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SUMRIO
Introduo e seus componentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
Introduo biologia molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
Organismos eucariontes e procariontes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
Organismos procariontes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
Organismos eucariontes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
Molculas fundamentais na expresso gnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
cidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
Protenas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10
Dogma central da biologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
Replicao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
Transcrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
Traduo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Metodologias aplicadas biologia celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
Extraes de DNA, RNA e protenas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
Quantificao do material extrado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
Reaes de polimerizao em cadeia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
Componentes da reao de PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
Desenho dos primers ou iniciadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Anlise e aplicao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
Anlise em eletroforese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
Eletroforese em gel de agarose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
Eletroforese em gel de poliacrilamida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
Variaes na metodologia da PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
Multiplex PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
Nested PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
PCR transcriptase reversa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
PCR em tempo real . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
Sequenciamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
Sequenciamento por Mtodo de Sanger . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
Sequenciamento de Nova Gerao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
Biologia molecular aplicada em diagnstico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
Kits disponveis e Plataformas disponvei para o uso em laboratrios . . . . . . . . . . . . 38
Concluso: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
Glossrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
Referncias bibliogrficas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
A partir desse marco histrico, os cientistas elaboraram tcnicas pelas quais pudessem estudar
e manipular o material gentico. Seu uso abrange muitos setores da rea de biolgicas, como
medicina, biologia e biomedicina. Na rea da sade, sua utilizao aperfeioou o estudo de doenas
genticas, tcnicas de tratamento e diagnstico. A biologia molecular cada vez mais utilizada no
diagnstico clnico. Um nmero crescente de doenas pode ser detectado e monitorado em tempo
hbil, proporcionando rapidez e eficincia a esse setor. O crescente uso dessa tcnica em anlises
clnicas fez com que seu aprendizado se tornasse essencial para a formao dos profissionais
dessa rea.
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Organismos procariontes
Do grego pro (antes) e karyon (ncleo), so organismos que no apresentam ncleo nas clulas.
Apenas o reino monera (bactrias e algas azuis) classificado como procarionte. A principal
caracterstica que os difere dos eucariontes a ausncia do envoltrio nuclear.
J que nosso interesse so as anlises clnicas, iremos focar nossa observao nas bactrias.
Esses microrganismos unicelulares apresentam estrutura simples. So classificados como Gram-
positivos ou Gram-negativos, de acordo com a parede celular. Bactrias Gram-positivas apresentam
parede celular mais espessa, porm mais simples. Bactrias Gram-negativas apresentam parede
celular menos espessa, mas tm uma membrana externa que a recobre, tornando sua estrutura
mais complexa (figura 1).
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Fonte: https://image.slidesharecdn.com/aulademicrobiologia-ppt-131220065223-
phpapp02/95/aula-de-microbiologia-ppt-12-638.jpg?cb=1387522454
Organismos eucariontes
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Fonte: https://static.todamateria.com.br/upload/55/14/5514b71582eb7-celulas-procariontes-inserir-imagem.jpg
SAIBA MAIS
O envoltrio nuclear uma estrutura que envolve o ncleo das clulas dos seres eucariontes, formado
por duas membranas (interna e externa). As membranas delimitam um espao entre elas denominado
espao perinuclear. A membrana externa e continua com o REG. As membranas so interrompidas
por poros. Conhea mais acessando o link: http://biologiacelulareestrutural.blogspot.com.br/2011/11/
envoltorio-nuclear.html
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cidos nucleicos
Todos os seres vivos contm dois tipos de cidos nucleicos, o cido desoxirribonucleico (DNA)
e o cido ribonucleico (RNA). Os vrus apresentam apenas um tipo de cido nucleico, DNA ou RNA,
porm sua definio como um organismo vivo ainda gera muita polmica, pois so parasitas
intracelulares obrigatrios e no apresentam a maquinaria necessria para se replicar e expressar
seus genes.
Toda molcula de cido nucleico apresenta em sua composio um grupo fosfato, um acar e
uma base nitrogenada, denominados de monmeros ou nucleotdeos dos cidos nucleicos (figura
2B). O grupo fosfato em questo o cido fosfrico, PO4H3. Ele libera ons H+, ficando com a carga
negativa (PO4-3), dando funo cida e carga negativa a esses cidos nucleicos. O acar uma
pentose, composta por um anel de cinco carbonos. No DNA, a pentose (desoxirribose) apresenta um
oxignio a menos que a ribose (RNA) (figura 2A). As bases podem ser purinas (adenina, guanina),
formadas por dois anis fundidos, ou pirimidinas (citosina, timina ou uracila), formadas por um anel
aromtico (figura 2D). Citosina, guanina e adenina so encontradas em ambos os cidos nucleicos,
porm a timina encontrada apenas no DNA e a uracila, apenas no RNA.
A polimerizao dos monmeros, isto , a ligao entre eles para formar tanto uma molcula
de DNA quanto uma de RNA, d-se por meio de ligaes fosfodister, nas quais o grupo hidroxila
(OH), ligado ao carbono 3 da pentose, removido e o oxignio do grupo fosfato, ligado ao carbono
5, assume o lugar. Esse grupo OH, mais outro tomo de H+ livre, formam uma molcula de gua.
por esse motivo que a extenso dos cidos nucleicos se d na direo 5-3 (figura 3).
A molcula de RNA apresenta fita simples. J a de DNA, fita dupla (figura 3). Entre as duas
fitas em paralelo, ocorrem ligaes de ponte de hidrognio entre as bases nitrogenadas. Uma base
pirimdica liga-se a uma base purnica, de forma que adenina se liga a timina por duas ligaes
de pontes de hidrognio e citosina se liga a guanina por trs pontes de hidrognio, estabelecendo
assim uma ligao mais forte que a das bases anteriormente descritas (figura 4).
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Figura 4 Molculas
Fonte: http://santhdalcin.blogspot.com.br/p/biologia-2-colegial.html
Fonte: http://coral.ufsm.br/blg220/hide/estrutnucleot1.htm.
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Fonte: http://kurtkraut.net/blog/2005/12/
CURIOSIDADE
Apesar de sua grande importncia na manutenoda biosfera, estima-se que menos de 10% dos
microrganismos existentes no planeta tenham sido caracterizados e descritos (Staley, 1998). Acesse
o link e saiba mais nesse estudo realizado pelo Centro de Referencia em Informao Ambiental
CRIA - http://www.faecpr.edu.br/site/documentos/recursos_microbiologicos_biotecnologia.pdf
Protenas
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para formar uma protena ocorre por ligaes peptdicas entre o grupo amina de um aminocido e
o grupo carboxila de outro. Assim, uma protena formada por polipeptdios (muitos aminocidos
formando ligaes peptdicas entre si). Uma protena que apresenta 300 aa (aminocidos) possui
aproximadamente 300 KDa (quilodaltons).
Estrutura terciria: refere-se a novas dobraduras que ocorrem na estrutura secundria, dando
uma conformao tridimensional protena.
Estrutura quaternria: resulta da interao de dois ou mais polipeptdeos e origina uma molcula
de grande complexidade.
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Figura 7 DNA
Replicao
Dentre a enorme diversidade de organismos que existem, todos compartilham uma propriedade
bsica, a de se reproduzir, assexuada ou sexuadamente. a partir da replicao do DNA, quando
um cromossomo se duplica, que novas clulas filhas so formadas, na diviso celular denominada
mitose, ou que os gametas formam-se, a partir da meiose.
A replicao do DNA inicia-se com a separao das duas fitas da dupla hlice, sendo essa
separao reversvel. As fitas de DNA serviro de molde para que outras novas sejam formadas.
Em bactrias, o DNA circular, logo, uma enzima denominada desoxirribonuclease rompe essa
estrutura, expondo uma extremidade.
Uma segunda enzima, a helicase, quebra as pontes de hidrognio que h entre as duplas fitas,
separando-as, formando assim as forquilhas de replicao. Protenas denominadas SSBP se ligam
ao DNA e estabilizam-no, mantendo-o desenrolado.
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Uma RNA polimerase especial, denominada primase, sintetiza um RNA pequeno e complementar
fita de DNA para que sirva de iniciador de replicao a outra enzima, a DNA polimerase III. Esta,
por si s, no consegue iniciar a replicao sem que haja esse molde inicial.
A DNA polimerase III percorre o DNA inserindo as bases complementares s fitas moldes. Para
cada timina, inserida uma adenina, e vice-versa; para cada guanina, inserida uma citosina, e
vice-versa. O primer formado (RNA) substitudo pela DNA polimerase I.
Como dito anteriormente a extenso do cido nucleico ocorre na direo 5- 3. Uma das fitas
moldes, fita lder, ir formar uma fita de DNA complementar contnua, e a outra fita complementar,
lenta, ir formar um DNA descontnuo, fragmentado. A esses fragmentos denominamos fragmentos
de Okasaki (figura 8).
Para que ocorra a unio desses fragmentos, uma enzima denominada ligase realiza a ligao
entre eles, formando uma fita de DNA contnuo.
Fonte: http://www.sistemanervoso.com/pagina.php?secao=5&materia_id=95&materiaver=1
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Transcrio
A transcrio consiste na formao de um RNA mensageiro (RNAm) que levar a mensagem
da formao de uma protena. Para que ocorra a transcrio, uma protena indutora, ou fator de
transcrio, liga-se sequncia promotora do gene que ser transcrito, denominada caixa TATA. A
partir da, a RNA polimerase pode formar um RNAm complementar fita de DNA. Porm, como dito
anteriormente, no lugar de timina, h uracila no RNA, ento, quando o DNA apresentar adenina, no
RNA ser inserida uma uracila. Esse RNAm formado denominado imaturo, pois apresenta tanto
a sequncia no codificante do DNA, denominada ntron e que no pode ser traduzida na protena,
quanto a poro codificante, denominada xon.
Esse RNAm imaturo passa primeiramente por um processo de splicing, no qual esses introns so
removidos. A segunda etapa de maturao do RNAm, que serve como um sinal para que, quando
for transportado para o citoplasma, no seja degradado, a incorporao de uma cauda poli A na
extremidade 3 e de um quepe na extremidade 5 (figura 6). Assim que passa por essas etapas, o
RNAm pode ser transportado para o citoplasma, onde ser traduzido em uma protena.
Figura 9 - RNAm
Fonte: http://e-escola.ist.utl.pt/topico.asp?id=227
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Nessa etapa de transcrio, a diferena entre organismos eucariotos e procariotos que, nestes,
a maturao do RNAm no necessria, j que transcrio e traduo ocorrem no citoplasma e h
poucos ntrons em bactrias, j que seu genoma pequeno e praticamente todo expresso.
Traduo
Quando o RNAm transferido para o citoplasma, este ir se acoplar a um ribossomo para
ser ento traduzido. Ribossomos so organelas celulares tanto de clulas eucariontes quanto
procariontes, e sua funo a sntese de protenas. Essas organelas so compostas por protenas
e RNA ribossmico (RNAr) e formadas por uma subunidade maior e uma menor.
Procariotos 70S
- rRNA 5S
32 protenas diferentes
21 protenas diferentes
Eucariotos 80S
- rRNA 5,8S
- rRNA 5S
50 protenas diferentes
30 protenas diferentes
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O RNAt constitudo de uma fita com 80 nucleotdeos em forma de cruz, em cuja extremidade
inferior existem trs nucleotdeos (anticdon) que so complementares aos cdons do RNAm. Na
extremidade superior, encontra-se o stio de ligao ao aminocido. Para cada cdon, h um RNAt
correspondente que carrega determinado aminocido. O cdigo gentico corresponde traduo
dos nucleotdeos em aminocidos, e estes seguem as seguintes leis:
Degenerao um mesmo aminocido pode ser codificado por vrios cdons diferentes.
No ambiguidade cada cdon corresponde a somente um aminocido.
Universalidade o cdigo gentico o mesmo nos mais diversos organismos (exceo:
protozorios ciliados e mitocndrias).
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Figura 10 Cdigo Gentico
Fonte: http://www.ufpe.br/biolmol/Genetica-Medicina/sintese_proteica.htm.
SAIBA MAIS
Traduo proteica - Nesse vdeo de animao educativa mostra o mecanismo de sntese proteica -
http://www.youtube.com/watch?v=cD4i-0weH4U&feature=fvwp&NR=1
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CURIOSIDADE
Usa-se nessa etapa uma enzima, uma proteinase, para degradar os componentes proteicos.
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Uma prxima etapa o uso de fenol, j que protena solvel nele e cido nucleico, no. Nesse
momento, ocorre a separao em fases, uma com cido nucleico diludo em soluo aquosa e outra
com protena diluda no fenol. Caso se queira usar a protena, essa fase protena-fenol removida.
Usa-se posteriormente clorofrmio, que remove o fenol, e NaCl2 (cloreto de sdio), que mantm
as protenas dissolvidas e no permite que se precipitem com o cido nucleico no fundo do tubo.
Precipitao: nessa etapa, usa-se etanol para precipitar o DNA, pois este insolvel a esse
reagente. Quanto mais gelado o etanol estiver, mais insolvel o DNA ser. Retira-se o lcool
aps uma centrifugao, e o pellet formado no fundo do tubo. Vale ressaltar que usamos
o termo pellet quando o DNA precipitado. Quando temos restos celulares, usamos o termo
debris celular.
Reidratao: aps a retirada do lcool e a precipitao do DNA no fundo do tubo, necessria
reidratao para que seja formada uma soluo que possa ser utilizada nas reaes. Usa-se
gua ultrapura, mili-Q ou gua destilada, estreis e livres de nucleases (enzimas que degradam
os cidos nucleicos). O DNA pode ser armazenado a 20 C, porm RNA e protenas, que so
molculas instveis e se degradam facilmente, so armazenados a temperaturas inferiores
(70 C).
cidos nucleicos apresentam OD de 260 nm, e protenas de 280 nm. Caso se queira medir a
quantidade de cido nucleico de uma amostra, deve-se informar o aparelho, para que ele diga a
quantidade de material com essa absorbncia encontrada na soluo. Uma boa extrao aquela
na qual todo material, exceto o cido nucleico, foi removido, por exemplo, protena. Para isso, o
aparelho faz uma relao entre a quantidade de OD 260 nm encontrada e a de 280 nm. A relao
entre elas pode ser mensurvel e definida. Caso a relao OD 260 nm/280 nm seja:
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1,751,80: significa que, na soluo, temos entre 1,75 e 1,80 vez mais cido nucleico que
protena. Essa amostra apresenta boa qualidade.
< 1,75: significa que o material apresenta muita protena, logo, sua eficincia nas reaes
subsequentes pode no ser boa.
2: essa a melhor relao, a ideal. Temos uma quantidade de duas vezes ou mais cidos
nucleicos, logo, a quantidade de protena no ser suficiente para interferir na eficincia das
prximas reaes.
ACONTECEU
Os produtos para extrao de DNA envolvem 3 etapas bsicas. Acesse o link e conhea essas etapas.
http://eaulas.usp.br/portal/video.action?idItem=5253
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SAIBA MAIS
Esse banco foi criado durante o Projeto Genoma pelo governo norte-americano. Nesse projeto,
centros de todo o mundo iniciaram o processo de sequenciar todo o genoma humano, facilitando
o intercmbio mtuo, para que ocorresse a divulgao das regies j estudadas e sequenciadas.
Hoje, temos disponveis genes de vrias espcies, no s humanos. Quando se insere um gene, tanto
pela sequncia de nucleotdeos que formada quanto pelo nome que foi dado a ela, pode-se ter
acesso a sua localizao no cromossomo, a espcie a que pertence e at a protena que expressa
(sequncia de aminocidos).
Caso os iniciadores para o gene sejam retirados de um trabalho (artigo) que j descreve sua
utilizao, podem ser conferidos nesse site, para a verificao de se so especficos apenas para
ele. Caso se queira desenhar iniciadores para esse gene usando a sequncia de nucleotdeos,
deve-se no mesmo endereo procurar pelo nome do gene e adquirir a sequncia correspondente.
Abaixo, est representada uma sequncia de um gene, PhoE, usado para identificao molecular
da bactria Gram-negativa Klebsiella pneumoniae.
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Essa sequncia representa apenas uma da dupla fita do DNA, logo tem uma fita complementar.
Devemos desenhar o primer que ir anelar nela e servir de iniciador para a Taq polimerase tanto
nela quanto na complementar. Um primer ideal apresenta de 18 a 24 nucleotdeos, e quanto menor
o nmero de C e G, melhor ser sua eficincia. Isso porque citosina e guanina formam trs pontes
de hidrognio, e assim aumenta a fora necessria para que anele na fita de DNA.
O primer que anela nessa fita molde chamado de primer sense ou primer forward. O que anela
na fita complementar chamado de primer anti-sense ou primer reverse.
Primer forward:CGTGGAACAATTCGATACTAAA.
Repare que o primer ser complementar fita de DNA ilustrada, e, assim, a extenso ser na
direo 5para 3:
O primer reverse ir anelar a fita complementar desse DNA. E desejamos desenhar esse primer
na regio abaixo em destaque:
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Fazemos essa mudana na direo para que o primer seja desenhado para estender o DNA na
direo correta.
Veja qual a sequncia complementar a essa que temos na regio onde queremos desenhar
o primer reverse:
AGCACCTAATGTTTTAGTTG
Sequncia no invertida
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O tamanho do produto de amplificao ser a soma dos nucleotdeos abrangidos entre os dois
primers. Nesse caso, 413 pb (letras em destaque).
Primer forward
Primer reverse
Agora que temos nosso DNA extrado e os primers desenhados, os reagentes sero adicionados, e
o PCR, inserido em um aparelho termociclador. Uma reao de PCR pode ser realizada em microtubos
de 0,2 L - 10-3(1 ml = 1.000 L) ou 0,5 L. A quantidade dos reagentes segue algumas regras:
A quantidade de MgCl ser de quatro a cinco vezes a quantidade de Taq polimerase, pois esta
precisa do primeiro como cofator para funcionar.
A quantidade de dNTP 0,5 L para cada par de primers.
A quantidade de DNA normalmente10% do volume da reao, isto , se o total de reagentes
for 25 L, 2,5 L ser de DNA.
O volume da reao pode variar, porm ela completada com gua pura (livre de nucleases
e estril).
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Desnaturao: a primeira etapa de uma PCR. Nela, ocorre abertura das duplas fitas de DNA.
A temperatura para que isso ocorra in vitro (fora do organismo) entre 90 C e 98 C, e o processo
pode durar de 10 segundos a 1 minuto. A temperatura e o tempo variam de acordo com o produto
que ser amplificado.
Anelamento: a segunda etapa da PCR. Nela, os primers iro anelar na regio ao DNA onde so
complementares. A temperatura em que isso ir ocorrer depende da quantidade de C e G no primer.
Hoje em dia, as empresas que confeccionam os primers mandam o valor da sua temperatura de
melting. Esta se refere temperatura em que aproximadamente metade dos primers esto anelados
ao DNA e a outra metade, no. A temperatura de anelamento 5 C menor que aquela em que eles
se separam. Ela normalmente varia entre 52 C e 62 C, e o tempo, de 30 segundos a 1 minuto. Isso
tambm depende do tamanho do primer.
Um ciclo da PCR corresponde a cada vez que a amostra passou pelas trs etapas. Se cada
dupla hlice de DNA pode ser separada em duas fitas, e cada uma servir de molde para uma nova
fita, a quantidade de produtos formados segue a razo exponencial 2. Essa quantidade, no final
da reao, segue a expresso 2n (n nmero de ciclos). Logo, uma PCR que realiza 30 ciclos ter no
final 230 = 1.073.741.824 (1 bilho, 73 milhes, 741 mil, 824 produtos de amplificao). Isso supondo
que haja apenas uma molcula de DNA na reao, o que no verdade.
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Fonte: http://geneticavirtual.webnode.com.br/genetica-virtual-home/topicos-extras/marcadores-
moleculares/marcadores-baseados-em-rea%C3%A7%C3%A3o-da-polimerase-em-cadeia-pcr/
SAIBA MAIS
Nesse vdeo em 3D tem como objetivo introduzir noes bsicas de Gentica e conceitos
fundamentais para o entendimento e interpretao da gentica mendeliana. Acesse o link e conhea
https://youtu.be/5YlfZwzRPa4
http://www.youtube.com/watch?v=B5dVik3VTtc
ANLISE E APLICAO
Anlise em eletroforese
Ao final de uma PCR, teremos apenas um tubo com DNA dentro. No somos capazes de analisar
dessa forma. Um mtodo que tornou possvel essa visualizao a eletroforese. Esse mtodo
eficiente para separar protenas e cidos nucleicos. A partir da gerao de uma corrente eltrica, as
molculas migram para polos opostos sua carga eltrica (exemplo: molculas negativas migram
em direo ao polo positivo) e so separadas de acordo com seu peso molecular. O mtodo pode
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ser de dois tipos: eletroforese em gel de agarose, usada para cidos nucleicos, e eletroforese em
gel de poliacrilamida, usada para protenas.
Quando polimerizado, o gel submerso em tampo dentro da cuba, o que facilitar a passagem
da corrente. Aos produtos de PCR que sero includos no poo formado no gel, adicionada uma
substncia denominada loading, que dar colorao ao DNA e peso para que se desloque para o
fundo e no flutue no tampo, alm de funcionar como marcador de corrida, mostrando onde o
DNA estar posicionado.
A cuba ento ligada a uma fonte que fornea energia necessria para a corrida. Uma voltagem
e uma corrente eltrica sero aplicadas por um determinado tempo ao gel, para que o DNA possa
migrar. Com a corrente eltrica, o DNA migra nesse gel em direo ao polo positivo. Como dito
anteriormente, ele tem carga negativa devido ao cido fosfrico dissociado. A agarose forma uma
malha que dificulta a migrao do DNA, proporcionando a separao deste de acordo com seu
peso molecular.
A voltagem da corrente que ser aplicada a essa corrida depende da velocidade em que se deseja
que o DNA migre. A concentrao do gel que ser formado depende do tamanho do produto de
amplificao. Quanto maior este, menos concentrado deve ser o gel, para que no haja dificuldade
na migrao, e menor deve ser a voltagem da corrida. A corrente eltrica varia de acordo com a
qualidade do tampo. Se este for muito utilizado, necessria uma corrente maior.
Sob uma mesma voltagem e concentrao de agarose, fragmentos mais leves migram mais
rpido. Logo, eles chegam antes ao polo positivo e posicionam-se na base do gel.
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Para que o DNA seja visualizado, corado com brometo de etdio, uma substncia mutagnica,
que se intercala no DNA e o torna fluorescente na luz ultravioleta (fotoiluminador). O vdeo abaixo
mostra o posicionamento de fragmentos de pesos diferentes, quando submetidos s mesmas
condies de corrida, e a visualizao aps corados com brometo.
SAIBA MAIS
Nesse vdeo complementar, poder conferir uma experincia com gel de agarose http://www.youtube.
com/watch?v=qLHsEkiGJOw
Fonte: http://www.abcam.com/Calpain-1-protein-Active-ab91019.html
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Multiplex PCR
A temperatura de anelamento dos primers usados deve ser semelhante, para que possa ser
padronizada uma nica no aparelho.
Os conjuntos de primers devem gerar produtos com tamanhos moleculares distintos, para
que possam ser diferenciados no gel de eletroforese.
Os primers devem apresentar especificidade de anelamento apenas com uma sequncia-alvo,
para que a amplificao seja somente do gene para o qual foram desenhados.
Apesar de ser uma estratgia de amplificao de uso conveniente para deteco de DNA de
agentes infecciosos, apresenta maior dificuldade no desenvolvimento da metodologia e menor
sensibilidade quando comparada com a amplificao de uma nica sequncia-alvo.
Nested PCR
Essa tcnica utilizada para aumentar a sensibilidade da reao quando usamos amostras
que apresentam pouco DNA. Porm, por haver transferncias do material da primeira reao para
a segunda, pode haver contaminao.
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A PCR transcriptase reversa (RT PCR) uma tcnica que se baseia na utilizao de uma
maquinaria existente naturalmente em vrus do tipo retrovrus, como o HIV, que apresentam RNA
ao invs de DNA. Eles tm que converter seu genoma em DNA para que seja ento processado
pela clula do hospedeiro. A enzima usada para essa converso a transcriptase reversa. Ela
chamada reversa por sintetizar DNA a partir de RNA. A essa molcula, damos o nome de cDNA
(DNA complementar). Essa enzima possibilitou aos cientistas o estudo com genoma de eucariotos,
j estes apresentam muitos ntrons (pores no expressas do DNA), e o RNA carrega apenas os
xons. Assim, pode-se avaliar o que realmente o cdigo que ir formar a protena. Alm de estudar
o gene, os pesquisadores usam esse mtodo para quantificar a expresso de determinado gene, j
que o RNAm a molcula que ser traduzido em uma protena.
Posteriormente, realizada uma PCR convencional com o cDNA, formando molculas de DNA de
fita dupla, amplificando assim o nmero de cpias referentes ao gene que se quer estudar (figura 11) .
A tcnica de PCR em tempo real (qPCR) um refinamento da tcnica original de PCR, sendo
considerada um mtodo homogneo de amplificao de DNA. Nela, amplificao e deteco so
realizadas no mesmo tubo de reao, eliminando-se processamentos ps-PCR, como anlise em
eletroforese, diminuindo assim o manuseio de produtos de amplificao e o risco de contaminao
cruzada.
Nesse tipo de PCR, alm dos reagentes usualmente utilizados, so adicionadas sondas especficas
marcadas com fluorforos. Os princpios aplicados para deteco de uma sequncia-alvo por qPCR
so baseados na mensurao de fluorescncia durante a reao. A quantidade do produto formado
monitorada no decorrer da reao por meio da deteco da fluorescncia por diferentes filtros de
captao presentes no aparelho em determinados comprimentos de onda. Trata-se de um mtodo
mais sensvel, em que se poupa tempo de efetuao e no qual o DNA pode ser mensurado. Podem-
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Intercalante fluorescente
Existem disponveis no mercado muitos tipos de intercalantes de DNA que podem ser usados em
qPCR (SYBR Green, Eva Green, Syto9), porm o SYBR Green o mais utilizado. Esse tipo de molcula
fluorescente intercala-se no DNA de dupla fita. Durante uma reao de PCR, o DNA primeiramente
desnaturado para que a dupla fita se separe. Conforme a nova molcula complementar fita
molde formada pela Taq polimerase, a molcula fluorescente intercala-se juntamente com os
nucleotdeos que so inseridos, e seu sinal detectado. Quanto maior o nmero de molculas de
DNA formadas, mais molculas com SYBR Green intercalado sero apresentadas.
Aps todos os ciclos de amplificao, o aparelho submete a reao a uma curva de dissociao
para se avaliar a temperatura de melting (Tm, temperatura de desnaturao). Essa temperatura
corresponde a 50% das fitas de DNA em dupla fita apresentando o SYBR Green intercalado e 50%
dissociadas com a molcula fluorescente dispersa. Usa-se essa curva porque essa molcula
intercala-se em qualquer dupla fita de DNA e no muito especfica, porm muito sensvel, e, de
acordo com o produto de amplificao, teremos um Tm diferente, pois este varia de acordo com o
tamanho do gene e a quantidade de C e G (figura 13).
Outro coeficiente que avaliado nesse mtodo o ciclo em que foi detectada a fluorescncia. Esta
proporcional quantidade de produto formado em cada ciclo. O nmero de ciclos de amplificao
necessrios para obter uma determinada quantidade de DNA registrado (ciclo threshold- Ct).
Quando o Ct deixa de ser basal, isto , no se refere fluorescncia emitida pelos reagentes e passa
a representar fluorescncia emitida pela amplificao do DNA, considerado pelo aparelho que a
amostra positiva. Assim, quanto mais DNA tivermos na amostra inicial, menor ser o Ct, porque
teremos fluorescncia detectvel mais cedo (figura 11).
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Figura 13 Anlise de Alta Resoluo Melting (HRM)
Fonte: http://www.gene-quantication.de/hrm-dyes.html
Figura 14 - PCR em tempo real mede na fase exponencial para quanticao mais precisa
Fonte: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/
PCR/real-time-pcr/qpcr-education/qpcr-vs-digital-pcr-vs-traditional-pcr.html
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SAIBA MAIS
Sondas:
Existem disponveis no mercado vrios tipos de sondas para o uso em qPCR (Molecular Beacon,
TaqMan, Scorpion e sondas adjacentes). Elas diferem quanto ao mecanismo com o qual hibridizam
o DNA. A mais comum a TaqMan. Iremos aprender sobre ela e descrever como ocorre a deteco
da fluorescncia em sondas que se ligam ao DNA (hibridizam) e so clivadas durante a extenso.
A sonda TaqMan desenhada da mesma forma que um primer para que seja complementar
apenas ao gene que se deseja detectar. Ela desenhada para anelar a aproximadamente 20 ou 30
nucleotdeos de distncia do primer, usando o forward como referncia. Usaremos novamente o
exemplo de gene anterior.
Primer reverso
Um exemplo hipottico seria desenhar a sonda no local demarcado na sequncia acima. Logo,
ela seria complementar regio.
Sonda: GCGTCGGATGTGGTCGAGG.
Uma sonda apresenta uma poro denominada de reprter, a qual emite fluorescncia, e uma
poro denominada de quencher, que resgata a fluorescncia da primeira enquanto esto unidas.
Veja o exemplo na nossa sonda:
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SAIBA MAIS
Sequenciamento
Sequenciar um genoma determinar a ordem de nucleotdeos que forma esse DNA. J foram
usados muitos mtodos para atingir essa finalidade (qumicos e radioativos), porm o mais utilizado
o mtodo de Sanger, chamado tambm de mtodo dideoxi ou mtodo de terminadores de cadeia.
Na dcada de 1970, Frederick Sanger props um mtodo enzimtico para se realizar sequenciamento.
Nele, usa-se um deoxinucleotdeo (dNTP) diferenciado e dideoxinucleotdeo (ddNTP) que, quando
inserido na sequncia de DNA em formao, interrompe a extenso deste. Um ddNTP um dNTP
(nucleotdeo usado em PCR) que no apresenta a hidroxila ligada ao carbono 3 da pentose. Logo,
a ligao fosfodister entre dois monmeros no ocorre, e a reao interrompida. Essa molcula
apresenta outra diferenciao. As bases nitrogenadas (A, T, G, C) so marcadas com fluorescncias
(figura 15).
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Fonte: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/Applied-Biosystems.html?CID=fl-AppliedBiosystems
Conforme so formadas molculas de DNA de tamanhos diferentes (mesmo que difiram uma
da outra apenas por um ddNTP terminal), elas migram de acordo com seus pesos moleculares, e
um sensor muito sensvel no aparelho de sequenciamento ir ler a fluorescncia de cada ddNTP.
Isso informado a um software, que ir compor a sequncia. Hoje em dia, aparelhos sofisticados
de sequenciamento apresentam um microcapilar por onde as molculas de DNA se deslocam para
que um laser faa a leitura, porm, quando se usa mtodo semiautomatizado, necessrio realizar
um gel de agarose fino e delicado para esse deslocamento, seguindo a mesma regra de corrida da
eletroforese, e um sensor detecta a fluorescncia.
SAIBA MAIS
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Cada tecnologia de sequenciamento possui uma estratgia diferente, mas em geral podemos
identificar etapas em comum entre todos os sequenciadores: preparo da amostra, amplificao da
biblioteca e sequenciamento.
A evoluo do sequenciamento de DNA foi muito mais acelerada do que dos processadores
de computadores. A implicao disso que os sequenciadores evoluram muito mais rpido do
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que os computadores que analisam os dados gerados, da a necessidade computacional para lidar
com os dados gerados ter se tornado muito maior. Profissionais esto se especializando na rea
de bioinformtica para que a anlise de todo esse material gerado seja elaborado.
Hoje, encontram-se disponveis kits para o diagnstico rpido em biologia molecular. Porm trata-
se de um mtodo comercial, cujo uso fica restrito a laboratrios de anlises clnicas sofisticados,
requerendo habilidade tcnica para o manuseio, alm de ser caro quando comparado com mtodos
tradicionais. Quando um biomdico se deparar com o uso de biologia molecular num laboratrio,
provavelmente ser naqueles que aderiram a essas plataformas fechadas, isto , metodologias
elaboradas por empresas, o que as torna ainda mais caras. Mesmo que essa seja ainda a realidade,
num futuro no muito distante, estaremos providos de profissionais que sero capazes de, alm de
manipular, validar, inovar e criar mtodos de deteco que podero ser aplicados em laboratrios.
Qualquer que seja a circunstncia do contato com a biologia molecular, importante ao biomdico
ter os conhecimentos bsicos para trabalhar nessa rea. Evidente que no se pode apontar todas
as metodologias disponveis, pois a cada dia elas recebem inovaes. Conforme essas mudanas
aparecem para ser implantadas, segue-se aprimorando metodologias anteriores, por isso a importncia
de conhec-las.
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Cada protocolo de diagnstico molecular, aps ter seus parmetros analticos testados, tambm
deve ter sua validao clnica determinada na populao a que se destina. Essa validao realizada
analisando-se o desempenho do teste em um nmero adequado de pacientes. A utilidade clnica
de um teste de diagnstico para a populao em que ser aplicado pode ser avaliada pelos valores
preditivos (positivo e negativo), que so calculados a partir da anlise dos parmetros de validao
clnica comparados com a prevalncia da doena (ROSSETTI, SILVA e RODRIGUES, 2006).
De acordo com o documento MM3-A2 do Clinical and Laboratory Standard Institute (2006), um
roteiro de avaliao para introduo de novo mtodo de diagnstico deve ser seguido, incluindo
a determinao de sensibilidade analtica (limite de deteco LoD), especificidade analtica,
preciso, cutoff (valor de corte), sensibilidade e especificidade diagnstica, acurcia diagnstica,
valores preditivos e diagnstico.
A Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria ANVISA regulamenta, por meio da RDC 302/05, que
tanto laboratrios clnicos quanto de pesquisa devem validar os mtodos desenvolvidos internamente
fornecendo evidncias quanto ao desempenho.
Extrao de DNA:
1. NucliSENSeasyMAG
2. QIAcube - Qiagen
3. QIAxtractor- Qiagen
PCR convencional:
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Seeplex VRE ACE Detection (deteco dos genes vanAe vanB em Enterococcus).
Seeplex MRSA ACE Detection (deteco dos genes mecA e nucespcie-especfico para
Staphylococcus aureus).
1- ROCHE LightCycler:
2- Cepheids Xpert
Xpert vanA.
Xpert MRSA.
3- M 2000 Abbot
Sequenciamento
1. ABI 3500
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CONCLUSO:
Concluiu-se nesse estudo qual o material gentico e sua expresso no organismo. Revendo
conceitos como clulas, organelas celulares, tipos de clulas e as relaes entre DNA, RNA (cido
desoxirribonucleico) e sntese proteica provendo com essas informaes, o conhecimento para
desenvolver estudos na rea da sade
GLOSSRIO
Bases purnicas: As purinas so bases nitrogenadas (denominadas ento bases pricas),
compostos orgnicos heterocclicos. So compostas por um anel pirimidnico fundido a um anel
imidazlico. (fonte: wikipedia)
Envoltrio Nuclear: uma estrutura que envolve o ncleo das clulas dos seres eucariontes,
formado por duas membranas (interna e externa). As membranas delimitam um espao entre elas
denominado espao perinuclear. A membrana externa e continua com o REG. As membranas so
interrompidas por poros. (fonte: http://biologiacelulareestrutural.blogspot.com.br/2011/11/envoltorio-
nuclear.html)
Helicase: A helicase ou DNA helicase uma enzima que promove a abertura da hlice de DNA,
separando-o em duas fitas simples para que possa sofrer replicao[1]. A helicase quebra as
ligaes de hidrognio entre as bases azotadas (purinas ou pirimidinas) de ambas as cadeias de
DNA, fazendo com que estas se separem. Esta enzima move-se ao longo da cadeia dupla de DNA
utilizando energia da hidrlise de ATP para separar as duas cadeias da molcula
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Ligase: A ligase do DNA (ou DNA ligase) uma enzima que promove a ligao entre os nucleotdeos
de duas molculas de DNA. (fonte: http://wikiciencias.casadasciencias.org/wiki/index.php/Ligase_
do_DNA)
Vrus: Os vrus so seres muito simples e pequenos (medem menos de 0,2 m), formados
basicamente por uma cpsula proteica envolvendo o material gentico, que, dependendo do tipo
de vrus, pode ser o DNA, RNA ou os dois juntos (citomegalovrus). A palavra vrus vem do Latim
virus que significa fludo venenoso ou toxina. (fonte: http://www.sobiologia.com.br/conteudos/
Seresvivos/Ciencias/biovirus.php)
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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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Varuzza, Leonardo. Introduo anlise de dados de sequenciadores de nova gerao Verso 2.0.
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