial Ltda
Capa:
Camila Contarato Burns Anvisa
Ficha Catalogrfica
Brasil. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria

Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco Relacionada Assistncia Sade. Mdulo 1: Biossegu-
rana e Manuteno de Equipamentos em Laboratrio de Microbiologia Clnica/Agncia Nacional de Vigiln-
cia Sanitria. Braslia: Anvisa, 2013.
44p.: il.9 volumes
ISBN
1. Infeco Relacionada Assistncia Sade Controle. 2. Infeco em Servios de Sade. 3. Microbiolo-

gia Clnica. 4. Vigilncia Sanitria em Servios de Sade. 5. Resistncia microbiana. I. Ttulo.
Sumrio
Apresentao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
Captulo 1: Segurana em laboratrio de Microbiologia Clnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.1 Biossegurana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.2 Classificao dos laboratrios, segundo Nvel de Biossegurana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2.1 Nvel 1 de Biossegurana (NB-1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.3 Classes de agentes de Risco Biolgico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.4 Recomendaes de Biossegurana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.5 Instalaes laboratoriais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.6 Equipamentos de proteo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.6.1 Equipamento de Proteo Individual (EPI) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.6.2 Equipamento de Proteo Coletiva (EPC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.7 Conduta em laboratrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.7.1 BPLCs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.7.2 Transporte de Amostras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.7.3 Utilizao de Cabines de Segurana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.7.4 Controle da Gerao de Aerossis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.8 Limpeza e desinfeco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.8.1 Higienizao das mos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.9 Resduos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.10 Acidentes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.10.1 Acidente com derramamento de Material Biolgico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.10.2 Quebra de tubos contendo Material Biolgico em Centrfuga . . . . . . . . . . . . . 19
1.10.3 Acidente com derramamento de Produtos Qumicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.11 Referncias Bibliogrficas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
Captulo 2: Garantia da qualidade em Microbiologia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.1 Introduo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.2 Manual de procedimentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.3 Recursos humanos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.4 rea fsica e instalaes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.5 Fase pr-analtica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.5.1 Requisio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.5.2 Coleta. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.5.3 Transporte e conservao. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.5.4 Critrios de rejeio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.6 Fase analtica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.6.1 Microbiologia geral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.6.2 Bacteriologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.6.3 Procedimentos analticos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.6.4 Micobacteriologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.6.5 Micologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.6.6 Processos Automatizados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
2.6.7 Testes de Proficincia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.7 Fase ps-analtica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.7.1 Conferncia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.7.2 Liberao dos laudos e notificao de resultados crticos. . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.8 Referncias Bibliogrficas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
Mdulo 1: Biossegurana e Manuteno de Equipamentos em Laboratrio de Microbiologia Clnica
Apresentao
A resistncia microbiana um grave problema mundial, estando associada ao aumento do

tempo de internao, dos custos do tratamento e das taxas de morbidade e mortalidade dos
pacientes. O uso indiscriminado e incorreto dos antimicrobianos na comunidade e no am-
biente hospitalar reconhecidamente um importante fator de risco para o aparecimento e a
disseminao da resistncia microbiana.
Nesse contexto, insere-se o Laboratrio de Microbiologia, que tem como objetivo no ape-
nas apontar o responsvel por um determinado estado infeccioso, mas tambm indicar,
atravs do monitoramento de populaes microbianas, qual o perfil dos micro-organismos
que esto interagindo com o organismo humano, possibilitando a indicao de tratamen-
tos mais adequados. Para o desempenho satisfatrio dessa funo, fundamental que os
laboratrios de microbiologia possuam estrutura capaz de estabelecer informaes sobre
a melhor amostra biolgica, reconhecer a microbiota e os contaminantes, identificar micro-
-organismos associados infeco ou com propsitos epidemiolgicos, obter resultados
rpidos em casos de emergncia, realizar o transporte rpido das amostras e manter uma
educao contnua em relao aos aspectos da infeco relacionada assistncia sade.
Tendo em vista esses aspectos e considerando que a microbiologia um campo muito din-
mico, a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa, em cooperao com a Organiza-
o Pan-Americana da Sade OPAS, prope a terceira reviso do Manual de Procedimentos
Bsicos em Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco Relacionada Assistncia
Sade, buscando atualizar informaes nos temas considerados essenciais e contando com
um seleto e conceituado corpo editorial. O manual composto por nove mdulos, a saber:
Mdulo 1 Biossegurana e manuteno de equipamentos em laboratrio de microbiolo-
gia clnica; Mdulo 2 Controle externo da qualidade; Mdulo 3 Principais Sndromes In-
fecciosas; Mdulo 4 Procedimentos laboratoriais: da requisio do exame anlise micro-
biolgica e laudo final; Mdulo 5 Tecnologias em Servios de Sade: descrio dos meios
de cultura empregados nos exames microbiolgicos; Mdulo 6 Deteco e identificao
de bactrias de importncia mdica; Mdulo 7 Deteco e identificao de micobactrias
de importncia mdica; Mdulo 8 Deteco e identificao de fungos de importncia m-
dica e Mdulo 9 Infeces virais.
A Anvisa e a OPAS esperam com essa publicao contribuir para que os laboratrios de micro-
biologia possam assimilar e alcanar novos nveis de complexidade laboratorial, atendendo s
exigncias e caractersticas prprias de cada unidade hospitalar, alm de subsidiar a adoo
de procedimentos bsicos padronizados nesses servios.
5
Captulo 1:
Segurana em laboratrio de Microbiologia Clnica
Maria Jos Franco Landi Bartelega
Laboratrios so estabelecimentos que prestam servios especficos populao e apresen-

tam uma diversidade de atuaes em sade que expem seus profissionais a grande varie-
dade de agentes de riscos biolgicos, qumicos e fsicos, associados aos materiais e mtodos
utilizados.
Visando minimizar tais riscos, essencial o estabelecimento de um Programa de Biossegu-

rana especfico, que dever dotar o laboratrio de estrutura fsica, administrativa e tcnica
compatvel com as atividades desenvolvidas, promovendo assim aes preventivas.
1.1 Biossegurana
Conjunto de medidas destinadas a prevenir riscos inerentes s atividades dos labora-

trios de assistncia, ensino, pesquisa e desenvolvimento tecnolgico, que possam
comprometer a sade dos profissionais e o meio ambiente.
A responsabilidade legal pela segurana em ambientes de trabalho cabe aos admi-

nistradores, no entanto os funcionrios devem incorporar em sua rotina de trabalho
as Boas Tcnicas Microbiolgicas e as Normas de Biossegurana. (NR-32 MTE)
Deve-se designar uma pessoa ou Comisso de Biossegurana que vise:
Implementar as normas preconizadas em Biossegurana a fim de prevenir riscos

para funcionrios, alunos, pacientes e meio ambiente.
Padronizar e normatizar procedimentos que regulamentem as normas de segu-
rana.
Identificar e classificar reas de risco.
7
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa
Estabelecer programas de treinamento para preveno de acidentes e monitorar

acidentes de trabalho.
1.2 Classificao dos laboratrios, segundo Nvel de Biossegurana
O nvel de Biossegurana de um procedimento ser determinado segundo o agente

biolgico de maior classe de risco envolvido. Quando no se conhece a patogenici-
dade do agente biolgico deve-se realizar uma avaliao do risco para estimar o nvel
de conteno.
A Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana (CTNBio) responsvel pelas atribui-

es relativas ao estabelecimento de normas, anlise de risco, definio dos Nveis
de Biossegurana e classificao de Organismos Geneticamente Modificados (OGM).
As caractersticas fsicas, estruturais e de conteno de um laboratrio determinam o
tipo de micro-organismo que pode ser manipulado em suas dependncias.
1.2.1 Nvel 1 de Biossegurana (NB-1)

Adequado ao trabalho que envolva agente com menor grau de risco (Clas-
se de Risco I) para profissionais do laboratrio e para o meio ambiente.
Aplicao das BPLs e utilizao de EPIs.
O trabalho geralmente conduzido em bancadas abertas, no exigindo

equipamentos especiais de conteno.
Os profissionais devero ter treinamento especfico nos procedimentos
realizados e trabalhar sob superviso.
O acesso ao laboratrio ser limitado ou restrito de acordo com definio
do responsvel e no ser permitida a entrada de animais e crianas.
Procedimentos tcnicos e administrativos descritos.
O laboratrio no est separado das demais dependncias do edifcio.
Deve possuir uma pia especfica para lavar as mos.

Adequado ao trabalho que envolve agentes de risco moderado para os
profissionais e para o meio ambiente, em geral agentes causadores de
doenas infecciosas (Classe de Risco II).
As instalaes exigidas devem atender as especificaes estabelecidas
para o NB-1 acrescidas das seguintes exigncias:
1) autoclave disponvel para descontaminao no interior ou prxima ao
laboratrio de modo a permitir a descontaminao de todo o material
antes do seu descarte;
8
2) cabine de Segurana Biolgica Classe I ou II e centrfuga com caapa

protegida sempre que houver manipulao de materiais em que possa
existir a formao de aerossis.
Os profissionais devero ter treinamento especfico no manejo de agen-
tes patognicos, ser orientados sobre os possveis riscos e trabalhar sob
superviso.
O acesso ao laboratrio ser limitado durante os procedimentos opera-
cionais.

Adequado ao trabalho com micro-organismos com elevado risco infec-
cioso (Classe de Risco III) podendo causar doenas sistmicas srias e po-
tencialmente letais como Mycobacterium tuberculosis, Coxiella burnetti e
Brucella spp., entre outros.
Barreiras de proteo individual devem ser utilizadas e toda manipulao
realizada em cabine de segurana biolgica classe II ou III, com filtro HEPA.
Oferecer treinamento especfico aos funcionrios no manejo de agentes
patognicos e potencialmente letais, orientar sobre os possveis riscos e
trabalhar sob superviso.
Quando no houver condies especficas para o NB-3 e instalaes labo-
ratoriais sem rea de acesso especfica, com ambientes selados ou fluxo
de ar unidirecional, as atividades de rotina e operaes repetitivas podem
ser realizadas em laboratrio com instalao NB-2, acrescidas de equipa-
mentos de conteno e das prticas recomendadas para NB-3. Cabe ao
pesquisador principal a deciso de implementar essas modificaes, co-
municando-as a CIBio e CTNBio (Biossegurana em Laboratrio de Sade
Pblica Oda, Leila, vila, Suzana et al. Braslia).
O acesso ao laboratrio ser controlado. Menores de idade no sero per-
mitidos dentro do laboratrio.

Representa o nvel mximo de segurana. Adequado ao manuseio de
agentes infecciosos que possuem alto risco de infeco individual e de
transmisso pelo ar e sempre que o trabalho envolver OGM resultante de
organismo receptor ou parenteral classificado como classe de risco NB-4.
Responsvel tcnico tem a responsabilidade final no controle do acesso
ao laboratrio.
9
1.3 Classes de agentes de Risco Biolgico
Agentes biolgicos humanos e animais so divididos em classes de acordo com cri-

trios de patogenicidade: alterao gentica ou recombinao gnica, estabilidade,
virulncia, modo de transmisso, endemicidade, consequncias epidemiolgicas,
disponibilidade de medidas profilticas e tratamento eficaz (Diretrizes Gerais para o
Trabalho em Conteno com Material Biolgico Ministrio da Sade).
Classe de Risco I Nenhum ou baixo risco individual e comunitrio. Microrganismo que tenha pouca
probabilidade de causar enfermidades humanas e em animais.
Ex: Bacillus subtilis, Lactobacillus casei
Classe de Risco II Risco individual moderado e risco comunitrio limitado. A exposio ao agente
patognico pode provocar doena humana ou animal, porm se dispe de
medidas eficazes de tratamento e preveno, sendo o risco de propagao
limitado.
Ex: Clostridium tetani, Staphylococcus aureus, Cndida albicans, Schistosoma
mansoni, Plasmodium etc.
Classe de Risco III Risco individual elevado e risco comunitrio limitado. A exposio pode causar
doenas graves ao homem podendo propagar-se de uma pessoa infectada para
outra, entretanto existe profilaxia e/ou tratamento.
Ex: Bacillus anthracis, Brucella, Mycobacterium tuberculosis, Histoplasma,
Toxoplasma gondii, Trypanossoma cruzi, virus da Hepatite, HIV.
Classe de Risco IV Elevado risco individual e comunitrio. Os agentes patognicos representam
grande ameaa para as pessoas e animais, com fcil propagao de um indivduo
a outro, direta e indiretamente, no existindo profilaxia nem tratamento.
Ex: vrus de febres hemorrgicas, vrus Ebola, certos arbovrus etc.
Classe de Risco V Elevado risco de causar doena animal e disseminao no meio ambiente.
Aplica-se a agentes de doena animal, no existente no Pas e que, embora no
sejam patgenos de importncia para o homem, podem gerar graves perdas
econmicas. Os agentes devem ter sua importao proibida e manipulados em
laboratrio de conteno mxima NB-4.
10
1.4 Recomendaes de Biossegurana
Barreiras de Conteno e
NB Agentes Prticas Instalaes
Equipamentos de segurana
1 Pouca probabilidade de causar Boas Prticas Microbiolgicas Equipamento de Proteo Bancada aberta e pia para a
doenas em adultos sadios (BPLs) Individual (EPI) avental e luvas lavagem das mos
2 Agentes associados a doenas NB-1 acrescido de: Barreiras Primrias: Cabine de NB-1 acrescido de:
Risco individual moderado e Acesso limitado Segurana Classe I ou II, usada Autoclave disponvel
limitado para comunidade Sinalizao de risco para manipulao de todos
Vias de transmisso: leso Manual de biossegurana materiais que possam formar
cutnea, ingesto, exposio de definindo polticas de vigilncia aerossol ou que haja risco de
mucosa mdica e necessidade de respingo.
descontaminao dos resduos EPI: avental, luvas e protetor facial
quando necessrio
3 Agentes que provocam infeces NB-2 acrescido de: Barreiras Primrias: Cabine de NB-2 acrescido de:
graves ou potencialmente letais. Acesso controlado Segurana Classe I ou II, usada Separao fsica de corredor de
Risco individual alto e limitado Descontaminao de todo para manipulao de todos os acesso
para comunidade. Transmisso resduo materiais Porta com fechamento
potencial por formao de Descontaminao do avental EPI: avental, luvas, mscaras automtico, dupla porta de
aerossis antes da lavagem quando necessrio acesso
Banco de soro de funcionrios na Ar no recirculado
admisso Presso negativa no laboratrio
4 Agentes com alto risco de causar NB-3 acrescido de: Barreiras Primrias: Manipulaes NB-3 acrescido de:
doena letal Trocar de roupa antes de entrar conduzidas em cabine de Construo separada ou rea
Risco individual e para no laboratrio Segurana Classe II B ou Classe III isolada
comunidade elevado Tomar banho na sada Sistema de exausto
Ocorrncias de infeces Todo material deve ser Fornecimento de ar e vcuo
causadas por transmisso por descontaminado antes de sair do Descontaminao
aerossis ou risco de transmisso laboratrio
desconhecido
11
1.5 Instalaes laboratoriais

NB Instalaes
1 Fcil limpeza e descontaminao.
Superfcie das bancadas impermevel e resistente a cidos, lcalis, solventes e calor.
Espao entre bancadas e equipamentos que permita a limpeza.
Pia para lavagem das mos.
2 NB-1 acrescida de:
Autoclave para descontaminao (dentro ou prximo).
3 NB-2 acrescido de:
Separado de reas de trnsito.
Sistema de dupla porta.
Superfcies internas, pisos e tetos resistentes a gua.
Portas com fechamento automtico.
Sistema de ar independente, ventilao unidirecional, sem recirculao de ar e filtrado
com filtro HEPA para eliminao.
Linhas de vcuo protegidas por sifo contendo desinfetante e filtro HEPA ou semelhantes.
4 NB-3 acrescido de:
Cmara de entrada e sada de pessoal separada por chuveiro.
Sistema de autoclave de dupla porta, cmara de fumigao.
Paredes, tetos e pisos construdos com sistema de vedao interna.
Sistema coletor de descontaminao de lquidos.
O ar deve ser insuflado atravs de filtros HEPA e eliminado para o exterior atravs de
dutos de exausto.
OBS: As instalaes devero ser verificadas uma vez por ano e filtros substitudos quando necessrio.
1.6 Equipamentos de proteo
Considera-se Equipamento de Proteo Individual (EPI) todo dispositivo ou produto,

de uso individual utilizado pelo trabalhador, destinado proteo de riscos suscet-
veis de ameaar a segurana e a sade no trabalho (NR 6 MTE). regulamentado pela
Portaria 485, de 11 de novembro de 2005, que aprova a NR 32 (Segurana e Sade no
Trabalho em Estabelecimentos de Sade) do Ministrio do Trabalho, competindo ao
profissional us-los e conserv-los.
1.6.1 Equipamento de Proteo Individual (EPI)

Avental: uso para todos que trabalham em ambiente laboratorial, confec-
cionado em algodo, com manga longa e punho sanfonado, na altura dos
joelhos e usado abotoado. No usar fora da rea de trabalho, nem guardar
junto com objetos pessoais. Para laboratrios NB-3, recomenda-se que o
abotoamento do avental seja nas costas. H necessidade de descontami-
nao antes da lavagem. Apesar do avental de algodo no ser conside-
rado EPI por no ter n de CA, seu uso deve ser obrigatrio.
Avental Impermevel: evita a contaminao do vesturio.
12
Luvas: uso para todos que trabalham em ambiente laboratorial, na mani-

pulao de amostras biolgicas, preparo de reagentes, lavagem de mate-
riais, atendimento ao paciente. Descartar sempre que estiverem contami-
nadas ou quando sua integridade estiver comprometida.
.. Nitrilica: usadas em trabalhos gerais, preparo de solues, lavagem de
materiais.
.. De latex ou silicone descartvel: usadas em procedimentos que ne-
cessitem de proteo contra material biolgico. Devem ser despreza-
das aps uso.
Kevlar: usadas para trabalhar em baixas ou altas temperaturas (autocla-
ves e estufas e freezer a 80).
Mscaras e Respiradores: proteo de boca e nariz contra respingos e
inalao de partculas em aerossol e substncias qumicas volteis e t-
xicas.
.. Mscara N-95: composta de 4 camadas de fibras sintticas imperme-
veis a fludos, com densidade e porosidade capazes de atuar como
barreira a micro-organismos transportado pelo ar (aerossis) com efi-
cincia de filtrao maior ou igual a 95%/ partculas de 0,3 m.
.. Respirador PFF2 + VO: usado quando da manipulao de reagentes
qumicos volteis.
culos de Proteo: destinado proteo dos olhos contra respingos de
material biolgico, substncias qumicas e partculas.
Protetor Facial: destinado proteo da face contra respingos de mate-
rial biolgico, substncias qumicas e partculas. Deve ser leve, resistente,
com visor em acrlico.
Sapatos: devem ser fechados, evitando-se assim impactos e respingos.
1.6.2 Equipamento de Proteo Coletiva (EPC)

Cabine de Segurana Biolgica: o principal equipamento de conten-
o fsica para agentes infecciosos. Protegem o material e o profissional,
na manipulao de materiais biolgicos altamente infectantes, substn-
cias txicas e cultura de clulas. Cumprir os prazos de reviso e troca de
filtros. As cabines devem estar em local de pouco trnsito e distantes de
portas. Existem trs tipos de cabine de segurana biolgica (Classes I, II e
III).
.. Classe I: uma cabine em que o fluxo de ar ocorre de fora para den-
tro, pela abertura frontal, sem recirculao do ar. O ar da cabine passa
por um filtro HEPA antes de ser liberado para o interior do laboratrio.
Essas cabines protegem o operador, mas no o material que est sen-
do manipulado e podem ser usadas quando se est trabalhando com
micro-organismos de baixo ou moderado risco.
13
.. Classe II: uma cabine com abertura frontal na qual uma parte do ar
recirculado. Esse tipo de cabine protege o operador, o material a ser
manipulado e o meio ambiente. Existem dois tipos de cabine classe II:
1) Classe II A: 30% de ar ambiente entra pela abertura frontal, 70%
recirculado para o interior da cabine passando por um filtro HEPA
e 30% exaurido para dentro ou fora do laboratrio passando por
filtro HEPA. Usadas na ausncia de substncias qumicas volteis, ra-
dioativas ou txicas.
2) Classe II B: 70% de ar ambiente entra pela abertura frontal, 30%
recirculado para o interior da cabine passando por um filtro HEPA e
70% exaurido para fora do laboratrio atravs de outro filtro HEPA,
por um sistema de exausto. So indicadas para manipulao de
cultura de micobactrias e com algumas substncias txicas, vol-
teis e/ou radioativas.
.. Classe III: uma cabine hermeticamente fechada, impermevel a gases,
e todo o trabalho realizado com luvas de borracha que esto presas
cmara. O ar que entra passa por um filtro HEPA e o ar que sai pelo
exaustor passa por dois filtros HEPA dispostos sequencialmente. Todos
os equipamentos necessrios (centrfuga, incubadora etc.) devem es-
tar dentro da cabine. indicada para o trabalho com micro-organis-
mos de alto poder infectante. Oferece o mais alto grau de proteo ao
operador e ao meio ambiente.
Lava-olhos: usado quando ocorrem acidentes onde haja contato de ma-
terial biolgico ou substncia qumica, com os olhos e/ou a face. Os pro-
fissionais devem estar treinados quanto ao seu uso e as orientaes loca-
lizadas prximas ao equipamento. Manter o acesso facilitado.
Chuveiro de Segurana: usados quando ocorrem acidentes com derra-
mamento de grande quantidade de material biolgico ou substncia qu-
mica sobre as roupas e pele do profissional, ou quando as roupas estive-
rem em chamas. Os profissionais devem ser treinados quanto ao seu uso
e as orientaes localizadas prximas ao equipamento. Manter o acesso
facilitado.
Proteo de Linha de Vcuo: evita contaminao do sistema de vcuo
com aerossis e fluidos derramados.
Autoclave: esterilizao por calor eficaz, tornando material infeccioso se-
guro para ser eliminado ou reutilizado.
Garrafas com Tampa de Rosca: produz confinamento eficaz contra ae-
rossis e derrames.
Microincineradores de ala: gs ou eletricidade tm escudo de vidro
ou cermica que minimizam salpicos ou borrifos quando se esterilizam as
alas.
14
1.7 Conduta em laboratrio
O diretor e/ou coordenador do laboratrio responsvel por assegurar a implemen-

tao das Normas de Biossegurana e as Condutas em Laboratrio.
Programa de Preveno de Risco Ambiental (PPRA) avaliado anualmente (NR-32

Ministrio do Trabalho).
Exame pr-admissional e peridico (Clnico e Laboratorial) Programa de Controle
Mdico de Sade Ocupacional (PCMSO) anual.
Programa de Vacinao atualizado.
Registro de doenas e acidentes de trabalho.
BPLCs (Boas Prticas em Laboratrio Clnico) implantadas e seguidas.
Acesso limitado ao laboratrio.
1.7.1 BPLCs
Proibido comer, beber, fumar, guardar alimentos e aplicar cosmticos na
rea tcnica.
Prender os cabelos e evitar o uso de bijuterias.
vedado o uso de calados abertos (chinelos e sandlias).
Toda amostra biolgica deve ser considerada potencialmente contami-

nada.
Obrigatrio o uso de EPIs.
Proibido pipetar com a boca.
Obrigatria a descontaminao das bancadas de trabalho antes e aps o

desenvolvimento das atividades.
Proibido reencapar e entortar agulhas aps o uso.
Nunca manipular materiais no identificados.
Segregar e acondicionar adequadamente resduos biolgicos, qumicos

e ionizantes.
Depositar todo material contaminado em recipientes apropriados para
autoclavao.
Higienizar sempre as mos.
1.7.2 Transporte de Amostras

Utilizar caixas rgidas preferencialmente providas de tampas higienizveis,
contendo estantes que permitam que os frascos permaneam na posio
vertical, evitando acidente por derramamento. Devem ser resistentes a
desinfetante qumico ou calor. Devem ser lavadas frequentemente e sem-
pre que ocorrer derramamento.
1.7.3 Utilizao de Cabines de Segurana

Ligar a cabine e a luz 10 a 15 minutos antes do uso.
15
Fechar as portas do laboratrio e evitar circulao de pessoas durante o

uso da cabine.
Colocar os equipamentos, meios de cultura, vidrarias etc. no plano de ati-
vidade da rea de trabalho.
Limpar todos os objetos antes de introduzi-los na cabine e organizar os
materiais de modo que no se misturem os itens limpos e contaminados.
Bicos de Bunsen no devem ser utilizados dentro da cabine, pois o calor
pode acarretar danos ao filtro HEPA e interromper o fluxo laminar de ar,
causando turbulncia.
Usar pipetador automtico.
Conduzir as manipulaes no centro da cabine.
Minimizar os movimentos dentro da cabine.
Terminado o trabalho, a superfcie de trabalho da cabine deve ser limpa
com desinfetante apropriado.
Deixar a cabine ligada 10 a 15 minutos antes de deslig-la.
Fazer controle da contagem de tempo do uso das lmpadas UV, e de utili-
zao da cabine para fim de manuteno e troca do pr-filtro.
1.7.4 Controle da Gerao de Aerossis

A manipulao de micro-organismos, sangue, fludos orgnicos, p e subs-
tncias qumicas poder levar formao de aerossis, podendo contribuir
para ocorrncia de enfermidades ocupacionais. Algumas operaes contri-
buem para formao de aerossis.
Uso de agitadores.
Remoo de tampas de borracha, de rosca ou de algodo de tubos de
ensaio.
Flambagem de alas de maneira inadequada.
Inoculao de culturas com pipeta ou ala de forma inadequada.
Remoo de meio de cultura lquido com seringa e agulha.
Destampar frasco de cultivo ou suspenso de lquidos imediatamente
aps agit-lo.
Romper clulas com ultrassom.
Soprar a ltima gota de cultivo ou substncia qumica de uma pipeta.
No vedar adequadamente frascos de substncias txicas volteis.
1.8 Limpeza e desinfeco
As superfcies contaminadas podem servir como reservatrio de agentes patogni-

cos, mas normalmente no so associadas diretamente transmisso de infeces
para Profissionais da rea da Sade ou pacientes. Mesmo diminuindo o impacto des-
16
sa transmisso atravs da higienizao das mos, a realizao da limpeza e desinfec-

o das superfcies fundamental para a reduo da incidncia de infeces.
Os fatores que influenciam na escolha do procedimento de desinfeco das superfcies

so: a) natureza do item a ser desinfetado; b) nmero de micro-organismos presentes;
c) resistncia do micro-organismo aos efeitos do germicida; d) quantidade de matria
orgnica presente; e) tipo e concentrao do germicida usado; f) durao e tempera-
tura do contato com o germicida; g) as especificaes e indicaes de uso do produto
pelo fabricante.
Eficincia dos agentes qumicos frente aos tipos comuns de micro-organismos
Bactria Bactria Bacilo

Desinfetante Esporo Vrus Fungo
gram (+) gram (-) Tuberculose
Sabo 0 0 0 0 0 0
Detergente 2 1 0 0 0 0
Quaternrio de amnia 3 2 0 0 2 2
Cloro 3 3 0 0 2 2
Comp. Fenlicos 3 3 0 0 2 2
Hexaclorofeno 3 1 0 0 2 2
lcoois 3 3 3 0 2 2
Glutaraldedo 3 3 3 2 3 3
Nveis: 3 = Bom 2 = Satisfatrio 1 = Insatisfatrio 0 = No ativo
Fonte: Segurana no Ambiente Hospitalar, Ministrio da Sade
1.8.1 Higienizao das mos

Mos contaminadas podem ser as principais vias de transmisso de infecc-
o. O simples ato de lavar as mos com gua e sabo lquido, visando a re-
moo de bactrias transitrias e algumas residentes, como tambm clulas
descamativas, pelos, suor, sujidades e oleosidade da pele, contribui para a
diminuio do risco de infeco.
Abrir a torneira e molhar as mos sem encostar-se pia.

Ensaboar as mos com sabo lquido. Friccionar as mos por cerca de 30
segundos, realizando todos os movimentos a seguir:
a) friccione circularmente palma com palma;
b) friccione circularmente dorso com palma;
c) lavar os espaos interdigitais deslizando uma mo sobre a outra;
d) friccione as articulaes de uma mo sobre a palma da outra;
e) lave o polegar com auxlio da outra mo;
17
f ) friccione circularmente as unhas (pontas dos dedos) na palma da outra

mo;
g) friccionar os pulsos com a palma da mo.
Enxaguar as mos retirando todo o resduo de sabo.
Enxugar as mos com papel toalha e fechar a torneira utilizando o mes-
mo papel (se a torneira no for com acionamento automtico). Torneiras
manuais devem ser mantidas abertas at o trmino da lavagem das mos.
1.9 Resduos
O laboratrio responsvel pelo correto gerenciamento de todos os resduos gera-

dos, atendendo as normas e exigncias legais, desde o momento de sua gerao at
seu destino final.
Os Resduos de Servios de Sade (RSS), segundo a RDC n 306 de 2004 da Anvisa, so

classificados em cinco grupos, a saber:
Grupo A: resduos com a possvel presena de agentes biolgicos que, por suas
caractersticas, podem apresentar risco de infeco.
Grupo B: resduos contendo substncias qumicas que podem apresentar risco
sade pblica ou ao meio ambiente, dependendo de suas caractersticas de infla-
mabilidade, corrosividade, reatividade e toxicidade.
Grupo C: quaisquer materiais resultantes de atividades que contenham radionu-
cldeos em quantidades superiores ao nvel de iseno estabelecida pelas normas
da Comisso Nacional de Energia Nuclear (CNEN).
Grupo D: resduos que no apresentam risco biolgico qumico ou radiolgico po-
dendo ser equiparado a resduo domstico, passvel de segregao para recicla-
gem.
Grupo E: materiais perfurocortantes ou escarificantes.
Num laboratrio de Microbiologia, todos os resduos gerados como culturas e esto-

ques de micro-organismo, meios de cultura e instrumentais utilizados para transfe-
rncia, inoculao ou mistura de culturas, amostras biolgicas, devem ser acondi-
cionados de maneira compatvel com o processo de tratamento a ser utilizado, que
poder ser um processo fsico ou outro que venha a ser validado para obteno de
reduo ou eliminao da carga microbiana.
Se o processo utilizado no promover a descaracterizao fsica das estruturas, o mes-

mo dever ser acondicionado em saco branco leitoso com simbologia de substncia
infectante conforme NBR 7500 da ABNT que ser substitudo sempre que atingirem
2/3 de sua capacidade ou pelo menos uma vez ao dia.
18
Havendo descaracterizao fsica das estruturas, podem ser acondicionados como

resduos do Grupo D.
Materiais perfurocortantes devem ser descartados em recipientes rgidos, resistentes

punctura, ruptura e vazamento, devidamente identificados e autoclavados antes
do descarte.
Os instrumentos de trabalho a serem reutilizados devero ser colocados em recipien-

tes preferencialmente plsticos contendo soluo desinfetante e permanecer o tem-
po estabelecido pelo fabricante para posterior autoclavagem, lavagem e reutilizao.
1.10 Acidentes
1.10.1 Acidente com derramamento de Material Biolgico

Isolar a rea atingida.
Impedir a manipulao no local por pelo menos 30 minutos.
Usar EPIs.
Colocar papel toalha sobre o material derramado e sobre o mesmo, so-

luo de hipoclorito de sdio a 2%, ou cloro ativo, aguardar 15 minutos.
Recolher em recipiente com saco para resduo infectante ou saco auto-
clavvel as toalhas de papel, luvas e todo material usado na descontami-
nao.
Estilhaos de vidro ou plstico devero ser recolhidos em caixa de perfuro-
cortante.
Refazer a descontaminao da rea com soluo de hipoclorito de sdio
a 2%.
1.10.2 Quebra de tubos contendo Material Biolgico em Centrfuga

Desligar a centrfuga e manter fechada por 30 minutos para disperso de
aerossis:
Usar EPIs.
Retirar estilhaos com auxlio de pina e descartar em caixa de perfuro-

cortante.
Limpar caapas, pinos e rotor com soluo de hipoclorito de sdio a 2%.
Limpar internamente a centrfuga com gaze embebida com soluo de

hipoclorito de sdio a 2% e aps com pano embebido em gua e sabo.
Descartar todo o material usado na descontaminao em recipiente com
saco para resduo infectante.
1.10.3 Acidente com derramamento de Produtos Qumicos

Utilizar EPIs.
19
Conter o lquido derramado em rea reduzida.

Cobrir o resduo com vermiculina ou areia e aguardar sua absoro.
Recolher todo o resduo e o material utilizado para limpar a rea em saco
plstico preto para posterior descarte.
1.11 Referncias Bibliogrficas

Isenberg, HD. Clinical Microbiology Procedures Handbook. American Society for
Microbiology, Washington, D.C., 1992.
ABNT. Biossegurana no Laboratrio Clnico. Normas Brasileiras. CTN Bio.
Fleming, D, Richardson, JH, Tulis, JJ, Wesley, D. Laboratory Safety Principles and Practices.
ASM Press, USA 2 ed., 1995.
Oda, LM. Capacity Building Programer on Biosafety A guide to supervisors, RJ 1998.
Oda, LM, vila, SM. Biosssegurana em Laboratrio de Sade Pblica. Ministrio da

Sade,1998.
Teixeira, P, Valle, S. Biossegurana Uma Abordagem Multidisciplinar. FIOCRUZ Rio de

Janeiro, 1996.
Oplustil, CP, Zoccoli, CM, Tabouti, NR, Sinto, IS. Procedimentos Bsicos em Microbiologia
Clnica.
U.S. Department of Health and Human Services. Public Health Service. Centers for Disease
Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th
Edition.
Organizaao Mundial Da Saude (OMS). Manual de Segurana Biolgica em Laboratrio, 3

edio.
Brasil. Ministrio da Sade. Secretaria Nacional de Assistncia Sade. Manual de

Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco Hospitalar.
1991.
Brasil. Ministrio do Trabalho. Portaria n 458, de 11 de novembro de 2005. Norma

Regulamentadora n 32. Segurana e Sade no Trabalho em Estabelecimentos de Sade.
Brasil. Ministrio da Sade. Anvisa. RDC n 306, de 07 de dezembro de 2004. Regulamento

Tcnico para Gerenciamento de Resduos de Sade.
Brasil. Ministrio do Meio Ambiente. Conama. Resoluo n 358, de 29 de abril de 2005.

Tratamento e Disposio Final dos Resduos dos Servios de Sade.
20
Captulo 2:
Garantia da qualidade em Microbiologia
Ana Lucia Roscani Calusni

Paula Virginia Bottini
2.1 Introduo
Um Servio de Microbiologia pode compreender diversos setores, dependendo da

forma de estruturao da rea. De maneira geral podemos subdividir a microbiologia
em Microbiologia Geral, Bacteriologia, Micobacteriologia, Micologia alm de Virolo-
gia e Parasitologia, sendo que os dois ltimos habitualmente constituem servios se-
parados na maioria dos laboratrios clnicos.
O laboratrio clnico de Microbiologia responsvel por providenciar informao

precisa e relevante quanto ao diagnstico do paciente. O valor e a preciso clnica
das anlises do material clnico e o respectivo isolamento do(s) micro-organismo(s)
so dependentes do programa de qualidade que, por sua vez, avalia a qualidade do
material, documenta a validade do mtodo aplicado, monitora a performance dos
procedimentos, reagentes, meios, instrumentos e do indivduo que executou a anli-
se e verifica os resultados do teste quanto aos erros e relevncia clnica. Um programa
de qualidade efetivo depende de um processo de avaliao contnuo e do seu cons-
tante aprimoramento.
Os principais erros em Microbiologia incluem tipo de amostra inadequada para o

exame a ser realizado, frascos de coleta no estreis, o no uso de meios de trans-
porte adequados, demora no transporte, uso de meios de cultura no apropriados,
informao incorreta dos achados, desconsiderar um achado na anlise, desconheci-
mento do papel dos interferentes e no analisar todos os achados em conjunto.
21
2.2 Manual de procedimentos
Todos os laboratrios devem possuir um manual de procedimentos atualizado e dis-

ponvel na rea de trabalho. Esses procedimentos operacionais (POPs) tm o objetivo
de padronizar e minimizar a ocorrncia de desvios na execuo de tarefas fundamen-
tais para a qualidade do exame, independentemente de quem as faa. Assim, garan-
te-se que sejam tomadas as aes na fase pr-analtica, analtica e ps-analtica para
assegurar que a qualidade de seus exames seja a mesma, de uma rodada para a outra,
de um turno para outro, de um dia para outro, aumentando-se a previsibilidade de
seus resultados e minimizando as variaes causadas por impercia e adaptaes ale-
atrias da metodologia.
Todos os POPs do laboratrio contm, no mnimo, as seguintes informaes:
Nome do laboratrio
Ttulo
Identificao, assinatura e data da elaborao, reviso e aprovao do POP
Nmero da verso atual
Nmero do documento
Abrangncia e distribuio
Nmero de cpias
Princpio do teste
Aplicao clnica
Amostra analisada (tipo de amostra e suas condies necessrias)
Padres, controles, reativos e outros insumos
Equipamentos (uso, calibrao e manuteno preventiva)
Passo a passo do ensaio (fase analtica detalhada)
Clculos (quando aplicvel: converso de unidades ou aplicao de fatores)
Controle da Qualidade (externo e interno com periodicidade e faixa de aceitao
de valores)
Interferentes e reaes cruzadas
Valores de referncia (referentes populao atendida)
Linearidade, limites de deteco e limitaes do mtodo (que devero estar con-
gruentes com as necessidades do usurio: sensibilidade, robustez contra fatores
externos, incertezas de medio etc.)
Interpretao dos resultados
Referncias Bibliogrficas (fontes dos dados obtidos no procedimento)
22
2.3 Recursos humanos
O dimensionamento do quadro de pessoal leva em conta algumas caractersticas dos

laboratrios, tais como: nmero de amostras processadas por dia, perfil dos pacien-
tes atendidos, presena ou no de atividade cientfica e/ou didtica concomitante,
necessidade de superviso constante, alm do horrio de funcionamento e prazo de-
terminado para liberao dos laudos.
Em termos de qualificao recomenda-se que os ensaios microbiolgicos sejam re-

alizados e supervisionados por pessoal experiente, qualificado em microbiologia ou
equivalente. A gerncia do laboratrio tem o papel de garantir que todo pessoal te-
nha recebido treinamento adequado para o desempenho competente de ensaios e
operao de equipamentos. Isso inclui treinamento em tcnicas bsicas, tais como
semeadura em placas, contagem de colnias, trabalhos em condio de assepsia etc.,
com o uso de critrios para determinar nveis de aceitao. O pessoal do laboratrio
somente pode realizar os ensaios se for reconhecidamente capacitado para faz-lo
ou se estiver sob superviso adequada. A capacitao contnua deve ser monitorada,
sendo capaz de detectar necessidades de reciclagem, cuja periodicidade necessita
ser estabelecida e documentada. A interpretao dos resultados de ensaio para iden-
tificao e verificao de micro-organismos fortemente relacionada com a experi-
ncia do analista e deve ser monitorada regularmente.
Vale lembrar que importante que o pessoal que realiza ensaios que exigem avalia-
o de cores seja testado com relao a possvel dificuldade de discriminao destas.
Isso no significa que pessoas com dificuldade de discriminao de cores no possam
atuar em microbiologia, mas apenas que devem exercer outras funes compatveis
com discromatopsias.
2.4 rea fsica e instalaes
A rea fsica deve ser suficiente para permitir que as reas de trabalho sejam mantidas
limpas e arrumadas, sendo o espao proporcional ao volume de anlises realizadas
e organizao interna do laboratrio. Dependendo dos tipos de ensaio realizados,
h necessidade de o acesso ao laboratrio microbiolgico ser restrito ao pessoal au-
torizado.
O planejamento da rea fsica de um laboratrio de microbiologia necessita atender

a alguns requistos bsicos:
Fluxo de trabalho que minimize riscos de contaminao cruzada. Para tanto pode-
-se executar as rotinas de maneira sequencial ou separando atividades por tempo
23
ou espao. So consideradas necessrias reas independentes para preparao de

meios de cultura, pesquisa e cultura de micobatrias e fungos.
Ventilao e temperatura apropriada. Isso pode ser obtido por ventilao natural
ou forada ou pelo uso de um condicionador de ar.
Uso de filtros apropriados quando do uso de condicionadores de ar, inspeciona-
dos, conservados e substitudos de acordo com o tipo de trabalho realizado. A
temperatura deve ser adequada aos procedimentos realizados e ao fluxo de traba-
lho da rea, mantendo-se registros dirios de sua variao.
Iluminao adequada. No se recomenda apenas insolao direta, pois esta muito
varivel. Recomenda-se que o controle da iluminao seja setorial para que possa
ser regulada para as diversas atividades que requerem maior ou menor incidncia
de luz.
Programa de limpeza documentado para instalaes, equipamentos e superfcies
de laboratrio, bem como um procedimento para lidar com derramamentos.
2.5 Fase pr-analtica
2.5.1 Requisio
Para garantir a qualidade do exame, essencial que as requisies para anli-
ses microbiolgicas contenham algumas informaes adicionais relevantes,
tais como origem da amostra, tipo de infeco, micro-organismo esperado,
uso de antimicrobianos, presena de imunodeficincia, entre outras.
2.5.2 Coleta
A coleta da amostra depende da anlise a ser realizada. No manual de coleta
constam todas as informaes necessrias para coleta dos diversos materiais
biolgicos (tais como escarro, urina, secrees, feridas, sangue, entre outros),
incluindo o procedimento detalhado para sua obteno, tempo mximo para
entrega ao laboratrio aps a coleta, meios de transporte utilizados (quando
apropriado) e mtodos de preservao da amostra em caso de demora para
processamento. Como frequentemente amostras para exames microbiolgi-
cos so coletados por pessoal externo ao laboratrio (ex: mdicos e equipe
de enfermagem), necessria a existncia de orientaes especficas sobre
conservao, manuseio seguro e transporte dos materiais biolgicos para o
laboratrio.
No caso de lquido cefalorraquidiano (LCR), este deve ser coletado em frasco

estril, sem gel separador e sem a adio de qualquer tipo de conservante.
O volume a ser coletado varia de acordo com a idade e as condies do pa-
ciente.
24
Da mesma forma, material proveniente de derrames cavitrios tambm so

coletados em frasco estril sem gel separador e sem a adio de qualquer
tipo de conservante. Grandes volumes de amostra podem ser tambm en-
caminhados em frascos de hemocultura pois a positividade das culturas au-
menta quando um volume maior utilizado.
Para realizao de urocultura, deve-se coletar uma amostra isolada de urina,

jato mdio aps assepsia, tendo o paciente mantido de duas a quatro horas
de estase vesical. Essa amostra pode ser randmica (coletada a qualquer mo-
mento do dia) ou na primeira urina da manh.
No caso de hemoculturas, geralmente duas coletas so suficientes, com

amostras obtidas antes do pico febril e com um intervalo mnimo de 15 a
20 minutos entre as punes. Havendo solicitao mdica de uma terceira
amostra esta pode obtida aps 15 a 20 minutos da coleta anterior ou prazo
de at 24 horas. O volume de sangue coletado uma das variveis mais cr-
ticas para a positividade do exame. Quanto maior o volume coletado maior
a probabilidade de positividade, respeitando-se sempre o volume padroni-
zado para cada frasco.
No caso de pacientes com dados clnicos e achados radiolgicos sugestivos

de tuberculose, recomenda-se que as amostras de escarro para pesquisa e
cultura para micobactrias sejam coletadas preferencialmente em trs dias
consecutivos ou alternados (3 amostras matinais).
2.5.3 Transporte e conservao

Aps a coleta, as amostras necessitam ser encaminhadas o mais rapidamen-
te possvel ao laboratrio a fim de eliminar possvel crescimento da micro-
biota normal. O objetivo primrio no transporte de amostras para diagns-
tico laboratorial consiste em manter a integridade do material biolgico,
evitando-se a deteriorao. Deve-se evitar condies ambientais adversas
como exposio ao frio e calor intensos ou dessecamento excessivo. Para mi-
nimizar os riscos aos transportadores necessria a utilizao de recipientes
adequados, isotrmicos, higienizveis, impermeveis, com tampa e devida-
mente sinalizados para material biolgico.
Para pesquisa de BAAR e cultura de BK as amostras devem ser entregues ao

laboratrio prontamente, idealmente dentro de 30 minutos, ou serem refri-
geradas dentro da primeira hora aps a coleta e entregues ao laboratrio em
at 48 horas aps a coleta.
25
2.5.4 Critrios de rejeio

Os critrios de rejeio podem variar para cada laboratrio, mas obrigatoria-
mente incluem: requisio incompleta ou ilegvel, material mal identificado
ou com contaminao visvel a olho nu, material coletado em frascos no
estreis ou com conservantes e amostras insuficientes. Outro critrio de re-
jeio inclui amostras inadequadas para realizao do teste solicitado (ex:
sonda Foley, material de colostomia, etc.).
2.6 Fase analtica
2.6.1 Microbiologia geral
Reagentes
Os reagentes ou insumos preparados ou aliquotados pelo laboratrio de-
vem conter em seus rtulos: nome, concentrao, nmero do lote (se apli-
cvel), data de preparo, identificao do responsvel pelo preparo (quando
aplicvel), data de validade, condies de armazenamento, alm de infor-
maes referentes a riscos potenciais e precaues de segurana. Da mesma
forma, todos os reagentes, kits e meios de cultura comerciais necessitam de
armazenamento segundo as orientaes do fabricante e devem ser utiliza-
dos dentro do prazo de validade.
Os laboratrios so responsveis por assegurar que a qualidade dos rea-

gentes utilizados seja apropriada para o ensaio em questo. A verificao
da adequao de cada lote de reagentes crticos para o ensaio, inicialmen-
te e durante sua validade, realizada atravs do uso de micro-organismos-
-controle positivos e negativos que sejam rastreveis a colees de culturas
nacionais ou internacionais reconhecidas. Havendo mltiplos componentes
em um conjunto de reagentes (kit), os diferentes componentes sero utiliza-
dos apenas com conjuntos de mesmo lote, a no ser que o fabricante permi-
ta o uso interlotes.
O desempenho dos reagentes sempre avaliado antes ou durante a sua co-

locao em uso. Para as pesquisas diretas, o uso de materiais de referncia
ou o teste em paralelo dos reagentes novos versus antigos so aceitveis e
seus resultados so documentados apropriadamente. No caso de pesquisas
diretas de antgenos em amostras, por meio de conjuntos diagnsticos (kits)
dotados de controles internos, recomenda-se testar tambm controles in-
dependentes, um positivo e um negativo (organismo ou extrato antignico)
com resultados documentados para cada novo lote ou para cada nova par-
tida recebida. Os controles internos fornecidos pelo fabricante podem ser
26
usados da em diante. No havendo controles internos como parte integran-

te dos kits deve-se testar um controle positivo e um negativo (organismo ou
extrato antignico) a cada dia em que se analisam amostras de pacientes.
Para painis ou baterias, so usados controles para cada antgeno bacteriano
pesquisado. Para testes complexos, que incluem uma fase de extrao, o sis-
tema verificado a cada dia de uso por meio de um organismo sabidamente
positivo.
Equipamentos
Os equipamentos existentes no laboratrio dependem da complexidade
e da demanda dos servios. Os equipamentos, sejam eles nacionais ou im-
portados, devem estar regularizados junto a Anvisa/Ministrio da Sade, de
acordo com a legislao vigente.
obrigatrio que todo laboratrio tenha um programa documentado para

a manuteno, calibrao e verificao de desempenho de seus equipamen-
tos. A manuteno de equipamentos crticos realizada em intervalos espe-
cificados, de acordo com vrios fatores, como, por exemplo, as especificaes
do fabricante e a taxa de uso, com registros detalhados de sua execuo. Na
Tabela 1 encontram-se os equipamentos mais utilizados em um laboratrio
de microbiologia, bem como os procedimentos de controle de qualidade,
periodicidade e limites de tolerncia.
Tabela 1 Procedimentos para o controle de qualidade de alguns equipamentos
EQUIPAMENTO PROCEDIMENTO PERIODICIDADE LIMITES DE TOLERNCIA

Refrigeradores Registro de Dirio ou contnuo 2oC a 8oC
Freezers temperatura* -8oC a 20 oC / -60oC a -75oC
Estufas 35,5oC 1oC
Banho-Maria 36oC a 38oC / 55oC a 57oC
Aquecedores 1oC do estabelecido
Estufas de CO2 Medida do contedo de Dirio ou duas vezes 5 a 10%
CO2: ao dia
Usar analisador de
gases sanguneos ou
dispositivo Fyrite1
Autoclaves Teste com tiras de Semanalmente O no crescimento de
esporos (Bacillus esporos indica corrida
stearothermophilus) estril.
Medidor de pH Testes com solues A cada uso 0,1 unidade de pH do
para pado em uso.
calibrar pH
27
EQUIPAMENTO PROCEDIMENTO PERIODICIDADE LIMITES DE TOLERNCIA

Jarras de Tira indicadora com azul A cada uso A converso da tira de
anaerobiose de metileno azul para branco indica
baixa tenso de CO2.
Cmera anaerbia Cultivo de Clostridium Peridico O crescimento indica baixa
com novyi tipo B tenso de O2.
luvas Soluo indicadora de Utilizada apenas quando
azul de metileno preciso uma tenso de O2
extremamente baixa.
A soluo permanece
incolor se a tenso de O2 for
baixa.
Rotador de Contagem de rpm A cada uso 180 rpm 10 rpm
sorologia
Centrfugas Controlar revolues Mensalmente Dentro de 5% do
com tacmetro estabelecido no indicador.
Cabines de Medir a velocidade do Semestral ou Fluxo de 1,52m de fluxo
segurana ar atravs da abertura trimestralmente de ar/minuto 0,152 m/
para o rosto2 minuto.
* cada termmetro de controle deve ser calibrado contra um termmetro padro.
1. Bacharach Instrument Co, Pittsburgh, PA.
2. Velometer Jr., Alnor Instrument Co., Chicago, IL.
obrigatrio que o laboratrio mantenha um programa para calibrao e
verificao de desempenho dos equipamentos que possuem influncia dire-
ta sobre os resultados dos ensaios. A frequncia de calibrao e a verificao
de desempenho so determinadas pelo histrico documentado do equipa-
mento e baseadas na necessidade, tipo e desempenho anterior do equipa-
mento (Tabela 2)
Tabela 2 Calibrao e verificaes de calibrao sugesto de periodicidade
EQUIPAMENTO REQUISITO PERIODICIDADE SUGERIDA

Termmetros de referncia Recalibrao inteiramente A cada 5 anos
(lquido em vidro) rastrevel
Um nico ponto (p. ex.: Anualmente
verificao do ponto de
congelamento)
Termopares de Recalibrao inteiramente A cada 3 anos
referncia rastrevel
Verificao com termmetro de Anualmente
referncia
Termmetros de Verificao com termmetro Anualmente
trabalho e Termopares de referncia no ponto de
de trabalho congelamento e/ou faixa de
temperaturas operacionais
Balanas Calibrao inteiramente Anualmente
rastrevel
28
EQUIPAMENTO REQUISITO PERIODICIDADE SUGERIDA

Pesos de calibrao Calibrao inteiramente A cada 5 anos
rastrevel
Peso (s) Verificao com peso calibrado Anualmente
aferidor (es) ou verificao na balana
imediatamente aps a calibrao
rastrevel
Vidrarias volumtricas Calibrao gravimtrica na Anualmente
tolerncia exigida
Microscpios Calibrao rastrevel de Aps a instalao, antes do uso
micrmetro de mesa (onde inicial
apropriado)
Higrmetros Calibrao rastrevel Anualmente
Centrfugas Calibrao rastrevel ou Anualmente
verificao com um tacmetro
Uso de controles
As amostras de controle da qualidade so testadas da mesma maneira que
as amostras de pacientes e pelo mesmo pessoal que rotineiramente realiza
os testes de pacientes. Os resultados dos controles so sempre avaliados an-
tes da emisso do laudo, havendo aes corretivas documentadas quando
o controle excede os limites de tolerncia. Resultados de controle que se
encontrem fora dos critrios de aceitabilidade especificados devem ser ime-
diatamente reportados ao supervisor responsvel para que aes corretivas
imediatas sejam tomadas.
Resultados de pacientes obtidos em uma rotina analtica cujos controles en-

contram-se fora dos limites de aceitao ou desde a ltima rotina aceitvel
sero re-analisados para determinar se existe alguma diferena clinicamente
significativa nos resultados obtidos.
Controle de microscopia
A maneira pela qual o exame microscpico realizado tem de ser consisten-
te. Para garantir a reprodutibilidade, uma vez que na maioria dos casos no
se dispe de controles de qualidade comerciais, pode-se adotar a prtica da
dupla observao, e/ou avaliao de um mesmo material por todos os indi-
vduos e/ou uso de slides ou figuras previamente validadas por consenso.
Mensalmente utilizar anlise de replicatas ou duplo-cego.
fundamental que o laboratrio disponha de um arquivo de micro-organis-

mos no usuais, como tambm de atlas, figuras ou outras publicaes que
auxiliem na identificao dos elementos presentes nos diversos materiais
biolgicos.
29
Recomenda-se guardar todas as lminas por pelo menos uma semana para
possvel reviso ou referncia. Lminas com achados raros devem ser con-
servadas por perodos de tempo mais longos, dependendo do espao dispo-
nvel. Nesse caso fixar a preparao atravs de meios de incluso rpida para
microscopia e cobertas com lamnulas.
Vale lembrar que a conservao e manuteno dos microscpios so fun-

damentais para a qualidade da anlise microscpica. Diariamente realiza-se
a limpeza de partculas de sujeira na ocular, objetivas e condensador com
leno de papel ou lenos prprios para limpeza de lentes. No utilizar gaze
ou papel higinico. Ao final da rotina retirar resduos de leo utilizando um
cotonete umedecido com uma soluo de lcool ter (1:1) ou lcool iso-
proplico 70% (nunca usar xilol), evitando contato com a regio perifrica
das lentes. Pode-se utilizar ainda solues prprias para limpeza de lentes
disponveis em pticas. Semestralmente procede-se limpeza da parte inter-
na das oculares e objetivas.
2.6.2 Bacteriologia
Meios de cultura
O laboratrio responsvel por garantir que todos os meios de cultura
usados, tanto comprados prontos como de preparo prprio, sejam est-
reis, capazes de permitir o crescimento adequado dos micro-organismos
e apresentem a reatividade bioqumica apropriada. Em geral, o laboratrio
mantm em estoque cepas de micro-organismos para testar os meios antes
ou simultaneamente ao uso, mantendo os registros adequados. Os micro-
-organismos empregados para o controle de qualidade devem ser mantidos
no laboratrio por meio de subcultivos de isolados recuperados como parte
do trabalho de rotina ou micro-organismo de referncia como os da ATCC.
Meios preparados no laboratrio

O desempenho apropriado dos meios de cultura, diluentes e outras solues
preparadas no laboratrio deve ser verificado com relao sobrevivncia
ou recuperao do micro-organismo-alvo, inibio ou supresso dos mi-
cro-organismos no-alvo, s propriedades bioqumicas (diferenciais e diag-
nsticas) e s propriedades fsicas (por exemplo: pH, volume e esterilidade).
Na Tabela 3, encontram-se listados os microganismos-controle e as reaes
esperadas para o controle de qualidade dos meios de cultura, segundo Winn
2006.
30
Tabela 3 Micro-organismos-controle e reaes para o controle de qualidade dos meios de

cultura
MEIO MICRORGANISMO REAO

gar-sangue Streptococcus do Grupo A Bom crescimento, beta-hemlise
Streptococcus pneumoniae Bom crescimento, alfa-hemlise
gar bile-esculina Espcies de Enterococcus Bom crescimento, cor negra
Streptococcus alfa-hemoltico Nenhum crescimento, sem
no do grupo D colorao do meio
gar chocolate Haemophilus influenzae Bom crescimento
Neisseria gonorrhoeae Bom crescimento
gar uria de Christensen Proteus mirabilis Toda a superfcie de cor rosa
(positivo)
Klebsiella pneumoniae Inclinao do meio rosa (positivo
parcial)
Escherichia coli Cor amarela (negativo)
gar citrato de Simmons Klebsiella pneumoniae Crescimento ou cor azul (positivo)
Sem crescimento, permanece
Escherichia coli verde (negativo)
gar cistina-tripticase (ACT)
- Dextrose Neisseria gonorrhoeae - Cor amarela (positivo)
Branhamella catarrhalis - No modifica a cor (negativo)
- Sacarose Escherichia coli - Cor amarela (positivo)

Neisseria gonorrhoeae - No modifica a cor (negativo)
- Maltose Espcies de Salmonella ou - Cor amarela (positivo)

Neisseria meningitidis - No modifica a cor (negativo)
Neisseria gonorrhoeae
- Lactose Neisseria lactamicus - Cor amarela (positivo)

Neisseria gonorrhoeae - No modifica a cor (negativo)
Descarboxilases
- Lisina Klebsiella pneumoniae - Cor azulada (positivo)
Enterobacter sakasakii - Cor amarela (negativo)
- Arginina Enterobacter cloacae - Cor azulada (positivo)

Proteus mirabilis - Cor amarela (negativo)
- Ornitina Proteu mirabilis - Cor azulada (positivo)

Klebsiella pneumoniae - Cor amarela (negativo)
DNAse Enterobacter cloacae Zona de clarificao
(adicionar HCl 1 N)
Serratia marcescens Sem zona de clarificao
31

gar eosina azul-de-metileno Escherichia coli Bom crescimento, brilho verde
metlico
Klebsiella pneumoniae Bom crescimento, prpuras, sem
brilho
Shigella flexneri Bom crescimento, transparentes
(lactosenegativas)
gar de Hecktoen Salmonella typhimurium Verdes com centro negro
Shigella flexneri Verdes transparentes
Escherichia coli Crescimento algo inibido,
alaranjadas
Indol Escherichia coli Cor vermelha (positivo)
Klebsiella pneumoniae Ausncia de cor vermelha
(negativo)
gar lisina-ferro Salmonella typhimurium Profundidade e inclinao
prpura + H2S
Shigella flexneri Inclinao prpura /
profundidade amarela
Proteus mirabilis Inclinao vermelha /
profundidade amarela
gar MacConkey Escherichia coli Colnias vermelhas (lactose-
positivas)
Proteus mirabilis Colnias incolores, sem
disseminao
Espcies de Enterococcus Sem crescimento
Malonato Escherichia coli Sem crescimento

Klebsiella pneumoniae Bom crescimento, cor azul
(positivo)
Motilidade Proteus mirabilis Meio turvo (positivo)
Klebsiella pneumoniae Sem borda plumosa em estria
(negativo)
Caldo ou gar nitrato Escherichia coli Cor vermelha ao adicionar
reativos
Acinetobacter lwoffi Ausncia de cor vermelha
(negativo)
gar sangue fenletil lcool Espcies de Streptococcus Bom crescimento
Escherichia coli Sem crescimento
o-Nitrofil-beta- Serratia marcescens Cor amarela (positivo)
Dgalactopiranosdeo (ONPG) Salmonella typhimurium Incolor (negativo)
Fenilalanina desaminase Proteus mirabilis Cor verde (adicionar FeCl3 a 10%)
Escherichia coli Ausncia de cor verde (negativo)
gar Salmonella-Shigella Salmonella typhimurium Colnias incolores, centro negro
Escherichia coli Sem crescimento
Voges-Proskauer Klebsiella pneumoniae Cor vermelha (adicionar reativos)
Escherichia coli No desenvolve cor (negativo)
32

gar xilose-lisina-dextrose Espcies de Salmonella Colnias vermelhas (lisina-
(XLD) positivas)
Escherichia coli Colnias amarelas (positiva para
acares)
Espcies de Shigella Colnia transparentes (negativo)
Matrias-primas (formulaes comerciais desidratadas e constituintes indi-

viduais) devem ser armazenadas sob condies apropriadas, em ambiente
frio, seco, protegido da luz e em recipientes hermeticamente fechados, espe-
cialmente aqueles com meios desidratados. Meios que apresentem qualquer
tipo de alterao de cor ou aspecto no podem ser usados. A gua utilizada
na preparao dos meios pode ser destilada, deionizada, ou produzida por
osmose reversa, livre de substncias bactericidas, inibidoras ou interferentes.
A validade dos meios preparados, mantidos nas condies definidas de ar-

mazenamento, deve ser determinada e controlada.
Meios prontos para uso

Para meios comprados prontos para uso, o laboratrio deve ter registros de
que cada lote tenha sido testado quanto esterilidade, capacidade de fa-
vorecer o crescimento dos organismos pretendidos e reatividade bioqu-
mica, antes ou coincidentemente ao incio do uso.
obrigao do fabricante fornecer as especificaes de qualidade do seu

produto, incluindo:
Nome dos meios e lista dos ingredientes, incluindo quaisquer suplemen-

tos.
Prazo de validade e critrios de aceitao aplicados.
Condies de armazenamento.
Frequncia de amostragem.
Verificao da esterilidade.
Verificao de crescimento dos micro-organismos de controle-alvo e no-

-alvo (com suas referncias da coleo de cultura) e Critrios de aceitao.
Verificaes fsicas e critrios de aceitao aplicados.
Data de edio da especificao.

Lotes de meios devem ser identificveis, sendo acompanhados pela evidn-
cia de que satisfazem a especificao de qualidade. O laboratrio dever se
certificar de que o fabricante notificar quaisquer alteraes na especifica-
o da qualidade do produto.
33
Corantes
Todos os procedimentos de colorao so controlados, com seu desempe-
nho registrado pelo menos semanalmente e para cada novo lote ou partida
de corante em uso, com organismos de referncia sabidamente gram-posi-
tivos e gram-negativos. Outras coloraes que no a de Gram (coloraes
no-imunofluorescentes e no-imunolgicas) so testadas com o uso de
controles positivos e negativos para a reatividade pretendida a cada dia de
uso e a cada novo lote ou partida recebida.
Controles positivos e negativos so processados em todas as coloraes es-

peciais para bactrias. As coloraes so verificadas a cada dia de uso ou
pelo menos semanalmente (o que for mais adequado) para a reatividade
pretendida de modo a garantir o desempenho consistente da colorao. Da
mesma forma, controles positivos e negativos so processados a cada vez
em que se utilizam coloraes fluorescentes.
Reagentes e controles
Para cada novo lote de reagentes para testes qualitativos, a mnima verifica-
o cruzada inclui a anlise de uma amostra sabidamente positiva e de uma
amostra sabidamente negativa. prefervel que essas validaes sejam rea-
lizadas utilizando-se amostras de pacientes que tenham sido testados ante-
riormente, ou que possam ser testadas simultaneamente com o lote anterior.
Em alguns casos as comparaes entre lotes podem apresentar dificuldades
prticas, como por exemplo para a pesquisa direta de Shigella nas fezes, uma
vez que amostra instvel e os positivos so raros. Em situaes em que a
maior parte das amostras ou organismos provenientes de pacientes reage
muito intensamente ao teste de interesse pode ser prefervel usar contro-
les bem caracterizados, fracamente positivos, para validar a sensibilidade do
novo lote de reagentes.
Controles positivos e negativos so testados e registrados para cada novo

lote, novo lote ou nova partida recebida dos seguintes testes: reagentes para
catalase, coagulase, oxidase; discos para bacitracina, optoquina, ONPG, X, V e
XV; e sistemas de identificao. Controles positivos e negativos tambm so
testados e registrados para cada novo lote recebido de anti-soros (exceto
Salmonella e Shigella que so testados quando preparados ou abertos e a
partir da uma vez a cada seis meses). Da mesma forma, controles positivos e
negativos para beta-lactamase (que no cefinase) so testados e registrados
a cada dia de uso. Por outro lado, no caso da cefinase, h necessidade de
testar apenas a cada novo lote.
34
Tiras de azul de metileno, culturas de organismos anaerbicos fastidiosos ou

outros procedimentos adequados so usados para a verificao da anaero-
biose nos sistemas como jarras, cmaras e sacos para anaerobiose.
Antibiograma
Falhas na deteco do padro de resistncia podem estar relacionadas a di-
versos fatores, tais como: m qualidade do meio de cultura, disco com baixa
concentrao de antimicrobiano, problemas no procedimento, inculo com
concentrao de micro-organismos fora do preconizado, tempo e tempera-
tura de incubao inapropriados.
A potncia dos discos para antibiograma verificada por meio de testes

utilizando organismos de referncia cujos padres de susceptibilidade so
conhecidos. Limites de tolerncia para a potncia dos antimicrobianos (in-
tervalo dos halos) so estabelecidos, sempre que possvel de acordo com o
CLSI (Clinical and Laboratory Standard Institute, antigo NCCLS).
As cepas de referncia tm um nmero mximo de geraes ao qual podem

ser submetidos, so cinco passagens a partir da cepa de referncia original.
O nmero indefinido de passagens pode comprometer principalmente a pu-
reza da cultura e as caractersticas fenotpicas de algumas bactrias. As cepas
de controle da qualidade devem ser testadas usando os mesmos materiais e
mtodos empregados para testes de isolados clnicos.
A frequncia dos testes de controle interno deve ser no mnimo mensal. En-
tretanto, publicaes recentes da Anvisa, em seu projeto de Monitoramen-
to e Preveno da Resistncia Microbiana em Servios de Sade, e do CLSI
preconizam testes semanais. Essas recomendaes devem ser seguidas se a
estrutura ou a capacidade do laboratrio permitir.
A introduo do programa de controle interno da qualidade inicia-se com

a realizao de testes dirios, passando, em fase posterior, para a realizao
mensal dos testes.
Teste dirio Testar todas as cepas de controle pertinentes durante cinco

dias consecutivos e documentar os resultados. Para passar a realizao
dos testes de diria para mensal, nenhuma das cinco leituras de halos,
para cada combinao de agente/antimicrobiano, pode estar fora dos li-
mites aceitveis.
Teste mensal Testar todas as cepas de CIQ no mnimo mensalmente e
sempre que qualquer novo reagente do teste for utilizado (ex.: um novo
35
lote de meio de cultura, um novo lote de discos ou outro fabricante de

insumos).
obrigatrio que a realizao dos testes de controle da qualidade seja do-

cumentada, anotando-se os nmeros dos lotes, meios de cultura, reagentes,
discos de antibiticos testados nas respectivas datas. Caso algum resultado
do teste mensal de controle da qualidade encontrar-se fora da faixa aceit-
vel, faz-se necessrio implantar ao corretiva.
Sempre que um novo agente antimicrobiano for acrescentado ou houver

mudanas importantes no mtodo de leitura dos resultados dos testes, estes
devem ser realizados por cinco dias consecutivos e documentados, antes de
se passar para uma frequncia mensal.
O controle da acurcia dos testes realizados deve ser feito utilizando-se as

cepas de referncia para o gnero ou espcie do micro-organismo ou classe
de antimicrobiano que est sendo testado. Sero testados os antimicrobia-
nos que fazem parte do antibiograma utilizado na rotina do laboratrio. Por
exemplo: se o laboratrio testa para Enterococcus spp. ampicilina, ciproflo-
xacina, clorafenicol, teicoplanina, vancomicina, quinupristin/dalfopristin, es-
tes mesmos antimicrobianos sero testados com a cepa referncia S. aureus
ATCC 25923 para avaliar a qualidade da prova realizada, e os halos encon-
trados sero comparados com os valores de referncia. Os limites aceitveis
para os halos encontrados para as cepas de referncias e os diversos antimi-
crobianos so descritos no documento M100-S16/CLSI ou norma substituta.
recomendvel que o laboratrio de microbiologia hospitalar estabelea in-

tercmbios com a equipe mdica (CCIH) e a farmcia para desenvolver uma
lista de antibiticos a ser reportada no laudo para os diferentes organismos
isolados de diferentes locais. Essa lista baseada nas diretrizes do CLSI, nas
tabelas de rotina (Grupo A) e seletiva (Grupo B). Limitaes ao nmero de
antimicrobianos reportados, chamada de laudo em cascata, em geral signi-
fica reportar no mais do que 4 agentes potenciais aos quais, pelo menos em
uma instncia, o organismo susceptvel. O laudo seletivo ajuda a melhorar
a relevncia clnica e ajuda a minimizar a seleo de cepas multirresisten-
tes e a evitar o abuso de agentes de amplo espectro. O laboratrio pode,
igualmente, reportar apenas os agentes antimicrobianos efetivos no local do
isolamento, havendo documentao da padronizao adotada. Os laborat-
rios hospitalares devem participar da CCIH de forma a manter e reportar ao
corpo clnico relatrios cumulativos do perfil de susceptibilidade antimicro-
biana, pelo menos anualmente.
36
Resultados aceitveis derivados dos testes das cepas controle no garantem

resultados acurados dos isolados de pacientes. Quando forem observados
resultados incomuns ou inconsistentes de isolados de pacientes, os resulta-
dos so analisados criticamente para a garantia da sua acurcia. Recomen-
da-se inicialmente verificar a pureza da cultura e confirmar a identificao
usando procedimentos alternativos (se disponveis), principalmente quando
observa-se:
Escherichia coli resistente ao imipenem;

Klebsiella spp. suscetvel a ampicilina;
Proteus mirabilis resistante a ampicilina;
Staphylococcus aureus resistante a vancomicina.
2.6.3 Procedimentos analticos

Os itens a seguir definem padres mnimos para a rotina. Isso no impede
o uso de culturas de triagem (estudos limitados) e no implica que todas as
culturas de rotina exijam meios especiais, mas sim que estes estejam dispo-
nveis quando necessrios.
Culturas de material proveniente do trato respiratrio

Inicialmente, sugere-se a realizao rotineira de um esfregao corado pelo
Gram em todos os escarros expectorados para determinar a aceitabilidade
da amostra para a cultura e a abrangncia das pesquisas a serem realizadas.
As amostras inaceitveis no devem ser processadas, e/ou o mdico assis-
tente deve ser notificado para que seja providenciada uma amostra adequa-
da de imediato.
Potenciais patgenos podem fazer parte da flora oral dos pacientes e pode
no ser necessria identificao e realizao de antibiogramas, quando hou-
ver evidncias de contaminao grosseira do escarro com saliva. Deve-se
tentar estabelecer uma correlao entre os resultados das culturas com os
resultados da colorao de Gram e, quando possvel, com informaes clni-
cas obtidas junto ao mdico assistente quanto a evidncias de uma possvel
pneumonia.
Os procedimentos de rotina para a cultura de amostras aceitveis de escarro

permitem o isolamento de pneumococos, Staphylococcus aureus, Pseudomo-
nas aeruginosa, e Enterobacteriaceae.
Culturas de Urina
O padro mnimo para a avaliao das culturas de urina inclui uma estimati-
va do nmero de organismos isolados e sua classificao em Gram-positivos
37
ou Gram-negativos. As culturas quantitativas (contagem de colnias) devem

ser realizadas rotineiramente, utilizando-se meios e procedimentos adequa-
dos ao isolamento e identificao tanto de Gram-positivos como de Gram-
-negativos.
Culturas de Material Ginecolgico

A triagem para Streptococcus Grupo B em mulheres grvidas feita de acor-
do com as diretrizes atuais, que recomendam a triagem universal para colo-
nizao vaginal e retal por estreptococos do Grupo B para todas as mulheres
gestantes entre a 35-37 semanas.
Coproculturas
Os procedimentos de rotina para o processamento de amostras quanto a
patgenos devem permitir o isolamento e a identificao de patgenos en-
tricos relevantes em pacientes com diarria.
Culturas de Lquor
Amostras de lquor para cultura necessitam ser processadas imediatamente
aps seu recebimento no laboratrio. Esfregaos para colorao de Gram
so preparados de rotina, e os resultados positivos so liberados de acordo
com a poltica de comunicao de resultados potencialmente crticos. Os ti-
pos de meios inoculados e os mtodos de incubao devem garantir a re-
cuperao de patgenos comuns e exigentes como a Neisseria meningitidis,
Streptococcus pneumoniae e o Haemophilus influenzae.
Quando se utiliza mtodos de pesquisa de antgenos, culturas de segurana

so realizadas, tanto para amostras positivas como para amostras negativas.
Hemoculturas
O volume de sangue coletado deve obedecer as especificaes do fabrican-
te dos frascos de hemocultura. Os sistemas de uso na rotina para a realiza-
o de hemoculturas permitem o isolamento e a identificao de aerbios e,
quando indicado, de anaerbios. Todas as culturas negativas macroscopica-
mente so verificadas por meio de colorao de Gram ou de subcultivo ae-
rbico, em algum momento, antes de serem liberadas como negativas, lem-
brando que hemoculturas automatizadas no necessitam dessa conferncia
adicional desde que tenham sido monitorizadas por pelo menos 5 dias.
As hemoculturas positivas so liberadas de acordo com a poltica de comu-

nicao de resultados potencialmente crticos.
38
Culturas de material de feridas

Para as feridas profundas, os procedimentos mnimos permitem a recupera-
o e a identificao de organismos aerbios e moderadamente anaerbios.
Esfregaos diretos corados pelo Gram so preparados e examinados de ro-
tina. Os procedimentos para a coleta e o manejo de amostras de feridas so
capazes de recuperar organismos anaerbios, quando indicado e em mate-
rial coletado adequadamente
2.6.4 Micobacteriologia
Meios de cultura
Da mesma forma que na bacteriologia uma amostra adequada de cada meio
e aditivo preparados pelo laboratrio verificada com relao a esterilida-
de (caso sejam adicionados aditivos aps a esterilizao inicial), capacidade
de favorecer o crescimento (quando aplicvel) por meio de cultivo de cepas
controle ou de testes em paralelo com lotes anteriores e reatividade bioqu-
mica (quando adequado). Meios micobacteriolgicos deteriorados so des-
cartados.
Colorao
As coloraes para bactrias lcool cido resistentes so controladas a cada
dia de uso por meio de cepas controle adequadas e os resultados registrados.
As coloraes fluorescentes so verificadas com o uso de controles positivos
e negativos a cada dia e os resultados so registrados. Resultados positivos
na pesquisa para micobacterias so liberados de acordo com a poltica de
comunicao de resultados crticos.
Procedimentos
Concentrao, inoculao e incubao
Amostras potencialmente contaminadas com outros micro-organismos
(ex. escarro, lavado brnquico) quando submetidas cultura para mico-
bactrias so descontaminadas e concentradas. A colorao para B.A.A.R.
realizada em lminas preparadas do material antes e aps a concentra-
o. Havendo uma quantidade adequada de material, o laboratrio ino-
cula as amostras (que no sangue) em meio apropriado.
Culturas e identificao
Caso o laboratrio oferea a identificao completa necessria uma va-
riedade de testes diferenciais suficientes para a diferenciao acurada dos
diferentes tipos de micobactrias. Controles positivos e negativos so tes-
tados rotineiramente e seus resultados registrados.
39
2.6.5 Micologia
Meios de cultura
Assim como na bacteriologia e na micobacteriologia, todos os meios so ve-
rificados quanto esterilidade (se forem adicionados aditivos aps a esteri-
lizao), quanto capacidade de favorecer o crescimento e quanto reativi-
dade bioqumica (quando aplicvel) por meios de cepas controle ou testes
em paralelo contra lotes anteriores.
Coloraes
Todos os procedimentos de colorao so verificados e seus resultados regis-
trados para cada novo lote de corante preparado, e pelo menos diariamen-
te, contra cepas controle sabidamente positivas e negativas. Controle para
preparaes de KOH no so necessrios. Controles para o lactofenol-azul
de algodo no precisam ser feitos a cada dia de uso, mas devem ser feitos a
cada novo ou preparado. Para certas coloraes, como Prata Metenamina de
Gomori e Giemsa, a prpria lmina serve de controle negativo.
Procedimentos e testes
O princpio da garantia da qualidade dos procedimentos analticos em mico-
logia baseia-se no uso de meios e condies de cultura variados o suficiente
para permitir o isolamento de patgenos significativos, com a menor inter-
ferncia possvel de contaminantes.
Os procedimentos preliminares, de triagem tais como KOH 10%, tinta da Chi-

na ou Giemsa esto disponveis e so realizados quando indicado. Os proce-
dimentos de isolamento e identificao incluem a triagem preliminar pelo
exame de preparaes diretas ou coradas, pelo uso de meios seletivos para
dermatfitos e fungos sistmicos e pelo uso de meios contendo agentes an-
timicrobianos.
Meios adicionais ou diferentes so usados para a cultura de dermatfitos e/

ou fungos sistmicos. Meios contendo agentes antimicrobianos so usados,
quando indicado, para a supresso do crescimento de bactrias, embora al-
guns agentes antimicrobianos possam inibir algumas leveduras ou a fase le-
vedurifome de organismos dimrficos. As temperaturas de incubao para
o crescimento e o isolamento de dermatfitos e de fungos sistmicos devem
estar definidas e seguidas rigorosamente. Quando as culturas so deixadas
temperatura ambiente (2226C), esta deve controlada, verificada e regis-
trada a cada dia.
40
2.6.6 Processos Automatizados

obrigatrio o controle e registro dos lotes e validade dos insumos em uso.
No caso da utilizao de turbidmetro, deve-se calibrar e registrar a transmi-
tncia diariamente.
Os requisitos mnimos para controle de qualidade em processos automatiza-

dos so os que se seguem:
Cepas de referncia recomendadas para testes de identificao

Recomenda-se testar no mnimo uma cepa de referncia por painel.
Para painis de Gram-negativos:

.. E. coli 25922 (qualidade da prova).
.. P. mirabilis 7002 (qualidade da prova de identificao de bacilos Gram-

-negativo).
.. K. pneumoniae 13883 (qualidade da prova de identificao de bacilos
Gram-negativo).
Para painis de Gram-positivos:
S. aureus 29213 (qualidade da prova de identificao de bacilos Gram-
-positivo).
E. faecalis 29212 (qualidade da prova de identificao de bacilos Gram-
-positivo).
Para painis de Leveduras:
C. albicans 14053 (qualidade da prova de identificao de leveduras).
Cepas de referncia recomendadas para testes de sensibilidade

Para painis de Gram-negativos:
E. coli 25922 (qualidade da prova).
E. coli 35218 (para inibidores de lactamase).
E. coli 51446 (ESBL).
P. aeruginosa 27853 (concentrao de ctions e pH com aminoglicos-
deos).
E. faecalis 29212 (quantidade de timina-timidina com SXT).
K. pneumoniae 700603 (ESBL).
K. pneumoniae BAA 1705 (Controle positivo para carbapenemase)
K. pneumoniae BAA 1706 (Controle negativo para carbapenemase)
Para painis de Gram-positivos:
S. aureus 29213 (qualidade da prova).
E. faecalis 29212 (quantidade de timina-timidina com SXT).
E. faecalis 51299 (resistncia a vancomicina).
E. coli 35218 (para inibidores de lactamase).
41
Validao
Protocolo de controle da qualidade dirio
Prova diria por 5 dias
Sem erro, seguir com o controle peridico.
1 de cada 5 ensaios apresentarem erro, tomar aes corretivas:
erros bvios: testar novamente no mesmo dia e, se o resultado for
o esperado, continuar com as provas dirias.
erros no bvios: testar novamente no mesmo dia e controlar por
cinco dias consecutivos. Se todos os resultados estiverem dentro do
esperado, passar ao controle mensal.
Protocolo de controle da qualidade peridico
Recomenda-se realizar os controles a cada ms, utilizando as listas de
cepas de referncia acima mencionadas. Tambm deve ser realizado
um controle a cada troca de lote do painel. Se os testes mensais apre-
sentarem erros, tomar aes corretivas e retornar aos testes dirios.
2.6.7 Testes de Proficincia

obrigatria a participao em um programa de proficincia em ensaios la-
boratoriais. Para as anlises no cobertas por programa de proficincia, o
laboratrio deve dispor de um sistema alternativo documentado para ava-
liao da confiabilidade dos resultados. A utilizao do controle alternativo
baseia-se em grande parte em documentos do CLSI no caso o GP29-A, que
estabelece que inicialmente o laboratrio tem que identificar os testes no
cobertos pelos programas de proficincia e desenvolver uma alternativa de
controle. Uma vez definido como ser feito esse controle, document-lo, es-
tabelecer limites de aceitao e definir a frequncia de utilizao.
Na prtica, o uso de controles alternativos permitem uma estimativa da exa-

tido dos resultados liberados na rotina e permite que o laboratrio atenda
aos requisitos dos programas de gesto de qualidade. Entretanto, uma pr-
tica difcil de gerenciar e de estabelecer os limites de aceitao dos resulta-
dos. Assim, o controle de qualidade alternativo no pode ser encarado como
um substituto dos testes de proficincia, mas sim como uma alternativa pos-
svel na indisponibilidade dos ensaios de proficincia.
2.7 Fase ps-analtica
2.7.1 Conferncia
Todo laboratrio necessita de um sistema documentado para detectar e cor-
rigir erros significativos de transcrio que poderiam afetar a conduta clnica.
Uma alternativa a reviso e conferncia dos resultados finais por um indiv-
42
duo qualificado para tal, antes da liberao final dos resultados, uma vez que a
maioria dos resultados no so interfaceados e sim digitados manualmente. O
sistema de informtica pode dispor de alertas, na etapa de digitao, para re-
sultados improvveis ou absurdos. Cada laboratrio define quais os resultados
que sero reportados imediatamente ao mdico responsvel pelo paciente.
2.7.2 Liberao dos laudos e notificao de resultados crticos

O laboratrio deve possuir polticas e instrues escritas para a emisso de
laudos que contemplem as situaes de rotina, os plantes e as urgncias.
Essas instrues incluem quem pode liberar os resultados e para quem, con-
templando tambm a liberao de resultados verbais e de laudos provis-
rios, quando aplicvel e necessrio.
necessrio que os resultados das culturas sejam reportados o mais rapi-

damente possvel, dispondo-se de critrios documentados para notificao
imediata ao mdico ou responsvel de resultados potencialmente crticos
que possam implicar a necessidade de atuao mdica imediata. As comuni-
caes verbais e os laudos provisrios so registrados e identificados como
tal, gerando-se laudos definitivos adequados no menor intervalo possvel.
Essa atividade deve ser devidamente registrada, mesmo quando o conta-
to no for conseguido. Esses registros incluem o resultado potencialmente
crtico, a data e horrio da notificao, o responsvel pela comunicao e a
pessoa notificada ou ainda a impossibilidade de comunicao e motivo.
43
2.8 Referncias Bibliogrficas

Anvisa. Habilitao para Laboratrio de Microbiologia. Sries Temticas, Laboratrio,
volume 3, 2006. Disponvel em http://www.anvisa.gov.br/reblas/eurachem/acreditacao.pdf
ltimo acesso em 12/03/2007
CLSI / NCCLS. Assessment of Laboratory Tests When Proficiency Testing is Not Available;
Approved Guideline (GP29-A) 2002.
CLSI / NCCLS Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow
Aerobically; Approved Standard Seventh Edition (M7-A7) 2006
CLSI / NCCLS Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved
Standard Ninth Edition (M2-A9) 2006.
CLSI / NCCLS Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 17th

Informational Supplement (M100-S17) 2007.
CLSI / NCCLS Performace Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 22th

Informational Supplement (M100-S22) 2012.
College of American Pathologists. Commission On Laboratory Accreditation Laboratory

Accreditation Program, Microbiology Checklist, 2006. Disponvel em http://www.cap.org/
apps/docs/laboratory_accreditation/checklists/microbiology__october2006.pdfltimo
acesso em 12/03/2007
Eurachem / Ea Guide 04/10. Accreditation for Microbiological Laboratories, 2002. Disponvel

em http://www.eurachem.ul.pt/guides/EurachemEA_Micro.pdf ltimo acesso em
12/03/2007.
Oplustil, CP et al. Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica. So Paulo: Sarvier, 2004.

Programa para Acreditao de Laboratrios Clnicos. Regulamento do Palc, Sociedade
Brasileira de Patologia Clnica, norma 2010. Disponvel em http://www.sbpc.org.br/upload/
conteudo/320101013112151.pdf ltimo acesso 29/01/2013.
Brasil. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria.Controle Interno da Qualidade para Testes

de Sensibilidade antimicrobianos. Disponvel em: http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/
manuais/manual_testes_antimicrobianos.pdf ltimo acesso em 12/03/2007.
Winn Jr, W et al Konemans Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology 6th ed,
Lippincott Williams & Wilkins, 2006.
44
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria - Anvisa
SIA Trecho 5 - rea especial 57 - Lote 200
CEP: 71205-050
Braslia - DF
Telefone: 61 3462 6000
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1. Infeco Relacionada Assistncia Sade Controle. 2. Infeco em Servios de Sade. 3. Microbiolo-

Captulo 1: Segurana em laboratrio de Microbiologia Clnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

Captulo 2: Garantia da qualidade em Microbiologia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

A resistncia microbiana um grave problema mundial, estando associada ao aumento do

Maria Jos Franco Landi Bartelega

Laboratrios so estabelecimentos que prestam servios especficos populao e apresen-

Visando minimizar tais riscos, essencial o estabelecimento de um Programa de Biossegu-

Conjunto de medidas destinadas a prevenir riscos inerentes s atividades dos labora-

A responsabilidade legal pela segurana em ambientes de trabalho cabe aos admi-

Deve-se designar uma pessoa ou Comisso de Biossegurana que vise:

Implementar as normas preconizadas em Biossegurana a fim de prevenir riscos

Estabelecer programas de treinamento para preveno de acidentes e monitorar

1.2 Classificao dos laboratrios, segundo Nvel de Biossegurana

O nvel de Biossegurana de um procedimento ser determinado segundo o agente

A Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana (CTNBio) responsvel pelas atribui-

1.2.1 Nvel 1 de Biossegurana (NB-1)

O trabalho geralmente conduzido em bancadas abertas, no exigindo

O laboratrio no est separado das demais dependncias do edifcio.

Deve possuir uma pia especfica para lavar as mos.

1.2.2 Nvel 2 de Biossegurana (NB-2)

2) cabine de Segurana Biolgica Classe I ou II e centrfuga com caapa

1.2.3 Nvel 3 de Biossegurana (NB-3)

1.2.4 Nvel 4 de Biossegurana (NB-4)

1.3 Classes de agentes de Risco Biolgico

Agentes biolgicos humanos e animais so divididos em classes de acordo com cri-

1.5 Instalaes laboratoriais

1.6 Equipamentos de proteo

Considera-se Equipamento de Proteo Individual (EPI) todo dispositivo ou produto,

1.6.1 Equipamento de Proteo Individual (EPI)

Luvas: uso para todos que trabalham em ambiente laboratorial, na mani-

1.6.2 Equipamento de Proteo Coletiva (EPC)

1.7 Conduta em laboratrio

O diretor e/ou coordenador do laboratrio responsvel por assegurar a implemen-

Programa de Preveno de Risco Ambiental (PPRA) avaliado anualmente (NR-32

vedado o uso de calados abertos (chinelos e sandlias).

Toda amostra biolgica deve ser considerada potencialmente contami-

Proibido pipetar com a boca.

Obrigatria a descontaminao das bancadas de trabalho antes e aps o

Nunca manipular materiais no identificados.

Segregar e acondicionar adequadamente resduos biolgicos, qumicos

1.7.2 Transporte de Amostras

1.7.3 Utilizao de Cabines de Segurana

Fechar as portas do laboratrio e evitar circulao de pessoas durante o

1.7.4 Controle da Gerao de Aerossis

1.8 Limpeza e desinfeco

As superfcies contaminadas podem servir como reservatrio de agentes patogni-

sa transmisso atravs da higienizao das mos, a realizao da limpeza e desinfec-

Os fatores que influenciam na escolha do procedimento de desinfeco das superfcies

Eficincia dos agentes qumicos frente aos tipos comuns de micro-organismos

Bactria Bactria Bacilo

1.8.1 Higienizao das mos

Abrir a torneira e molhar as mos sem encostar-se pia.

f ) friccione circularmente as unhas (pontas dos dedos) na palma da outra

O laboratrio responsvel pelo correto gerenciamento de todos os resduos gera-

Os Resduos de Servios de Sade (RSS), segundo a RDC n 306 de 2004 da Anvisa, so