ConceitosMetodos - Volume4 - Imunologia Cap 1 PDF

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Conceitos e Mtodos para a Formao de Tcni-

cos em Laboratrios de Sade
2 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade
FUNDAO OSWALDO CRUZ

Presidente
Paulo Ernani Gadelha Vieira
ESCOLA POLITCNICA DE SADE JOAQUIM VENNCIO

Diretora
Isabel Brasil Pereira
Vice-diretor de Pesquisa e Desenvolvimento Tecnolgico

Maurcio Monken
Vice-diretora de Ensino e Informao

Mrcia Valria Morosini
Vice-diretor de Gesto e Desenvolvimento Institucional

Sergio Munck
INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Diretora
Tnia Cremonini Arajo Jorge
Vice-diretora de Pesquisa, Desenvolvimento Tecnolgico e Inovao

Mariza Gonalves Morgado
Vice-diretora de Ensino, Informao e Comunicao

Helene dos Santos Barbosa
Vice-diretora de Servios de Referncia e Colees Cientficas

Elizabeth Ferreira Rangel
Vice-diretor de Desenvolvimento Institucional e Gesto

Christian Maurice Gabriel Niel
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Conceitos e Mtodos para a Formao de Tcnicos

em Laboratrios de Sade
Volume 4
ORGANIZADORAS
Etelcia Moraes Molinaro
Luzia Ftima Gonalves Caputo
Maria Regina Reis Amendoeira
Copyright 2010 dos autores

Todos os direitos desta edio reservados
Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio/Fundao Oswaldo Cruz
Fotos
Conselho Editorial
Maria Eveline Castro Pereira
Dr. Ana Luzia Lauria Filgueiras Moyses Gomes Marcelino
Dr. Clarissa Menezes Maya Monteiro Ortrud Monika Bart Schatzmayr
Dr. Ftima Conceio Silva Raphael dos Santos Stephens
Dr. Herman Gonalves Schatzmayr Rodrigo Mexas
Dr. La Camillo-Coura
Dr. Lycia de Brito Gitirana Desenhos
Dra. Marcia Cristina Ferro Alexandre Newton Marinho da Costa Jnior
Dr. Marco Antonio Ferreira da Costa
Dr. Margareth Maria de Carvalho Queiroz Reviso
Dr. Maria Helena Migues da Rocha Leo Luciana Duarte
Dr. Maria Regina Reis Amendoeira (presidente)
Dr. Otlio Machado Pereira Bastos Secretria Executiva da Coleo
Josane Ferreira Filho
Capa
Z Luiz Fonseca
Projeto Grfico e Editorao

Marcelo Paixo
Catalogao na fonte
Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio
Biblioteca Emlia Bustamante
M722c Molinaro, Etelcia Moraes
Conceitos e mtodos para a formao de profissionais em laboratrios
de sade: volume 1 / Organizao de Etelcia Moraes Molinaro, Luzia
Ftima Gonalves Caputo e Maria Regina Reis Amendoeira. - Rio de
Janeiro: EPSJV; IOC, 2009.
290 p. : il. , tab. , graf.

ISBN: 978-85-98768-41-0
1. Tcnicas e Procedimentos de Laboratrio.2. Pessoal de Laboratrio.

3. Laboratrios. 4. Formao de Tcnicos. 5. Sade e Educao. I. Ttulo.
II. Caputo, Luzia Ftima Gonalves. III. Amendoeira, Maria Regina Reis.
CDD 542.1
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Autores
Antnio T eva
Teva
Bilogo, Doutor em Biologia Celular e Molecular pela Fundao Oswaldo Cruz/Fiocruz.
Tecnologista em Sade Pblica do Laboratrio de Pesquisa em Leishmaniose do Instituto
Oswaldo Cruz/IOC/Fiocruz. (Egresso do Curso Tcnico de Pesquisa em Biologia Parasit-
ria/Instituto Oswaldo Cruz/IOC, 1984).
Aurea Maria Lage de Moraes

Biloga, Doutora em Cincias pela Fundao Oswaldo Cruz/Fiocruz. Pesquisadora Titular
e Chefe do Laboratrio de Taxonomia, Bioqumica e Bioprospeco de Fungos do Institu-
to Oswaldo Cruz/IOC/Fiocruz.
Flvia Coelho Ribeiro

Medica Veterinria, Doutora em Cincias em Diagnstico de doenas infecciosas pelo
Instituto de Pesquisa Clnica Evandro Chagas/IPEC/Fiocruz. Professora/pesquisadora da
Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio/EPSJV/Fiocruz.
Jos Carlos Couto Fernandez

Bilogo, Doutor em Biologia Celular e Molecular pela Fundao Oswaldo Cruz/Fiocruz.
Pesquisador Titular em Sade Pblica pelo Instituto Oswaldo Cruz/IOC/Fiocruz. (Egresso
do Curso Tcnico de Pesquisa em Biologia Parasitria/Instituto Oswaldo Cruz/IOC, 1983).
Joseli Maria da Rocha Nogueira

Biloga, Doutora em Cincias pela Escola Nacional de Sade Pblica/ENSP/Fiocruz.
Tecnologista Snior, do Laboratrio de Pesquisa e Servio em Sade Pblica/ENSP/
Fiocruz.
Leila Abboud Dias Carneiro

Biloga, Mestre em Cincias em Biologia Celular e Molecular pelo Instituto Oswaldo
Cruz/IOC/Fiocruz); Pesquisadora Colaboradora integrante do Grupo da Rede Microbicidas
do Laboratrio de Imunologia Clnica do Instituto Oswaldo Cruz/IOC/Fiocruz.
Lucieny de Faria Souza Miguel

Biloga e Farmacutica, especialista em bacteriologia pela Universidade Federal do Rio
de Janeiro/UFRJ. Microbiologista do Laboratrio Central de Sade Pblica Noel Nutels
setor de Bacteriologia do Laboratrio Central de Sade Pblica/LACEN.
Maria Beatriz Siqueira Campos de Oliveira

Biomdica, Mestre em Educao /UNESA. Doutora em Ensino em Biocincias e Sade/
IOC/Fiocruz. Tecnologista Snior da Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio/
EPSJV/Fiocruz.
Paulo R oberto Soares Stephens

Roberto
Bilogo, Mestre em Microbiologia e Imunologia pela Universidade Federal do Rio de
Janeiro/UFRJ. Tecnologista Snior em Sade Pblica do Laboratrio de Imunologia Cl-
nica do Instituto Oswaldo Cruz /IOC/Fiocruz.
R odrigo de Almeida P aes

Paes
Microbiologista e Imunologista, Mestre em Cincias pelo Instituto Oswaldo Cruz/IOC/
Fiocruz. Tcnico em Sade Pblica II do Instituto de Pesquisa Clnica Evandro Chagas/
IPEC/Fiocruz.
Valmir Laurentino Silva

Bilogo, Doutor em Biologia Animal pela Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro/
UFRRJ. Tecnologista em Sade Pblica do Departamento de Cincias Biolgicas da
Escola Nacional de Sade Pblica/ENSP/Fiocruz. (Egresso do Curso Tcnico de Pesquisa
em Biologia Parasitria/Instituto Oswaldo Cruz/IOC, 1984)
Vernica Leite de Holanda

Biloga, Mestranda no curso de Ps-Graduao em Microbiologia Veterinria pela Uni-
versidade Federal Rural do Rio de Janeiro/UFRRJ. Professora do Governo do Estado do
Rio de Janeiro/SEE-RJ.
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Sumrio
Prefcio 9
Apresentao da coleo 13
Apresentao pelas organizadoras 15
Captulo 1. Imunologia 19
Captulo 2. Virologia 125
Captulo 3. Bacteriologia 221
Captulo 4. Micologia 399
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PREFCIO
O Chico Trombone costumava me dizer:

Isso eu sei fazer, Dr. Luiz Fernando, aprendi com Joaquim Venncio.
E era com orgulho que se referia a seu mestre.
Vimos, portanto, que a formao de tcnicos j vem dos tempos de
Oswaldo. claro que no era institucionalizado como hoje. Eram outros
tempos.
Joaquim Venncio nasceu na fazenda Bela Vista, em Minas Gerais. Era
a fazenda da me de Carlos Chagas, pai. Em 1916, veio trabalhar no Instituto
Oswaldo Cruz. Veio e deu certo. O Dr. Lutz teria dito certa vez:
No troco o Venncio por nenhum doutor de Oxford ou de
Cambridge.
Se no disse, pensou.
Eficincia nos processos de seleo de pessoal? Competncia do
servio de recursos humanos? Evidentemente que no. No havia nada
disso nessa poca. As coisas eram muito mais simples, e davam certo. Veio
porque era amigo do velho Carlos Chagas. Amigos de infncia. Brincaram
juntos na fazenda.
Quando Joaquim Venncio faleceu, em 27 de agosto de 1955, teve
seu necrolgio publicado na Revista Brasileira de Biologia. Lugar de ne-
crolgio de cientista famoso. Cito textual: Joaquim Venncio conseguiu,

durante cerca de 35 anos que trabalhou ativamente, aprender zoologia
que conhecia de modo invejvel. Como decorrncia das contingncias da
vida, no teve oportunidade de instruir-se, mas sua mentalidade era de um
homem culto. Pela convivncia com o Dr. Lutz, pela observao direta do
que via nas excurses e no laboratrio, adquiriu conhecimento detalhado
de vrios grupos zoolgicos, principalmente anfbios, moluscos fluviais e
trematdeos. Chegou a conhecer muito bem os anfbios e, com grande
facilidade, os classificava nas excurses pela voz. Dadas as indicaes feitas
pelo Dr. Lutz em seus trabalhos, h casos em que foi citado na literatura
como colaborador direto.
Joaquim Venncio era, sem dvida, um naturalista. Era competente,
tinha o domnio do ofcio, a maestria da arte.
E gostava de ensinar. Ensinou muita gente.
Certa vez, o Venancinho me disse:
Era a Escola do Venncio, n? Foi muito boa, n?
* * *
Na presidncia de Sergio Arouca, resolvemos atualizar a Escola de
Venncio. E foi assim que surgiu a Escola Politcnica, com o nome do seu
patrono. Cresceu e abriu vrias frentes, desde a vocao cientfica aos
cursos de nvel mdio complementados pela formao de tcnicos. Foi um
xito, como a antiga. Aparece sempre nos primeiros lugares nas avaliaes
e j se estendeu a outras instituies.
* * *
E agora surgem os livros didticos. Organizado por Etelcia Moraes
Molinaro, Luzia Ftima Gonalves Caputo e Maria Regina Reis Amendo-
eira, vem luz a coleo Conceitos e Mtodos para a Formao de
Prefcio | 11
Tcnicos em Laboratrios de Sade, reunindo professores de vrias uni-

dades da Fiocruz.
Os captulos oferecem a histria da tcnica, os seus fundamentos, a
maneira moderna de realiz-la, as suas aplicaes, a organizao do labora-
trio etc.
til para os cursos da Fundao e para outros externos. Mostra,
tambm, o quanto as unidades da Fiocruz esto integradas na realizao de
suas tarefas.
Ensino questo primordial. Sem ele, o pas no se desenvolve.
Est de parabns a Fiocruz pela realizao de mais uma tarefa de
primordial importncia.
Oswaldo Cruz est orgulhoso dos seus continuadores.
Luiz Fernando Ferreira
Pesquisador Emrito da Fundao Oswaldo Cruz
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Apresentao
A coletnea de livros intitulada Conceitos e Mtodos para a Formao

de Profissionais em Laboratrios de Sade, organizada por Etelcia Moraes
Molinaro, Luzia Ftima Gonalves Caputo e Maria Regina Reis Amendoeira
antes de tudo uma obra original, importante e necessria. Original porque no
existe na literatura tcnica em sade, na rea biomdica brasileira e internacio-
nal, pelo menos que eu saiba, algo semelhante em abrangncia, profundidade
e seleo dos temas abordados; importante pelo pblico alvo a que se desti-
na, muito alm da Formao de Tcnicos de Laboratrios, abrangendo certa-
mente todos os profissionais de sade, e necessria porque servir como
obra de referncia para a formao dos mencionados tcnicos e de consulta
obrigatria para todos os profissionais de sade que necessitem de esclareci-
mento dos aspectos tcnicos ali abordados.
Versada em cinco volumes e 22 captulos, organizados em sequncia
lgica, desde a biossegurana e boas prticas de laboratrio, passando por
todos os fundamentos das tcnicas laboratoriais, bioqumica bsica, biologia
celular e molecular, histologia e ultraestrutura, at atingir o cerne da prtica
laboratorial, da imunologia infectoparasitologia virologia, bacteriologia,
micologia, protozoologia e helmintologia e seus vetores, com a entomologia
mdica e a malacologia. Os autores que escrevem os respectivos captulos,
so do melhor nvel intelectual e cientfico, com a titulao de mestres, douto-

res e especialistas, com grande experincia prtica nos assuntos de que tratam.
Parabenizo o Instituto Oswaldo Cruz e a Escola Politcnica Joaquim
Venncio, que patrocinaram esta obra de referncia, os quais, desde seus
primrdios, valorizaram a qualidade da formao dos seus tcnicos e com eles
povoaram e esto povoando o Brasil de Norte a Sul e de Leste a Oeste com
o que temos de melhor os fundamentos para uma boa pesquisa. Aproveito
esta oportunidade para homenagear a figura de Henry Willcox, que no incio
da dcada de 1980, quando o convidei para me ajudar na coordenao dos
cursos de ps-graduao em Biologia Parasitria e Medicina Tropical do Institu-
to Oswaldo Cruz, foi o grande incentivador para criarmos paralelamente o
Curso de Tcnico em Pesquisa, do qual foi o seu primeiro coordenador.
Igualmente parabenizo as organizadoras desta coletnea e a Fiocruz como
um todo, pelo lanamento desta obra pioneira.
Jos Rodrigues Coura
Pesquisador Titular Emrito
Chefe do Laboratrio de Doenas Parasitrias IOC/Fiocruz
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Um sonho quase realizado

(Oswaldo Cruz 1872-1917)
As alteraes pelas quais passa o mundo com a globalizao trazem

como consequncia o surgimento de novos paradigmas tecnolgicos, fazen-
do-se necessrio que o ensino da rea da sade atenda s exigncias do
mundo moderno, do trabalho e do atual perfil do tcnico da rea.
Os cursos para a formao de tcnicos da Fundao Oswaldo Cruz -
Fiocruz buscam demonstrar os princpios cientficos envolvidos com as tcnicas
laboratoriais, preparando os alunos para as transformaes no mundo do traba-
lho em sade, decorrentes do desenvolvimento tecnolgico e cientfico. Nes-
te contexto, duas Unidades Tcnicas Cientficas desta instituio, o Institu-
to Oswaldo Cruz IOC e a Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio
EPSJV, historicamente so as responsveis por coordenarem cursos e espe-
cializaes tcnicas que se firmaram como modelos desses princpios. Essas
Unidades, na rea de ensino tcnico, sempre estiveram intrinsecamente ligadas,
e os professores realizam permanente parcerias entre si. Muitos de ns, egres-
sos desses cursos, so hoje docentes e autores desta coleo.
Alm da formao tcnica de profissionais em nvel regional e nacional,
intensificou-se, na Fiocruz, a demanda para o estabelecimento de cooperaes
tcnicas internacionais, que por sua expertise e capacidade de produzir, pas-
sou a divulgar conhecimentos, elaborando cursos, metodologias e tecnologias

educacionais. A Escola Politcnica Centro Colaborador da Organizao
Mundial da Sade (OMS) para a educao de tcnicos em sade, desde
2004.
A ideia da publicao dessa coleo surgiu da necessidade conjunta das
duas Unidades da Fiocruz de produzir material didtico, que atendesse aos
alunos dos cursos de Nvel Tcnico em Sade da Fiocruz e de outros locais.Desse
modo, o nosso principal desafio oferecer contedo que abarque toda a rea
tcnica de sade utilizada nos principais cursos de nvel mdio, e, que ao
mesmo tempo, possa manter-se suficientemente atualizado.
Dada a complexidade da estrutura instrumental e pedaggica dos Cursos
Tcnicos, se fez necessria a publicao de uma coleo, escolhendo-se tpi-
cos de importncia bsica. Para tanto, foram convidados pesquisadores/profes-
sores com experincia em ensino de Cursos de Nvel Tcnico e de destacado
conhecimento nos temas abordados nos 22 captulos, que constituem os cinco
volumes da coleo.
A coleo Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em
Laboratrios de Sade tem como objetivo integrar conhecimentos tericos e
prticos, proporcionando ao aluno informaes que possibilitem uma perma-
nente reflexo de seu papel como agente transformador dos processos e
atividades de ensino, pesquisa cientfica e desenvolvimento tecnolgico. Ou-
tro objetivo inconteste destes livros servir para professores, como norteadores
da definio curricular de seus cursos.
Visando garantir a autonomia dos autores, e respectivas responsa-
bilidades, foi mantida a formatao original dos textos, inclusive fotos,
figuras, diagramas. Podem ocorrer tambm, algumas repeties de contedo
em alguns captulos, mas, a nosso ver, a retirada de partes de captulos j
abordadas poderia descontextualizar o texto.
Um sonho quase realizado | 17
O pontap inicial deste sonho s foi possvel pelo incondicional apoio

dado pelo professor Andr Paulo da Silva Malho, pela Dra. Isabel Brasil
Pereira, pessoa-chave desencadeadora do processo, e pela Dra. Tnia
Cremonini de Arajo Jorge, que apoiaram e incentivaram institucionalmente
o projeto. Agradecemos especialmente aos autores que abraaram este tra-
balho com muito entusiasmo e que possibilitaram a sua concretizao. E um
carinho especial para Josane Ferreira Filho pela organizao paciente de
nossas reunies e textos, com a gratido das organizadoras e autores.
Agradecemos em especial aos renomados cientistas emritos da
Fundao Oswaldo Cruz, doutores Luiz Fernando Ferreira patrono da
EPSJV e Jos Rodrigues Coura, que nos deram a honra de apresen-
tar esta coleo.
Esperamos assim, estar contribuindo para a sistematizao do conhe-
cimento dos leitores sobre os diversos tpicos abordados em cada captu-
lo, apresentando cada assunto de forma didtica e sinttica, recomendando
a consulta literatura especializada sempre que houver necessidade de
aprofundamento do conhecimento em determinados temas.
Etelcia Moraes Molinaro
Luzia Ftima Gonalves Caputo
Maria Regina Reis Amendoeira
Organizadoras
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Captulo 1
Imunologia
Antnio Teva
Jos Carlos Couto Fernandez
Valmir Laurentino Silva
1. Introduo Imunologia
A imunologia uma cincia recente. Sua origem atribuda, por alguns
autores, a Edward Jenner, que, em 1796, verificou proteo induzida pelo
cowpox (vrus da varola bovina) contra a varola humana, nomeando tal pro-
cesso da vacinao. No entanto, sabido que, na antiguidade, os chineses j
inalavam o p das crostas secas das pstulas de varola ou as inseriam em
pequenos cortes na pele, em busca de proteo.
O sistema imune o conjunto de clulas, tecidos, rgos e molculas
que os humanos e outros seres vivos usam para a eliminao de agentes ou
molculas estranhas, inclusive o cncer, com a finalidade de se manter a
homeostasia do organismo. Os mecanismos fisiolgicos do sistema imune con-
sistem numa resposta coordenada dessas clulas e molculas diante dos orga-
nismos infecciosos e dos demais ativadores, o que leva ao aparecimento de
respostas especficas e seletivas, inclusive com memria imunitria, que tambm
pode ser criada artificialmente, atravs das vacinas. Na ausncia de um sistema

imune funcional, infeces leves podem sobrepujar o hospedeiro e lev-lo
morte. Porm, mesmo com um sistema imune funcional, o homem, por exem-
plo, pode adquirir uma doena infecciosa ou um cncer, pois a resposta imune
especfica, diante de um agente agressor, leva tempo para se desenvolver e,
alm disso, tanto organismos estranhos, como clulas neoplsicas, desenvol-
vem mecanismos de evaso para fugir da resposta imune.
Neste captulo, sero abordados conceitos bsicos dos principais com-
ponentes do sistema imune, os mecanismos de resposta especfica ante os
diversos agentes infectoparasitrios, como tambm a investigao dos vestgios
da passagem desses agentes, por meio de mtodos laboratoriais para pesquisa
de antgenos e anticorpos especficos, principal propsito desse texto, uma
vez que se destina a alunos de escolas tcnicas de nvel mdio.
2. rgos, tecidos e clulas

envolvidos na resposta imunitria
2.1. Clulas que participam do sistema imunitrio

As respostas imunes so mediadas por uma variedade de clulas e por
molculas que estas clulas expressam (Figura 1). Os leuccitos so as clulas
que desempenham as principais aes, mas outras clulas, que se encontram
nos tecidos, tambm participam da resposta imunitria, enviando sinais e rece-
bendo estmulos dos leuccitos. As clulas que participam do sistema imunitrio
se originam na medula ssea, onde muitas evoluem para a fase adulta. A partir
da medula, e por meio de vasos sanguneos, elas migram junto com todos os
elementos celulares do sangue. Inclusive as hemcias, que transportam o oxig-
nio, e as plaquetas que participam da coagulao, uma vez que estes elemen-
tos se originam das clulas-tronco progenitoras da medula. As clulas que
derivam do progenitor mieloide e do progenitor linfoide so as que mais
Imunologia | 21
interessam para o entendimento das aes do sistema imunitrio, de modo

que, neste texto, no sero considerados os megacaricitos e os eritrcitos.
O progenitor mieloide o precursor dos granulcitos, fagcitos
mononucleares (macrfagos), clulas dendrticas e mastcitos do sistema imu-
ne. Os macrfagos so as clulas fagocitrias mais relevantes. Estas clulas so
a forma diferenciada dos moncitos sanguneos, que se encontram estrategica-
mente distribudos em vrios tecidos para dar origem ao sistema fagocitrio
mononuclear. Os microglicitos so os macrfagos do crebro, as clulas de
Kupffer so os macrfagos do fgado, os macrfagos alveolares fazem parte do
tecido pulmonar, entre outros macrfagos residentes em diferentes tecidos. As
funes dos macrfagos se caracterizam pela neutralizao, ingesto e destrui-
o de partculas, incluindo os biopatgenos, alm de processar e apresentar
antgenos para os linfcitos T. Neste contexto, so as clulas dendrticas as
mais especializadas na captura e na apresentao de antgenos para os linfcitos
T. As clulas dendrticas imaturas migram do sangue para residirem nos tecidos
e realizam tanto a fagocitose quanto a micropinocitose. Aps o encontro com
um patgeno, maturam rapidamente e migram para os ndulos linfticos, onde
encontram o ambiente adequado para a apresentao de antgenos.
Os granulcitos recebem essa denominao por possurem grnulos em
seu citoplasma que se coram densamente por corantes hematolgicos tradicio-
nais. So tambm chamados de leuccitos polimorfonucleares, devido s formas
de seus ncleos. Existem trs tipos de granulcitos, sendo eles os neutrfilos, os
eosinfilos e os basfilos; todos com um tempo de vida relativamente curto e
produzidos em grande nmero durante as respostas inflamatrias.
Os neutrfilos, assim como os macrfagos e as clulas dendrticas, so
representantes do grupo de clulas fagocitrias do sistema imunitrio, mas,
diferentemente destas clulas, no apresentam antgenos para os linfcitos T.
Os neutrfilos so os elementos celulares mais numerosos e importantes da
resposta inata.
Os eosinfilos parecem ser importantes, principalmente na resposta

diante de infeces parasitrias ou processos alrgicos, j que seu nmero
aumenta no curso destas reaes.
A funo dos basfilos provavelmente similar e complementar dos
eosinfilos e mastcitos.
Os mastcitos, cujo precursor parece ser comum aos basfilos,
devido a semelhanas funcionais, tambm se diferenciam ao chegar aos
tecidos onde residem. Eles se localizam principalmente margem dos
vasos sanguneos e liberam mediadores que agem nas paredes vasculares
quando ativados.
Figura 1. Clulas que participam do sistema inunitrio

Imunologia | 23
O progenitor linfoide comum d origem aos linfcitos. Os linfcitos so

as clulas que reconhecem, especificamente, os antgenos. Sua morfologia tpica
consiste em uma pequena clula redonda com ncleo esfrico. Apesar da aparn-
cia uniforme microscopia tica, vrios tipos de linfcitos podem ser distinguidos
com base nas suas propriedades funcionais e protenas especficas que expressam.
A distino mais fundamental consiste na classificao destas clulas em duas
linhagens principais, conhecidas como linfcitos B e linfcitos T.
Os linfcitos B, tambm chamados de clulas B (de bursa ou bolsa de
Fabricius, nas aves, e derivadas da medula ssea, nos mamferos), quando
ativados, proliferam e se diferenciam em clulas plasmticas ou plasmcitos,
que so as clulas efetoras da linhagem B, cuja funo principal a secreo de
anticorpos. Os linfcitos T, ou clulas T (derivados do timo), se apresentam
em duas classes principais. Uma se diferencia, quando ativada, em clulas T
CD8+ ou citotxicas, que matam as clulas infectadas, ao passo que a outra
classe de clulas T, chamadas de clulas T CD4+ ou auxiliares, atuam na
ativao de outras clulas, como os linfcitos B e os macrfagos, alm de
coordenar a resposta imunitria.
O receptor de antgeno da clula B (BCR) (Figura 2) uma forma de
anticorpo ligada membrana que a clula B passa a produzir, aps sua ativao
e diferenciao em clula plasmtica. Os anticorpos so molculas agrupadas
em uma classe de substncias denominadas imunoglobulinas, e o receptor de
antgeno do linfcito B tambm conhecido como imunoglobulina de mem-
brana. A imunidade humoral a principal funo das clulas B e dos
plasmcitos, e consiste em secretar anticorpos no sangue e em outros lquidos
orgnicos, resultando efeitos protetores, mediados por lquidos teciduais.
O receptor de antgeno da clula T (TCR) (Figura 2) constitui uma
classe heterognea de protenas de membrana que, embora estejam relaciona-
das evolutivamente com as imunoglobulinas, so diferentes delas, j que esto
adaptadas para detectar antgenos derivados de protenas estranhas ou

patgenos que entram nas clulas hospedeiras. Todavia, em contraste com as
imunoglobulinas, os TCRs nunca so secretados, de modo que a clula T
precisa migrar at as reas de leso para exercer seus efeitos protetores, por
meio de contato direto com a clula alvo ou para influenciar as atividades de
outras clulas do sistema imunitrio. Juntamente com os macrfagos, as
clulas T desenvolvem uma categoria de resposta imune denominada imuni-
dade mediada por clulas.
Figura 2. Estruturas bsicas do receptor de superfcie da clula B e do receptor T.
A maioria dos linfcitos virgens possui uma sobrevida muito curta,

sendo programada para morrer em poucos dias aps ter sado da medula
ssea ou do timo. No entanto, se uma dessas clulas receber sinais indican-
do a presena de um imungeno (antgeno que estimula uma resposta imune
especfica), ela poder responder por meio de um fenmeno conhecido
como ativao, durante o qual pode sofrer vrios ciclos de diviso celular.
Imunologia | 25
Algumas das clulas-filhas retomam ao estado de repouso, tornando-se clu-

las de memria, que podem sobreviver por vrios anos. Estes linfcitos de
memria representam uma grande proporo das clulas do sistema imunitrio.
A outra prognie do linfcito virgem ativado diferencia-se em clulas efetoras,
que sobrevivem apenas alguns dias, mas que, durante este perodo, executam
atividade que resultam em defesa.
Outra classe de clulas linfoides, chamada de clulas matadoras natu-
rais ou clulas natural killer (NK), desprovida de receptores antgeno-
especficos, sendo parte do sistema imune inato. Essas clulas circulam no
sangue como grandes linfcitos, com diferentes grnulos citotxicos, e so
capazes de reconhecer e matar algumas clulas anormais, tais como clulas
tumorais e clulas infectadas por vrus. E parecem ser importantes na defesa
contra biopatgenos intracelulares na imunidade inata.
2.2. Os rgos linfoides e a rede linftica

Os rgos linfoides (Figura 3) so tecidos organizados que contm
grandes quantidades de linfcitos em um ambiente de clulas no linfoides.
Nesses rgos, as interaes que os linfcitos tm com as clulas no linfoides
so importantes, tanto para o desenvolvimento dos linfcitos e o incio da
resposta imune adaptativa, como para a manuteno dos mesmos. Tais r-
gos podem ser divididos em rgos linfoides centrais ou primrios, produ-
tores de linfcitos, e rgos linfoides perifricos ou secundrios, que de-
sempenham a funo de maximizar o encontro entre os linfcitos e os
produtos processados pelas clulas apresentadoras de antgenos, dando in-
cio resposta imune. Os rgos linfoides centrais so a medula ssea
vermelha e o timo, um grande rgo localizado na poro superior do trax.
Tanto os linfcitos B como as clulas T surgem na medula ssea, mas apenas
os linfcitos B ali se diferenciam. Os linfcitos T migram para o timo para
sofrer seu processo de diferenciao. Uma vez completada sua maturao
celular, os dois tipos de linfcitos entram na corrente sangunea, migrando

para os rgos linfoides perifricos. Durante a vida intrauterina, o fgado
fetal desempenha o papel que a medula ssea vermelha passa a desenvol-
ver plenamente aps o nascimento.
Os rgos linfoides perifricos so especializados na captura do
antgeno para possibilitar o incio das respostas imunes adaptativas. Os
microrganismos patognicos podem penetrar no hospedeiro por muitas
portas de entrada, instalando o processo infeccioso em qualquer stio, mas
o encontro do antgeno com os linfcitos acontecer nos rgos linfoides
perifricos: os ndulos linfticos, o bao e vrios tecidos linfoides associa-
dos s superfcies das mucosas. Os linfcitos esto em contnua recirculao
entre esses tecidos, para os quais o antgeno tambm carreado, vindo de
todos os locais de infeco, primariamente dentro de macrfagos e clulas
dendrticas. Dentro dos rgos linfoides, clulas especializadas, como as
clulas dendrticas maduras, apresentam o antgeno para os linfcitos.
A rede linftica consiste em um extenso sistema de vasos que
coletam o lquido intersticial, fazendo-o retornar para o sangue. Esse
lquido intersticial produzido continuamente pela passagem de gua e
solutos de baixo peso molecular atravs das paredes vasculares que pe-
netram no espao intersticial, pela secreo celular e outros fatores de
excreo. Ao ser parcialmente drenado para os vasos linfticos, passa a
ser chamado de linfa. A linfa flui lentamente pelos vasos linfticos prim-
rios, desgua em vasos linfticos de calibre progressivamente maior, que
convergem para o ducto torcico, e desemboca na veia cava superior,
que, por sua vez, devolve todo o volume para a corrente sangunea, num
fenmeno denominado recirculao.
Localizados em pontos de convergncia da rede vascular, os ndu-
los linfticos constituem uma srie de rgos encapsulados em forma de
caroo de feijo, que se distribuem ao longo dos vasos linfticos. Os
Imunologia | 27
vasos linfticos aferentes drenam o fluido dos tecidos e carregam antgenos

e clulas infectadas aos seios dos ndulos linfticos, onde os antgenos so
capturados. Os seios so revestidos por orifcios minsculos, que permi-
tem a linfa e seu contedo atravessarem o ndulo linftico e entrarem em
contato com os linfcitos. Nos ndulos linfticos, os linfcitos B se locali-
zam em folculos nas reas corticais, tambm denominadas reas timo-
independentes; as clulas T so mais difusamente distribudas em torno das
reas paracorticais, tambm conhecidas como zonas de clulas T ou reas
timo-dependentes. Alguns dos folculos de clulas B contm reas cen-
trais, denominadas centros germinativos, onde ocorre intensa proliferao
dos linfcitos B, aps seu encontro com o antgeno especfico e clulas T
auxiliares. Por fim, a linfa sai por um vaso linftico eferente no lado oposto
do ndulo linftico, numa regio conhecida como hilo.
O bao encontra-se situado atrs do estmago e filtra o sangue da
mesma forma como os ndulos linfticos filtram a linfa e coletam antgenos.
Tambm captura e se desfaz de clulas vermelhas senescentes. A massa
principal deste rgo composta pela polpa vermelha e os linfcitos cir-
cundam as arterolas que o penetram, formando reas da polpa branca, cuja
regio mais interna dividida em uma camada linfoide periarteriolar, con-
tendo principalmente clulas T e revestidas por uma coroa de clulas B.
Figura 3. rgos, tecidos e clulas envolvidos na resposta imunitria.
2.3.Tecido linfoide associado mucosa

A expresso tecido linfoide associado mucosa (MALT = mucosal-
associated lymphoid tissue) uma descrio geral para os tecidos linfoides no
encapsulados, que existem nas regies subjacentes s mucosas. Os MALTs se
distribuem anatomicamente e seus componentes individuais incluem:
Anel de Waldeyer - Anel de estruturas linfoides que circunda a
faringe. formado pelas tonsilas e adenoides.
Tecido linfoide associado aos brnquios (BALT = bronchial-associated
lymphoid tissue) - Agregados linfocitrios semelhantes, mas organizados
difusamente, que protegem o epitlio respiratrio.
Imunologia | 29
Tecidos linfoides associados ao intestino (GALT = gut-associated

lymphoid tissues) - Incluem folculos linfoides isolados e o apndice
cecal, alm de estruturas especializadas do intestino delgado, as placas
de Peyer.
Tecido linftico urogenital
Entre outros MALTs (Figura 3).
Coletivamente, estima-se que o sistema imune de mucosa contenha
tantos linfcitos quanto o resto do corpo. Esses linfcitos formam um grupo
especial de clulas que seguem leis um tanto diferentes. Embora notavelmente
diferentes em sua aparncia, os ndulos linfticos, o bao e os tecidos linfoides
associados mucosa demonstram a mesma arquitetura bsica. Cada um deles
opera segundo o mesmo princpio, capturando o antgeno nos locais de infec-
o e apresentando-o a pequenos linfcitos migratrios para, assim, induzirem
as respostas imunes adaptativas. Os tecidos linfoides perifricos tambm proveem
sinais de sobrevivncia aos linfcitos que no encontram seu antgeno especfi-
co. Isto importante para manter o nmero correto de linfcitos T e B
circulantes, e assegura que somente os linfcitos com o potencial de responder
ao antgeno estranho sejam mantidos.
2.4. Recirculao de linfcitos

Os pequenos linfcitos T e B que se diferenciaram na medula ssea e
no timo, mas que ainda no se encontraram com o antgeno, so referidos
como linfcitos virgens ou em repouso. Estes elementos circulam continua-
mente do sangue para os tecidos linfoides perifricos, nos quais penetram por
meio de interaes adesivas especiais com os capilares e retornam para o
sangue atravs dos vasos linfticos ou, no caso do bao, diretamente ao
sangue. Na presena de uma infeco, os linfcitos que reconhecem o agente
infeccioso so retidos no tecido linfoide, onde proliferam e se diferenciam em
clulas efetoras, capazes de controlar a infeco.
Quando ocorre uma infeco tecidual, os antgenos so capturados por

clulas dendrticas, que se deslocam do stio da infeco pelos vasos linfticos
aferentes para os ndulos linfticos. Nos ndulos linfticos, essas clulas pro-
cessam e apresentam o antgeno aos linfcitos T que esto recirculando, os
quais elas ajudam a ativar. As clulas B que encontram o antgeno, medida
que migram atravs do ndulo linftico, tambm so detidas e ativadas com o
auxlio de algumas clulas T ativadas. Uma vez que esses linfcitos especficos
tenham passado por um perodo de proliferao e diferenciao, eles deixam
os ndulos linfticos como clulas efetoras atravs dos vasos linfticos eferentes.
T:: desenvolvimento, diversidade e ativao

3. Clulas T
Os linfcitos so as nicas clulas do organismo que expressam recepto-
res altamente diversificados para o antgeno, o que permite o reconhecimento
de uma grande variedade de substncias estranhas. Essa diversidade gerada
durante o processo de desenvolvimento dos linfcitos T e B, a partir de clulas
precursoras. O desenvolvimento dos linfcitos T alfa beta (ab) e gama delta
(gd) segue estgios sequenciais, consistindo na recombinao somtica e ex-
presso dos genes do TCR, proliferao celular, seleo induzida pelo antgeno
e aquisio de fentipos de capacidade funcional. Essas clulas se originam de
precursores do fgado fetal ou da medula ssea de adultos e completam o seu
desenvolvimento no timo. As clulas T em desenvolvimento no timo so
chamadas de timcitos. A maioria dos timcitos imaturos no expressa o TCR
ou os correceptores CD4 e CD8 e migram atravs do crtex, onde os eventos
de maturao ocorrem quando expressam pela primeira vez o TCR e iniciam a
maturao em clulas CD4 ou CD8.
Os nveis de proliferao e apoptose so extremamente altos nos timcitos
corticais, onde cerca de 95% morrem antes de chegar regio medular do
timo. O resultado desse processo seletivo a restrio ao MHC prprio e a
tolerncia a muitos autoantgenos. A diferenciao funcional e fenotpica em
Imunologia | 31
clulas T CD4 ou CD8 ocorre na medula tmica, e as clulas T maduras so

liberadas para a circulao.
3.1. Receptores de antgenos e molculas

acessrias dos linfcitos T
Os linfcitos T respondem aos antgenos peptdicos, que so expos-
tos pelas clulas apresentadoras de antgenos (APCs). O incio desta res-
posta requer o reconhecimento especfico do antgeno pelas clulas T, a
adeso estvel das clulas T s APCs e a transduo dos sinais ativadores.
Cada um desses eventos mediado por molculas distintas, expressas pelas
clulas T. As molculas de MHC e os peptdeos formam um complexo na
membrana plasmtica das APCs. O receptor que reconhece esse complexo
peptdeo-MHC o TCR (Figura 2), que distribudo clonalmente, ou
seja, os clones de linfcitos que apresentam diferentes especificidades ex-
pressam distintos TCRs. Os sinais bioqumicos, que so acionados na clula
T pelo reconhecimento do antgeno, no so transduzidos pelo TCR, mas
por protenas no variveis chamadas CD3 e dzeta (z), que esto ligadas de
forma no covalente ao receptor do antgeno para formar o complexo TCR.
Portanto, nas clulas T, o reconhecimento do antgeno basicamente realiza-
do por dois grupos de molculas: um receptor para o antgeno altamente
varivel, o TCR, e protenas sinalizadoras no variveis (CD3 e cadeia z).
Outras molculas acessrias funcionam como molculas de adeso para esta-
bilizar a ligao das clulas T s APCs, permitindo que o TCR mantenha
ntimo contato com o antgeno durante o tempo suficiente para a transduo
dos sinais necessrios ativao dessas clulas.
As clulas T que expressam o TCR d pertencem a uma linhagem
distinta das clulas T restritas ao MHC. A percentagem das clulas T d
muito varivel nos diferentes tecidos das diferentes espcies, normalmente no
excedendo mais do que 5%. Elas no reconhecem os antgenos peptdeos
associados s molculas MHC e no so restritas ao MHC. Alguns clones

dessas clulas reconhecem uma pequena molcula que pode ser apresentada
por molculas similares s da classe I do MHC, ou seja, uma apresentao no
clssica de molculas normalmente encontradas nas microbactrias e em outros
microrganismos. A diversidade limitada das clulas d sugere que os ligantes
desses receptores so bem conservados. Elas podem iniciar a resposta imune
contra um pequeno nmero de microrganismos antes mesmo do recrutamento
das clulas T antgeno-especficas ab.
Alm dos componentes do complexo TCR, as clulas T apresentam
vrias protenas de membrana, as quais exercem papel crucial na resposta
destas clulas no reconhecimento do antgeno. Essas molculas presentes
na membrana de linfcitos ligam-se especificamente a outras molculas da
membrana de outras clulas, como as APCs, clulas do endotlio de
vasos e da matriz extracelular. Essas molculas no apresentam regies
variveis, no so polimrficas, so idnticas em todas as clulas T de
todos os indivduos de uma mesma espcie, e so responsveis pela
transduo de sinais bioqumicos para o interior das clulas T. Essa propri-
edade assegura que as clulas T e as APCs permaneam ligadas o tempo
suficiente para permitir aos TCRs a oportunidade de localizar, reconhecer
e responder ao complexo peptdeo-MHC na APC.
3.2. Correceptores CD4 e CD8: Receptores envolvidos na

ativao
As molculas CD4 e CD8 so protenas das clulas T que se ligam s
regies no polimrficas das molculas de MHC e transduzem os sinais que,
juntamente com os sinais liberados pelo complexo TCR, iniciam a ativao das
clulas T. Normalmente, as clulas T ab maduras expressam CD4 ou CD8,
embora existam referncias da expresso de ambos os marcadores. Esses
correceptores interagem com as molculas de MHC, quando o TCR reconhe-
Imunologia | 33
ce de forma especfica o complexo peptdeo-MHC na APC. Cerca de 65%

das clulas T ab maduras do sangue e dos tecidos expressam o correceptor
CD4 e 35% do CD8.
4. Natureza dos antgenos

O antgeno (do grego anti,contra e gen, gerar) qualquer substn-
cia solvel, celular ou particulada que pode ser especificamente ligada por
um anticorpo ou por um receptor de antgeno de clula T. Os antgenos
possuem duas propriedades: a da imunogenicidade, que a capacidade
de induzir uma resposta imune especfica, e a da antigenicidade, que a
capacidade de interagir com os linfcitos T ou linfcitos B j sensibilizados.
Assim, todas as substncias imunognicas so tambm antignicas. As mo-
lculas que desencadeiam a resposta imune so chamadas de imungenos.
Pequenas substncias qumicas no so capazes de estimular uma resposta
e, portanto, recebem o nome de hapteno. Para ter capacidade de induzir
uma resposta imune, o hapteno ligado a uma macromolcula, que
chamada de carreadora. O complexo hapteno-carreador, ao contrrio do
hapteno livre, pode atuar como um imungeno.
4.1. Determinante antignico

Os stios de ligao dos anticorpos e dos TCRs interagem com uma
rea muito pequena das macromolculas antignicas, que chamada de
determinante antignico ou epitopo. Portanto, a menor poro da mo-
lcula responsvel pela ligao ao linfcito ou anticorpo. A presena de
vrios determinantes iguais chamada de polivalncia ou multivalncia e
cada um pode ser ligado por uma molcula com regio varivel. As super-
fcies celulares, incluindo os microrganismos, geralmente possuem uma grande
quantidade de determinantes antignicos.
4.2. Relao filogentica dos antgenos

A estimulao de linfcitos de galinhas com protena de pato resulta em
uma resposta imune muito baixa. Por outro lado, se inoculadas em galinhas,
protenas de coelho, a resposta imune bastante elevada. Isto acontece porque
quanto mais prxima for a relao filogentica, menor ser o estmulo e vice-
versa. Existe pouca diferena entre as protenas de galinhas e patos e muita
diferena entre as protenas de aves e mamferos. Embora este conceito da
relao filogentica reflita boa parte das aplicaes imunolgicas, no pode ser
tomado como regra. A induo de uma resposta imune muito especfica funo
direta da semelhana biolgica entre a fonte do antgeno e o animal receptor,
ainda que seja menos intensa. Lebres e coelhos pertencem mesma famlia e so
bastante semelhantes, tanto morfolgica quanto fisiologicamente. Portanto, ao se
injetar protenas de coelho em lebre, poder se obter anticorpos muito especfi-
cos, ou seja, anticorpos que s reagem contra protena de coelho.
4.3. Peso molecular e complexidade molecular

Na maioria dos antgenos, quanto maior for a molcula, maior ser o
nmero de epitopo; e quanto maior a complexidade, maior ser a
imunogenicidade. Um antgeno complexo contm vrios determinantes
antignicos, onde alguns dos quais so mais eficientes na induo da resposta
imune e so chamados imunodominantes.
4.4. Configurao espacial e acessibilidade

A imunogenicidade e a antigenicidade de uma protena no depende
apenas de sua estrutura primria (isto , da sequncia de aminocido), mas
tambm das estruturas secundrias, tercirias e at quaternrias. Assim, se tratar-
mos uma protena pelo calor, ou agentes qumicos desnaturantes, e inocularmos
esta em um animal, poderemos obter a formao de anticorpos com especificidade
diferente do que se inoculssemos a protena intacta. A configurao espacial de
Imunologia | 35
diversos epitopos em uma nica molcula de protena pode influenciar a ligao

do anticorpo de vrias formas (Figura 4). A rea importante para a imunogenicidade
deve ficar acessvel, na superfcie da molcula.
Figura 4. Distribuio dos determinantes antignicos sequenciais e no

sequenciais em uma macromolcula proteica
4.5. Forma de administrao e adjuvantes

A dose do antgeno, a via e o esquema de imunizao, assim como o
uso de adjuvantes, so fatores atuantes na induo da resposta imune. As
vias de inoculao subcutnea, intradrmica e intramuscular levam geralmente
os imungenos para os ndulos linfticos regionais, e, mais frequentemente,
induzem a imunidade celular. Os antgenos inoculados por via endovenosa e
intraperitonial acumulam-se predominantemente no bao, e mais frequente-
mente induzem a uma imunidade humoral. O adjuvante melhora a
imunogenicidade de compostos com ele misturado, sem interferir na
especificidade da resposta. Em medicina preventiva, so muitas vezes adicio-
nados s vacinas para reduzir a dose e a frequncia de injees dos antgenos
utilizados para a imunoprofilaxia de doenas infecciosas. Normalmente, o
antgeno aprisionado por ele, formando depsitos, o qual liberado aos
poucos por perodo de tempo mais extenso. Com isso, h o aumento do
tempo de exposio do antgeno no organismo pelo retardamento de sua
destruio, estimulando, assim, a migrao de clulas para o local de inoculao

e aumentando a interao destas clulas com o mesmo. O tipo de adjuvante
mais comumente usado em estudos experimentais o adjuvante de Freund,
que pode ser classificado em dois tipos: AIF (Adjuvante Incompleto de
Freund), que constitudo por leo mineral neutro e lanolina ou Arlacel; e o
ACF (Adjuvante Completo de Freund), que alm do leo mineral neutro
mais lanolina, adicionado um componente bacteriano, normalmente o
Mycobacterium, morto pelo calor. Alm desses, outros adjuvantes so utiliza-
dos, como o sulfato de alumnio, o hidrxido de alumnio, a IL-12, entre
outros. Dependendo da composio, adjuvantes podem ou no ser usados em
seres humanos.
Bases qumicas da especificidade antignica

Anticorpos formados contra determinadas substncias tm uma reao
forte contra elas, principalmente se os anticorpos interagem com os antgenos
especficos que induziram a sua formao (antgenos homlogos), mas podem
reagir com a mesma ou menor intensidade com outros antgenos, que so
chamados de antgenos heterlogos, porm com estrutura semelhante. Essas
reaes com antgenos heterlogos so denominadas reaes cruzadas. As
reaes cruzadas podem ocorrer basicamente em funo da similaridade entre
dois diferentes determinantes antignicos, ou ainda pelo fato de dois antgenos
diferentes apresentarem o mesmo determinante antignico.
5. Diversidade das imunogobulinas

Os anticorpos so conceituados como glicoprotenas globulares com
funo imunitria e pertencem superfamlia das imunoglobulinas. So sinte-
tizados por linfcitos B e, principalmente, por plasmcitos, em resposta ao
estmulo imunognico. Interagem, especificamente, com os imungenos, que
estimulam sua biossntese; desencadeiam vrios mecanismos na fase efetora
Imunologia | 37
da resposta imune que, frequentemente, resultam em anular a ao de

biopatgenos, por meio da ativao do sistema complemento, opsonizao
dos antgenos para fagocitose, citotoxicidade celular dependente de anticorpo
(ADCC), em que os anticorpos marcam os microrganismos para serem destrudos
pelas clulas do sistema imune inato e reaes de hipersensibilidades, entre
outras ocorrem.
Estas funes so estruturalmente separadas na molcula e a regio de
ligao ao antgeno varia amplamente, sendo conhecida como regio varivel ou
regio V. A regio molecular que participa da funo efetora conhecida como
regio constante ou C, e no varia do mesmo modo, embora apresente cinco
formas principais que se especializaram na ativao de diferentes mecanismos.
A notvel diversidade das molculas dos anticorpos consequncia de
um mecanismo altamente especializado, pelos quais os genes expressos so
reunidos por rearranjos de DNA, que juntam dois ou trs diferentes segui-
mentos para formar um gene de regio varivel durante o desenvolvimento das
clulas B. Subsequentes rearranjos nucleicos podem reunir o gene composto
da regio varivel e qualquer gene da regio constante, produzindo assim
anticorpos de cada um dos 5 isotipos.
Estruturalmente (Figura 5), a imunoglobulina formada por duas cadeias
leves (L-light-leve), idnticas, constitudas de polipeptdeos de cerca de 25
mil Daltons e de duas cadeias pesadas (H- heavy- pesado), tambm idnticas,
com peso molecular de 50 mil Daltons ou mais. Cada cadeia leve est ligada a
uma cadeia pesada por pontes dissulfdricas. O nmero exato e as posies
destas pontes entre as cadeias diferem entre as classes e subclasses de
Imunoglobulinas. Alm disso, ambas as cadeias, leves e pesadas, possuem
uma regio varivel e outra constante. Portanto, a imunoglobulina possui na
cadeia leve uma regio constante (CL) e uma varivel (VL). O mesmo na
cadeia pesada, uma regio constante (CH) e uma varivel (VH). Existem dois
tipos de cadeias leves, a kappa (k) e a lambda (l). Em humanos, 60% das
cadeias leves so do tipo kappa, e 40% so do tipo lambda. Os primeiros

110, ou mais, aminocidos da regio aminoterminal das cadeias leves ou
pesadas variam muito entre os anticorpos de especificidade diferentes e por
isto so chamadas de regio varivel.
A molcula de imunoglobulina pode ser digerida por enzimas
proteolticas. A digesto pela papana quebra a molcula em trs fragmentos
(Figura 5): dois fragmentos chamados Fab (fragment antingen binding), que
se liga ao antgeno especfico, e um fragmento denominado Fc (fragment
crystallizable, fragmento cristalizvel), por formar cristais quando armazenado
em locais frios. Os fragmentos Fab so os que contm as cadeias leves (L)
completas, emparelhadas com os domnios V (varivel) e C (constante) da
cadeia pesada, enquanto o Fc, contm apenas o domnio C (constante). A
papana cliva a molcula na poro aminoterminal das pontes de enxofre,
permitindo que as metades carboxiterminais da Fc permaneam unidas, dei-
xando o fragmento Fc livre. J a pepsina, cliva na mesma regio, mas na
poro carboxiterminal das pontes dissulfrdicas, produzindo o (Fab)2, onde
os dois braos dos Ac permanecem unidos.
Figura 5. Estrutrua bsica de uma imunoglobina e a formao dos fragmentos

pela digesto enzimtica.
Imunologia | 39
5.1. Gerao da diversidade na resposta imune

humoral e maturao da afinidade
Mesmo a resposta a um Ag simples diversa, com muitas molculas de
Igs, cada uma com afinidade nica e especificidade acurada. Durante a organi-
zao dos diferentes segmentos genticos necessrios para produzir uma mol-
cula de Ig, combinaes ao acaso dos diferentes componentes gnicos produ-
zem uma enorme diversidade potencial.
Durante as fases iniciais do desenvolvimento do linfcito B, a IgM de
membrana produzida como receptor. A mudana de isotipo em clulas B
ocorre ao serem estimuladas pelo antgeno. Isto assegura a manuteno da
mesma regio varivel, garantindo a especificidade ao Ag correspondente,
expressa nos diferentes isotipos, aos quais orientam diferentes funes efetoras.
Uma diferena bsica entre o Ac produzido na resposta primria e na res-
posta secundria a sua afinidade. O Ac da classe IgM, produzido para um
Ag na resposta primria, tende a ser de afinidade relativamente baixa e pode
contar com uma avidez adicional, causada por sua estrutura pentamrica, para
ligar-se eficientemente ao Ag. Entretanto, a IgG e outras classes produzidas
na resposta secundria tendem a ter uma afinidade maior. Vale ressaltar que o
aumento gradual da afinidade do Ac pelo Ag indutor, que observado no
curso de uma resposta, acontece no ndulo linftico. Este fenmeno
(maturao da afinidade) a consequncia da hipermutao somtica dos
genes de Ig acoplada com a seleo das clulas B com Ig de superfcie de
alta afinidade. A maturao da afinidade, no curso de uma resposta imune,
pode ser encarada como um processo darwiniano, requerendo primeiro a
gerao de variabilidade nos receptores de clulas B e ento a seleo
daqueles com maior afinidade pelo Ag. Aps esse processo, as clulas B,
que se ligam ao Ag de modo bem-sucedido e sobrevivem seleo, saem
do centro germinativo do ndulo linftico para tornarem-se clulas B de
memria ou clulas plasmticas secretoras de Ac.
5.2. Distribuio e propriedades dos isotipos

Os agentes infectoparasitrios devem achar seus caminhos para a maior
parte dos locais do organismo hospedeiro, e os anticorpos tambm devem ser
amplamente distribudos para cont-los. Os anticorpos so distribudos por
difuso atravs de mecanismos especiais, para lev-los, por exemplo, para os
pulmes e o intestino. Anticorpos de diferentes isotipos (Figura 6) operam
em locais diferentes. Os primeiros anticorpos a serem produzidos numa res-
posta imune humoral so sempre as IgMs. Estes so produzidos antes que a
clula B tenha sofrido hipermutao somtica; portanto, tendem a ser de baixa
afinidade, como visto anteriormente. Estas molculas formam pentmeros, cujos
10 stios de ligao com o Ag podem se unir simultaneamente a antgenos
multivalentes, tais como os polissacardeos de parede celular bacteriana. Esta
estrutura pentamrica tambm torna a IgM capaz de ativar o complemento de
maneira mais eficaz, o que contribui para o controle mais eficiente de uma
infeco. Quanto IgD, no se conhece muito bem a sua funo, mas parece
exercer um papel na diferenciao dos linfcitos B induzida pelo Ag. O
principal isotipo de imunoglobulina no sangue e nos fluidos extracelulares a
IgG, considerando todas as subclasses (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4). A IgG
tem propriedades diversas, dentre as quais, confere proteo ao feto, pois a
nica classe de imunoglobulina humana que pode ser transportada atravs da
placenta diretamente para a corrente circulatria do feto. A IgG tambm atua
na neutralizao de toxinas, imobilizao de bactrias, sensibilizao para NK,
ativao do complemento e opsonizao.
A IgA a principal imunoglobulina presente em secrees externas,
como saliva, muco, suor, suco gstrico e lgrimas. Alm disso, a principal
imunoglobulina contida no colostro e no leite, e deve ser no neonato a
principal fonte de proteo contra patgenos no intestino. A IgA se divide
em duas subclasses, IgA1 e IgA2. A IgA presente no plasma encontrada na
forma monomrica e em pequenas concentraes, enquanto a forma dimrica
Imunologia | 41
encontrada em grandes concentraes nas regies mucosas do organismo.

Estas previnem a invaso de bactrias ou a penetrao de toxinas nas clulas
epiteliais. A IgE est difundida de maneira moderada nos espaos extravasculares
e tem como principal propriedade a sensibilizao de mastcitos e basfilos,
promovendo reao inflamatria, atravs da liberao de mediadores qumicos
como a histamina, que, por sua vez, promove vasodilatao, permitindo a
passagem de Acs do vaso para a rea lesada, e fatores quimioatraentes que
recrutam fagcitos para o local de infeco. Alm disso, podem estar envolvi-
das em processos alrgicos e na ajuda para eliminao de helmintos, quando
sensibilizam eosinfilos.
Figura 6. Estrutura dos cinco principais isotipos de imunoglobulinas humanas
5.3. Polimorfismo das imunoglobulinas

Quando uma Ig usada como Ag, ela tratada como qualquer outra
protena estranha e faz desencadear uma resposta de Ac. Pode ser produzido
Ac anti-Ig que reconhea aminocidos caractersticos do isotipo do Ac injeta-
do. Tambm possvel gerar Acs que reconhecem diferenas no Ac de
membros da mesma espcie e tal fenmeno se deve variao gentica ou
polimorfismo. Tais variantes allicas so chamadas de alotipos e representam
pequenas diferenas polimrficas nos loci, que codificam as regies constantes

das cadeias leves e pesadas. Contrastando com os Acs anti-isotipos, os Acs
anti alotipos reconhecero Ig de um dado isotipo em alguns representantes de
uma dada espcie. Finalmente, as variaes na sequncia dos epitopos de uma
Ig so conhecidas como idiotipos (Figura 7).
Para a produo de Acs altamente especficos, a clivagem pela papana
(Figura 5) essencial, pois esta enzima, como j foi dito anteriormente, corta
a molcula antes das pontes de sulfeto, o que mantm a poro Fc inteira, e a
produo dos Ac sero altamente especficas contra a regio Fc daquele isotipo.
Quando se deseja uma molcula de Ac que no reaja com o sistema comple-
mento e no se fixe em receptores para Fc de superfcie celular, cliva-se a Ig
com a pepsina, que corta depois das pontes de sulfeto, o que mantm a
frao (Fab)2 ntegra, permitindo a ligao especfica com o alvo desejado e
impossibilitando as aes efetoras caractersticas do isotipo.
Figura 7. Localizao das variaes isotpicas, alotpicas na molcula de

imunoglobina.
Imunologia | 43
5.4. Anticorpos monoclonais

Em 1975, Georges Khler e Cesar Milstein planejaram um mtodo para a
preparao do anticorpo monoclonal (Ac mo), atravs da fuso da clula B ativada
normal produtora de anticorpo com uma clula do mieloma (uma clula plasmtica
cancerosa). Neste evento, produziram uma clula hbrida (hibridoma), que possua
as propriedades de crescimento imortal da clula do mieloma e secretava o Ac
produzido pela clula B.
Os clones resultantes das clulas do hibridoma que secretam grandes quanti-
dades de Ac mo podem ser indefinidamente cultivadas. Os hibridomas de clulas B
so produzidos utilizando polietilenoglicol (PEG) para fusionar as clulas do mieloma
com as clulas B de animais que foram imunizados com o Ag, atravs do qual se
deseja produzir os anticorpos. As clulas do mieloma contribuem para o crescimen-
to imortal das clulas fusionadas, e as clulas B contribuem com a informao
gentica para a sntese do Ac especfico de interesse. As condies do procedi-
mento devem permitir seletivamente a sobrevivncia e o crescimento somente dos
hibridomas. Para tal, utilizado o meio HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina).
Neste meio, a aminopterina bloqueia a sntese de DNA pela via de novo. Na
presena de aminopterina, as clulas devem usar a via de salvamento, onde as
enzimas catalisadoras so a fosforribosiltransferase hipoxantina-guanina (HGPRT) ou
a timidina quinase (TK), para produzir o DNA. Uma mutao em qualquer uma
destas duas enzimas bloqueia a habilidade da clula em usar a via de salvamento.
Portanto, clulas do mieloma sozinhas morrero, pois so deficientes para as enzimas
HGPRT ou TK, essenciais para a via de salvamento. Somente as hbridas iro
sobreviver, pois a clula B contribui com a enzima que falta para a via de salvamento.
Embora as clulas B no fusionadas sejam capazes de sobreviver no meio HAT,
estas no vivem por perodos extensos in vitro e morrem.
Aps a obteno dos hibridomas, estes devem ser diludos e distribudos em
placas de cultura apropriada numa concentrao de 0,5 clula por poo. Tal
procedimento nos dar a certeza de que o Ac produzido seja oriundo de
um nico clone, pois como no existe meia clula, teoricamente, teremos um

poo vazio e outro com apenas uma clula. Feito isso, cada hibridoma, aps
multiplicao e produo de Ac, ser examinado por teste sorolgico, tendo em
vista a identificao dos hibridomas desejados, ou seja, aqueles que sintetizam o
anticorpo monoclonal que reaja com o Ag correspontente. Uma vez identifica-
dos, os hibridomas so induzidos proliferao, tornando-se assim uma fonte
inesgotvel de anticorpos altamente especficos.
Os Ac mo so muito teis como reagentes para diagnstico, exames de
imagem e procedimentos teraputicos na clnica mdica. Para diagnstico, podem
ser utilizados na deteco de gravidez, diagnstico de numerosos microrganismos
patognicos, medidas de nveis sanguneos de vrias drogas, tipagem sangunea,
tipagem de antgenos de histocompatibilidade, caracterizao fenotpica de diversos
tipos celulares e deteco de antgenos produzidos por determinados tumores. Por
exemplo, para esse propsito, Ac mo radiomarcados podem ser utilizados in vivo
na deteco ou localizao de antgenos tumorais, permitindo diagnsticos precoces
de alguns tumores primrios ou metastticos nos pacientes. Na imunoterapia, o Ac
mo especfico para um determinado Ag tumoral de superfcie, acoplado com um
quimio ou radioterpico, pode ser potente agente teraputico.
6. Sistema completo
O nome complemento foi originado a partir da atividade complementar de
protenas na ao bactericida de alguns Acs. O sistema complemento um comple-
xo proteico existente no plasma, sob a forma inativa, constitudo por substncias
termolbeis e/ou termoestveis; e que tem como funo a eliminao de um agente
estranho pela ativao de mecanismos inespecficos, que se constitui de:
Fagocitose - quando algumas protenas ativadas do complemento unem-se
a bactrias, opsonizando-as para ingesto pelos fagcitos portadores de
receptores do complemento;
Imunologia | 45
Reao inflamatria - quando os pequenos fragmentos de protenas

promovem eventos vasculares e recrutam fagcitos ao local da ativida-
de inflamatria.
Lise - quando uma vez desencadeada a cascata, os componentes terminais
do complemento lesam certas bactrias, vrus e clulas com a formao de
poros na membrana celular.
Alm dessas trs funes, o sistema complemento tambm responsvel
pela depurao imune, que consiste na remoo de complexos imunes da circulao
no bao e no fgado. Este sistema, com cerca de 30 protenas ou mais, interage por
ativao enzimtica. O complemento pode agir sozinho ou com Ac e so conheci-
das 3 vias, a clssica, a alternativa e a via das lectinas. A via clssica ativada por
complexos imunes, enquanto as vias alternativa e das lectinas so ativadas por
microrganismos. Todas as vias de ativao convergem para uma etapa final de reao
em cadeia denominada sequncia comum (Figura 8).
Figura 8. Vias de ativao do sistema complemento

No processo de ativao, que envolve uma srie de etapas proteolticas,

uma protena precursora inativa clivada para fornecer um grande fragmento
ativo; esta se une superfcie celular e contribui para a prxima clivagem, e
um pequeno fragmento peptdico que liberado serve como mediador de
resposta inflamatria. Cada uma das trs vias de ativao gera uma convertase
de C3 por um caminho diferente, determinando que as principais molculas
efetoras e os eventos tardios sejam os mesmos para as trs vias. importante
lembrar que a ativao inadequada e a persistncia dos efeitos inflamatrios
so potencialmente prejudiciais ao organismo, de modo que a sua regulao
precisa ser bem rigorosa. E uma das maneiras de controle se resume ao
pouqussimo tempo que os componentes-chaves permanecem ativos (milsi-
mos de segundos), a menos que se liguem a uma superfcie celular. Alm da
curta vida-mdia dos fragmentos do complemento, existem vrios pontos na
via de ativao, nos quais podem atuar protenas reguladoras, o que previne
a ativao inadvertida do complemento sobre clulas do hospedeiro e evita a
leso de clulas do organismo.
Quanto nomenclatura, todos os componentes da via clssica so
designados pela letra C, seguida por uma designao numrica simples: C1,
C2. Os componentes foram numerados pela ordem de descoberta e no
segundo a sequncia de reaes (C1, 4, 2, 3, 5, 6, 7, 8 e 9). Quanto
aos produtos de clivagem, so designados por letras minsculas, onde o
maior fragmento recebe a letra b (exceto o fragmento C2, que recebe a letra
a) e o menor, a letra a. Os componentes iniciais da via alternativa, em vez de
serem numerados, so indicados pelas letras maisculas B e D, e seus produ-
tos de clivagem tambm so designados pelas letras b e a, onde o maior
fragmento Bb e o menor, Ba. Quanto aos componentes ativados, recebem
uma linha horizontal superior, por exemplo, Bb.
Imunologia | 47
6.1. Ativao da via clssica

O componente C1 um complexo formado por trs protenas C1q,
C1r e C1s. Uma vez formado o complexo Ag-Ac, o componente C1q se
liga na regio Fc do Ac, dando incio a uma reao em cascata, onde C1q
ativa duas molculas de C1r capazes de se ligar a outras duas de C1s,
resultando no complexo C1q-C1s-C1r-C1r-C1s, que uma serina
protease. Desta forma, C1s atua em C4 e C2, dissociando-as em C4a e
C4b, C2a e C2b. Nesta etapa, a unio de C4b a C2b (em alguns livros,
C2a) forma a C3 convertase. Aps a formao da C3 convertase, esta
cliva C3 em C3a e C3b. O C3 a frao mais abundante no plasma e o
mais importante entre os componentes do complemento, pois inmeras
molculas de C3b podem se ligar superfcie de um patgeno. Alguns
fragmentos C3b se ligam a receptores da membrana e atuam como opsoninas,
facilitando a fagocitose, outros fragmentos de C3b se ligam a C3 convertase,
originando a C5 convertase (C4bC2bC3b) da via clssica (Figura 9),
que vai atuar em C5 dissociando-o em C5a e C5b. Com a dissociao de
C5, inicia-se uma etapa comum a todas as vias de ativao do complemen-
to, onde a frao C5b interage com C6, que abre um stio de ligao para
C7. Por sua vez, o complexo C5bC6C7 deposita-se na superfcie da
membrana e abre o stio de ligao para C8, que penetra na membrana da
clula. O C8, ento, abre um stio para C9, que, aps a ligao de vrios
C9, forma um canal transmembrnico ou poro hidroflico, chamado de
complexo de ataque membrana (MAC), ocasionando lise celular e
desequilbrio osmtico. importante ressaltar que no curso da cascata do
sistema complemento, os fragmentos menores C4a, C2a, C3a e C5a
liberados no interstcio, so potentes mediadores inflamatrios.
Figura 9. Ativao da cascata do complemento pela via clssica.
6.2. Via das Lectinas

A via das lectinas (Figura 10) semelhante via clssica. As lectinas so
protenas, ou glicoprotenas, que se ligam a carboidratos e podem ativar a via
clssica do complemento na ausncia do complexo antgeno-anticorpo. A
principal lectina a protena ligadora de manose (MBL), que faz o papel de
C1q ao se ligar resduos de carboidratos da superfcie de uma bactria
ativadora ou outras substncias. A MBL est associada com duas pr-enzimas
MASP-1 e MASP-2 (Serina Protease Associada a MBL). Quando a MBL
se liga aos grupamentos manose terminais nos carboidratos bacterianos, MASP-
1 e MASP-2 so ativadas e continuam a ativar a via clssica.
Imunologia | 49
Figura 10. Ativao da cascata do complemento pela via das lectinas
6.3. Via Alternativa

Com exceo da etapa inicial, os eventos da via alternativa (Figura 11)
so homlogos aos da via clssica e das lectinas. A via alternativa constante-
mente ativada, em taxa muito reduzida, a qual aumenta drasticamente na pre-
sena de superfcies ativadoras adequadas, como as membranas celulares de
microrganismos. Esta via pode ser ativada pela ligao do C3b ou de uma
forma hidrolizada espontaneamente, conhecida como iC3b, superfcie do
patgeno. Este se liga ao fator B, formando C3bB, componente suscestvel
ao fator D, uma protease do plasma. O fator D cliva o componente B em Ba
e Bb, onde Bb permanece ligado ao C3b, formando a molcula C3bBb que
a C3 convertase da via alternada. A C3 convertase da via alternativa produ-
zir mais C3b, tornando o sistema mais ativo, pois muitos fagcitos possuem
receptores para este componente. A C3 convertase da via alternativa extre-
mamente instvel e, por isso, costuma sofrer rpida dissociao. No entanto,
uma protena plasmtica denominada properdina se liga a esta convertase e a
estabiliza, diminuindo sua degradao e permitindo a continuao da cascata.
Nesta via, alguns C3b se ligam ao C3bBb e formam a C5 convertase da via

alternada C3b2Bb ou C3bBbC3b. Este complexo cliva C5 em C5a e C5b,
dando incio a sequncia comum, onde C5b inicia o complexo de ataque
membrana, ligando-se a C6, C7, C8 e C9 (Figura 12).
Figura 11. Ativao da cascata do complemento pela via alternativa.
Figura 12. Sequncia final da cascata do complemento comum a todas as vias

de ativao, onde C5b inicia o complexo de ataque membrana, ligando-se a
C6, C7, C8 e C9.
Imunologia | 51
7. Complexo principal de histocompatibilidade

Todo organismo multicelular possui algum sistema de defesa que distin-
gue agentes infectoparasitrios e elimina-os do hospedeiro. Mais ainda, os
grandes vertebrados tm um sistema imune mais evoludo que pode discriminar
o que estranho e fazer uma resposta seletiva para o mesmo. A vantagem de
tal imunidade especfica a rpida adaptao do sistema imune aos agentes
patognicos que so mais frequentemente encontrados no meio ambiente lo-
cal. Esta capacidade conseguida atravs do complexo principal de
histocompatibilidade, cujos produtos desempenham um papel no reconheci-
mento intercelular e na discriminao entre o prprio e no prprio. A identi-
ficao das molculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC)
aconteceu pela investigao da sua funo na resposta imunolgica aos tumo-
res, na rejeio de transplantes de pele e no controle da resposta imune.
7.1. Estrutura das molculas do MHC

Os genes que codificam as molculas do MHC esto localizados no
cromossomo 6 humano e no 17 em camundongos, denominados antgenos
leucocitrios humanos (HLA) e de histocompatibilidade (H-2), respectiva-
mente. O MHC pode ser dividido em quatro subconjuntos de genes ou
classes: classes I, II, III e IV, sendo os de classe I e II ligados ao processamento
e apresentao de antgenos, enquanto os genes que compem as classes III e
IV codificam para outras protenas, estando algumas relacionadas com a res-
posta imune, tais como componentes do sistema complemento, algumas citocinas,
etc. Em humanos, existem trs loci que codificam as molculas de classe I, os
quais so denominados HLA-A, HLA-B e HLA-C, e trs loci gnicos do
MHC de classe II, que so denominados HLA-DP, HLA-DQ e HLA-DR.
Normalmente, um indivduo herda duas cpias de cada locus gnico (um de
cada progenitor). Assim, em humanos, temos seis loci de classe I e seis loci de
classe II. Todos esses loci apresentam alto grau de polimorfismo, ou seja,
apresentam mltiplos alelos na populao. As molculas do MHC de classe I,

que esto presentes na maioria das clulas nucleadas, so reconhecidas princi-
palmente pelo TCR de linfcitos T CD8, ao passo que as molculas de classe
II, presentes principalmente na superfcie das clulas apresentadoras de antgenos
profissionais, so reconhecidas pelo TCR dos linfcitos T CD4.
7.2. MHC de classe I

As molculas do MHC de classe I so expressas na membrana celular
da maioria das clulas nucleadas dos vertebrados. Sua estrutura constituda
por uma cadeia a (alfa) de aproximadamente 45kDa, que atravessa a membra-
na plasmtica. A outra a b2- microglobulina de 12kDa que se encontra
fracamente ligada membrana. Os genes que codificam a cadeia a (varivel)
esto localizados dentro da regio genmica do MHC, enquanto os genes
que codificam a b2-microglobulina (invarivel) esto localizados fora da regio
do MHC no cromossomo 15 humano. A cadeia a formada por trs
segmentos a1, a2 e a3. A regio em que o peptdeo se liga corresponde
regio amino-terminal e composta pelos segmentos a1 e a2, que formam
uma fenda ou bolsa onde ele se encaixa. O tamanho dessa fenda permite ligar
peptdeos de 8 a 11 aminocidos e corresponde regio do MHC de classe
I que interage com o TCR do linfcito T. Por essa razo, os antgenos proteicos
precisam ser processados para gerar peptdeos, pequenos o suficiente para se
ligarem molcula do MHC. A regio invarivel, que corresponde ao seg-
mento a3, se liga ao correceptor CD8 do linfcito T. Essa ligao confere a
especificidade da molcula de classe I com a clula T CD8. O domnio a,
tambm se liga de forma no covalente molcula b2-microglobulina, sendo
esse complexo estabilizado pelo peptdeo processado que se liga nos dom-
nios a1 e a2 (Figura 13). Somente nessa forma estvel a molcula do
MHC de classe I expressa na superfcie das clulas.
Imunologia | 53
7.3. MHC de classe II

As molculas do MHC de classe II tambm so expressas na membrana
celular. Mas estas so expressas na superfcie de clulas apresentadoras de antgenos
profissionais. Essas clulas incluem as clulas dendrticas, os macrfagos e os linfcitos
B. A molcula de classe II formada por uma cadeia a e uma b. A cadeia a tem
32-34kDa, enquanto a cadeia b tem 29-32kDa (Figura 13). As duas cadeias do
MHC de classe II so codificadas dentro da regio genmica do MHC e ambas
so polimrficas, ou seja, so variveis. As cadeias a e b, na poro extracelular,
possuem domnios a1 e a2 e b1 e b2, onde a poro varivel das duas cadeias
so os segmentos a1 e b1, conforme pode ser visto na Figura 13. Os domnios
a1 e b1 interagem para formar a fenda de ligao ao peptdeo, que estruturalmen-
te bastante similar molcula do MHC de classe I. Esta fenda, ou bolsa onde
se encaixa o peptdeo a ser apresentado clula T. Assim, como de se esperar,
esta tambm a regio da molcula do MHC de classe II que apresenta maior
variabilidade. Na molcula de classe II, as extremidades da fenda de ligao do
peptdeo so abertas, o que permite a ligao de peptdeos de 10-30 aminocidos,
mas pode ocorrer ligao de peptdeos maiores, o que no acontece com a
molcula de classe I que tem as extremidades fechadas.
Figura 13. As trs classes de genes no MHC humano e a expresso dos

produtos de classe I e II.
7.4. Processamento e apresentao de antgenos s clulas T CD8

Antgenos apresentados pelas molculas de MHC de classe I so, na
maioria das vezes, gerados dentro da mesma clula que produziu a molcula
de classe I. Os peptdeos gerados so derivados de protenas que se encon-
tram no citosol da clula, que podem ser da prpria clula, de origem viral ou
de outros microrganismos intracelulares e antgenos tumorais. Os antgenos, em
geral protenas presentes no citoplasma, so degradados em peptdeos por um
complexo multiproteoltico denominado proteassoma. Esses peptdeos so trans-
portados do citoplasma para o retculo endoplasmtico rugoso por intermdio
de uma protena transportadora de antgeno (TAP). Os peptdeos transporta-
dos pela TAP para dentro do retculo endoplasmtico se ligam molcula
nascente do MHC classe I, tornando-a estvel. Assim, o complexo resultante,
MHC classe I e peptdeo, deixam o retculo endoplasmtico e movem-se para
o complexo de Golgi, do qual transportado para a superfcie da clula onde
reconhecido pela clula T CD8.
7.5. Processamento e apresentao de antgenos s clulas T CD4

As molculas do MHC de classe II tambm se ligam a peptdeos
originados da degradao proteica, mas, geralmente, os peptdeos resultam da
protelise de molculas endocitadas ou partculas fagocitadas pelas APC. As
partculas so internalizadas em vesculas intracelulares, denominadas endossomas,
que se fundem com lisossomas, contendo enzimas proteolticas. A vescula
resultante dessa fuso chamada fagolisossoma. O processo de degradao
do antgeno ocorre em condies cidas, que o pH timo para a ao das
enzimas proteolticas, e os peptdeos originados da degradao se ligam na
fenda da molcula do MHC de classe II. Quando recm-sintetizada no retculo
endoplasmtico, a molcula do MHC de classe II tem a fenda protegida por
uma protena denominada cadeia invariante (Ii). Desse modo, a fenda do
MHC classe II no pode acomodar peptdeos presentes no retculo
Imunologia | 55
endoplasmtico. Essa molcula de classe II , ento, direcionada para os

fagolisossomas, onde se encontram os peptdeos exgenos resultantes da
protelise dos antgenos. Nos fagolisossomas, as enzimas proteolticas digerem
a cadeia II; porm, no totalmente, restando o fragmento chamado peptdeo
de classe II, associado cadeia invariante (CLIP = class II associated invariant
chain peptide). Com a remoo do CLIP, por meio da molcula HLA-DM,
o peptdeo processado pode se ligar fenda da molcula de classe II e ser
reconhecido especificamente pelos linfcitos T CD4.
8. Resposta celular e resposta humoral

Se a resposta inata for suficiente para anular a ao de um agente
infectoparasitrio, no ocorrer ativao da resposta imune adaptativa e, por-
tanto, no formar memria imunitria. Por outro lado, caso ocorra persistncia
da infeco, devido aos mecanismos de escape desse agente, haver a neces-
sidade da ativao da resposta imune adaptativa. Em funo da natureza do
agente infectoparasitrio e da forma com que seus antgenos so processados,
a resposta imune adaptativa pode seguir dois caminhos distintos, que levam
proliferao de clulas CD8+ (resposta celular predominantemente Th1) e
secreo de anticorpos por clulas B e plasmcitos (resposta humoral predomi-
nantemente Th2) (Figura 14). Th1 e Th2 no so sinnimos de resposta
celular e humoral. Existe predomnio, mas clulas Th2 so funcionais, e existem
anticorpos IgG ligados ao Th1.
A imunidade mediada por clulas se desenvolve por uma rede de
interaes que resulta em defesa contra microrganismos que sobrevivem dentro
de fagcitos ou de outras clulas. Os antgenos de patgenos processados no
citosol, fora de vesculas cidas, so conduzidos at a superfcie celular pela
molcula de classe I e apresentados para as clulas T CD8+ que eliminam
diretamente a clula infectada, enquanto os antgenos de patgenos processa-
dos em vesculas cidas so apresentados pelas molculas de classe II s clulas
T CD4+, que podem se diferenciar em dois tipos: CD4+Th1, que ativam

clulas mononucleares (macrfagos e linfcitos) e CD4+Th2, que induzem a
proliferao e diferenciao das clulas B em plasmcitos produtores de
anticorpos.
Figura 14. Esquema geral da resposta celular e humoral
8.1. Resposta celular e o mecanismo de ao das clulas T CD8+

Os linfcitos T CD8+ ativados se diferenciam em clulas T citolticas
(CTL), que destroem somente as clulas portadoras do antgeno associado a
produtos de classe I do MHC, no danificando a clula vizinha durante o
evento. O mecanismo de ao pode ocorrer pela lise direta atravs das enzimas
perforinas e granzimas, como tambm pela induo de apoptose. No primei-
ro processo, aps a ligao do TCR/CD3 com o antgeno via MHC I, os
microtbulos da clula CD8+ se movem para a rea de contato com a clula
alvo, e os grnulos contendo as enzimas citolticas tambm se aglomeram nesta
regio. Neste contato, as protenas formadoras de poros (perforinas) entram
em contato com concentraes de Ca++ e sofrem polimerizao. Esta
Imunologia | 57
polimerizao forma um canal permevel a ons na membrana plasmtica da

clula alvo, levando a um desequilbrio osmtico e lise (Figura 15). Alm de
lise direta, as clulas CD8+ CTL produzem IFN-g, que estimula a atividade
fagocitria de macrfagos, inibe diretamente a replicao de vrus e induz a
expresso de molculas de classe I. O segundo mecanismo de destruio de
clula-alvo envolve a interao da molcula ligante de Fas, denominada Fas-L e
presente no CTL, com a molcula Fas (CD95), presente na clula alvo. Essa
interao leva a clula-alvo apoptose, que tambm pode ser induzida pela
ao das granzimas. Neste evento, as clulas acometidas condensam o citoplasma
e a cromatina, formando os corpos apoptticos, que sero fagocitados rapida-
mente por clulas vizinhas sem a formao de reao inflamatria adjacente
(Figura 15). Um efeito adicional da apoptose a ativao de enzimas celulares
que degradam genomas virais em at 200 pares de bases e seus mltiplos.
Figura 15. Necrose e apoptose induzidas por clulas T citotxicas

8.2. Mecanismo de ao das clulas CD4+ Th1 e CD4+ Th2

Alguns microrganismos como Mycobacterium spp so patgenos
intracelulares que crescem em vesculas, onde so parcialmente protegidos da
ao dos anticorpos e das clulas CD8 CTL. Estes normalmente inibem a
fuso destas vesculas com o lisossomo, prevenindo sua destruio. Diante
disso, esses microrganismos so eliminados normalmente quando estas clulas
so ativadas atravs de citocinas inflamatrias, como o IFN-g, produzido pelas
clulas CD4+Th1.
O processo de ativao, atravs do contato dos macrfagos com as
clulas CD4+Th1, gera uma srie de aes bioqumicas que convertem o
macrfago numa potente clula anti bacteriana. Estas reaes so: fuso do
fagossomo com o lisossomo, expondo as bactrias s enzimas lisossomais;
aumento da expresso de MHC de classe I e classe II; expresso de receptor
de TNF-a e secreo de TNF-a, que junto com o IFN- g, sinergiza para o
aumento da ao bactericida, resultando na produo de xido ntrico (NO)
e oxignio reativo (O2); secreo de IL-12, que orienta a diferenciao de
clulas Th0 para Th1; e secreo de IL-10, que inibe a produo de IFN- g e
serve para amortecer os efeitos lesivos da ativao exacerbada de macrfagos
nos tecidos. Quando um patgeno resiste aos efeitos iniciais da resposta imune
celular, pode-se evoluir para uma inflamao crnica, consistindo intenso infiltrado
mononuclear e proliferao de tecido conjuntivo caracterstico de inflamao
inespecfica ou por um padro de inflamao crnica que se distingue pela
formao de granuloma que se caracteriza por agregados de macrfagos ativados,
os quais assumem uma aparncia epitelioide circundados por linfcitos T. Fre-
quentemente, mas no invariavelmente, clulas gigantes multinucleadas, que
derivam da fuso de vrios macrfagos, so encontradas em granulomas mais
antigos. As clulas CD4 Th1 e Th2 participam regulando tais granulomas com
produo de citocinas inflamatrias e anti-inflamatrias, prevenindo a dissemi-
nao dos patgenos e leses tissulares.
Imunologia | 59
8.3. Resposta humoral

Muitas bactrias importantes nas doenas infecciosas humanas se mul-
tiplicam nos espaos extracelulares do organismo, e a maior parte dos
patgenos intracelulares se dissemina de uma clula para outra atravs dos
fludos extracelulares. A resposta imune humoral conduz destruio dos
microrganismos extracelulares e seus produtos, como, por exemplo, as
toxinas; alm de tambm prevenir ou diminuir a disseminao das infeces
intracelulares, atravs da neutralizao desses agentes. Os anticorpos tam-
bm facilitam o reconhecimento de microrganismos por clulas fagocitrias,
permitindo que assim sejam ingeridos e digeridos, como ativam o sistema
complemento, potencializando a opsonizao, recrutando clulas inflama-
trias para o local da infeco e lisando certos microrganismos pela forma-
o dos poros em suas membranas (Figura 16).
Figura 16. Alguns mecanismos efetores da resposta mediada por anticorpos

Nesta resposta, a ativao das clulas B e sua diferenciao em clulas

plasmticas secretoras de imunoglobulinas deflagrada pelo antgeno especfico e
requer a participao de clulas CD4 Th2 (Figura 14), que tambm controlam a
mudana de isotipo e desempenham papel importante na hipermutao somtica, o
que necessrio para a maturao da afinidade dos anticorpos, que ocorre no curso
da resposta humoral. A imunoglobulina de superfcie funciona como receptor de
antgenos, ou BCR, e realiza dois papis na ativao: a transduo de sinal direto
para o interior da clula, quando se une ao antgeno e a conduo desses antgenos
aos stios intracelulares, para ser degradado e levado superfcie do linfcito B,
onde, por sua vez, so reconhecidos por CD4 Th2 antgenos especficos. Esta
resposta dependente da clula T chamada de timo-dependente (TD). Porm,
alguns antgenos, como os lipopolissacardeos (LPS) bacterianos, podem ativar
diretamente linfcitos B, e tal resposta chamada de timo-independente (TI).
Anticorpos de alta afinidade neutralizam toxinas, vrus e bactrias. Mas,
podem no resolver o problema, pois muitos agentes no so neutralizados pelos
anticorpos e devem ser removidos por outros meios. Assim, o papel dos anticorpos
nestas situaes ativar outras clulas (clulas efetoras acessrias), que tenham
receptores para Fc de Imunoglobulina. Dentre essas, podemos citar macrfagos e
neutrfilos, que ingerem bactrias recobertas por IgG; assim como as NK, que
lisam diretamente parasitos recobertos por IgG; e ainda clulas infectadas com vrus,
recobertas tambm com IgG. Tal fenmeno acontece por um mecanismo denomi-
nado citotoxidade celular, dependente de anticorpo (ADCC). Alm da ADCC,
via IgG, exercida pela NK, o mesmo fenmeno pode ser observado por meio da
IgE, onde as clulas citotxicas so os eosinfilos, e a importncia da ADCC via
IgE se deve ao fato de que alguns parasitos no so mortos diretamente por
fagocitose, somente atravs dos mediadores liberados por estas clulas. A IgE
tambm participa na sensibilizao e ativao de mastcitos promovendo liberao
de substncias que dilatam vasos sanguneos e recrutam clulas inflamatrias.
Imunologia | 61
9. Resposta imune aos agentes infectoparasitrios

O ambiente em que vivemos povoado por muitas espcies de
microrganismos onde uma pequena parcela tem a capacidade de causar
doenas. O sistema imune evoluiu no sentido de promover aes que
resultem na defesa contra estes microrganismos, contribuindo para a recu-
perao e manuteno da homeostase. Os agentes infectoparasitrios dife-
rem em sua patogenicidade e virulncia. A patogenicidade refere-se
capacidade de um organismo causar doena, e a virulncia o grau de
patogenicidade. Portanto, a patogenicidade depende das caractersticas do
agente, do estado imunitrio do hospedeiro e dos determinantes
socioambientais. Em indivduos com sistema imunitrio normal, os agentes
infectoparasitrios devem ser suficientemente virulentos para se estabelecer
e causar infeco. Por outro lado, indivduos com sistema imunitrio debili-
tado, agentes pouco virulentos, tais como os comensais, podem causar
leses graves. Neste tpico sero abordados os principais mecanismos de
resposta s aes dos vrus, bactrias, protozorios e helmintos que parasitam
o organismo humano.
Os vrus so microrganismos intracelulares obrigatrios, que se repli-
cam no interior das clulas e podem causar leso tecidual e doena, por
vrios mecanismos (Figura 17). A replicao viral interfere com a sntese e
com as funes normais das protenas celulares, levando leso da clula
infectada e morte. Este o efeito citoptico, e se diz que a infeco
ltica. Vrus no citopticos podem causar infeces latentes, durante as
quais residem nas clulas do hospedeiro e produzem protenas estranhas ao
mesmo tempo em que estimulam a imunidade especfica. Em decorrncia,
as clulas infectadas so reconhecidas e mortas pelas clulas CTL. As
protenas virais tambm podem estimular as reaes de hipersensibilidade
tardia (DTH), e a leso celular uma consequncia direta das respostas
imunes fisiolgicas contra os vrus.
Figura 17. Mecanismos pelos quais os vrus lesionam as clulas
Os principais mecanismos de imunidade inata aos vrus envolvem a

estimulao direta de IFN a/b pelas clulas infectadas, que funcionam inibindo
a replicao viral e lise das clulas infectadas pelas clulas NK. Alm desses
mecanismos, a ativao do sistema complemento e a fagocitose servem para
eliminar vrus de locais extracelulares. Na imunidade especfica, combina-se a
resposta celular com a resposta humoral. Os anticorpos especficos se ligam s
protenas do envelope ou do capsdeo, impedindo a fixao do vrus na clula
hospedeira e, consequentemente, impedindo sua penetrao (Figura 16).
Alm disso, os anticorpos IgG opsonizantes tambm podem potencializar a
remoo pela fagocitose (Figura 16) ou destruio das clulas infectadas atra-
vs da ADCC via clulas NK. Embora os anticorpos sejam importantes na
imunidade contra vrus, eles no so suficientes para eliminar infeces virais.
Imunologia | 63
Contudo, o principal mecanismo contra uma infeco viral estabelecida atra-

vs de uma resposta celular via CD8+ citolticos especficos, que destroem as
clulas infectadas, estimulam a ao de enzimas intracelulares que degradam
genomas virais e secretam citocinas com ao de interferon.
As bactrias extracelulares causam doena de duas maneiras: induzindo
reao inflamatria que resulta na destruio tecidual no local da infeco e
produzindo toxinas, que possuem diversos efeitos patolgicos. Estas podem
ser endotoxinas (componentes da parede celular bacteriana) ou exotoxinas
(ativamente secretadas pelas bactrias). Portanto, as respostas imunes contra
bactrias extracelulares visam eliminar a bactria e o efeito de suas toxinas.
O principal mecanismo de imunidade inata a fagocitose por neutrfilos,
moncitos e macrfagos, mas a resistncia destas bactrias fagocitose e a sua
digesto um determinante na virulncia. A ativao do sistema complemento
na ausncia do anticorpo importante, pois a produo de C3b opsoniza a
bactria e favorece a fagocitose. O MAC lisa diretamente a bactria e os
subprodutos do complemento (fragmentos menores), que participam da res-
posta inflamatria recrutando e ativando leuccitos. A imunidade humoral es-
pecfica a principal resposta protetora contra essas bactrias e consiste do
reconhecimento de antgenos proteicos por clulas CD4+ Th2, apresentados
via MHC de classe II. Os anticorpos especficos, alm de neutralizarem bact-
rias e suas toxinas, impedindo sua ligao s clulas alvo, ativam o sistema
complemento potencializando suas aes.
Quanto s bactrias que sobrevivem no interior de clulas hospedeiras,
as mais patognicas so aquelas que sobrevivem no interior dos macrfagos,
como as microbactrias. Por serem praticamente inacessveis aos anticorpos, sua
eliminao requer mecanismos diferentes daqueles observados para bactrias
extracelulares. O principal mecanismo de imunidade inata contra essas bactrias
atravs da fagocitose, mas estas podem ativar diretamente ou indiretamente
clulas NK, que promovem uma defesa precoce contra bactrias intracelulares
antes da resposta especfica. A principal resposta especfica contra essas bact-

rias a resposta celular, com atuao de clulas Th1 (CD4+ e/ou CD8+)
que estimulam os macrfagos a produzirem diversas substncias bactericidas.
Desta maneira, as clulas CD4+ Th1 e CD8+ Th1 atuam em conjunto na
resposta celular contra bactrias intracelulares e o mecanismo exercido por uma
pode complementar o da outra. importante salientar que a ativao de
macrfagos tambm pode causar leso tecidual, manifestada pela reao de
hipersensibilidade tardia (DTH ou HT), assim como as observadas nas infec-
es virais e em outros agentes infectoparasitrios.
Em termos muito genricos, os anticorpos so mais eficazes contra os
parasitos extracelulares e os CTLs, contra os intracelulares. Em outras pala-
vras, as citocinas produzidas pelas clulas T CD4+ podem ser importantes
na determinao do resultado da infeco, uma vez que as clulas Th1 e
Th2 possuem um perfil de citocinas contrastante e de contrarregulao,
mostrando que o papel das clulas Th1 e Th2 na determinao do resultado
da infeco sugere que as respostas das clulas Th1 levem morte dos
patgenos intracelulares e que as respostas das clulas Th2 eliminem os
patgenos extracelulares. Todavia, isto muito mais uma simplificao did-
tica do que o quadro real.
O tipo de resposta que conferir maior proteo depende da natureza
e da fase evolutiva do parasito. Por exemplo, o anticorpo por si s, ou
combinado com o complemento, pode danificar alguns parasitos extracelulares,
mas ser sempre melhor quando atuando com uma clula efetora. Diferentes
mecanismos efetores atuaro em uma nica infeco contra os diferentes estgi-
os do ciclo de vida do parasito. Assim, na malria, os anticorpos contra as
formas livres bloqueiam sua capacidade para invadir novas clulas, mas as
respostas mediadas por clulas impedem o desenvolvimento da fase heptica
nos hepatcitos. A imunidade protetora na malria no se correlaciona simples-
mente com os nveis de anticorpos e pode at ser induzida na ausncia deles.
Imunologia | 65
O parasito precisa superar os mecanismos de defesa preexistentes no

hospedeiro, para que possa se estabelecer com sucesso antes da iniciao da
resposta imune especfica do hospedeiro. O complemento exerce um papel
nesta fase, uma vez que vrios tipos de parasitos, incluindo os vermes adultos
e as larvas infectantes, possuem molculas em sua superfcie de revestimento
que ativam a via alternativa. Macrfagos, neutrfilos, eosinfilos e plaquetas
constituem a primeira linha de defesa. Anticorpos e citocinas, produzidos
especificamente em resposta aos antgenos parasitrios, potencializam as ativi-
dades antiparasitrias de todas estas clulas efetoras. Entretanto, os macrfagos
teciduais, moncitos e granulcitos possuem alguma atividade intrnseca antes
mesmo da potencializao.
Os tripanossomos e os parasitos da malria (plasmdios) que penetram
no sangue so removidos da circulao por clulas fagocticas no fgado e no
bao. Antes de agirem como clulas apresentadoras de antgenos na iniciao
de uma resposta imune, os macrfagos atuam como clulas efetoras que inibem
a multiplicao dos parasitos ou at mesmo os destroem. Estas clulas tambm
secretam molculas que regulam a resposta inflamatria e potencializam a imuni-
dade atravs da ativao de outras clulas. A fagocitose pelos macrfagos
fornece uma defesa importante contra os parasitos menores; entretanto, estas
clulas tambm secretam muitos fatores txicos que permitem a destruio dos
parasitos sem a internalizao. Quando ativados pelas citocinas, os macrfagos
podem destruir parasitos extracelulares relativamente pequenos, como os est-
gios eritrocitrios do plasmdio, e tambm os parasitos maiores, como os
estgios larvais do esquistossomo. Os macrfagos tambm atuam como clulas
exterminadoras atravs da ADCC.
A ativao dos neutrfilos e macrfagos uma caracterstica geral dos
estgios iniciais da infeco. Todas as funes efetoras dos macrfagos so
potencializadas logo aps a infeco. Embora sua ativao especfica seja induzida
por citocinas secretadas pelas clulas T, como IFNg, GM-CSF, IL-3 e IL-4,
mecanismos T-independentes tambm podem ativ-los. Neste caso, clulas

NK secretam IFNg quando estimuladas pela IL-12 produzida pelos macrfagos.
As propriedades efetoras exibidas pelos macrfagos tambm podem ser
apresentadas pelos neutrfilos. Os neutrfilos so clulas fagocticas que po-
dem destruir os agressores, seja por mecanismos dependentes de oxignio,
seja por independentes, como o xido ntrico. Os neutrfilos produzem uma
exploso oxidativa mais intensa do que os macrfagos e seus grnulos secretores
contm protenas altamente citotxicas. A destruio extracelular pelos neutrfilos
mediada por H202, enquanto os componentes granulares esto envolvidos
na destruio intracelular dos organismos internalizados. Os neutrfilos esto
presentes nas leses inflamatrias causadas por parasitos e provavelmente atuando
na eliminao desses parasitos das clulas rompidas. Como os macrfagos, os
neutrfilos possuem receptores para Fc e receptores para complemento e
podem participar das reaes citotxicas dependentes de anticorpo, a fim de
destruir as larvas de Schistosoma mansoni, por exemplo. Dessa forma, os
neutrfilos so mais destrutivos do que os eosinfilos para vrias espcies de
nematdeos, embora a eficcia relativa dos dois tipos celulares possa depender
do istipo e da especificidade do anticorpo.
Os eosinfilos esto associados a infeces helmnticas e se encontram
envolvidos especificamente na defesa contra os estgios teciduais de helmintos,
que so grandes demais para serem fagocitados. A reao do mastcito de-
pendente de IgE consta primariamente em localizar os eosinfilos prximos ao
parasito e, ento, potencializar suas funes antiparasitrias.
Os eosinfilos so clulas de menor potencial fagoctico perante os
neutrfilos, no entanto, sofrem um processo de desgranulao em resposta a
distrbios em sua membrana celular, liberando o contedo granular sobre a
superfcie dos parasitos. O dano aos helmintos pode ser causado pela protena
bsica principal (MBP). A MBP no especfica para um determinado alvo,
mas o dano s clulas do hospedeiro muito pequeno, uma vez que a
Imunologia | 67
protena fica confinada a um espao diminuto entre o eosinfilo e o verme.

Os eosinfilos e os mastcitos podem agir em conjunto na destruio das
larvas de helmintos, onde os produtos dos mastcitos potencializam a ao
dos eosinfilos. Desta forma, os antgenos liberados provocam desgranulao
local dos mastcitos dependentes de IgE e a liberao de mediadores, que
atraem seletivamente os eosinfilos para o local, potencializando ainda mais
suas atividades (Figura 18).
Figura 18. Expulso de helmintos parasitos do lume intestinal
A resposta imune contra Trypanosoma cruzi depende no apenas das

clulas T CD4+ e CD8+, mas tambm das NK e da produo de anticorpos.
O mesmo verdadeiro para a resposta imune contra o Toxoplasma gondii. As
clulas NK, estimuladas pela IL-12 secretadas pelos macrfagos, constituem
outra fonte de IFNg. As infeces crnicas normalmente esto associadas com
produo reduzida de IFNg e provavelmente explicam a alta incidncia de
tuberculose e toxoplasmose em pacientes com AIDS, os quais possuem nme-

ros reduzidos de clulas T CD4+.
Em algumas infeces parasitrias, o sistema imunitrio no consegue
eliminar o parasito, mas reage isolando o organismo com clulas inflamatrias.
O hospedeiro reage ao antgeno localmente, o que estimula a liberao de
citocinas, que por sua vez recrutam as clulas de defesa para o local afetado.
Na esquistossomose, a formao do granuloma outro exemplo da reao do
hospedeiro contra o parasito. Essa reao uma resposta crnica mediada por
clulas aos antgenos solveis liberados pelos ovos do parasito no fgado. Os
macrfagos se acumulam no local e liberam fatores fibrognicos que estimulam
a formao do tecido granulomatoso. Embora essa reao possa ser benfica
para o hospedeiro, no sentido que isola as clulas hepticas das toxinas secretadas
pelos ovos dos helmintos, tambm constitui a maior fonte de dano, provocan-
do alteraes irreversveis no fgado e perda da funo heptica.
Em muitas infeces a distino entre uma resposta mediada por clulas
ou por anticorpo pode ser difcil, dado que ambas atuam em conjunto contra o
parasito. A expulso de alguns nematdeos intestinais ocorre espontaneamen-
te poucas semanas aps a infeco primria. Parece haver dois estgios na
expulso, alcanados por uma combinao de mecanismos T-dependentes e T-
independentes. Clulas T (predominantemente Th2) respondem aos antgenos
do parasito e induzem a produo de anticorpo pelas clulas que sofreram
proliferao. Ocorre proliferao dos mastcitos da mucosa e hiperplasia das
clulas caliciformes secretoras de muco no epitlio intestinal. Os vermes so
danificados por anticorpo e produtos dos mastcitos sensibilizados por IgE,
que desgranulam aps o contato com o antgeno e liberam a histamina que,
por sua vez, aumenta a permeabilidade do epitlio intestinal onde o verme se
encontra. Esses processos no so suficientes para eliminar os vermes; portan-
to, molculas inflamatrias inespecficas, secretadas pelos macrfagos, incluin-
do TNF e IL-1, contribuem para a proliferao das clulas caliciformes e
Imunologia | 69
provocam aumento na secreo de muco. O muco reveste os vermes e leva

sua expulso.
Existem inmeros exemplos de estratgias fsicas simples e protetoras nos
parasitos. Os nematdeos possuem uma cutcula extracelular espessa que os
protege da agresso txica. O tegumento dos esquistossomos sofre um
espessamento durante a maturao, oferecendo uma proteo semelhante. A
superfcie frouxa de revestimento de muitos nematdeos pode se desintegrar
sob o ataque imune.
A maioria dos parasitos interfere na resposta imune e a imunossupresso
uma caracterstica universal da infeco parasitria, comprometendo tanto as
respostas mediadas por anticorpo como as mediadas por clulas.
Os antgenos solveis dos parasitos, quando liberados em enormes
quantidades, podem prejudicar a resposta do hospedeiro por um processo
denominado distrao imune. Assim, os antgenos solveis de vrios agentes
infectoparasitrios parecem inativar os anticorpos circulantes, fornecendo uma
cortina de fumaa e desviando o anticorpo do parasito. Muitos destes
antgenos de superfcie liberados so formas solveis de molculas inseridas na
membrana do biopatgeno.
Alm dos efeitos destrutivos diretos de alguns parasitos e de seus produtos
aos tecidos do hospedeiro, muitas respostas imunes, por si s, possuem efeitos
patolgicos. Na malria, na tripanossomose e na leishmaniose visceral, o nmero e a
atividade aumentados dos macrfagos e linfcitos, no fgado e no bao, levam ao
aumento de tamanho destes rgos. Na esquistossomose, grande parte da patolo-
gia resulta dos granulomas dependentes de linfcitos que se formam ao redor dos
ovos no fgado. As alteraes significantes que ocorrem nos indivduos com elefantase
so provavelmente resultado de respostas imunopatolgicas s larvas adultas nos
linfticos. A formao de complexos imunes comum, eles podem ser depositados
nos rins, como na sndrome nefrtica da malria, e podem dar origem a vrias outras
alteraes patolgicas.
A IgE das infeces helmnticas pode promover desde efeitos bran-

dos reaes severas no hospedeiro, por meio da liberao de mediado-
res pelos mastcitos, caracterizados por pruridos, eritemas, dificuldades
respiratrias ou mesmo choque anafiltico.
10. Aplicao e importncia do diagnstico

imunosorolgico das doenas infecto parasitrias
O diagnstico sorolgico das doenas transmissveis consiste na in-
vestigao da infeco no indivduo ou na populao, mediante a deteco,
quantificao e caracterizao de variveis (imunoglobulinas, antgenos,
citocinas) presentes no plasma/soro sanguneo ou em outros materiais bio-
lgicos, tais como amostra fecal, urina, saliva, escarro ou tecidos.
O desenvolvimento de novas informaes cientficas est relacionado
com os progressos na metodologia pelo desenvolvimento de novos proce-
dimentos, novas tcnicas ou instrumentos. Os primeiros mtodos de iden-
tificao e medida de imunoglobulinas foram desenvolvidos por Von Behring
& Kitasato, influenciados pelos experimentos de Pasteur sobre a Teoria dos
Germes, ao encontrarem no soro de animais imunizados contra difteria e
ttano, substncias neutralizantes e especficas que denominaram anticorpos.
As pesquisas desenvolvidas por vrios cientistas se voltaram imediatamente
para a caracterizao bioqumica dessas substncias neutralizantes e o de-
senvolvimento de tcnicas capazes de induzir a formao de elevadas con-
centraes de anticorpos em animais de laboratrio. Este foi o perodo
fundador do diagnstico sorolgico.
Neste tpico, as tcnicas sorolgicas sero abordadas, principal-
mente, sob o ponto de vista dos profissionais que realizam o diagnstico
sorolgico das doenas infectoparasitrias.
Imunologia | 71
10.1. Aplicaes dos testes sorolgicos

Os testes sorolgicos vm sendo constantemente empregados para
auxiliar na confirmao diagnstica das suspeitas clnicas de infeces, permi-
tindo a obteno de resultados em curto espao de tempo, em funo de
algumas caractersticas que incluem a simplicidade de execuo, baixo custo
operacional e a possibilidade de automao. Suas contribuies, entretanto,
so inestimveis, principalmente quando o patgeno, ou seus produtos,
dificilmente podem ser demonstrados nos fluidos biolgicos ou na estrutura
hstica do hospedeiro.
Estes mtodos so utilizados na qualificao e quantificao de diversos
componentes, incluindo antgenos, anticorpos, imunocomplexos, enzimas e
hormnios, entre outras molculas relacionadas ao processo inflamatrio. O
conhecimento dos fundamentos gerais para adequada aplicao e criteriosa
interpretao dos resultados exige que estas tcnicas sejam realizadas por pro-
fissionais bem treinados, a fim de se prevenir a ocorrncia dos falsos resulta-
dos, que conduzem para o diagnstico e tratamento incorretos dos pacientes.
O mtodo sorolgico pode ser qualitativo ou quantitativo. O mtodo
qualitativo indica uma resposta do tipo ou tudo ou nada, por exemplo:
aglutinou ou no aglutinou, infectado ou no infectado. O ensaio quantitativo
mede a concentrao de antgeno ou anticorpos, podendo ser expressa sob a
forma de cruzes, titulaes, densidades ticas em reaes fotocolorimtricas ou
outras unidades de medida que se aplicam. A expresso do resultado sob a
forma de cruzes, ou por titulaes, que correspondem a maior diluio em que
ainda se observa a reao antgeno-anticorpo, bastante subjetiva, por retratar
a intensidade de uma reao determinada visualmente por critrios pessoais. A
utilizao de aparelhos que realizam a leitura automtica das reaes sorolgicas
traduz em nmeros os resultados obtidos de maneira visual, reduzindo, por um
lado, a probabilidade dos erros, mas por outro, elevando (em alguns casos) o
custo do exame laboratorial.
10.2. A importncia do diagnstico individual

O indivduo sintomtico ou assintomtico com nveis de anticorpos
especficos detectveis denominado soropositivo. Aquele que no pos-
sui anticorpos detectveis o soronegativo. No caso do indivduo diag-
nosticado soronegativo (em uma primeira anlise), que ao reavaliar a pri-
meira amostra junto com uma segunda, de coleta mais recente (processo
conhecido como sorologia pareada), e no caso de resultado da primeira
amostra se repetir e a segunda resultar positiva, diz-se que ocorreu
soroconverso. O diagnstico individual normalmente se realiza com a
finalidade de elucidar processos patolgicos com sinais e sintomas comuns
a vrias doenas, procedimento este denominado diagnstico diferencial.
Como exemplos, podem-se distinguir sorologicamente doenas como a
leishmaniose tegumentar difusa e a hansenase lepromatosa, a leishmaniose
visceral e a hepatite viral, a hepatite B e a hepatite C, a toxoplasmose e a
rubola, entre outras.
Em algumas situaes torna-se importante determinar a fase clnica
da doena, principalmente aquelas em que os patgenos possuem habili-
dade para atravessar a barreira placentria e gerar embriopatias ou fetopatias.
A presena de anticorpos especficos uma evidncia da exposio atual
ou anterior aos agentes infecciosos, caracterizada pela diversidade funcio-
nal das vrias classes de imunoglobulinas e a ordem em que se apresentam
nos fluidos biolgicos. Determinada por fatores genticos, a IgM, regra
geral, a primeira a apresentar nveis que possibilitam a deteco aps
estmulo imunognico e caracterizar fase inicial na maioria das infeces. O
seu decrscimo compensado pelo surgimento da IgG, normalmente en-
contrada ao final de um processo agudo, permanecendo durante a fase
crnica, e podendo ser detectada durante longo perodo no plasma do
hospedeiro, mesmo aps a cura, como imunoglobulina de memria. Nor-
Imunologia | 73
malmente, nas solicitaes de exame laboratorial, pedem-se a pesquisa de

IgM e IgG especficas. Porm, em infeces recentes por Toxoplasma
gondii ou por citomegalovrus, a IgM e IgG podem eventualmente resultar
negativas, mas a IgA positiva pode corrigir falhas no diagnstico. Por estas
razes, imunoglobulinas como a IgE e a IgA especficas tm sido pesquisadas
e utilizadas com maior preciso na determinao de fase inicial das infec-
es, uma vez que possuem vida mdia menor e permanecem na circulao
aps o incio do processo infeccioso, por um perodo ainda mais curto que
o da IgM.
Os testes sorolgicos so tambm utilizados para verificao do po-
tencial de virulncia e de invasividade dos enteroparasitos. A Entamoeba
histolytica, por exemplo, enquanto parasita o lume intestinal, parece no
induzir, ou pouco induz, a formao de anticorpos especficos. Por outro
lado, a ulcerao, a penetrao tecidual e a consequente multiplicao e
disseminao deste parasito no hospedeiro, pode proporcionar elevados
ttulos de IgG anti ameba no plasma sanguneo, facilmente detectveis.
Alm das imunoglobulinas, as Protenas de Fase Aguda (PFA),
presentes normalmente em baixas concentraes no plasma sanguneo, alte-
ram-se em resposta aos estmulos inflamatrios aps leso tecidual ou infec-
o. Em linhas gerais, as PFA constituem um vasto nmero de protenas
plasmticas de origem heptica, cuja sntese aumenta em 25% ou mais e
podem ser classificadas em funo do incremento de sua produo aps
estmulo inflamatrio (Quadro 1). Tradicionalmente, a quantificao da
Protena C Reativa (PCR) na prtica clnica tem vrios objetivos, entre
eles, a avaliao da extenso e a atividade da inflamao, o que permite o
acompanhamento do processo patolgico, diferenciao entre doena in-
flamatria e no inflamatria e estimativa de seu respectivo prognstico.
Quadro 1. Caractersticas cinticas das protenas de fase aguda

Protenas de fase aguda Tempo de resposta entre estmulo Peso molecular (kDa)
e elevao dos nveis plasmticos
Grupo 1: aumenta menos de uma vez
Ceruloplasmina 48-72 horas 132
C3 48-72 horas 180
C4 48-72 horas 206
Grupo II: aumenta de duas a quatro vezes

a-1- glicoprotena cida 24 horas 41
a-1 - antitripsina 10 horas 54
a-1 - antiquimotripsina 10 horas 68
Haptoglobina 24 horas 86
Fibrinognio 24 horas 340
Grupo III: aumenta acima de cinco mil vezes

Protena C reativa 6-10 horas 110
Encefalites virticas, citomegalia, 2-10 horas 180
herpes sistmica e tuberculose
Amiloide srico A
Os testes sorolgicos tambm so utilizados para selecionar doado-

res e receptores de sangue e de rgos, no s no contexto de quem
desempenha a determinao de grupos sanguneos ou antgenos de
histocompatibilidade, como tambm para quem se compromete na deteco
e preveno de doenas infecciosas transmissveis por meio da transfuso
sangunea e hemoderivados, como tecidos e rgos transplantados. No
Brasil, o Ministrio da Sade estabeleceu estratgias de controle apoiadas
na triagem clnica, epidemiolgica e sorolgica para preveno das doenas
transfusionais, que incluem a doena de Chagas, a sfilis, as hepatites B e
C, a sndrome de imunodeficincia adquirida (SIDA/AIDS), o vrus da
leucemia T do adulto (HTLV-I e II), em todo o territrio nacional, e a
malria, em regies endmicas. As condies que constituem contraindicao
absoluta para doao de rgos, relacionadas s doenas infecciosas, alm
das empregadas na preveno de doenas transmissveis por meio da transfu-
Imunologia | 75
so sangunea e hemoderivados, incluem avaliao laboratorial de septice-

mia bacteriana ou fngica, ativa.
As molculas liberadas pelo parasito e os anticorpos correspondentes
encontrados no hospedeiro so chamados de marcadores sorolgicos. Estes
marcadores podem ser utilizados para avaliar o prognstico de doenas e alguns
marcadores indicam evoluo para cura, enquanto outro agravamento. Baseando-
se nestes princpios, pode-se avaliar a eficcia teraputica.
Os anticorpos protetores, induzidos por parasitos em processos
infecciosos ou por vacinas, podem ser pesquisados e utilizados como
marcadores para avaliar a imunidade especfica, naturalmente adquirida
ou artificialmente induzida por vacinas. Os testes sorolgicos realizados
em paciente pr-natal so de fundamental importncia na pesquisa de
doenas congnitas, como a toxoplasmose, a sfilis, a citomegalia, entre
outras; e na avaliao da imunidade especfica, principalmente para do-
enas imunoprevinveis com a aplicao de vacinas (hepatite B, rubola,
difteria, ttano).
10.3. A importncia do diagnstico coletivo

A aplicao dos testes sorolgicos em inquritos epidemiolgicos
denomina-se soroepidemiologia e serve para estimar a soroprevalncia,
que corresponde ao nmero de indivduos positivos em um perodo de
tempo determinado, sem distinguir os casos novos dos antigos. Como a
soroprevalncia est intimamente relacionada com a taxa de infeco e a
permanncia dos anticorpos circulantes, este indicador auxilia nos seguintes
propsitos em relao s doenas infectoparasitrias: estabelecer prevalncia
sorolgica, identificar os principais problemas sanitrios, estabelecer priori-
dades de vacinao, demarcar a distribuio e verificar a erradicao de
doenas, verificar a reintroduo de doenas em reas consolidadas, deter-
minar a periodicidade das epidemias, avaliar as campanhas de vacinao,
investigar enfermidades descobertas recentemente (doenas emergentes) e

estimar as perdas econmicas atribudas enfermidade.
Testes sorolgicos tambm so aplicados na anlise do contedo
intestinal de insetos hematfagos, para identificao das fontes alimentares
dos vetores envolvidos na transmisso de doenas. Estabelecer o padro
alimentar dos insetos hematfagos de grande importncia para o entendi-
mento de sua biologia, alm de possuir valor fundamental para a Sade
Pblica, no delineamento de estratgias de controle de vrios agravos
gerados por esses vetores.
11. Fundamentos gerais do imunodiagnstico

A pesquisa laboratorial da resposta imune pode ser empregada para
a verificao da resposta humoral e da resposta celular. A pesquisa da
resposta humoral pode ser realizada de duas maneiras. Uma dessas manei-
ras refere-se ao emprego de anticorpos especficos para identificar um
antgeno parasitrio ou outras substncias que desempenham o papel de
antgenos na reao, tais como drogas, hormnios, cidos nuclicos,
citocinas, receptores de clulas, etc. Uma outra maneira a deteco de
anticorpos especficos na amostra a ser testada, passvel de determinar se
um indivduo foi exposto a um organismo especfico. A medida das interaes
entre antgeno-anticorpo com o propsito de diagnstico conhecida
como imunosorologia.
As tcnicas imunossorolgicas fundamentam-se na natureza da
interao antgeno-anticorpo, nas quais podem expressar-se de duas formas
distintas, em decorrncia da utilizao de imunorreagentes livres de marca-
o ou de reagentes marcados. As tcnicas em que no se empregam
marcadores demonstram-se por fenmenos visveis. Portanto, ao se combi-
nar anticorpos com antgenos solveis, os complexos resultantes podem
Imunologia | 77
formar precipitados insolveis. Se os antgenos so particulados (bactrias,

protozorios, hemcias), os anticorpos os aglutinam. Se o anticorpo pode
ativar a via clssica do sistema complemento e o antgeno se encontra em
uma superfcie celular, o resultado pode ser a citlise. As tcnicas que
empregam imunorreagentes marcados caracterizam-se pela simples combina-
o do antgeno com o anticorpo, necessitando que um deles esteja marca-
do convenientemente. O imunorreagente pode ser marcado com corantes
fluorescentes ou quimioluminescentes, radioistopos, enzimas, ouro ou
prata coloidais, entre outros marcadores.
11.1 Reaes de precipitao

As reaes de precipitao ocorrem entre antgenos solveis e seus
anticorpos correspondentes, com formao de agregados insolveis que se
precipitam. Os determinantes mais importantes das reaes de precipitao
consistem nas concentraes relativas de antgeno e anticorpo. Esta relao
ilustrada esquematicamente na Figura 19. Ocorre precipitao mxima
quando a quantidade se antgenos e de anticorpos so equivalentes (zona
de equivalncia), com quantidades decrescentes nas zonas de excesso de
antgeno ou excesso de anticorpo. O fenmeno de prozona refere-se
precipitao subtima, invisvel aos nossos olhos, que ocorre na regio de
excesso de anticorpo. Portanto, necessrio que diluies de antissoros
reajam com quantidades fixas de antgeno a fim de obter o mximo de linha
de precipitao. O fenmeno de prozona pode ser responsvel pelo apa-
recimento de resultados falso-negativos em outros testes sorolgicos, alm
dos testes de precipitao, como nas reaes de aglutinao. Existem
vrios sistemas disponveis para a prtica da reao de precipitao, dentre
estes, destacam-se a precipitao em meios lquidos, meios semisslidos,
como gar ou agarose, e outros suportes, tais como o acetato de celulose.
Figura 19. Curva de formao de imunocomplexos visveis
11.2. Reao de precipitao em meio lquido

Conhecida tambm como tcnica da precipitina ou tcnica do anel,
a reao de precipitao em meio lquido (Figura 20) consiste em se
colocar em tubos de ensaio ou em tubos capilares uma soluo de anticorpos
conhecidos (soro hiperimune) e sobre ela se adicionar, cuidadosamente, a
soluo antignica que se deseja pesquisar, de modo a constituir-se uma
interface entre ambas. As molculas da soluo antignica iro difundir-se
atravs da outra soluo, formando um gradiente de concentrao. Ao
nvel em que a equivalncia antgeno/anticorpo for a ideal, se formar uma
faixa de precipitado visvel (um anel de turvao branco leitoso na interface).
Imunologia | 79
Figura 20. Imunodifuso em meio lquido (Teste de Precipitina)
11.3. Reao de imunodifuso simples em meio semisslido

Neste sistema, tambm chamado imunodifuso unidirecional ou tcnica
de Oudin, a soluo antignica sobreposta a uma coluna de gar, em um
tubo de 35 a 45 mm de altura contendo o soro hiperimune. As molculas de
antgeno penetram no gel e se difundem com velocidade caracterstica para
cada espcie molecular (coeficiente de difuso) influenciada pela concentrao
do gel. Ao final de certo tempo de difuso, que em geral de uma semana,
cada antgeno ter formado, com o seu anticorpo correspondente, um disco
ou zona de precipitao.
11.4. Reao de imunodifuso dupla

(imunodifuso de OUCHTERLONY)
Em uma delgada camada de gel sobre uma lmina de vidro escavam-se
pequenos orifcios. Em um deles, coloca-se soro ou plasma e, em outro
orifcio, coloca-se o antgeno. Um difunde em direo ao outro, formando
precipitados brancos em forma de linhas ou arcos, tambm chamados de
bandas de precipitao (Figura 21). Quando a concentrao de antgenos e

anticorpos muito pequena, as bandas no so visveis, necessitando, nesse
caso, que se use soluo corante para protenas. Quando necessrio, corar o
gel para visualizar as bandas deve-se retirar do gel os imunorreagentes que no
formaram imunocomplexos (imunorreagentes solveis) por processos de lava-
gem com soluo fisiolgica. O imunocomplexo (agregado insolvel), em
funo do seu tamanho efetivo, fica retido nas malhas do gel, onde, em
seguida, submetido ao corante adequado, o que possibilita a visualizao
das bandas quando formadas. A velocidade de difuso de cada imunorreagente
regida pelas leis da difuso e depende da concentrao e do tamanho dos
poros do gel, da temperatura, da concentrao do gar e de sua pureza.
Figura 21. Representao esquemtica da reao de imunodifuso dupla

Ouchterlony.
Imunologia | 81
11.5. Reao de imunodifuso radial simples

(imunodifuso de MANCINI)
Nesta tcnica, o anticorpo especfico para determinado antgeno in-
corporado ao gel e distribudo sobre uma lmina de vidro ou placa de Petri.
Em posies adequadas, so feitos orifcios onde se colocam solues antignicas
a serem testadas, bem como solues padro, com pelo menos trs concentra-
es conhecidas do antgeno. A partir desse momento, ocorre difuso radial
do antgeno, resultando na opacificao em forma circular (halo ou anel) em
torno do orifcio. O dimetro deste anel de precipitao proporcional
concentrao do antgeno e, deste modo, a quantidade deste pode ser deter-
minada por comparao com os dimetros obtidos por padres conhecidos
por meio de uma curva de referncia.
11.6. Reao de imunoeletroforese (mtodo de

GRABAR e WILLIAMS)
A imunoeletroforese uma tcnica de imunoprecipitao em meio gela-
tinoso que combina a eletroforese com a imunodifuso radial. A tcnica
realizada em duas etapas: na primeira, os antgenos so fracionados por
eletroforese, enquanto na segunda etapa, ocorre a difuso dos antgenos
contra o antissoro especfico, presente nas canaletas abertas no gel. A reao
antgeno-anticorpo nesse sistema evidenciada pela formao de linhas ou
bandas de precipitao no gel, correspondendo cada banda a um complexo
imune especfico.
11.7. Reao de imunoeletroforese unidimensional simples

Tambm conhecida como eletroforese de foguete ou tcnica de
Laurell, a imunoeletroforese unidimensional utiliza antissoro especfico para
o antgeno, ou o anticorpo que se quer quantificar, incorporado ao gel de
agarose, que colocado em lminas de vidro. Assim como na tcnica de
Grabar e Williams, o pH do gel determinado de modo que a molcula a

ser analisada fique com carga negativa, migre para o polo positivo e a
substncia incorporada no migre ao gel. As amostras a serem quantificadas,
bem como os controles, so distribudos em pequenos orifcios do gel e
submetidos eletroforese. A partir dos orifcios de aplicao, formam-se
cones de precipitao, cujas extenses variam de acordo com as concentra-
es das substncias pesquisadas. O padro de precipitao se assemelha
a um foguete, por se formar nas margens laterais do curso da migrao
eletrofortica, at que se esgote a substncia em anlise, resultando na
convergncia das margens laterais em forma de ponta.
11.8. Reao de contraimunoeletroforese

Tambm chamada de eletroimunodifuso dupla unidimensional. Nesta
tcnica, antgenos e anticorpos migram por eletroforese, simultaneamen-
te, em direes opostas, a partir de orifcios separados do gel, no mes-
mo eixo, resultando na precipitao no ponto de encontro dos
imunorreagentes entre os orifcios. Para a realizao deste mtodo,
antgenos e anticorpos devem apresentar diferentes mobilidades
eletroforticas. Os anticorpos possuem propriedades de migrar para o
polo negativo (ctodo) em um campo eltrico, enquanto os antgenos
devem ser previamente tratados com soluo tampo de pH adequado
para otimizar os efeitos eletroendosmticos que orientem sua migrao
para o polo positivo (nodo). Este fenmeno pode ser induzido com o
uso de tampes alcalinos (Figura 22). Este mtodo permite a realizao
de vrias anlises em uma nica lmina, fornece resultados mais rpidos e
mais sensveis que a imunodifuso convencional e pode ser realizado em
outros suportes, como o acetato de celulose.
Imunologia | 83
Figura 22. Representao esquemtica da reao de contraimunoeletroforese
11.9. Reaes de aglutinao

A aglutinao a formao de redes de clulas ou partculas inertes
(ltex ou gelatina), interligadas por pontes moleculares de anticorpos, que se
combinam simultaneamente com dois determinantes antignicos nas superfcies
de clulas ou partculas adjacentes.
11.10. Reao de aglutinao direta

A aglutinao direta a formao de agregados suficientemente grandes
que ocorre entre partculas insolveis, em sua forma ntegra ou fragmentada,
contendo antgenos naturais de superfcie. Hemcias, bactrias, fungos e
protozorios podem ser aglutinados diretamente por anticorpos, os quais,
sendo bivalentes, formam pontes, ligando determinantes antignicos nas super-
fcies de partculas vizinhas. Para se detectar anticorpos especficos, diluies
seriadas das amostras so postas para reagir junto a uma quantidade constan-
te de antgeno. Aps um perodo de incubao, a reao se concretiza
(Figura 23) e o resultado geralmente expresso como ttulo da amostra, ou

seja, a mxima diluio em que ocorre aglutinao.
Figura 23. Representao esquemtica da reao de aglutinao direta
11.11. Reao de inibio da aglutinao

direta de hemcias por antgenos virais
Diversos antgenos virais encontram receptores na superfcie de
hemcias, principalmente hemcias avirias, e induzem sua aglutinao. Esta
propriedade particular de muitos vrus aproveitada para a titulao de
anticorpos produzidos contra esses antgenos virais, na vigncia dos pro-
cessos infecciosos ou na convalescena, para fins diagnsticos e de seg-
mento evolutivo.
Todas as reaes de inibio baseiam-se na competio, seja de dois
determinantes antignicos semelhantes por um mesmo stio de combinao
ou de dois anticorpos diferentes por um mesmo determinante antignico.
A reao se efetua entre os imunorreagentes que formam o composto mais
estvel. Neste caso, o soro do paciente, contendo anticorpos especficos,
em diluio seriada, misturado a quantidades fixas de antgeno viral pa-
dronizado, sendo incubado a 37 0C e, em seguida, as hemcias so adici-
onadas (Figura 24). Verifica-se at qual diluio houve neutralizao, ou
seja, inibio da propriedade aglutinante para hemcia.
Imunologia | 85
Figura 24. Representao da inibio da aglutinao viral das hemcias
11.12. Reao de aglutinao passiva de

hemcias e suportes inertes
A reao se baseia na aglutinao de hemcias ou de partculas inertes
(ltex, gelatina) que funcionam como suporte, recobertas por um antgeno
especfico solvel, em presena de amostra de soro ou plasma contendo os
anticorpos correspondentes. A formao de pontes de anticorpos entre as
partculas adjacentes indica a ocorrncia da reao (Figura 25).
Figura 25. Esquema da reao de aglutinao passiva de hemcias e suportes inertes
11.13. Reao de inibio passiva de partculas inertes (ltex)

Partculas de ltex tendo antgenos ancorados sua superfcie podem
ser aglutinadas pela formao de ponte anticrpica, do mesmo modo que a
aglutinao direta de hemcias, como j foi exposto. No entanto, ao se
misturar antgenos solveis aos soros contendo anticorpos, haver bloqueio

dos stios de combinao das molculas de anticorpo e inibio da
aglutinao.
11.14. Reao de fixao do complemento

A fixao do complemento ocorre aps a interao antgeno-
anticorpo. O consumo de complemento in vitro pode ser utilizado como
um teste para detectar e medir concentraes de anticorpos e antgenos. A
reao se manifesta em trs momentos: no primeiro, o antgeno se combina
com o anticorpo. No segundo, se os imunocomplexos estiverem presen-
tes, os componentes do sistema complemento ligam-se, sendo assim con-
sumidos. Finalmente, adiciona-se o sistema revelador que consiste de hemcias
de carneiro sensibilizadas com hemolisina (anticorpo antieritrocitrio). Aps
um perodo de incubao, observa-se se ocorreu ou no lise das hemcias
sensibilizadas e a atividade hemoltica pode ento ser medida, a fim de se
determinar a quantidade do imunorreagente pesquisado (Figura 26).
Ao se pesquisar a presena de anticorpos em fludos biolgicos, a
ausncia de lise do sistema hemoltico indica a sua presena na amostra,
pois como os principais componentes do sistema complemento foram
consumidos na lise do imunocomplexo inicial, no estaro disponveis
para a lise do sistema hemoltico e a reao ser positiva.
Tanto os anticorpos como os antgenos devem ser destitudos de
atividade anti-complementar para no ativar o complemento, indepen-
dentemente do imunocomplexo. O complemento obtido de soro de
cobaia, colhido e estocado de maneira apropriada para preservar a ativi-
dade hemoltica.
Imunologia | 87
Figura 26. Representao da reao de fixao de complemento
11.15. Reaes de imunofluorescncia

A tcnica de imunofluorescncia foi descrita pela primeira vez por
Albert H. Coons e seus colaboradores, em 1941. Estes pesquisadores
objetivavam empregar corantes em tcnicas sorolgicas e utilizaram para
isso, alm dos corantes comuns, radicais fluorescentes.
Neste perodo, j era conhecida a capacidade dos anticorpos de se
ligarem a radicais qumicos sem perder sua caracterstica de reconhecimento
e ligao aos antgenos. J haviam sido descritos trabalhos utilizando con-
jugados de anticorpos e corantes em tcnicas de aglutinao. O produto
resultante desta conjugao no s mantinha suas propriedades aglutinantes
originais como ainda coloria os grumos aglutinados. Porm, esta colorao
foi considerada de fraca intensidade, o que levou Coons a optar pelos
corantes fluorescentes.
Uma das grandes vantagens da tcnica a intensa luminosidade emi-
tida por quantidades muito pequenas de corantes fluorescentes, permitin-
do identificar estruturas fluorescentes entre vrias outras estruturas presen-

tes em cortes de tecidos ou esfregaos.
A tcnica de imunofluorescncia representou um grande avano no
imunodiagnstico, principalmente no que diz respeito sorologia. At a elabo-
rao deste mtodo, as reaes ocorridas entre antgeno e anticorpo s podiam
ser evidenciadas atravs de reaes secundrias, como a precipitao ou a
aglutinao, que geram fenmenos decorrentes da formao de imunocomplexos
em grande quantidade ou utilizando partculas relativamente grandes. Uma das
vantagens da imunofluorescncia foi o fato de ter maior sensibilidade que os
mtodos existentes na ocasio, permitindo distinguir uma nica clula bacteriana
corada por fluorescena entre 107 bactrias no coradas.
S foi possvel o desenvolvimento da tcnica de imunofluorescncia
devido a caractersticas especiais que algumas substncias possuem de armaze-
nar energia luminosa e liber-la mais tarde. A este fenmeno foi dado o nome
de luminescncia. Se a substncia capaz de armazenar e emitir luminescncia
por perodos mais longos, chama-se ento fosforescncia; se o perodo de
emisso da luminosidade mais curto, chama-se a isso fluorescncia. Entre os
corantes fluorescentes mais utilizados destacam-se a rodamina (isotiocianato de
tetrametil rodamina TRICT) e a fluorescena (isotiocianato de fluorescena
FITC), esta ltima supera a primeira por possuir maior eficincia quntica, ou
seja, maior capacidade de absoro e de emisso de luminosidade. Porm,
com a modernizao dos equipamentos, no s de microscpios como tam-
bm de citmetros, foram feitas modificaes para aumentar a eficincia quntica
dos demais corantes para utiliz-los em testes que buscam mais de um marcador
em superfcies celulares.
A intensidade da luz emitida por este corante sofre grande interferncia
do meio em que ele se encontra. O pH um dos fatores que mais interfere,
pois h um mnimo de fluorescncia em pH cido e mxima fluorescncia em
Imunologia | 89
pH alcalino, por isso o material deve ser montado em glicerina tamponada

alcalina antes da observao em microscpio de fluorescncia.
Para se obter bons resultados com as tcnicas imunofluorescentes,
fundamental a utilizao de um bom microscpio tico equipado com acess-
rios e filtros que permitam a boa visualizao e captao da fluorescncia.
Atualmente, existem vrios modelos de variadas procedncias. Para a escolha
do equipamento que mais se adapte s necessidades do laboratrio, deve-se
ter em mente qual o objetivo do teste, que tipo de material ser utilizado
como antgeno ou como amostra (para que seja feita a escolha das objetivas e
oculares), qual o corante ou corantes que sero utilizados (para que sejam
definidos os filtros do equipamento), quantos exames sero realizados em
mdia e quantas vezes por semana, uma vez que tal escolha ir interferir na vida
til e escolha da lmpada a ser utilizada, entre outros fatores.
A ligao qumica de anticorpos a corantes d origem a um composto
chamado conjugado, que associa a capacidade de reconhecimento e ligao
do primeiro s propriedades corantes do segundo, sem que ocorra nenhum
tipo de prejuzo para ambos. Apesar de processo de conjugao ser relativa-
mente simples, h uma srie de cuidados que precisam ser seguidos devido s
variaes que podem ocorrer em cada um dos reagentes a cada associao.
Um dos cuidados principais a imunizao dos animais com os antgenos mais
purificados possveis para evitar a reatividade cruzada com outros antgenos.
Atualmente existem no mercado compostos conjugados de extrema pureza e
alta especificidade, direcionados contra os mais variados antgenos e que aten-
dem perfeitamente s necessidades da grande maioria dos laboratrios.
A partir do mtodo descrito por Coons e seus colaboradores, sugiram
numerosas variaes, das quais, a imunofluorescncia direta foi a mais simples
e a primeira a ser descrita. Nesta tcnica, o conjugado reage diretamente com
antgenos presentes na superfcie de clulas (Figura 27). Como esta tcnica se
presta pesquisa de substncias que atuam como antgenos para o conjugado,
torna-se necessria, a cada procura de um antgeno diferente, a produo de

um conjugado diferente. Alm disso, de todas as variaes da imunofluorescncia,
esta a menos especfica, j que principalmente em tecidos ou esfregaos,
devido grande quantidade de material na amostra, pode ocorrer a presena
de antgenos homlogos ao que se est pesquisando. Quando se trata de
clulas ntegras, h certa facilidade no reconhecimento, porm em fragmentos
celulares ou estruturas muito pequenas necessrio grande conhecimento e
intenso treinamento para diminuir a inespecificidade.
Esta variao do mtodo ainda bastante aplicada no diagnstico de
infeces por Chlamydia trachomatis em esfregaos cervicais e uretrais. Este
mtodo tambm foi largamente utilizado na identificao de antgenos do
MHC e na tipagem de linfcitos B e linfcitos T.
Figura 27. Esquema da reao de imunofluorescncia direita
Outra variedade do mtodo a imunofluorescncia indireta. Nesta

modalidade, pode-se realizar a pesquisa de anticorpos contra os mais variados
antgenos. O conjugado uma imunoglobulina que reconhece a outra
Imunologia | 91
imunoglobulina como antgeno, ou seja, uma anti-imunoglobulina ou anticorpo

secundrio (Figura.28). A vantagem deste mtodo que o anticorpo pode
estar ancorado superfcie de qualquer antgeno e ainda assim ser reconheci-
do pelo conjugado. Assim, um nico conjugado pode ser utilizado na pesqui-
sa de anticorpos contra vrias infeces diferentes, tornando o mtodo mais
barato. Uma vez que o reconhecimento de uma imunoglobulina por outra se
d pela regio estvel do fragmento cristalizvel (poro Fc), a ligao
espcie especfica, conferindo ao mtodo grande especificidade. Ele tambm
mais sensvel do que o mtodo direto, porque existem normalmente mais
epitopos na imunoglobulina para o conjugado se ligar. Quanto maior a quanti-
dade de conjugado maior ser a emisso de fluorescncia.
Figura 28. Esquema da reao de imunofluorescncia
Esta modalidade do mtodo auxilia o diagnstico de vrias doenas e

permite a pesquisa de diferentes isotipos de imunoglobulinas, sendo que,
neste caso, h a necessidade de utilizar um conjugado para cada um dos
isotipos. Desta forma, o mtodo utilizado no acompanhamento da doena e,
em alguns casos, pode ser tambm utilizado como critrio de cura.
De uma maneira geral, a tcnica de imunofluorescncia apresenta nveis

de sensibilidade que variam de 70% a 90%, e especificidade que varia de
85% a 99%. Por ser um mtodo com perfil mais especfico, este mais
utilizado em confirmaes sorolgicas. Deve-se utilizar o mtodo de
imunofluorescncia sempre aliado a outro mtodo mais sensvel para a realiza-
o da triagem e fornecer os dois resultados em combinao. A sua utilizao
pesquisando IgM e IgG sricas pode aumentar a sensibilidade, uma vez que a
primeira aparece mais precocemente.
11.16. Ensaios imunoenzimticos - Enzyme-linked

immunosorbent assay - ELISA
Os estudos preliminares que tornaram passveis de execuo os mto-
dos imunoenzimticos foram realizados, simultaneamente, em 1966, por Nakane
e Pierce, nos Estados Unidos, e por Avrameas e Uriel, na Frana, com a
utilizao da peroxidase (horseradish peroxidase - HRP) para a confeco de
conjugados proteicos, tendo como precursor o processo de marcao de
protenas com corantes fluorescentes, criado por Coons, em 1941.
Em 1971, dois grupos de pesquisadores, um holands, formado por
Van Weemen e Schurs, e um sueco, formado por Engvall e Perlmann, idealiza-
ram e introduziram, pioneiramente, o mtodo imunoenzimtico para deteco
e quantificao de antgenos ou anticorpos especficos. Estes grupos observa-
ram que protenas poderiam ser imobilizadas em uma superfcie slida de
poliestireno e a reao imune, ser revelada pela formao de produtos colori-
dos da reao enzima-substrato, na presena de um componente doador de
eltrons, denominado cromgeno.
O mtodo ELISA, quando efetuado em timas condies (enzimas
altamente ativas, antgenos puros, substratos de alta qualidade, anticorpo e
conjugado), apresenta sensibilidade semelhante ao radioimunoensaio, com a
vantagem de no ser necessrio utilizar material radioativo. Entretanto, esse
Imunologia | 93
mtodo apresenta algumas desvantagens, pois alguns substratos usados nessas

reaes so teratognicos e a presena de enzimas endgenas interferem nos
resultados quando se usa clulas inteiras como antgenos.
A reao desenvolvida frequentemente em placas plsticas de
microdiluio (suporte), contendo sries de orifcios, onde so depositados os
imunorreagentes, antgenos ou anticorpos, dependendo do objetivo do mto-
do. O processo de revestimento da placa com o imunorreagente adequado
denomina-se sensibilizao. Para sensibilizar a placa deve-se tratar o
imunorreagente com soluo alcalina, deixando-o com carga efetiva negativa, e
assim promover, passivamente, a adsoro placa por interaes eletrostticas
(foras coulmbicas), as quais ocorrem em virtude das cargas positivas do
poliestireno ou polivinil (polyvinyl chloride - PVC) utilizado para confeccion-
las. Alm das placas de microdiluio de 96 cavidades, tambm so utilizados
outros suportes, entre os quais, esferas de sefarose, esferas de poliestireno ou
de PVC, ou tubos de poliestireno ou PVC, que possibilitam a adsoro
adequada da maioria dos imunorreagentes.
As etapas de lavagem das placas de microdiluio interpem-se s demais
etapas de execuo do mtodo e servem para retirar excessos de imunorreagentes
no ligados. Podem ser usados procedimentos manuais ou automticos, que vo
desde o uso de jorradeiras contendo a soluo de lavagem, ou de pente multicanal
adaptado a um sistema de vcuo (lavadora semiautomtica), at a utilizao de
lavadoras de placas automticas, que reduzem o tempo de realizao do teste e
proporcionam maior uniformidade ao processo.
O revestimento da superfcie interna da placa de ELISA, pelo menos
no plano terico, no absoluto e, portanto, algumas regies permanecem
livres de ligao. Estes espaos devem ser ocupados com qualquer molcula
alheia ao sistema reacional, no sentido de reduzir, ou mesmo evitar, a ligao
inespecfica, no imune, de componentes da amostra, geradores de reaes
indesejveis que possibilitam falsas interpretaes. A cobertura destes espaos
vazios chamada de bloqueio. Entre as protenas mais empregadas nesta etapa

destacam-se a soro albumina bovina (BSA), a ovalbumina e a casena, alm de
um complexo proteico, como o soro de cobaia.
Dependendo do material a ser pesquisado, pode-se conjugar antgenos
com enzimas (Ag-E) e anticorpos ou anti anticorpos com enzimas (Ac-E).
Enzimas so macromolculas de natureza proteica, com funo biolgica
de alto poder cataltico de reaes qumicas e elevada especificidade ao
substrato correspondente. As mais usadas nestes testes so a fosfatase
alcalina e a peroxidase.
Para revelar a presena da enzima no complexo formado, utiliza-se uma
soluo reveladora, que consiste em um tampo adequado, onde se adicionam
o substrato correspondente enzima conjugada e um componente doador de
eltrons (cromgeno). A enzima conjugada quebra o substrato e seus produ-
tos atuam no cromgeno, alterando a colorao do sistema (Figura 29).
Figura 29. Esquema do ensaio imunoenzimtico ELISA indireto,para pesquisa

de anticorpos especficos
A leitura da reao em condies de trabalho de campo pode ser feita

de forma visual, simplesmente pela observao da alterao da colorao. Em
condio laboratorial utiliza-se espectrofotmetro apropriado para leitura dos
Imunologia | 95
orifcios das placas, que transforma a intensidade de cor em nmeros. Quanto

maior a leitura, maior ser a concentrao de enzima conjugada e,
consequentemente, maior ser a concentrao da substncia pesquisada em
tcnicas no competitivas.
O mtodo ELISA pode ser classificado de acordo com sua atividade
de amplificao, ou seja, por mtodos diretos no competitivos, ou baseados
em sua atividade moduladora, que so mtodos competitivos.
O ELISA direto mais usado em imuno-histoqumica. Seu fundamento
consiste na utilizao de anticorpos primrios marcados com enzima, que se
combinam especificamente aos antgenos presentes em cortes histolgicos. A
aplicao da soluo reveladora destaca o material pesquisado.
O ELISA indireto empregado para a pesquisa de anticorpos, onde
amostras de soro ou plasma so colocadas para reagir com antgenos imobiliza-
dos em uma fase slida (placas de ELISA). Posteriormente, so revelados com
auxlio de conjugado enzimtico especfico levando a formao de um produto
corado ao agir sobre substratos cromognicos. Para pesquisa de antgenos
presentes em material biolgico, a amostra posta para reagir com anticorpos
especficos imobilizados na fase slida.
O ELISA competitivo consiste na pesquisa de antgeno, onde o
anticorpo mobilizado na fase slida e o antgeno correspondente compete
com uma quantidade padronizada e marcado para stios de combinao dispo-
nvel. Nesse caso, a reduo da reao indica maior quantidade de antgeno
na soluo. Para pesquisar anticorpos, o antgeno imobilizado e poder se
ligar ao anticorpo da amostra ou ao j conhecido e marcado (conjugado
enzimtico), para, assim, decrescer a intensidade de colorao da reao. Em
ambos os mtodos competitivos (Figura 30), dois procedimentos podem ser
seguidos: a competio simultnea, cujo antgeno ou anticorpo marcado
adicionado junto com a amostra; ou a saturao sequencial, onde o antgeno
ou anticorpo adicionado primeiro, seguido de uma incubao com o

imunorreagente marcado.
Figura 30. Modelo de mtodo competitivo, onde antgenos marcados e antgenos

no marcados de uma amostra competem pelos stios de ligao dos anticorpos
imobilizados em um suporte
11.17. Western blotting - WB

A tcnica de Western Blotting, tambm chamada de immunoblotting
ou imunoeletrotransferncia, uma ferramenta de grande utilidade para a
caracterizao de antgenos, ou para pesquisa de anticorpos especficos para
um determinado componente antignico.
A tcnica de WB baseia-se numa combinao de trs mtodos muito
aplicados em biologia molecular: a separao de macromolculas atravs de
eletroforese em gel de poliacrilamida, na presena de duodecil-sulfato de
Imunologia | 97
sdio (SDS-PAGE); sua transferncia eletroltica para membranas (geralmente

de nitrocelulose); e o ensaio de revelao, utilizando anticorpos ou protena
A, marcados por enzimas, radionucldeos, fluorocrmos, metais coloidais ou
complexo biotinina-avidina-peroxidase.
Assim, as protenas de um dado antgeno so separadas, transferidas
eletroliticamente para membranas de nitrocelulose e postas a reagir com anticorpos
marcados. No final, a reao antgeno-anticorpo revelada por meio de
imunocomplexos formados com protenas definidas, e facilmente identificadas
pelos seus pesos moleculares caractersticos.
A origem do nome Western Blotting partiu de uma brincadeira acadmi-
ca baseada no nome Southern, do autor de um mtodo de eletrotransferncia
de fragmentos de cidos nucleicos (DNA), que recebeu o nome de Southern
Blot. Pouco tempo mais tarde, Alwine e cols conseguiram fazer uma adequa-
o na tcnica de Southern Blotting, que se consistiu na eletrotransferncia de
cido ribonucleico (RNA), o qual, por sua vez, foi analisado atravs de
sondas de DNA. Assim, seguindo o princpio da brincadeira inicial, resolveu-
se chamar a nova tcnica de Northern Blotting. Pouco mais tarde, em 1979,
Towbin, Staehelin e Gordon desenvolveram o mtodo de eletrotransferncia
de protenas. Para seguir a j ento tradicional forma de referir-se ao mtodo
resolveu-se batizar a nova tcnica de Western Blotting.
A razo para transferirem-se protenas, a partir de um gel de poliacrilamida
para uma membrana sinttica, est na possibilidade de manuseio contnuo do
material para anlise, alm de se poder trabalhar com vrios reveladores ao
mesmo tempo, ou com sondas de elevado peso molecular, uma vez que a
poliacrilamida no um material muito adequado para que molculas de gran-
de tamanho sejam difundidas.
As membranas mais utilizadas para o blotting so derivadas da
nitrocelulose. Apesar disso, elas so frgeis e apresentam uma baixa capacida-
de de ligao s macromolculas eletrotransferidas. As membranas de nylon
so muito mais resistentes e ligam-se muito fortemente s protenas. Sua

capacidade de ligao seis vezes maior que a das membranas de nitrocelulose.
Sua limitao est relacionada a no impregnao por corantes, comumente
empregados na revelao de protenas (azul de Comanssie e negro de
amido), e grande quantidade de reaes inespecficas, requerendo, assim,
um bloqueio muito bem feito antes de se desenvolver o ensaio
imunoenzimtico para a revelao do Western Blotting. Outro aspecto muito
importante a porosidade da membrana. Recomenda-se a utilizao de
membranas com 0,45mm para o uso genrico e com dimetros bastante
menores (0,2mm) para estruturas proteicas, com pesos moleculares inferio-
res a 20 kDa. As melhores membranas, embora sendo bastante caras, so as
de difluoreto de polivinilideno (PVDF). Elas combinam a excelente capaci-
dade ligante e a resistncia mecnica manipulao necessria para a elabo-
rao das fitas, contendo protenas eletrotransferidas.
11.18. Teste imunocromatogrfico

O dispositivo de imunocromatografia composto de uma membrana
porosa de celulose modificada e membranas absorventes acessrias de fibra de
vidro, contendo os elementos de reao, ajustadas em um invlucro plstico
apropriado com uma janela para se acrescentar a amostra de teste e outra para
leitura do resultado da reao. O princpio de funcionamento do teste
imunocromatogrfico baseia-se na reao especfica antgeno-anticorpo e se
constitui por uma fase slida (membrana porosa), onde esto imobilizados
elementos de captura, e por uma fase mvel, onde esto suspensos o conjuga-
do (que pode ser a protena A, ligada ao ouro coloidal ou outros conjugados
disponveis) e a molcula alvo da amostra.
A fase mvel migra sobre a fase slida por efeito de capilaridade,
conduzindo o complexo formado entre a molcula alvo e o conjugado, que,
por sua vez, ser retido na linha de captura da fase slida, formando um
Imunologia | 99
complexo macromolecular colorido visvel ao olho humano. Caso a amostra

no contenha a molcula alvo, esta linha de reao no se formar. Uma
segunda linha de reao, denominada linha de controle, se forma pela captura
do conjugado livre, que permite a confirmao da migrao da fase mvel
(Figura 31).
Figura 31. Princpio doTeste Imunocromatogrfico
11.19. Imuno-histoqumica
A imuno-histoqumica (IHQ) rene a interao antgeno anticorpo in
vitro, tcnicas histolgicas e reaes qumicas, em um mtodo que permite
detectar diferentes estruturas de tecidos, revelados por diversos tipos de pro-
cessos de visualizao. utilizada no diagnstico anatomopatolgico de vrias
doenas degenerativas ou parasitrias, bem como na identificao de estruturas
normais em estudos de histologia bsica. As tcnicas de IHQ permitem a
localizao de protenas nas clulas de uma seo de tecido, fixados em formol
ou includo em blocos de parafina. Existe, atualmente, a disponibilidade de um
nmero crescente de anticorpos para uso em IHQ, o que vem possibilitado
uma maior preciso diagnstica.
Existem dois tipos de tcnicas de imuno-histoqumica:
Tcnica direta Os anticorpos primrios so ligados a um marcador

apropriado, e o corte de tecido, que contm antgenos especficos,
incubado com o anticorpo durante algum tempo. Aps a interao
entre os anticorpos e as protenas, os anticorpos que no se ligaram
so removidos por lavagem. Dependendo do marcador utilizado, a
leitura da reao ser realizada pela microscopia adequada; para
marcadores fluorescentes, por exemplo, o corte observado por
microscopia de imunofluorescncia, enquanto para outros marcadores,
utiliza-se a microscopia tica convencional.
Tcnica indireta Nesta tcnica, se utiliza o anticorpo primrio

especfico para uma determinada protena e para o anticorpo se-
cundrio, uma anti-imunoglobulina marcada que reconhece o
anticorpo primrio. O corte de tecido incubado com o anticorpo
especfico para determinada protena. Depois de lavado, incuba-
do com o imunoconjugado, que se vai ligar ao anticorpo primrio.
Em seguida, h a observao por microscopia adequada, depen-
dendo do marcador utilizado.
A tcnica de IHQ pode tambm estar associada a um processo
enzimtico de colorao, como ao complexo avidina-biotina-enzima-
cromgeno (Figura 32). O complexo formado pela ligao de uma
molcula de estreptavidina com vrias de biotina associadas a uma enzima
(peroxidase ou fosfatase alcalina), que tem como funo a converso de
um cromgeno incolor em um produto final colorido. O cromgeno mais
utilizado o DAB (diaminobenzidina), que confere cor marrom-ferruginosa
ao precipitado permanente.
Imunologia | 101
Figura 32. Amplificao de sinal devido ao maior nmero de molculas de

enzimas biotinaladas ligadas avidina
O anticorpo marcado com a peroxidase pode se ligar a stios teciduais

inespecficos, prejudicando a resultado do exame. A utilizao de protenas
inertes alheias ao sistema reacional, tais como soro fetal bovino, soro albumina
bovina ou casena, ao competirem com os stios de ligao inespecficos,
reduzem a reao inespecfica. A peroxidase endgena, encontrada em dife-
rentes tecidos, tambm pode mascarar uma reao e deve ser inibida pela
incubao prvia do corte com perxido de hidrognio. A fosfatase alcalina
est amplamente distribuda nos tecidos humanos e encontrada em altas
concentraes na mucosa intestinal e nos tbulos proximais dos rins, entre
outros tecidos. A biotina endgena, assim como as outras protenas utilizadas
na IHQ, tambm encontrada em tecidos, particularmente no fgado, pul-
mo, bao, tecido adiposo, glndula mamria, rim e crebro. A atividade da
biotina pode ser suprimida pelo uso de tampes alcalinos, pela pr-incubao
com avidina ou com leite desnatado.
A avidina uma glicoprotena bsica com PM de aproximadamente

68 mil, obtida a partir da clara do ovo de vrias espcies de aves. A molcula
de avidina quadrivalente e simtrica, onde cada lado da molcula contm um
par de receptores para a biotina. A estreptavidina, obtida a partir do Streptomyces
avidinii, possui ponto isoeltrico prximo ao neutro e mantm as propriedades
de ligao da avidina sem apresentar prejuzos ao resultado final. O sistema
avidina-biotina permite a amplificao de sinal, pois muitas molculas de biotina
podem se ligar a um anticorpo. E a adio da avidina marcada com corantes
fluorescentes, ou com enzimas, resultam em uma amplificao da reao, facili-
tando a visualizao do corte corado.
11.20. Citometria de fluxo

A citometria de fluxo uma tcnica utilizada para contar, examinar e
classificar partculas microscpicas suspensas, em fluxo, em um meio lquido.
Permite a anlise de vrios parmetros simultaneamente, sendo conhecida tam-
bm por citometria de fluxo multiparamtrica. A verso mais aplicada da
citometria de fluxo denominada FACS (fluorescence-activated cell sorter,
separador de clula ativado por fluorescncia), que foi projetada para automatizar
a anlise e a separao das clulas coradas com anticorpo fluorescente. O
FACS utiliza um feixe de laser e um detector de luz para contar as clulas
intactas nicas em suspeno. Atravs de um aparelho de deteco tico-
eletrnico so possveis anlises de caractersticas fsicas e/ou qumicas de uma
simples clula.
Em sistemas celulares, as principais propriedades analisadas so o tama-
nho relativo, a granulosidade relativa, a complexidade interna das partculas e a
intensidade relativa da fluorescncia. Essas caractersticas so determinadas por
meio de um sistema de acoplamento ptico-eletrnico que registra a forma
como a clula, ou partcula, dispersa a luz do laser incidente, emitindo
fluorescncia (Figura 33).
Imunologia | 103
Figura 33. Deteco de linfticos B fluorescente, por citometria de fluxo
O fundamendo da citometria de fluxo consiste na emisso de um feixe

de luz (normalmente laser), de nico comprimento de onda (cor), direccionado
a um meio lquido em fluxo. Um nmero de dectores apontado ao local
onde o fluxo passa atravs do feixe de luz. Um na linha do feixe (Forward
Scatter ou FSC) e vrios perpendiculares a este ( Side Scatter ou SSC), alm
de um ou mais detectores fluorescentes. Cada partcula suspensa passando
atravs do feixe dispersa a luz de uma forma, e os corantes qumicos fluores-
centes encontrados na partcula, ou juntos partcula, podem ser excitados,
emitindo luz de menor frequncia do que o da fonte de luz.
Esta combinao de luz dispersa e fluorescente melhorada pelos
dectetores e, analisando as flutuaes de brilho de cada detector (uma para
cada pico de emisso fluorescente), possvel explorar vrios tipos de infor-
mao sobre a estrutura fsica e qumica de cada partcula, individualmente.
FSC correlaciona-se com o volume celular e SSC depende da complexidade
interna da partcula (Ex: forma do ncleo, quantidade e tipo dos grnulos
citoplasmticos e rugosidade da membrana). Atualmente, alguns citmetros de
fluxo tm eliminado a necessidade da fluorescncia e usado somente disperso

de luz para sua medio. Outros citmetros de fluxo formam imagens de cada
fluorescncia da clula, disperso de luz e transmisso de luz.
O citmetro de fluxo dividido fundamentalmente em cinco sistemas:
Sistema fluido Local onde ocorrer a introduo e o alinhamento

das clulas por diferena de presso, e que sero interceptadas pela
luz do laser.
Sistema ptico Contm a fonte de luz do laser. Normalmente

so usadas lmpadas de mercrio ou xenon, lasers de alto poder
(argnio, kripton), lasers de poder baixo (argnio-488nm, red-
HeNe-633nm, green-HeNe e HeCd-UV) e lasers diodo (azul,
verde, vermelho e violeta).
Sistema eletrnico Responsvel por converter os sinais ticos

detectados em sinais eletrnicos proporcionais, atravs de um sistema
analgico para digital (ADC), gerando FSC e SSC, assim como
sinais fluorescentes.
Sistema de amplificao Codifica e processa as informaes

recebidas em escala linear ou escala logartimica.
Sistema computacional Responsvel pela anlise, processamento

dos sinais e emisso do resultado, utilizando softwares especficos.
Existe ainda um filtro e um sistema detector que capta a luz proveni-
ente das clulas. A emisso de luz frontal mede o tamanho da clula
e a luz lateral avalia a sua granulosidade e complexidade interna.
Modernos citmetros de fluxo so capazes de analisar vrias partcu-
las em cada segundo, em tempo real, e podem separar e isolar partculas
com propriedades especficas. Os parmetros possveis de medir so: vo-
lume e complexidade morfolgica das clulas, pigmentos celulares (como a
Imunologia | 105
clorofila), DNA, RNA, anlise e classificao de cromossomas, prote-

nas, antgenos superfcie celular (marcadores CD) e antgenos
intracelulares, entre outras molculas.
A hematologia foi uma das primeiras modalidades biomdicas a se
beneficiar das aplicaes clnicas da citometria de fluxo. Algumas destas
aplicaes so utilizadas regularmente para o diagnstico ou o acompanha-
mento teraputico de diferentes afeces. Em cancerologia, a deteco da
clula tumoral a aplicao mais desenvolvida. Esta deteco repousa
essencialmente sobre a medio de contedo anormal de DNA no ncleo
da clula tumoral e da expresso proteica dos antgenos tumorais.
Atualmente, a imunologia, a biologia molecular e as anlises clnicas
so as reas da cincia que mais utilizam a citometria de fluxo para a deteco
ou identificao de subtipos de clulas implicadas na imunidade. A contagem
de linfcitos T consiste em classificar e quantificar as subpopulaes desses
linfcitos, pela pesquisa imunofenotpica dos CDs, por meio de conjugados
fluorescentes especficos. Dependendo dos fluorocromos que estaro liga-
dos aos anticorpos monoclonais, as fluorescncias emitidas por eles, quando
excitados pelo laser , tero comprimentos de ondas diferentes e,
consequentemente, cores diferentes. H diversos tipos de fluorocromos,
como o isotiocianato de fluorescena (FITC), a ficoeritrina (PE), a protena
Clorofil peridinina (PerCP) e o Texas Red.
Os sinais eletrnicos so usados para analisar as clulas de acordo
com seus marcadores de superfcie, e esta anlise interpretada atravs de
um grfico de separao dividido em janelas (gates) (Figura 34). O citmetro
fornece o nmero absoluto de linfcitos, por exemplo, linfcitos T CD3+/
CD4+ e de linfcitos T CD3+/CD8+, porque em cada tubo de amos-
tra existe um nmero conhecido de partculas de referncia conjugadas com
fluorocromos (valor padro).
Figura 34. Anlise do linftico feita pelo Citmetro de Fluxo mostrando os

Gates e as populaes marcadascom FITC, PE e PerCP
11.21. Testes de hipersensibilidade celular cutnea tardia

Embora existam mtodos in vitro para o exame da imunidade celular,
como, por exemplo, a linfoproliferao e a citometria de fluxo, a resposta
celular tambm pode ser verificada in vivo por meio de testes de
hipersensibilidade celular cutnea tardia. Estes testes so muito simples e
podem ser empregados na avaliao geral da imunidade celular em estudos
de deficincia imunolgica e na verificao da exposio a determinados
agentes infectoparasitrios individuais ou em inquritos epidemiolgicos.
importante ressaltar que um teste positivo para um agente infeccioso no
significa necessariamente diagnstico de doena ativa ou infeco por este
agente, mas apenas a presena de clulas Th1 de memria, cuja origem foi
induzida por uma infeco primria assintomtica ou de uma doena curada.
O teste negativo indica que o indivduo no deve ter tido contato com o
agente que se investiga.
Imunologia | 107
Estes testes, alm de representarem o principal exame complementar

para o diagnstico e acompanhamento do curso de vrias enfermidades
infectoparasitrias, so indicados tambm para a avaliao da diminuio da
imunidade celular Th1, ou anergia, que se configura pela ausncia de resposta
a uma bateria de antgenos comuns, determinada por fatores genticos ou
ambientais. Como ocorre, por exemplo, em indivduos com infeces recor-
rentes, com infeces causadas por microrganismos que normalmente no so
patognicos, indivduos em uso de imunossupressores, indivduos com
imunodeficincias primrias ou com doenas que levam imunodeficincia
secundria, como a AIDS, neoplasias, doenas autoimunes, etc. Na suspeita
de anergia, feita a aplicao na pele, de certos produtos qumicos que
reagem com protenas que induzem sensibilizao sistmica a vrios metablitos
do agente sensibilizante. O dinitroclorobenzeno (DNCB) um agente que
tem sido utilizado desta maneira, com a finalidade de testar a imunidade celular
em pacientes com suspeita de anergia. Este no deve ser um procedimento de
rotina, e deve ser reservado a pacientes que apresentaram ausncia de resposta
celular aos antgenos comumente testados.
Dentre os antgenos mais utilizados, para a avaliao da resposta celular
de hipersensibilidade tardia, figuram os seguintes: a tuberculina, tambm cha-
mada de PPD (derivado proteico purificado), empregada no teste de Mantoux,
que utilizado para a avaliao da exposio ao Mycobacterium tuberculosis;
a lepromina, ou antgeno de Mitsuda ou mitsudina, que utilizada diante da
suspeita de hansenase; o extrato de Leishmania contido no teste de
Montenegro, utilizado no diagnstico complementar e em inquritos
epidemiolgicos de leishmaniose tegumentar; os antgenos de Candida albicans,
candidina ou oidiomicina, empregados diante da suspeita de candidase; a
tricofitina, para as dermatofitoses causadas por fungos; a paracoccidioidina,
utilizada sob a forma de filtrado de cultura na avaliao da resposta celular ao
Paracoccidioides brasiliensis, e outros.
O teste se procede pelo inculo, aps antissepsia da pele com lcool,

de 0,1 mL de antgeno especfico, por via intradmica na face anterior do
antebrao, usando seringas de 1 mL com agulhas n 8x0,25mm, estreis e
descartveis. Como controle, deve-se injetar o mesmo volume de soluo
salina em outro ponto do antebrao. A formao de uma ppula pequena e
uniforme indica injeo correta. A injeo subcutnea leva diluio do antgeno
e pode gerar resultados falso-negativos. A leitura realizada por medio dos
maiores dimetros do eritema e da endurao aps 48-72 horas na maioria
dos procedimentos. Endurao maior que 5 mm de dimetro geralmente indica
resposta positiva.
12. Alguns parmetros utilizados no controle

de qualidade do diagnstico sorolgico
O controle de qualidade para o diagnstico sorolgico das doenas
infectoparasitrias, da mesma maneira que para todos os outros procedimentos
laboratoriais, deve ser criteriosa em todas as etapas do processo. Comeando
pela fase pr-analtica, que inclui a indicao e solicitao corretas do teste
adequado, coleta da amostra do paciente convenientemente preparado, alm
do transporte e manuseio da amostra em condies apropriadas at o laborat-
rio de anlise. A fase analtica compreende a escolha do mtodo adequado,
a realizao do teste de acordo com as recomendaes do fabricante e o
registro do resultado obtido. A fase ps-analtica inclui os eventuais clculos e
a apresentao do resultado em forma de laudo final. A partir desta fase, deve
ser feita a interpretao do resultado, em conjunto com os dados clnicos e
demais exames laboratoriais, para que seja definida a melhor conduta.
12.1. Construo de banco de soros

O banco de soros uma coleo catalogada de amostras representativas
de uma populao que se mantm para preservar suas caractersticas imunolgicas.
Imunologia | 109
Para a adequada constituio, necessrio a incluso de amostras proveni-

entes de pessoas infectadas e de pessoas no infectadas. As amostras de
pessoas infectadas, chamadas controles positivos, devem ser pertencentes
s reas endmicas (se a doena possuir tal caracterstica) e vir com diag-
nstico conclusivo que demonstre o parasito ou por provas que deem tais
indicaes, como, por exemplo, os testes intradrmicos de hipersensibilidade
celular, reao de hibridizao ou a reao polimersica em cadeia ( Polymerase
Chain Reaction - PCR). As amostras de indivduos no infectados, consi-
derados normais e chamados de controles negativos, so selecionadas
mediante a apresentao de resultados negativos obtidos com as mesmas
provas utilizadas para seleo das amostras positivas e, se possvel for,
provenientes de reas no endmicas da modalidade estudada. Se houver
a incluso de soros provenientes de indivduos com outras doenas, para a
verificao de respostas cruzadas, as mesmas provas diagnsticas de certeza
devem ser realizadas. Todo banco de amostras necessita da aprovao de
comisso de tica em pesquisa envolvendo seres humanos, bem como da
aprovao de comisso de tica para uso de animais (CEUA), quando
envolve amostras no humanas.
12.2. Avaliao dos mtodos sorolgicos

Ao analisar o comportamento sorolgico de duas populaes, onde
uma delas seja constituda por amostras provenientes de pessoas infectadas
e a outra de pessoas no infectadas, ao se comparar os resultados sorolgicos
obtidos em ambas, com frequncia relativa em porcentagem, encontram-se
duas curvas gaussianas bem definidas (Figura 35).
Figura 35. Distribuio de frequncias dos ttulos sorolgicos de duas popula-

es hipotticas, uma normal A e outra infectada B, encontradas com um teste
sorolgico hipoteticamente ideal
Entretanto, estes dados hipotticos ideais no refletem o que se

observa em uma rotina de diagnstico sorolgico. Os resultados dos testes
sorolgicos se agrupam em quatro categorias, de acordo com a existncia
ou no da doena e a positividade ou no do teste. Para qualquer infeco
que se analise, observa-se sobreposio entre as curvas de distribuio da
populao normal (A) e a de infectados (B), como se mostra na Figura
36, onde os soros, com resultados positivos ao teste e provenientes de
pacientes nos quais o diagnstico de certeza era positivo, denominam-se
verdadeiros-positivos. Soros com resultados negativos obtidos de contro-
les normais so chamados verdadeiros-negativos. Soros com resultados
negativos provenientes de pacientes infectados so denominados falsos-
negativos e aqueles com resultado positivo ao teste sorolgico, porm
obtidos de controles normais, so os falsos-positivos.
Imunologia | 111
Figura 36. Distribuio de frequncias dos ttulos sorolgicos, semelhantes ao

que se encontra habitualmente: uma normal A e outra infectada B, obtidas
com um teste sorolgico hipoteticamente ideal
Neste exemplo hipottico, a sobreposio das curvas simtrica e a

linha de corte (cut off) encontra-se marcada ao centro, fornecendo assim, igual
quantidade de resultados falsos-negativos (C) e falsos-positivos (D). Os da-
dos com que se obtm as curvas podem ser extrados de um quadro de dupla
entrada, como apresentado no Quadro 2.
Quadro 2 Demonstrao de populaes de indivduos infectados e no

infectados, onde: a = Verdadeiros-positivos, b = Falsos-positivos, c =
Falsos-negativos, d = Verdadeiros-negativos e P = Prevalncia.
INDIVDUOS
INFECO
TESTE
PRESENTE AUSENTE TOTAL
POSITIVO a b a+b
NEGATIVO c d c+d
TOTAL a + c (P) b+d n
Apesar de testes sorolgicos produzirem muitos resultados verdadei-

ros, alguns resultados falsos, como j mencionado, podem ser gerados,
sejam eles positivos ou negativos; e, por conseguinte, comum dizer que
os testes sorolgicos so presuntivos, ou seja, de valor probabilstico.
Estes testes, obrigatoriamente, devem ser avaliados para definir parmetros
importantes quanto s suas qualidades fixas (sensibilidade, especificidade e
acurcia), uma vez que estes valores independem da prevalncia da infec-
o estudada na populao.
Um teste de triagem sorolgica ideal deve ser capaz de identificar
todos os indivduos com a condio estudada e de excluir todos os indiv-
duos que no apresentem esta condio. A probabilidade do teste em
identificar corretamente, em uma populao, os indivduos que apresentem
a infeco, denomina-se sensibilidade (S) e pode, tambm, ser conceitu-
ada como a capacidade de um teste sorolgico proporcionar resultados
positivos nos indivduos infectados ou, ainda, como a capacidade do m-
todo sorolgico em detectar quantidades mnimas do material desejado.
Calcula-se a sensibilidade com a seguinte relao:
Sensibilidade = a : (a + c)
De acordo com os dados do quadro 3
Sensibilidade = 300 : 400 = 0,75 ou 75%
Os resultados podem ser apresentados em uma escala de 0 a 1, mas
normalmente so expressos em porcentagem.
A capacidade do teste para excluir aqueles que no so afetados
chamada especificidade (E), que tambm pode ser conceituada como a
qualidade que um teste apresenta em distinguir molculas diferentes, porm,
com elevado grau de homologia. Aproveitando os dados do Quadro 3, a
especificidade calcula-se por:
Imunologia | 113
Especificidade = d : (b + d ) onde Especificidade = 540 : 600 = 0,9 ou 90%
Quadro 3 Resultados sorolgicos hipotticos encontrados em duas popula-

es de indivduos infectados e no infectados
INDIVIDUOS
INFECO
TESTE
PRESENTE AUSENTE TOTAL
POSITIVO 300 a 60 b 360 a + b

NEGATIVO 100 c 540 d 640 c + d
TOTAL 400 a + c (P) 600 b+d 1000 n
A acurcia (A), tambm chamada de confiabilidade ou eficincia do

teste, refere-se ao somatrio dos resultados verdadeiros positivos e negativos
em relao populao estudada.
Acurcia = (a + d) : n onde Acurcia = (300 + 540) : 1000 = 0,84 ou 84%
O coeficiente de prevalncia (P) pode ser conceituado como a por-

centagem de indivduos infectados, parasitologicamente comprovados em uma
populao. Esse conceito difere da soroprevalncia, (SP) que considera a
porcentagem de indivduos soropositivos na populao estudada.
Prevalncia = (a + c) : n onde Prevalncia = 400 : 1.000 = 40%
Soroprevalncia = (a + b) : n onde Soroprevalncia = 360 : 1.000 = 36%
A determinao das qualidades fixas de um teste sorolgico, por si s,

no satisfaz suficientemente s necessidades do controle sob os resultados
sorolgicos, uma vez que a ocorrncia de resultados falsos pode alterar, em
funo da prevalncia de infeco. Como as tcnicas sorolgicas so utilizadas
em diversos lugares do mundo em reas com diferentes coeficientes de
prevalncia, importante conhecer a probabilidade de que os resultados

positivos segundo a tcnica empregada sejam realmente positivos, bem
como os resultados negativos sejam realmente negativos. Estas probabilida-
des so os valores de predio (VP) da tcnica. O parmetro mais fre-
quentemente utilizado o valor de predio de positividade (VPP), que
permite identificar os doentes em um grupo de indivduos considerados
soropositivos. O valor de predio de negatividade (VPN) conceituado
como a probabilidade de que a doena estudada no exista em um grupo
de indivduos considerados como soronegativos. Disto deduz-se que o
valor de predio pode ser dado pelo teorema de Bayes:
VPP = (P x S) : (P x S) + (1 - P) x (1 - E)
VPN = E x (1 - P) : E x (1 - P) + (1 - S) x P
Por outro lado, os clculos podem expressar-se de uma forma mais

simples, mediante os valores do Quadro 3 apresentado anteriormente:
VPP = a : (a + b) onde VPP = 300 : 360 = 0,83 (83%)
VPN = d : (c + d) onde VPN = 540 : 640 = 0,84 (84%)
feita a aplicao do mesmo teste sorolgico, com sensibilidade e

especificidade invariveis, em duas reas endmicas para uma determinada
doena, onde a nica diferena entre estas populaes seja a prevalncia
de infeco encontrada, representada por uma populao (A) de baixa
prevalncia e uma (B) de alta prevalncia. A alterao no comportamento
do teste se verifica pela modificao dos valores de predio de positividade
e de negatividade. A partir dos valores apresentados no quadro 4, pode-
se verificar tais modificaes.
Imunologia | 115
Quadro 4 - Quadro explicativo para os clculos do valor de predio de

positividade em duas populaes hipotticas: populao A = baixa prevalncia
e populao B = alta prevalncia, para uma determinada infeco.
Resultado (A) Prevalncia de infeco = 1% (B) Prevalncia de infeco = 10%

do teste Infectados No infectados total Infectados No infectados total
Positivo 980 990 1970 9800 900 10700

Negativo 20 98010 98030 200 89100 89300
Total 1000 99000 100000 10000 90000 100000
P = 1% S = 98% SP = 99% P = 10% S = 98% SP = 99%

VPP = 980 / 1970 X 100 = 49,7% VPP = 9800 / 10700 X 100 = 91,6%
Conforme demonstrado, embora o teste sorolgico tenha sensibilidade

e especificidade elevadas, 98% e 99% respectivamente, sua aplicao em
rea de baixa prevalncia gerou valor de predio de positividade inferior a
50%. Contrariamente, em rea de alta prevalncia o valor de predio de
positividade elevou-se acima de 90%.
O Quadro 5 ilustra, com maiores detalhes, como o valor de predio
de positividade dos testes sorolgicos, com diferentes nveis de sensibilidade e
de especificidade, sofrem alteraes em funo dos valores crescentes do
coeficiente de prevalncia. Via de regra, o teste sorolgico no deve ser
empregado em reas de baixa prevalncia em consequncia da gerao de
numerosos resultados falsos-positivos.
Em tcnicas parasitolgicas dificilmente ocorrem resultados falso-positi-
vos, como, por exemplo, a identificao de hemoparasitos em exames micros-
cpicos pela extenso sangunea em lmina, ou enteroparasitos em fezes,
definitivo para comprovar uma infeco. Por outro lado, no podem ser utiliza-
dos para estimar a prevalncia real de infeco, por apresentarem resultados

falso-negativos.
Quadro 5 - VPP de testes com diferentes ndices de sensibilidade e

especificidade para diversas taxas de prevalncia
VARIAO DO VALOR DE PREDIO DE POSITIVIDADE

especificidade = 99% sensibilidade = 99%
Prevalncia % sensibilidade % especificidade 99%

70 80 90 95 99 70 80 90 95 99
0,5 2 2 5 9 33 26 29 31 22 33
1,0 3 5 9 17 50 41 45 48 49 50
5,0 15 21 34 51 84 79 81 83 83 84
10,0 27 35 52 69 92 89 90 91 91 92
20,0 45 55 71 83 96 95 95 96 96 96
Valores de predio de positividade
Os resultados dos testes sorolgicos tambm podem ser confrontados

para a verificao da copositividade, da conegatividade e da concordncia
bruta. Estes parmetros podem ser obtidos em funo da distribuio dos
resultados dos testes sorolgicos, como representados no Quadro 6 de ma-
neira semelhante sensibilidade, especificidade e confiabilidade. A concor-
dncia ajustada Kappa (K) um parmetro que se baseia na comparao do
ndice de concordncia esperada com o ndice de concordncia observada.
Imunologia | 117
Quadro 6 - Quadro explicativo para os clculos da Copositividade, e da

Conegatividade, Concordncia bruta e Concordncia ajustada Kappa (K.)
TESTE 1 (Teste de referncia)

TESTE 2 PRESENTE AUSENTE TOTAL
POSITIVO a b a + b (p1)
NEGATIVO c d c + d (q1)
TOTAL a + c (p2) b + d (q2) a+b+c+d
Copositividade = a : (a + c)
Conegatividade = d : (b + d)
Concordncia bruta= (a + d) : ( a + b + c +d)
Kappa = [2 (ad + bc) : (p1q2 + p2q1)]
Pode-se utilizar o seguinte critrio para conceituar os resultados

do controle de qualidade: valores 40,0% so considerados pobres, de
40,1 at 79,9% regulares, valores 80,0 a 89,9% so considerados bons
e 90% so considerados excelentes.
Resumo do captulo
O sistema imunitrio, assim como os demais sistemas do organismo,
possui suas prprias clulas, tecidos, rgos e molculas. A principal clula
desse sistema o linfcito. Os linfcitos so as nicas clulas do organismo
que expressam receptores altamente diversificados para o antgeno, o que
permite o reconhecimento de uma grande variedade de substncias estranhas.
A ativao do sistema imune adaptativo depende da apresentao de
antgenos. Um antgeno qualquer substncia que pode ser reconhecida por
um anticorpo ou por um receptor de clula T. Os antgenos possuem duas
propriedades: a imunogenicidade e a antigenicidade. Os que no so capazes
de induzir uma resposta imune so chamados de haptenos e precisam ser
acoplados s molculas carreadoras para adquirirem tal capacidade. O
determinante antignico, ou epitopo, a menor poro da molcula e
responsvel pela propriedade de estimular uma resposta imune. As superfcies
celulares, incluindo os microrganismos, geralmente possuem uma grande quan-
tidade de determinantes antignicos.
Os anticorpos atuam na resposta imune ligando-se especificamente ao
agente patognico ou seu subproduto, ativando o sistema complemento,
opsonizando para aumentar a fagocitose e a citotoxicidade dependente de
anticorpo, e permitindo, assim, que microrganismos e parasitos sejam destrudos
pelas clulas do sistema imune.
Os anticorpos se encontram distribudos por todo o organismo, pois
os agentes infecciosos podem vencer as diversas barreiras naturais e estabele-
cer uma infeco em qualquer parte do corpo. Os primeiros anticorpos a
serem produzidos numa resposta imune so as IgM e tendem a ser de baixa
afinidade, mas so muito potentes na ativao do sistema complemento. A
IgG o principal isotipo no sangue e fluidos extracelulares, e transportada
atravs da placenta diretamente para a corrente circulatria do feto durante a
vida intrauterina. A IgA tem papel importante na proteo das superfcies
Imunologia | 119
mucosas contra patgenos ou seus subprodutos. A IgE tem como principal

funo o recrutamento de clulas inflamatrias atravs da ativao de mastcitos
e basfilos, como tambm pode estar envolvida na eliminao de parasitos e
processos alrgicos.
Existem vrios sistemas proteicos de reao em cadeia no plasma sangu-
neo, dentre estes, o sistema complemento, que um complexo sistema
constitudo por molculas termolbeis e termoestveis, e que tem como funo
a eliminao de um agente estranho, facilitando a fagocitose, quando algumas
protenas ativadas do complemento opsonizam a superfcie do patgeno; por
reao Inflamatria, quando os pequenos fragmentos de protenas recrutam
fagcitos ao local da atividade inflamatria; ou por lise direta, quando, uma
vez desencadeada a cascata, os componentes terminais do complemento lesam
a membrana dos microrganismos.
Todo organismo multicelular possui algum sistema de defesa que distin-
gue os patgenos e elimina-os do hospedeiro. A vantagem de tal imunidade
especfica que o sistema imune pode rapidamente adaptar-se queles patgenos
que so mais frequentemente encontrados no meio ambiente local. Esta capa-
cidade conseguida atravs do complexo principal de histocompatibilidade,
cujos produtos desempenham um papel no reconhecimento intercelular e na
discriminao entre o prprio e o no prprio.
Didaticamente, a imunidade adaptativa se organiza em imunidade humoral
e imunidade celular. A imunidade mediada por clulas se desenvolve por uma
rede de interaes que resulta em defesa contra microrganismos, os quais
sobrevivem dentro de fagcitos ou de outras clulas. A resposta iniciada
pelo reconhecimento do antgeno de microrganismos intracelulares por clulas
T atravs do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Na respos-
ta via CD8, somente a clula alvo que porte o antgeno associado classe I
pode ser lisada ou induzida a entrar em apoptose. Em outro mecanismo da
resposta celular, as clulas T CD4+ Th1 ativam, por exemplo, macrfagos
infectados atravs de citocinas como o IFN-g. Quando um patgeno resiste

aos efeitos dos macrfagos ativados, pode-se desenvolver uma infeco crni-
ca. J a resposta imune humoral conduz destruio dos microrganismos
extracelulares e previne ou diminui a disseminao das infeces intracelulares,
por meio da neutralizao, opsonizao e ativao do sistema complemento.
A ativao das clulas B e sua diferenciao em clulas secretoras de
imunoglobulinas so deflagradas pelo antgeno especfico e requer a participa-
o de clulas CD4+ Th2, que tambm controlam a mudana de isotipo e
desempenham papel importante na hipermutao somtica, o que necessrio
para a maturao da afinidade dos anticorpos.
Em algumas infeces, o sistema imunitrio no consegue eliminar o
parasito, mas reage isolando o agente com clulas inflamatrias. Na
esquistossomose, a formao do granuloma um exemplo da reao do hos-
pedeiro contra o parasito. A maioria dos parasitos desenvolve mecanismos de
escape do sistema imune para garantir sua sobrevivncia e alguns comprometem
tanto as respostas mediadas por anticorpos como as mediadas por clulas.
A medida das interaes entre antgeno-anticorpo com o propsito de
diagnstico conhecida como imunossorologia. As tcnicas imunossorolgicas
fundamentam-se na natureza da interao antgeno-anticorpo nas quais podem
expressar-se em duas formas distintas, em decorrncia da utilizao de
imunorreagentes livres de marcao ou de reagentes marcados. As tcnicas que
no empregam marcadores demonstram-se por fenmenos visveis. Portanto,
ao se combinar anticorpos com antgenos solveis, os complexos resultantes
podem formar precipitados insolveis. Se os antgenos so particulados (bact-
rias, protozorios, hemcias), os anticorpos os aglutinam. Se o anticorpo pode
ativar a via clssica do sistema complemento e o antgeno se encontra em uma
superfcie celular, o resultado pode ser a citlise. As tcnicas que empregam
imunorreagentes marcados caracterizam-se pela simples combinao do antgeno
com o anticorpo, necessitando que um deles esteja marcado convenientemente.
Imunologia | 121
O imunorreagente pode ser marcado com corantes fluorescentes ou

quimioluminescentes, radioistopos, enzimas, ouro ou prata coloidais, entre
outros marcadores.
Apesar de testes sorolgicos produzirem muitos resultados verdadeiros,
alguns resultados falsos podem ser gerados, sejam eles positivos ou negativos
e, por conseguinte, comum dizer que os testes sorolgicos so presuntivos,
ou seja, de valor probabilstico. Estes testes, obrigatoriamente, devem ser
avaliados para definir parmetros importantes quanto s suas qualidades fixas
(sensibilidade, especificidade e acurcia), uma vez que estes valores independem
da prevalncia da infeco estudada na populao.
Questes
1) Descreva o processo de maturao das clulas T, no timo.
2) Comente sobre a importncia das molculas de adeso na resposta imune.
3) Defina imunogenicidade e especificidade.
4) Defina adjuvante e sua funo na resposta imune.
5) Descreva as principais propriedades das cinco classes de Imunoglobulinas.
6) Como voc prepararia um anticorpo contra IgG humana?
7) Descreva o processo de ativao da via clssica e da via alternativa do

complemento.
8) Descreva os principais mecanismos de atuao do sistema complemento na

eliminao de patgenos.
9) Descreva o processamento e apresentao de um antgeno intracelular

presente no citoplasma da clula.
10) Descreva o processamento e apresentao de um antgeno, oriundo de

uma bactria extracelular, que foi ativamente fagocitada por um macrfago.
11) Descreva os principais mecanismos de atuao da resposta humoral.
12) Descreva os mecanismos de ao exercidos pelas clulas CD8 na resposta
celular.
13) Descreva os principais mecanismos de imunidade inata e adaptativa contra
vrus.
14) Descreva os principais mecanismos de imunidade adaptativa e especfica
contra bactrias extracelulares e bactrias intracelulares.
15) Como os helmintos parasitas do lume intestinal so expulsos do organis-
mo?
16) Sempre que encontramos uma reao imunolgica positiva, ela determina
a presena do agente etiolgico? Justifique.
17) O que converso sorolgica?
18) Explique o fenmeno prozona e como fazemos sua neutralizao.
19) O que causa reao cruzada em provas sorolgicas? O voc sugere para
impedir esse fenmeno?
20) Quais a provas sorolgicas realizadas em banco de sangue para preven-
o de doenas transmissveis?
21) Quais as vantagens e desvantagens do uso de anticorpos monoclonais em
provas sorolgicas?
22) Como se processam as reaes de aglutinao direta? D um exemplo de
teste comumente usado para fins de diagnsticos.
23) Qual o fundamento da reao de imunofluorescncia indireta (RIFI)?
24) Fale sobre a reao Imunoenzimtica (ELISA), quanto ao seu modo de
ao, suas vantagens e desvantagens.
Imunologia | 123
25) Na etapa de sensibilizao das placas plsticas de microdiluio, da

reao imunoenzimtica ELISA, utilizamos tampes com pH elevado (por
volta de 9,6) para preparar os antgenos proteicos. Por qu?
26) Com que propsito utilizamos casena (protena do leite) no desenvolvi-
mento do ELISA?
27) Fale sobre o fundamento do teste de imunoeletrotransferncia ( Western-
blotting).
28) Conceitue:
a) Sensibilidade; b) Especificidade
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| 125
Captulo 2
Virologia
Paulo Roberto Soares Stephens
Maria Beatriz Siqueira Campos de Oliveira
Flvia Coelho Ribeiro
Leila Abboud Dias Carneiro
1. Introduo
Existem muitas controvrsias na comunidade cientfica a respeito do vrus
ser ou no um ser vivo. Muitos autores consideram que a vida se originou do
RNA, pois, a partir desta molcula so formadas novas quantidades dela
mesma. Em 1960, o fsico alemo Manfred Eigen, ganhador de um prmio
Nobel, descobriu que era possvel a replicao de RNA in vitro. O RNA,
portanto, tornou-se um grande candidato condio de supermolcula da vida
primitiva, capaz de se replicar e sofrer mutaes, albergando genes codificadores
de enzimas e outras protenas.
Essa molcula, denominada RNA de Eigen, muito semelhante ao
vrus, pois se encontra na fronteira entre o qumico e o biolgico. Uma das
hipteses da origem do vrus, denominada Teoria dos Elementos Subcelulares,
de que o vrus seria proveniente de uma molcula de RNA. Uma outra
hiptese defende que o vrus teria se originado de seres unicelulares de vida
livre que, por uma perda progressiva de propriedades celulares, criou uma
dependncia, tornando-o um parasita intracelular obrigatrio.
Os que defendem que o vrus no um ser vivo partem do princpio
de que ele no tem vida livre, pois sua replicao s possvel dentro de
uma clula viva. Alm disso, alguns desses agentes possuem a capacidade
de se cristalizar quando submetido a situaes adversas. Entretanto, os que
o classificam como ser vivo se apoiam em duas caractersticas. A primeira se
refere sua capacidade de replicao que os diferem de outros agentes,
tais como as toxinas bacterianas; e a segunda, presena de uma estrutura
protetora de seu material gentico, ausente nos plasmdeos (molcula de
DNA circular).
Apesar de terem a capacidade de se replicar, os vrus no possuem
um aparato enzimtico suficiente para a replicao, necessitando, assim, da
maquinria celular para completar o seu ciclo replicativo, o que o torna um
parasita intracelular obrigatrio.
Sua fragilidade aparente, por ser estritamente dependente da clu-
la, descartada pela capacidade de controle e redirecionamento do meta-
bolismo celular para o seu prprio benefcio. Apesar da baixa complexida-
de estrutural, pode causar grandes danos clula hospedeira, mesmo apre-
sentando morfologicamente apenas o material gentico, um capsdeo e, em
alguns vrus, um envelope.
Algumas propriedades distinguem os vrus de outros microrganismos.
A primeira est relacionada ao seu tamanho, o qual pode variar de 10 a
300 nm. Dessa forma, so considerados os menores microrganismos exis-
tentes, podendo ser visualizados apenas atravs da microscopia eletrnica.
Para fins de comparao, lembramos que as bactrias e as hemcias possu-
em, em mdia, 10 a 15 vezes o tamanho dos vrus, o que possibilita a
identificao destes por meio da microscopia tica.
Virologia | 127
A segunda propriedade se refere ao genoma viral, que pode ser

DNA ou RNA, com exceo do Mimivrus (famlia: Mimiviridae), o qual
apresenta em seu genoma os dois cidos nucleicos (DNA e RNA), des-
coberto em 2003, por pesquisadores da Universidade Mditerrane, em
Marseille, Frana (LA SCOLA et al., 2003). O cido nucleico contm
os genes responsveis pelas informaes genticas para a codificao de
protenas com composio qumica bem definida, capazes de induzir res-
postas imunolgicas especficas. Esta especificidade uma das caractersti-
cas virais, ou seja, quando somos acometidos por uma infeco viral, o
nosso sistema imune produz anticorpos especficos, que podem ser identi-
ficados atravs do diagnstico sorolgico. O mecanismo de replicao viral
favorece as frequentes mutaes, burlando, assim, o sistema imune.
Outra importante propriedade dos vrus a sua natureza particulada,
j que ele capaz de se replicar, formando seus componentes separada-
mente, sendo o cido nucleico uma das primeiras molculas a ser formada.
Como mencionado anteriormente, o vrus precisa necessariamente de uma
clula viva para realizar seu ciclo. Dessa forma, tratam-se de parasitas estri-
tos, no possuindo atividade metablica fora das clulas hospedeiras. Estas
clulas podem ser de animais, vegetais ou microrganismos .
As propriedades fsico-qumicas dos vrus os tornam capazes de infectar
o organismo atravs de receptores de membrana especficos, presentes nas
clulas hospedeiras. O fato de o vrus apresentar tropismo celular vai influen-
ciar no tipo de doena causada. Por exemplo, um vrus que possui afinidade
por clulas do sistema imune compromete a sua funo. Assim, a interao
vrus-hospedeiro a chave de muitos aspectos das doenas virais, tanto da
transmisso quanto da capacidade de o vrus de se sobrepor s defesas do
hospedeiro. Uma resposta imune exacerbada do hospedeiro pode, tambm,
contribuir para causar maiores danos, agravando a enfermidade.
2. Taxonomia Viral
Taxonomia
Figura 1. Adaptado do livro Virologia Humana, autora Ledy do Horto dos

Santos Oliveira
O International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) vem apri-

morando as normas de classificao viral passo a passo, estabelecendo, assim,
uma taxonomia exclusiva para a organizao dos vrus. O mais importante de
todo esse princpio que os vrus podem ser agrupados de acordo com as
suas propriedades fsico, qumicas e biolgicas, assim como as das clulas que
infectam. Dessa forma, os vrus podem ser classificados de acordo com o tipo
de cido nucleico, simetria do capsdeo, presena ou ausncia do envelope,
tamanho e sensibilidade s substncias qumicas.
Quanto ao genoma dos vrus, este pode ser constitudo por fita simples
(ss) ou dupla (ds), linear ou circular, de polaridade positiva ou negativa. As
diferentes caractersticas do cido nucleico conduziro a variadas estratgias de
Virologia | 129
replicao. Alguns vrus so capazes de realizar recombinaes genticas e

montagens incorretas de partculas virais, podendo produzir vrus provenientes
de diferentes ancestrais. Certos vrus, como o HIV, tm seus cidos nucleicos
incorporados ao genoma da clula hospedeira. Logo, atravs da taxonomia,
no possvel associarmos uma espcie de vrus a um ancestral comum.
Uma outra classificao viral foi definida por David Baltimore, em 1971,
a fim de correlacionar as caractersticas do cido nucleico com as estratgias de
replicao. Esta classificao no tem finalidade taxonmica, uma vez que o
autor utiliza a j existente.
Classificao de Baltimore:
Classe I - DNA de fita dupla - Ex: Adenovrus, Herpesvrus e
Poxvrus.
Classe II - DNA de fita simples positiva - Ex: Parvovrus
Classe III - RNA de fita dupla - Ex: Reovrus, Birnavrus
Classe IV - RNA de fita simples positiva - Ex: Picornavrus e Togavrus
Classe V - RNA de fita simples negativa - Ex: Orthomixovrus e
Rhabdovrus
Classe VI - RNA de fita simples positiva, com DNA intermedirio no
ciclo biolgico do vrus - Ex: Retrovrus
Classe VII - DNA de fita dupla com RNA intermedirio - Ex.
Hepadnavrus
3. Estrutura viral
Basicamente os vrus so constitudos por dois componentes essenciais:
a parte central, que recebe o nome de cerne, onde se encontra o genoma, e
que pode ser DNA ou RNA (salvo exceo); associado a uma capa proteica
denominada capsdeo, formando ambos o nucleocapsdeo.
Ao final da replicao, a prognie viral constituda por partculas

completas (vrion), as quais so infecciosas, e por outras partculas incomple-
tas e no infecciosas. Em alguns gneros, com o Poliovrus e o Adenovrus,
os vrions consistem unicamente de nucleocapsdeo. J em outros gneros,
como o Mixovrus, o Herpesvrus e o Poxvrus, os vrions so constitudos
por uma membrana lipoproteica externa, o envelope. Muitos vrus adquirem
o envelope durante sua sada da clula hospedeira, para onde levam parte
da membrana celular.
Os vrus possuem propriedades fsico-qumicas e biolgicas importantes
na interao com a clula hospedeira. Entre elas, podemos destacar: massa
molecular, pH, temperatura, estabilidade inica, densidade, suscetibilidade a
agentes fsicos e qumicos, composio proteica (de carboidratos e de lipdios),
natureza e afinidade antignica, tropismo, transmisso e patogenicidade.
A partir do arranjo estrutural do nucleocapsdeo, os vrus apresentam as
seguintes simetrias: icosadrica, helicoidal e complexa. Na forma icosadrica, o
capsdeo est organizado como um polgono retangular. Nos vrtices dos
tringulos so encontrados os capsmeros, classificados em Hexmeros, quan-
do possuem seis lados, e em Pentmeros, quando constitudos por cinco
lados. Dessa forma, os vrus icosadricos1 assemelham-se a cristais. O nmero
e a arrumao dos capsmeros so teis na identificao desses vrus. Como
exemplos destes vrus existem os Adenovrus, os Picornavrus, os Rinovrus,
dentre outros.
Nos vrus com morfologia helicoidal, o cido nucleico circundado por
um capsdeo cilndrico como uma estrutura de hlice. Esta forma pode ser de
dois tipos: helicoidal rgido, que se assemelha a bastonetes, e helicoidal frou-
xo, cujos nucleocapsdeos se dobram em forma de novelos, geralmente irregu-
lares, assumindo um aspecto polimrfico. Exemplificando este grupo de vrus
existem o Influenza e o vrus do Mosaico do Tabaco, dentre outros.
1
Figura geomtrica com vinte faces iguais.
Virologia | 131
A grande maioria dos vrus tem seus elementos organizados segundo as

simetrias icosadrica ou helicoidal. Entretanto, alguns vrus, como o Poxvrus,
apresentam uma organizao morfolgica mais complexa, pois podem apresen-
tar duas cadeias peptdicas na constituio do capsdeo . Sua forma resulta da
suborganizao de cada um dos componentes da partcula viral, como o caso
dos bacterifagos. Estes ltimos agentes parasitam as bactrias, introduzindo
nestas o material gentico. Para tanto, os bacterifagos possuem uma estrutura
composta de cabea poligonal, cauda, bainha contrtil, placa basal e fibras
(Figura 3). Existem tambm bacterifagos com estrutura icosadrica.
A estrutura do genoma depende se o vrus RNA ou DNA, pois o
DNA apresenta os nucleotdeos citosina, guanina, adenosina e timina, en-
quanto que o RNA possui a uracila no lugar da timina. O genoma de RNA
ou DNA pode ser constitudo por uma nica fita (ss) ou por duas fitas (ds).
Fitas positivas de RNA so fitas que contm o cdigo que ser traduzido
pelos ribossomos. Fitas positivas de DNA so fitas que contm a mesma base
sequencial do RNA mensageiro. Fita negativa de RNA ou DNA a fita com
base sequencial complementar fita positiva.
Concluindo, o vrus constitudo basicamente por duas estruturas: ci-
do nucleico e capsdeo, sendo que, em alguns grupos, apresentam tambm o
envelope ou envlucros. A funo do cido nucleico albergar a informao
gentica (replicao viral) e a do capsdeo a proteo do genoma. Alm
disso, esta estrutura a principal responsvel pela induo da resposta imune
do hospedeiro. Em vrus envelopados, os lipdeos se apresentam na forma de
fosfolipdeos, o que auxilia a entrada do vrus na clula hospedeira e confere
uma maior proteo do microrganismo (Figura 2).
Figura 2. Estrutura viral Adaptao e arte grfica por Raphael dos Santos
Stephens.
4. Ciclo viral
A replicao viral, que ocorre no interior da clula do hospedeiro,
evolui seguindo as etapas de adsoro, penetrao, desnudamento, transcrio
e traduo (sntese), maturao e liberao (Figura 3).
4.1. Adsoro
a ligao de uma molcula presente na superfcie da partcula viral
com os receptores especficos da membrana celular do hospedeiro. Nos
vrus envelopados, as estruturas de ligao geralmente se apresentam sob a
forma de espculas, como nos Paramyxovrus e nos vrus sem envelope. A
ligao clula-vrus geralmente est relacionada a um ou grupo de
polipeptdeos estruturais, como acontece nos Papilomavrus. A presena
ou ausncia de receptores celulares determina o tropismo viral, ou seja, o
tipo de clula em que so capazes de ser replicados. Para haver a adsoro,
Virologia | 133
necessria uma ponte entre as protenas mediadas por ons livres de

clcio e magnsio, uma vez que as protenas apresentam carga negativa.
Outros fatores vo influenciar diretamente na adsoro do vrus na mem-
brana celular, tais como, temperatura, pH e envoltrios com glicoprotenas.
4.2. Penetrao
a entrada do vrus na clula. Esta pode ser feita de duas maneiras:
fuso e viropexia. A fuso quando a membrana celular e o envelope do
vrus se fundem, permitindo a entrada deste no citosol da clula. No caso
da famlia Paramixoviridae, a protena F catalisa a ligao da membrana com
o envelope. A viropexia uma invaginao da membrana celular mediada
por receptores e por protenas, denominadas clatrinas, que revestem a
membrana internamente. Nos dois mecanismos existe uma dependncia em
relao temperatura adequada, que fica em torno de 37C, em vrus que
replicam em clulas de vertebrado.
4.3. Desnudamento
Neste processo, o capsdeo removido pela ao de enzimas
celulares existentes nos lisossomos, expondo o genoma viral. Alm dis-
so, se observa a fase de eclipse, onde no h aumento do nmero de
partculas infecciosas na clula hospedeira. De uma maneira geral, o vrus
que possui como cido nucleico o DNA faz sntese no ncleo, com
exceo do Poxvrus, uma vez que precisa da enzima polimerase, encon-
trada no ncleo da clula. O vrus que possui como genoma o RNA faz
a sntese viral no citoplasma, com exceo do vrus Influenza, pois j
possui a enzima polimerase.
4.4. Sntese viral

A sntese viral compreende a formao das protenas estruturais e no
estruturais a partir dos processos de transcrio2 e traduo3. Os vrus foram
agrupados em sete classes propostas por Baltimore em 1971, de acordo com
as caractersticas do cido nucleico e as estratgias de replicao.
Nos vrus inseridos nas classes I, III, IV e V, o processo de traduo do
RNA mensageiro ocorre no citoplasma da clula hospedeira. J nos vrus da
classe II, este processo ocorre no ncleo. Em todas estas classes, o RNA
mensageiro sintetizado vai se ligar aos ribossomas, codificando a sntese das
protenas virais. As primeiras protenas a serem sintetizadas so chamadas de
estruturais, pois vo formar a partcula viral. As tardias so as protenas no
estruturais, que participam do processo de replicao viral.
Na classe VI, os vrus de RNA realizam a transcrio reversa formando
o DNA complementar (RNADNARNA), devido a presena da enzima
transcriptase reversa (famlia Retroviridae). Os vrus da classe VII apresentam
um RNA intermedirio de fita simples, maior do que o DNA de cadeia dupla
que o originou (DNARNADNA).
Resumindo, abaixo esto descritas as caractersticas principais de cada
classe.
Classe I: Ocorre no citoplasma, independente do genoma celular,
que bloqueado.
Classe II: realizada no ncleo, simultaneamente sntese do genoma
celular.
Classe III: Processa-se no citoplasma; sendo, no incio, apenas umas
das fitas do cido nucleico copiada.
2
o processo de formao do RNA mensageiro a partir do DNA.
3
o processo de converso de uma molcula, ou sequncia nucleotdica, em aminocidos, formando
uma protena.
Virologia | 135
Classe IV: Ocorre no citoplasma, por meio de um processo comple-

xo, ainda pouco esclarecido.
Classe V: A fita simples de RNA serve de molde para a formao de
genoma viral e sntese de RNA mensageiro.
Classe VI: Pertence a essa classe a famlia Retroviridae, que possui uma
enzima chamada Transcriptase Reversa, responsvel pela sntese de DNA
a partir de RNA.
Classe VII: Tem como exemplo a famlia Hepadnaviridae, cuja caracte-
rstica principal a formao de um RNA intermedirio.
4.5. Montagem e Maturao

Nessa fase, as protenas vo se agregando ao genoma, formando o
nucleocapsdeo. Alguns vrus, como o Rotavrus, apresentam mais de um
capsdeo. A maturao consiste na formao das partculas virais completas, ou
vrions, que, em alguns casos, requerem a obteno do envoltrio lipdico ou
envelope. Este processo, dependente de enzimas tanto do vrus quanto da
clula hospedeira, podendo ocorrer no citoplasma ou no ncleo da clula. De
uma forma geral, os vrus que possuem genoma constitudo de DNA condensam
as suas partes no ncleo, enquanto os de RNA, no citoplasma.
4.6. Liberao
A sada do vrus da clula pode ocorrer por lise celular ou brotamento.
Na lise celular (ciclo ltico), a quantidade de vrus produzida no interior da
clula to grande que a clula se rompe, liberando novas partculas virais que
vo entrar em outras clulas. Geralmente, os vrus no envelopados realizam
este ciclo, ao passo que os envelopados saem da clula por brotamento.
Neste caso, os nucleocapsdeos migram para a face interna da membrana
celular e saem por brotamento, levando parte da membrana.
Figura 3. Replicao viral
Observao: Replicao dos bacterifagos

Em relao aos bacterifagos, nos dois ciclos (ltico e lisognico), as fases
de replicao so quase idnticas. Entretanto, no ciclo ltico, o vrus insere
o seu material gentico na clula hospedeira, onde as funes normais
desta so interrompidas pela insero do cido nucleico viral, produzindo
tantas partculas virais que ao encher demasiadamente a clula, a arreben-
ta, liberando um grande nmero de novos vrus. Concluindo, no ciclo
ltico h uma rpida replicao do genoma viral, montagem e liberao de
Virologia | 137
vrus completos, levando lise celular, ou seja, a clula infectada rompe-se

e os novos vrus so liberados.
No lisognico, o vrus insere seu cido nucleico na clula hospedeira,
onde este torna-se parte do DNA da clula infectada e a clula continua
com suas funes normais. Durante a mitose, o material gentico da clula
com o do vrus incorporado sofrem duplicao, gerando clulas-filhas com
o novo genoma. Logo, a clula infectada transmitir as informaes ge-
nticas virais sempre que passar por mitose e todas as clulas estaro
infectadas tambm (Figura 4).
Figura 4. Ciclo ltico e Lisognico
5. P atognese da infeco viral

Patognese
A doena viral ocorre em consequncia da infeco viral em um
hospedeiro, o qual pode apresentar ou no sinais e sintomas clnicos. Em
muitos casos, a infeco viral no capaz de causar alteraes clnicas
visveis no indivduo, infeco inaparente ou subclnica. Entretanto, quan-

do observamos alteraes clnicas no hospedeiro, chamamos de infeco
sintomtica ou aparente.
Algumas infeces virais podem causar o que chamamos de sndrome,
que consiste em um grupo de sinais4 e sintomas5 especficos, caracterizando
uma determinada infeco. Sendo assim, podemos considerar que um mesmo
vrus pode causar sintomas clnicos diferentes. Alm disso, tambm possvel
que diferentes vrus possam causar os mesmos sintomas (Tabela 1).
Tabela 1- Correlao entre alguns sintomas clnicos da via respiratria e o

agente viral
Sndromes Principais Causas virais mais comuns

sintomas Lactantes Crianas Adultos
Laringite/ Rouquido, tosse Parainfluenza, Parainfluenza, Parainfluenza,
gripe de cachorro Influenza Influenza Influenza
Traqueobronquite Tosse Parainfluenza, Parainfluenza, Influenza,
Influenza Influenza Adenovrus
Bronquiolite Tosse, dispneia Vrus sincicial Raro Raro
respiratrio,
Parainfluenza
Faringite Faringite Adenovrus, Adenovrus, Adenovrus,
Herpes simples Vrus Coxsackie Vrus Coxsackie
Pneumonia Tosse, dor Vrus sincicial Influenza, Influenza,
torcica respiratrio, Parainfluenza Adenovrus
Influenza
Resfriado Obstruo nasal, Rinovrus, Rinovrus, Rinovrus,
comum secreo nasal Adenovrus Adenovrus Coronavrus
4
o que o mdico ou pessoas prximas ao paciente observam, como leses na pele, vmito,
diarreia, etc.
5
o que o paciente relata. Como dor de cabea, dores no corpo, tontura, etc.
Virologia | 139
Os diferentes sinais e sintomas da doena viral observados em um

hospedeiro so determinados por caractersticas especficas do agente, e
tambm do hospedeiro, as quais so influenciadas por fatores genticos
de ambos.
A patognese viral refere-se interao de fatores virais e do hospe-
deiro, que levam produo de doena. Um vrus patognico tem que ser
capaz de infectar e causar sinais da doena em um hospedeiro suscetvel.
No processo da patognese viral podemos observar doenas mais severas
ou mais brandas. Isso ocorre devido existncia de cepas virais mais ou
menos virulentas, ou s diferentes respostas imunolgicas do hospedeiro.
As respostas das clulas dos hospedeiros suscetveis s infeces
virais podem ocorrer atravs de trs caminhos diferentes: ausncia de alte-
raes aparentes, efeito citoptico (CPE) seguido de morte e transforma-
o celular (crescimento alterado).
Em relao aos padres de doenas virais no hospedeiro, as infec-
es podem se apresentar das seguintes formas: localizada ou disseminada,
sintomtica ou inaparente, aguda ou crnica. A persistncia de um agente
viral, sem que o hospedeiro manifeste sintomas clnicos especficos, carac-
teriza o perodo de latncia (Figura 5).
Figura 5. Latncia viral
Na infeco localizada, a replicao viral permanece prxima ao

stio de entrada do vrus. Exemplo: pele, tratos respiratrio e
gastroentrico. Na infeco sistmica ou disseminada, o espalhamento
do agente pelo organismo ocorre em vrias etapas, como entrada, disse-
minao para os linfonodos regionais, viremia primria e disseminao
para rgos suscetveis. Aps a viremia secundria, os vrus so dissemi-
nados para outros rgos, como crebro, pulmo, pele, etc. (Figura 6).
Existe uma predileo dos vrus para determinados rgos. Os vrus das
hepatites, por exemplo, atingem principalmente o fgado. o que cha-
mamos de tropismo viral.
Virologia | 141
Figura 6. Stios de entrada, viremia e disseminao viral
Como j dissemos anteriormente, nas infeces sintomticas, alm do

diagnstico clnico, necessria tambm a realizao do diagnstico laboratorial,
considerando que os sintomas clnicos sejam inespecficos para as doenas
virais (perodo prodrmico). No indivduo assintomtico, muitas vezes, a
infeco s confirmada aps exame laboratorial. Em gestantes, por exem-
plo, o Ministrio da Sade brasileiro recomenda que seja feito exame, a fim
de avaliar a imunidade para a rubola e comprovar se a mulher j teve
contato com o vrus anteriormente.
A infeco aguda caracterizada pela presena de sintomas inespecficos,
caractersticos das doenas virais, tais como febre, cefaleia e mialgia. Este
perodo o ideal para serem coletados espcimes clnicos necessrios para o

diagnstico laboratorial, j que a fase onde existe uma maior carga viral no
hospedeiro. Nas infeces crnicas, os vrus no so eliminados do organis-
mo, permanecendo quase sempre em nveis baixos, acarretando ou no sinto-
mas clnicos. Como exemplo desta infeco, temos os herpesvrus simples e o
HIV, dentre outros.
6- Epidemiologia das infeces virais

De acordo com a Portaria no 2.259, de novembro de 2005, o Minis-
tro da Sade, no uso de suas atribuies, aprovou a Resoluo 33/05 do
Grupo Mercado Comum, intitulada Glossrio de terminologia de Vigilncia
Epidemiolgica MERCOSUL que, entre outras providncias, conceitua ter-
mos para serem usados em Vigilncia Epidemiolgica.
Quadro 1 - Sntese do glossrio da Portaria no 2.259, de novembro de

2005.
Termos Conceitos
Caso autctone Pessoa ou animal que tenha contrado uma doena em sua
residncia (Pas)
Caso suspeito Pessoa ou animal cuja histria clnica, sintomas, sinais e possvel
exposio a uma fonte de contaminao, sugere que pode ter,
ou ir desenvolver uma doena infecciosa.
Cobertura vacinal Indicador que expressa a proporo da populao-alvo, que
foi vacinada conforme as normas estabelecidas nas estratgias
de vacinao.
Comportamento Comportamento das pessoas que aumenta a probabilidade
de risco de adquirir ou transmitir uma doena.
Controle de Aes ou intervenes desenvolvidas com o objetivo de reduzir
qualidade a morbidade e mortalidade de doenas ao mais baixo nvel
possvel.
Virologia | 143
Doena emergente/ Doena infecciosa recentemente conhecida, cuja incidncia

reemergente esteja aumentando em um determinado local ou em uma pessoa
especfica.
Endemias a presena contnua de uma doena ou um agente infeccioso
em uma rea geogrfica determinada.
Enzootia Presena contnua, ou prevalncia habitual, de uma doena ou
agente infeccioso na populao animal de uma rea geogrfica.
Epidemia Manifestao de um nmero de casos de alguma doena, que
excede claramente a incidncia prevista, em um perodo de
tempo determinado, em uma coletividade ou regio.
Erradicao Cessao de toda transmisso de uma infeco pela extino
artificial da espcie do agente em questo. A erradicao
pressupe a ausncia completa do risco de reintroduo de
uma doena, de forma que permita a suspenso de todas as
medidas de preveno e controle.
Foco natural Um pequeno territrio, compreendendo uma ou vrias zonas,
(nicho) onde a circulao do agente causal se estabelece em um
ecossistema por um tempo indefinidamente longo, sem a sua
importao de outra regio.
Fonte de uma pessoa, animal, objeto ou substncia a partir da qual o
infeco agente infeccioso se transmite a um hospedeiro.
Hospedeiro Organismo simples ou complexo, incluindo o homem, que em
circunstncias naturais permite a subsistncia ou o alojamento
de um agente infeccioso.
Hospedeiro aquele em que o parasita chega sua maturidade ou passa
definitivo por sua fase sexual.
Hospedeiro aquele no qual o parasita passa por sua etapa larvria ou
intermedirio assexual.
Taxa de Nmero de casos novos de uma doena em uma populao
incidncia particular durante um perodo especfico de tempo.
Perodo de Intervalo de tempo entre a exposio efetiva do hospedeiro

encubao suscetvel a um agente biolgico, ou seus produtos txicos, e
o incio de sinais e sintomas clnicos da doena neste hospedeiro.
Infestao Entende-se por infestao de pessoas ou animais, o alojamento,
o desenvolvimento e reproduo de artrpodes na superfcie
do corpo ou na roupa. Os objetos ou locais infestados so
aqueles que albergam ou servem de alojamento aos animais,
especialmente artrpodes e roedores.
Janela Intervalo entre o incio da infeco e a possibilidade de
imunolgica deteco de anticorpos, atravs de tcnicas laboratoriais.
Morbidade Expressa a ocorrncia de uma doena em uma populao. Os
indicadores so as taxas de incidncia e prevalncia.
Mortalidade a medida de frequncia de bitos em uma populao durante
um determinado perodo, normalmente um ano.
Oportunista Organismo que, vivendo normalmente como comensal ou de
vida livre, passa a atuar como parasito. Geralmente coincidindo
com uma diminuio da resistncia natural do hospedeiro.
Pandemias Epidemia que alcana grandes extenses geogrficas, de
forma quase simultnea ou com deslocamento de um
continente a outro.
Patogenicidade Capacidade de um agente biolgico de produzir doena em
um hospedeiro suscetvel.
Portador Pessoa ou animal infectado que alberga um agente infeccioso
especfico de uma doena, sem apresentar sintomas clnicos
desta, e que constitui fonte potencial de infeco.
Taxa de Nmero de casos existentes em um determinado momento,
prevalncia em uma populao definida.
Perodo Intervalo de tempo entre os primeiros sintomas da doena e o
Prodrmico incio dos sinais ou sintomas caractersticos da doena a qual
se pode estabelecer o diagnstico.
Virologia | 145
Reservatrio de Qualquer ser humano, animal, artrpode, solo, matria ou

agentes infecciosos uma combinao deles, nos quais normalmente vive e se
multiplica um agente infeccioso, do qual depende para a sua
sobrevivncia, de maneira que possa ser transmitido a um
hospedeiro suscetvel.
Surto Ocorrncia de dois ou mais casos de um evento de sade
vinculados epidemiologicamente.
Transmisso Transferncia do agente etiolgico por meio de veculos
indireta animados ou inanimados. Para que a transmisso indireta possa
ocorrer, essencial que os germes sejam capazes de sobreviver
fora do organismo durante um certo tempo e que exista um
veculo apto que leve os germes de um lugar para outro, de
modo que permita a sobrevivncia do agente.
Vetor Ser vivo (inseto ou outro animal) que assegura a transmisso
de um agente infeccioso.
Virulncia Grau de patogenicidade de um agente infeccioso, indicado
pelas taxas de letalidade ou por sua capacidade de invadir e
lesar os tecidos do hspede, ou por ambos os parmetros.
Zoonoses Infeco ou doena infecciosa transmissvel, em condies
naturais, dos animais vertebrados para os humanos.
A epidemiologia viral consiste na relao entre o agente viral e o meio

ambiente, ou meio externo. Nesta interao, a maioria dos vrus no vivel
no ambiente por longos perodos. Dessa forma, a transmisso de um vrus
pode ser invivel devido sua inativao no ambiente.
A epidemiologia a cincia que estuda as doenas em uma determinada
populao. Alm disso, investiga os fatores envolvidos na manuteno e trans-
misso das infeces, sua dinmica e distribuio. A complexidade dessas
interaes bastante varivel e pode envolver vrias espcies. Algumas infec-
es virais se mantm em uma populao atravs de uma cadeia de sucessivas
infeces agudas entre o hospedeiro de uma nica espcie animal. Mas exis-
tem vrus que so capazes de infectar vrias espcies de hospedeiros.
A fonte de infeco (hospedeiro ou reservatrio) qualquer vertebra-

do que esteja infectado e seja capaz de transmitir o agente para outros susce-
tveis. Esses hospedeiros podem ser classificados como portadores ou doen-
tes. Estes ltimos so os que manifestam os sinais clnicos da doena e so
considerados epidemiologicamente de menor importncia, pois so facilmente
reconhecidos e diagnosticados, permitindo a adoo de medidas de controle.
Por outro lado, os portadores geralmente so assintomticos, transmitindo a
doena por um maior perodo, por serem dificilmente identificados.
Com relao aos indivduos portadores, podemos classific-los em:
a) Portadores ativos. Podem se dividir em permanentes ou tempo-
rrios.
Os permanentes excretam os vrus continuamente, como, por exemplo,
os animais infectados com o vrus da diarreia bovina (BVDV); e os
temporrios excretam o agente apenas por determinados perodos.
b) Portadores prodmicos ou em perodo de incubao.
Estes portadores, alm de disseminarem o vrus no ambiente ou a outros
hospedeiros suscetveis, podem continuar disseminando o vrus aps a
resoluo da doena clnica.
6.1. Cadeia de infeco

Para a manuteno do processo infeccioso so necessrios:
Penetrao e replicao do agente viral no hospedeiro.
Produo da prognie vivel.
Prognie deve ser excretada do hospedeiro a tempo, pela via adequa-
da e em quantidade suficiente para permitir sua transmisso a outros
hospedeiros.
O agente viral deve resistir s adversidades do ambiente o tempo
necessrio para encontrar o hospedeiro suscetvel.
Virologia | 147
6.2. Interao vrus/hospedeiro

O encontro do vrus com o hospedeiro suscetvel torna possvel a
infeco viral. Esta interao consiste das seguintes etapas:
Penetrao do agente viral, a qual deve ocorrer pela via adequada.
Replicao nos tecidos e rgos-alvo.
Resistncia resposta imune do hospedeiro.
Produo da prognie viral.
Nova excreo viral.
A transmisso de um agente viral pode ser direta, ou seja, de um
hospedeiro para outro. Neste caso, as condies ambientais so menos rele-
vantes. Entretanto, a transmisso pode ser tambm por contato indireto, atra-
vs da manipulao de objetos contaminados ou artrpodos. Neste caso, as
condies ambientais so mais importantes no processo de transmisso.
Para que o agente viral excretado entre em um novo hospedeiro, a
suscetibilidade do indivduo deve se sobrepor sua resistncia ao vrus. Na
suscetibilidade esto associados vrios aspectos, como espcie, raa, sexo,
idade, exposio prvia ao agente, estado nutricional e fisiolgico, e outros.
Todos esses aspectos contribuiro para a suscetibilidade ou resistncia ao agen-
te viral. A perpetuao de uma determinada infeco viral dependente do
nmero de hospedeiros suscetveis. Caso isto no ocorra, o vrus pode ser
extinto em uma dada populao.
6.3. Mecanismos de Transmisso

Para a entrada do vrus na clula, este deve, inicialmente, se adsorver ou
se ligar a receptores existentes na superfcie das clulas do hospedeiro e, a
partir da, penetrar. A maioria dos vrus entra no hospedeiro atravs das mucosas
dos tratos respiratrio e gastrointestinal. Alguns vrus invadem o hospedeiro
pelas mucosas urogenital e conjuntiva. Nesta primeira, temos como exemplo o
vrus da imunodeficincia humana (HIV). Alguns vrus so introduzidos no
hospedeiro diretamente atravs do sangue, como o caso dos vrus da hepa-

tite B e o prprio HIV (Quadro 2).
Quadro 2- Principais vias de entrada dos vrus associados s infeces em humanos

Via de Grupo de vrus Produo de sintomas Produo de infeco
entrada locais na porta de entrada generalizada associada
doena de rgos especficos
Retrovrus Vrus da imunodeficincia humana
Injeo
Hepadnavrus Hepatite B
Herpesvrus Vrus Epstein-Barr, citomegalovrus
Flavivrus Muitas espcies, incluindo o vrus
Picadas e da febre amarela
mordidas Togavrus Muitas espcies, incluindo o vrus
da dengue e das encefalites equinas
Rabdovrus Vrus da raiva
Boca, trato Reovrus Rotavrus
intestinal Picomavrus Alguns enterovrus, incluindo
poliovrus e vrus da hepatite A
Herpesvrus Vrus Epstein-Barr, Citomegalovrus
herpes vrus simples
Adenovrus Algumas espcies
Pele, Poxvrus Vrus do molusco
traumatismo contagioso, vrus orf
leve Herpesvrus Herpesvrus simples
Papovarrus Papiloma vrus
Coronavrus Maioria das espcies Citomegalovrus
Vias
respiratrias Paramixovrus Vrus da parainfluenza, vrus Vrus da caxumba, vrus
sincial respiratrio do sarampo
Ortomixovrus Vrus da influenza
Togavrus Vrus da rubola
Picomavrus Rinovrus Alguns enterovrus
Poxvrus Vrus da varola (extinto)
Herpesvrus Vrus Eptein-Barr, Vrus da varicela
herpesvrus simples
Adenovrus Maioria das espcies
Virologia | 149
6.3.1. Mucosa
6.3.1.1. Trato respiratrio
O trato respiratrio a principal via de entrada do vrus no organismo.

Seus mecanismos de defesa compreendem: a presena de clulas epiteliais ciliadas,
muco, anticorpos secretrios da classe A, clulas fagocitrias alveolares, dentre
outros. Alguns desses mecanismos auxiliam na remoo de partculas estranhas.
Muitas vezes, os vrus ultrapassam essas barreiras, principalmente quan-
do h um imunocomprometimento. Inicialmente, esses agentes se replicam nas
clulas epiteliais, produzindo uma infeco localizada, podendo ser dissemina-
da, rapidamente, com o auxlio dos fludos locais. A infeco localizada no
est, necessariamente, relacionada a uma doena mais amena, pois, em muitos
casos, grandes reas do trato respiratrio podem estar acometidas, causando
uma enfermidade severa. A excreo das partculas virais, por esta via para o
ambiente, favorece a rpida disseminao viral entre os indivduos.
Exemplos dos vrus que causam infeco localizada no trato respiratrio:
Vrus da influenza, Vrus Parainfluenza, Rinovrus, Vrus Respiratrio Sincial e
Adenovrus.
Exemplos de vrus que infectam atravs do trato respiratrio e causam infeco
disseminada: Vrus da Caxumba, Vrus do Sarampo e Vrus da Rubola.
6.3.1.2. Trato gastrointestinal
Nesta via a infeco dada principalmente pela ingesto de alimentos

ou gua contaminados, podendo ocorrer tambm pelo compartilhamento de
talheres e copos utilizados por pessoas infectadas. A via de entrada a
orofaringe, onde esses agentes se concentram ou so transportados para o
trato gastrointestinal. J a excreo viral feita pelas fezes, completando o
ciclo oral-fecal.
O trato gastrointestinal, por sua vez, protegido contra os agentes

infecciosos por imunoglobulinas secretoras (IgA), muco, cidos gstricos, sais
biliares, enzimas proteolticas, dentre outros. Alm desses, o peristaltismo
um importante mecanismo para manter o alimento e o agente em movimento,
dificultando o estabelecimento da infeco. Em situaes extraordinrias, pode
ocorrer o inverso, ou seja, um movimento antiperistltico, cuja funo a
eliminao do microrganismo. Em geral, os vrus que causam infeco intestinal
so cido-bile resistentes.
Exemplos dos vrus que causam infeco localizada na boca e orofaringe:
Vrus do Herpes Simplex, Vrus Epstein-Barr e Citomegalovrus.
Exemplos de vrus que infectam o trato gastrointestinal, produzindo
enterites: Rotavrus, Vrus Norwalk e Astrovrus.
Exemplos de vrus que infectam atravs do trato gastrointestinal e
causam infeco disseminada: Vrus da hepatite A, Vrus da Hepatite E
e Poliovrus.
6.3.1.3. Trato gniturinrio
uma via de entrada para vrios tipos de vrus, principalmente os que

utilizam via sexual. A contaminao dada pelas diversas formas de contato
sexual entre indivduos e por instrumentos cirrgicos ginecolgicos e roupas
ntimas contaminadas (fmites).
O pH, a microbiota e o muco local constituem uma importante prote-
o desta via. Assim como nos tratos discutidos anteriormente, o vrus pode se
alojar localmente ou disseminar para outras reas.
Exemplos dos vrus que causam infeco localizada no trato gnito-
urinrio: Vrus do Herpes simplex, Vrus do Papiloma.
Exemplos de vrus que infectam o trato gniturinrio, produzindo
infeces sistmicas: Citomegalovrus, Vrus de Hepatite B e C e HIV.
Virologia | 151
6.3.1.4. Conjuntiva
O acometimento da conjuntiva pode se dar por infeco dos olhos

pelas mos ou objetos contaminados. Pode ser causada, na maior parte das
vezes, por um Adenovrus, que normalmente causa o resfriado comum, permi-
tindo a transmisso por gotculas de tosse e por espirros.
Embora menos resistente que a pele, a conjuntiva constantemente
lavada pela secreo lacrimal, que funciona como uma barreira bioqumica,
contendo principalmente a lisozima6 IgA secretria. A conjuntiva ainda
protegida fisicamente pelos clios e movimentos das plpebras, os quais
auxiliam na manuteno da lubrificao dos olhos.
Exemplos dos vrus que infectam por meio da conjuntiva: Enterovrus e
Adenovrus.
6.3.2. Pele
Esta uma porta de entrada de vrios agentes microbianos. Apesar de a

picada dos artrpodes e a contaminao via sangunea terem como primeiro
acesso a pele, optamos por separ-los deste item para uma melhor compreen-
so do ciclo de transmisso viral.
A infeco da pele possvel atravs do contato direto com leses de
pessoas infectadas, mordida de animais vertebrados, objetos contaminados
(ex: alicates) e a presena de soluo de continuidade, permitindo a penetra-
o do vrus.
Sua proteo se deve ao epitlio estratificado da pele, pH, cidos
graxos (gordura), secrees (suor), e os pelos que revestem a epiderme.
Exemplos dos vrus que causam leses cutneas localizadas: Papilomavrus,
Poxvrus.
6
Enzima microbicida
Exemplos de vrus transmitido por mordida de animal: Vrus da Raiva

(Rhabdovrus).
6.3.3. Sangue
A infeco do sangue pode ocorrer por meio de compartilhamento de
seringas, transfuso sangunea e transplante de rgos. A proteo desta via,
alm da pele e da mucosa (porta de entrada), o prprio sistema imunitrio,
j que envolve componentes sanguneos (clulas, sistema complemento,
imunoglobulinas, etc.) para o combate da infeco. Esta defesa pode ser
burlada pelos vrus, atravs dos mecanismos de escape ou mesmo pelo fato de
alguns vrus possurem tropismo por clulas do sistema imune.
Exemplos de vrus transmitidos por via iatrognica (agulhas, material
cirrgico): HIV, Vrus da Hepatite B e C.
6.3.4. Vetores
Alguns vrus, denominados Arbovrus, so transmitidos estritamente
por vetores, como os mosquitos, os quais tm o papel de carre-los e
transmiti-los, atravs da picada, para os hospedeiros vertebrados. Esses agentes
so armazenados, podendo se replicar no interior dos artrpodes sem causar
danos a estes.
Exemplos de vrus transmitidos por artrpodes: vrus da dengue e da
febre amarela.
6.3.5. Transmisso Vertical
Esta transmisso ocorre da me para o filho e pode ser, via placenta ou

congnita, no momento do parto ou perinatal7, ou ainda pela exposio ps-
parto, via amamentao.
7
sangue e secrees
Virologia | 153
Como barreiras de proteo, a me passa para seu filho, por via

placentria, imunoglobulinas IgG e pela amamentao, em especial no colostro,
IgA. O feto e o recm-nascido, por sua vez, produzem a IgM em resposta a
uma infeco.
Exemplos de vrus transmitido por via placentria: vrus da rubola e
citomegalovrus.
7. Profilaxia
A profilaxia das doenas virais segue os mesmos princpios da de outras
doenas infectoparasitrias, que englobam a implantao de polticas de sade
pblica. Dentro desse contexto, a educao assume um papel fundamental,
pois necessria a informao para a sociedade sobre o agente etiolgico,
formas de transmisso, a sintomatologia e os fatores de risco para que haja um
controle eficaz da doena.
As doenas virais podem ser transmitidas de diversas maneiras, como
comentado anteriormente. Dessa forma, aos vrus que so contrados por via
oral, merecem que seja dada uma ateno especial no saneamento bsico,
controle da gua e alimentos ingeridos e higiene de forma geral, principalmente
das mos. Em relao transmisso por via respiratria, devem-se evitar ambi-
entes fechados e, em casos de epidemias, pacientes infectados devem ser
isolados e seus contactantes mantidos em monitoramento. Caso seja necess-
rio, devem ser realizados programas de preveno, como a distribuio de
mscaras para a populao.
Para vrus transmitidos via parenteral, a profilaxia enfoca os bancos de
sangue, o cuidado no uso de material descartvel (luvas, agulhas, etc...) e
instrumentos cirrgicos ou odontolgicos. As doenas sexualmente transmissveis
(DST) abrangem as campanhas de uso de preservativos e de vacinao, quan-
do existentes. E ainda, os vrus transmitidos por vetores tm como principal
ponto profiltico o controle ou a erradicao destes insetos.
A imunizao do indivduo feita por meio da inoculao do pr-

prio agente viral modificado (atenuado ou morto) ou parte deste. O
tempo de imunidade, conferida pelas vacinas, varia de acordo com as
caractersticas dos respectivos vrus, tornando necessria, em muitos casos,
a reimunizao (reforo vacinal). A vacinao tem sido a forma mais eficaz
de prevenir algumas doenas, as quais podem ser fatais em determinados
indivduos. A infeco pelo vrus influenza em idosos, por exemplo, pode
apresentar complicaes severas e at mesmo o bito. Desta forma, a
vacinao em idosos, de um modo geral, ameniza a severidade da doena.
Cada pas possui uma relao de vacinas em suas campanhas, de
acordo com as doenas presentes em seu territrio. Desde o nascimento
do beb at a terceira idade existe um programa de imunizao obrigat-
rio. Algumas vacinas so apenas necessrias em alguns casos como, por
exemplo, em viagens para regies endmicas. Casos especiais devero ser
avaliados, como os de alergias aos componentes das vacinas, os de gravi-
dez e os de imunizao com vrus vivo, o qual no pode ser administrado
em indivduos imunodeprimidos.
Como vimos, vrias doenas podem ser prevenidas por vacina, evi-
tando possveis complicaes e at mesmo o bito em determinadas classes
de indivduos. Dentre estas vacinas, possvel prevenir vrias doenas,
como febre amarela, hepatite B, sarampo, poliomielite e outras.
Desde 1937, a Fiocruz (antigo Instituto Soroterpico de
Manguinhos) desenvolve a tcnica da produo da vacina contra febre
amarela, inoculando o vrus 17D em ovos de galinha embrionados (SPF).
O tempo de imunidade conferida por esta vacina de 10 anos e
contraindicada em indivduos com histrico de alergia s protenas do ovo
e da galinha.
Virologia | 155
Figura 7. Produo de vacina contra febre amarela 1959 - Fiocruz (arquivo

particular do Dr. Jos Fonseca da Cunha)
Outra doena prevenvel por vacina, principalmente para os profissionais

da sade, a hepatite, causada pelo Vrus da hepatite B, que pode levar a um
quadro severo, crnico e fatal. Alm disso, a hepatite B umas das principais
causas de cncer de fgado. Assim, a vacina para combater esse vrus previne
no apenas a hepatite B, mas tambm o desenvolvimento de cncer heptico.
A produo dessa vacina baseia-se no emprego de fragmentos de antgeno s
do Vrus da hepatite B (HbsAg), um importante imungeno, para a induo
da formao de anticorpos, o que no representa um risco de causar a doena.
Como tambm verificado anteriormente, para a febre amarela, a durao
da imunizao, nesse caso, de 10 anos, conferida aps um correto esquema
de vacinao (trs doses com intervalos de 1 a 3 meses).
A vacina contra o sarampo produzida por Biomanguinhos, unidade da
Fiocruz desde 1982, empregando a tecnologia fornecida pelo Instituto Biken
por cooperao entre o Brasil e o Japo. Nesta vacina, o vrus inoculado em
clulas denominadas fibroblastos de pinto, obtidas de embries de galinha
com 10 a 11 dias de desenvolvimento, utilizando a cepa Biken CAM 70.
As campanhas de vacinao contra o sarampo em crianas menores de um ano

permitiram uma reduo do nmero de casos a partir de 1992.
A poliomielite foi considerada erradicada do Brasil, graas s contnuas
campanhas de vacinao no nosso pas utilizando a vacina Sabin, coordenadas
pela Organizao Mundial da Sade (OMS). Entretanto, o vrus ainda circula
em diversos pontos do mundo, como em alguns pases da frica e da sia.
Sabin a vacina utilizada em imunizaes de rotina no Brasil. Os principais alvos
das campanhas so as crianas menores de 5 anos que recebem a vacina e
comeam, ento, a eliminar os vrus junto com as fezes por cerca de um ms e
meio, o que pode levar a uma vacinao secundria de outras pessoas. Os
indivduos imunizados produzem anticorpos contra os trs sorotipos (1, 2 e 3).
Atualmente, existem vrios tipos de vacinas, como as atenuadas, as
inativadas, as de subunidades, as recombinantes e as de cido nucleico ou de
DNA, ainda em fase de estudos clnicos. As atenuadas consistem na presena
do agente viral vivo modificado, principalmente por passagens sucessivas do
agente viral em culturas celulares, permitindo ao vrus a perda da capacidade
patognica, mas mantendo sua capacidade replicativa. Esta vacina tem como
principal vantagem a induo de excelente resposta imunolgica pelo hospe-
deiro. Mas, por outro lado, no deve ser usada por indivduos imunodeficientes,
pois pode haver a reverso de vrus vacinal a selvagem nestes indivduos.
Como exemplo desta vacina temos a Sabin, vacina oral contra a poliomielite.
As vacinas inativadas so constitudas por vrus mortos por processos
fsicos, como a temperatura, ou por processos qumicos, como o formaldedo.
A vantagem desta vacina que pode ser utilizada em qualquer indivduo, pois
no h a possibilidade de reverso do vrus vacinal a selvagem. No entanto, a
desvantagem que a resposta imunolgica no to boa. A vacina contra a
raiva exemplifica esta categoria de vacinas.
As vacinas de subunidades consistem de fragmentos do agente viral, os
quais so molculas importantes na induo de anticorpos protetores como,
Virologia | 157
por exemplo, a vacina contra a influenza, que consiste das hemaglutininas e

neuraminidases do vrus. A grande vantagem destas vacinas no expor o
indivduo ao agente viral como um todo.
As vacinas atenuadas so as mais antigas, surgiram h mais de 200
anos, marcando o incio da imunologia como cincia. Estas vacinas foram
desenvolvidas por um pesquisador ingls chamado Edward Jenner, o qual
utilizou o vrus da vaccnia para imunizaes contra a varola, doena epid-
mica, responsvel pela morte de milhes de pessoas. O chamado vrus
vaccnia, causava leses em bovinos e Jenner observou que ordenhadores
raramente tinham varola. Ele teve a ideia de coletar o vrus de animais e
us-lo, com sucesso, para vacinar pessoas contra a varola. A varola
considerada a nica doena mundialmente erradicada, pois no existe mais
a circulao desse vrus, graas s campanhas de vacinao. A Organizao
Mundial da Sade declarou a varola como erradicada no mundo no dia 8
de maio de 1980. Da mesma forma, havia uma previso de erradicao da
poliomielite at o ano de 2002. Mas, apesar do intenso esforo de todos
os pases, isso ainda no aconteceu.
Com a introduo da biologia molecular, foi possvel a fabricao de
vacinas recombinantes, as quais apresentam pequenos peptdeos origina-
dos de alguma protena viral. A obteno destas molculas s possvel
atravs da tecnologia da recombinao gnica. A vacina contra a hepatite
B, atualmente usada no Brasil, segue esta tecnologia de fabricao.
Ainda em fase de estudos pr-clnicos e clnicos, as vacinas de
DNA podero ser a sada para prevenir algumas doenas virais, as quais
so causadas por vrus de alta capacidade de mutao e alto grau de
virulncia, como o Vrus da Imunodeficincia Humana (HIV).
8. T
Tratamento
ratamento
O controle de algumas doenas virais atravs da quimioterapia foi uma
grande conquista das ltimas dcadas. Devido caracterstica peculiar dos
vrus, que a de agir como um parasita intracelular obrigatrio, durante muito
tempo achou-se que seria impossvel o desenvolvimento de drogas contra estes
agentes. Mas a identificao de enzimas produzidas por estes prprios agen-
tes, e que os possibilitam replicar no interior das clulas, impulsionou os
estudos de drogas capazes de inibir tais enzimas, de modo a no danificar as
clulas do hospedeiro.
Considerando que todas as fases do ciclo de replicao viral requerem a
participao de uma enzima, o bloqueio de qualquer uma das referidas fases
acarretaria na no formao da partcula infecciosa. Tais etapas do ciclo de
replicao viral incluem: adsoro, desnudamento, sntese, maturao e libera-
o da prognie viral da clula hospedeira.
As drogas antivirais podem atuar interferindo em qualquer uma das
etapas da replicao viral, como a adeso clula, a penetrao, a eliminao
do envoltrio viral para liberar seu material gentico e a produo de novas
partculas virais por parte da clula. Como os vrus somente replicam no interior
das clulas e utilizam as mesmas vias metablicas que as clulas sadias, as
drogas antivirais so frequentemente mais txicas para as clulas humanas que
os antibiticos. Um outro problema das drogas antivirais que o vrus pode
desenvolver rapidamente resistncia a elas mesmas.
Na tabela a seguir, encontram-se algumas drogas antivirais, os vrus
suscetveis e os seus respectivos stios-alvos.
Virologia | 159
Quadro 4. Mecanismos bsicos de ao de drogas antivirais
Drogas antivirais
Saquinavir Anti- Anti- Anti- Outros
herpticos influenza hepatite
Indinavir Aciclovir Amantadina Adefovir Imiquimod
Azatavir Cidofovir Oseltamivir Lamivudina Interferons
Inibidores Ritonavir Docosanol Rimantadina Entricitabina Ribavirina
de Nelfinavir Famciclovir Zanamivir
proteases Amprenavir Foscarnet Peramivir
A I S
Lopinavir Formivirsen
Tipranavir Ganciclovir
Darunavir Idoxuridina
A N T I R E T R O V I R
Inibidores Enfuvitide Penciclovir

de fuso
Inibidores Zidovudina Trifluridina
de
transcriptase
reserva
Didadosina Brivudina
Anlogo de
nucleosdeo
Estavudina Valaciclovir
Zalcitabina Valganciclovir
Lamivudina Vidarabina
Entricitabina
Abacavir
Neviparina
nucleotdeo de nucleosdeo
Anlogo de No anlogo
Efavirenz
Delavirdina
Tenofovir
Adefovir
Mecanismos gerais de ao dos antivirais:

Amantadina (1966) e Rimantadina (1993): inibem a penetrao da
partcula viral no hospedeiro, bloqueiam a desencapsulao do genoma
viral e a sua subsequente transferncia para a clula hospedeira.
Zanamivir e Oseltamivir: inibidores da neuraminidase.
Paramivir: impede a liberao de novos vrus da clula infectada.
Aciclovir, Valaciclovir, Penciclovir e Fanciclovir: Inibio competitiva
da DNA polimerase. O trifosfato de Aciclovir incorporado no
DNA viral, impedindo o alongamento da cadeia de DNA. No caso
do Valaciclovir, este convertido em Aciclovir quando ingerido. J o
Penciclovir apresenta potncia cem vezes menor que o Aciclovir.
Ganciclovir e Valganciclovir: atuam na terminao da cadeia por
fosforilao, at a forma GCV monofosfato na posio 3. A repetio
de cadeia redundante, a no ser que seja realmente necessria.
Cidofovir: atua na terminao da cadeia por fosforilao, at a forma
difosfato, e na incorporao na posio 3.
Foscarnet: inibe a DNA polimerase, a RNA polimerase e a
transcriptase reversa.
Fomivirsem: complementar sequncia de bases, hibridiza-se e blo-
queia a expresso (translao) do RNAm do CMV, inibindo a snte-
se de protenas e a replicao viral.
Interferons: liga-se a receptores de superfcie em clulas infectadas,
inibindo a transcrio e a traduo de RNAm viral.
Imiquimod: indutor tpico de citocinas que potencializa a produo
de alfa-interferon, o qual apresenta efeito antiviral, antiproliferativo e
antiangiognico.
Virologia | 161
9. Diagnstico Laboratorial
Os diferentes mtodos de diagnstico dos vrus permitem a identifica-
o da morfologia e das protenas, alm do cido nucleico. Muitas vezes
necessrio utilizar mais de um mtodo, a fim de se ter uma melhor definio
diagnstica, j que existem diferentes vrus que apresentam morfologia seme-
lhante. Desta forma, o diagnstico no pode ser baseado apenas neste
aspecto morfolgico outros aspectos devero ser considerados para um di-
agnstico preciso.
Com a utilizao de animais de laboratrio e das culturas de clulas,
possvel isolar e identificar estes agentes. Devido dificuldade do isolamento
de um vrus a partir de espcimes clnicos (secrees diversas, urina, fezes,
lquido cefalorraquidiano, pele, lquido pleural, saliva, soro, etc.), os ensaios
sorolgicos so uma alternativa e permitem a avaliao indireta do vrus, pela
deteco de anticorpos especficos, tanto na fase aguda da doena, quanto na
de convalescena.
A realizao dos ensaios laboratoriais para o diagnstico viral deve
obedecer a todas as normas de Biossegurana e boas prticas de paboratrio
(ver captulo 1 do volume 1).
9.1. Isolamento dos vrus

Os vrus, ao contrrio de outros microrganismos, s se replicam em
clulas vivas. Desse modo, seu isolamento apenas possvel quando se utiliza
um hospedeiro vivo, como a cultura de clulas, os animais de laboratrio e os
ovos embrionados.
9.1.1. Cultura de clulas

As clulas de mamferos foram cultivadas pela primeira vez em laborat-
rio h pouco mais de 70 anos. Em meados do sculo XX, um grupo de
pesquisadores isolou o Poliovrus em cultura de clulas. A partir da, uma
infinidade de famlias virais foi isolada e identificada, sendo algumas destas no

associadas s doenas da poca (ver detalhes no captulo 4 do volume 2).
Por meio da microscopia tica, a presena do vrus identificada de
forma indireta, atravs de alteraes morfolgicas na clula, denominadas efei-
to citoptico (CPE).
9.1.2. Animais de laboratrio
Esse mtodo no muito utilizado atualmente por dois motivos

principais: o primeiro, pela dificuldade de aprovao do uso pelo Comit
de tica de Animais de Laboratrio e de Biossegurana, que sugere,
quando vivel, a utilizao de outros mtodos; o segundo, pelo tempo
demandado para o desenvolvimento da doena no animal. Na maioria das
vezes no possvel reproduzir a doena humana em animais, sendo difcil
a correlao com a encontrada em humanos. (ver captulo 4 do volume 1).
9.1.3. Ovos Embrionados
Os ovos utilizados para o cultivo de alguns vrus so os de galinha

embrionados, como SPF (Specific Pathogen Free). A escolha destes se deve a
cinco critrios:
Disponibilidade do material.
Facilidade de crescimento e manipulao, uma vez que no necess-
rio cuidado com manejo e alimentao.
Meio constante com composio qualitativa, possuindo grande con-
centrao de nutrientes.
Ausncia da produo de anticorpos pelo embrio (livre de patgenos);
Meio estril, enquanto o ovo estiver fechado.
Virologia | 163
Neste hospedeiro, existem diferentes stios para a inoculao do vrus

(saco alantide, cavidade amnitica, membrana corio-alantoide e gema). A
escolha de um deles dependente do tropismo viral. A confirmao da
infeco baseada na presena de membrana (efeito citoptico), deformao
e morte do embrio.
Os procedimentos que devem ser seguidos para a realizao desta
tcnica so:
Manuteno do ovo de galinha embrionado SPF em estufa a 37 graus
Celsius, com umidade de 55% e sob constante movimento, simulando
a situao real (chocadeira mecnica).
Antes da inoculao indispensvel a inspeo dos ovos, atravs do
ovoscpio8. Todos os embries devem estar vivos.
Em mdia, o material suspeito inoculado de 6 a 8 dias aps a
inspeo dos ovos.
Escolher a regio para a inoculao de acordo com o tropismo do
vrus, sendo:
Regio Inoculao de
Saco alantoide Vrus da gripe e da caxumba
Cavidade amnitiva Vrus da encefalite
Membrana corioalantoide Vrus da herpes, varola e sarampo
Saco vitelino Vrus da raiva
8
Equipamento de iluminao utilizado para visualizar o interior do ovo.
Figura 8. Esquema do ovo embrionado de galinha - desenhado por Raphael

dos Santos Stephens.
9.2. Identificao direta e indireta dos vrus

O diagnstico pode ser feito pela deteco direta do vrus, ou por
parte dele, como as protenas e o cido nucleico. Assim como possvel
fazermos o diagnstico indireto, identificando alteraes causadas pelo agente
ou pelos anticorpos gerados devido presena dos vrus.
9.2.1. Microscopia eletrnica (ME)
A ME utiliza o microscpio eletrnico, o qual emite feixes de eltrons

sobre o material, de modo que a visualizao do objeto seja possvel. Este
mtodo se subdivide em microscopia eletrnica de varredura e de transmisso.
Os eltrons transmitidos, parcialmente absorvidos pelo objeto, servem para
formar a imagem no microscpio eletrnico de transmisso. Na microscopia de
varredura so produzidas imagens de alta resoluo a partir da superfcie de
uma amostra, demonstrando uma aparncia tridimensional caracterstica, que
so teis para avaliar a estrutura superficial de uma determinada partcula (ver
captulo 1 do volume 2).
Virologia | 165
9.2.2. Ensaios imunolgicos
A resposta imune tem papel fundamental na defesa contra agentes infec-

ciosos e constitui o principal impedimento para a ocorrncia de infeces
disseminadas, habitualmente associadas com um alto ndice de mortalidade. Os
mtodos mais empregados para o diagnstico virolgico, devido sua praticidade
e seu baixo custo em relao aos outros, so os que se baseiam na interao
de alguns antgenos virais com anticorpos especficos. Os anticorpos e os
antgenos virais podem ser dosados a partir de secrees seromucosas, como
urina, fezes, lquido cefaloraquidiano, tecidos, soro, etc. A quantidade e as
caractersticas dos anticorpos e antgenos obtidos so determinadas utilizando-
se ensaios. Estes ensaios so designados de sorolgicos, pois inicialmente
utilizou-se soro para a realizao de tais mtodos. Algumas modalidades des-
tes mtodos so: neutralizao, precipitao, aglutinao, imunocitologia e
imunoenzimticas (ver captulo 1 do volume 4).
9.2.2.1. Neutralizao de vrus com anticorpos

Em nvel celular, as alteraes nas clulas infectadas por vrus variam de
morfolgicas a de crescimento, como arredondamento celular, presena de
incluses, rompimento e fuses celulares. As tcnicas de neutralizao com
anticorpos se baseiam na infeco viral em cultura de clulas e o bloqueio da
replicao viral por anticorpos neutralizantes. Este mtodo mede a capacidade
dos anticorpos, presente nas amostras de soro do paciente, em neutralizar os
vrus, ou seja, reduzir ou eliminar o efeito citoptico produzido pelos vrus nas
clulas infectadas. A soroneutralizao um ensaio que permite a titulao dos
anticorpos para determinados vrus, presentes no sangue do paciente.
9.2.2.2. Precipitao
As reaes de precipitao podem ser realizadas em meio lquido ou

gelatinoso. Existem duas modalidades desta reao:
A) Imunodifuso Radial Simples

No gel de agarose que recobre uma lmina de vidro, o soro especfico
incorporado e, em orifcios feitos no gel, so adicionadas diferentes concen-
traes do antgeno. Durante a incubao, ocorre a difuso do antgeno na
agarose, com a formao de complexos antgeno-anticorpo. Os complexos
precipitam e formam um halo ao redor do orifcio. Esta reao visualizada
pela colorao do gel aps o trmino da reao.
B) Imunodifuso Dupla
Introduzem-se anticorpos e antgenos em diferentes zonas de um gel de
agar. Durante a incubao, ocorre a difuso do anticorpo em direo ao
antgeno, ou vice-versa. Ocorre ento a formao de complexos antgeno-
anticorpo insolveis, que precipitam e iro formar linhas entre os orifcios. a
formao da linha de precipitao (identidade) que indica a presena de
anticorpos ou antgenos especficos.
9.2.2.3. Inibio de Hemaglutinao
Esta metodologia se baseia na propriedade de certos vrus em aglutinar

hemcias. A reao consiste em reagir diluies dos soros do pacientes
com um antgeno hemaglutinante, previamente titulado. Havendo anticorpos
na amostra, estes iro inibir a hemaglutinao. Caso contrrio, o vrus ir
aglutinar as hemcias.
9.2.2.4. Imuno-histoqumica
uma tcnica que permite localizar componentes tissulares in situ de

forma direta ou indireta, e est baseada na conjugao de marcadores
(fluorocromos, enzimas, dentre outras) a molculas de imunoglobulina, a fim
de se visualizar a reao antgeno-anticorpo.
Virologia | 167
A) Imunoperoxidase
Tcnica que utiliza como marcador a enzima peroxidase, originan-
do uma molcula visvel ao microscpio ptico. Esta tcnica muito
utilizada para o diagnstico de HPV.
B) Imunofluorescncia
Tcnica que utiliza como marcadores compostos como a fluorescena
e a rodamina, que ao serem expostos luz Ultravioleta do microscpio
de fluorescncia, emitem uma fluorescncia que visvel aos nossos olhos.
Esta tcnica muito utilizada para o diagnstico de vrias doenas virais
como Citomegalovrus e HIV.
9.2.2.5. Ensaio imunoenzimtico
A) Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ELISA

Este um dos principais mtodos utilizados para o diagnstico de
doenas virais, permitindo a deteco de anticorpos especficos no soro
ou plasma sanguneo. Este ensaio baseia-se na reao antgeno-anticorpo,
onde uma das duas molculas marcada com uma enzima como, por
exemplo, a peroxidase. Neste ensaio inclui-se tambm uma substncia
cromognica e um substrato especfico para a enzima. A positividade do
resultado est relacionada presena de cor, significando que houve
reao de um antgeno. A intensidade da cor permite uma anlise quan-
titativa do resultado.
B) Immunoblotting
um mtodo utilizado para determinar a quantidade relativa e o
peso molecular de uma protena presente em uma mistura de protenas
ou de outras molculas. A mistura primeiramente submetida a uma
separao analtica, geralmente por eletroforese em gel de poliacrilamida
(SDS-PAGE), de modo que as molculas sero separadas de acordo com os

seus pesos moleculares. O espectro de protenas separadas ento transferido
do gel para uma membrana suporte, por ao de capilaridade ou eletricidade
(eletroblotting), de modo que a membrana adquira uma rplica do espectro das
molculas. A posio do antgeno proteico na membrana pode, ento, ser
detectado pelo acoplamento de um anticorpo marcado, especfico para aquela
protena. Este mtodo pode ser usado como confirmatrio para o HIV.
9.3 Ensaios Moleculares
9.3.1- PCR (reao em cadeia da polimerase)

Praticamente qualquer microrganismo pode ser pesquisado pela tcnica
da PCR. Agentes como vrus, bactrias, fungos e protozorios podem ser
identificados nos mais diferentes tipos de amostras e lquidos biolgicos.
A capacidade de amplificar muitas vezes o cido nucleico viral permite que,
atravs desta tcnica, uma pequena quantidade de partculas virais sejam detectadas.
A reao em cadeia da polimerase (PCR) uma tcnica razoavelmente
rpida, com elevado grau de sensibilidade e especificidade, utilizando quanti-
dades mnimas de DNA ou RNA. Para esta reao so necessrias algumas
enzimas como a DNA polimerase, enzima responsvel pela replicao, uma
regio especfica do cido nucleico pesquisado (Primer), nucleotdeos, dentre
outros reagentes, alm de equipamentos, como o termociclador.
9.3.2. Hibridizao
Tendo-se em vista que os vrus possuem cido nucleico, o emprego de
tcnicas que sejam capazes de detectar esta molcula viral faz-se importante. A
hibridizao de fitas de DNA de diferentes fontes forma a base de um conjunto de
tcnicas essenciais prtica moderna da gentica molecular. possvel se detectar
uma sequncia especfica de DNA ou gene alvo, hibridizando aquela regio alvo
Virologia | 169
com uma sequncia complementar de bases (sonda), usualmente marcada com

alguma molcula. O processo de hibridizao molecular pode ocorrer entre duas
fitas de DNA /RNA ou entre uma de DNA e outra de RNA. As tcnicas de
hibridizao podem variar para se detectar uma molcula de RNA especfico em vez
de uma de DNA, o que permitiria verificar se um gene em particular se encontra
ativo ou inativo.
A Sonda um segmento conhecido de DNA ou de RNA, obtido por
clonagem molecular ou sntese qumica, que complementar a uma sequncia de
interesse e que contm uma marcao (radioistopo ou marcador qumico), a qual
permite a sua visualizao e o acompanhamento da reao.
Esse processo altamente especfico e controlvel, e a sensibilidade dos
mtodos por sonda pode ser aumentada pela amplificao especfica de algumas
sequncias virais por PCR.
10. Caractersticas das principais famlias

A disseminao viral em humanos decorre de milhares de anos, caracterizan-
do a relao mais ntima do homem com outros seres no contexto ambiental. Os
vrus tm dimenses em nanmetros, apresentam simplicidade estrutural e depen-
dncia pela clula hospedeira. Por este fato, mantm-se a ideia de que so parasitas
intracelulares obrigatrios e tambm so capazes de alterar parcialmente o DNA da
clula hospedeira.
Os vrus infectam diferentes espcies de hospedeiros; os que infectam animais,
principalmente, so, agrupados de acordo com a estrutura de seu genoma e, assim,
classificados em famlias (Quadro 1). Os critrios dessa classificao envolvem a
natureza do cido nucleico, o que possibilita vrios mecanismos de replicao. Esse
processo, assim como a natureza das infeces que causam, tem contribudo com a
organizao das caractersticas das famlias virais.
A grande maioria dos vrus que infectam vertebrados apresenta o RNA
como cido nucleico devido a esse tipo de cido apresentar uma alta taxa
mutagnica, que durante a sua evoluo resultou em uma grande diversidade
viral. Por esses vrus serem menos especficos do que os de DNA, infectam
uma variedade maior de espcies animais, acarretando vrias zoonoses.
Quadro 5. Classificao dos vrus em famlias, com base em algumas de suas

propriedades
Genoma e caractersticas fsicas
cido Simetria do Envelope Natureza fsica Famlia viral
Nucleico capsdeo dos acdos
nucleicos
DNA Icosadrica Ausente fs Parvoviridae
Papillomaviridae
Polyomaviridae
fd Adenoviridae
Presente Herpesviridae
Iridoviridae
Poxviridae
Complexa fd / fs, circular Hepadnaviridae
RNA Desconhecida fs Coronaviridae
ou complexa Flaviviridae
fs, segmentado Arenaviridae
Icosadrica fs Caliciviridae
Togaviridae
Ausente Picornaviridade
fd Birnaviridae
Desconhecida Presente fs Retroviridae
ou complexa
Icosadrica Ausente fs, linear Astroviridade
fd, segmentado Reoviridae
Helicoidal Presente Orthomyxoviridade
fs Paramyxoviridade
Rhabdoviridae
Filoviridae
fs, segmentado Bunyaviridae
fs: fita simples; fd: fita dupla
Virologia | 171
10.1. Parvoviridae
A famlia Parvoviridae engloba os menores vrus DNA existentes, consi-
derando que o prefixo parvo deriva do latim e significa pequeno.
Esta famlia est dividida em duas subfamlias: Parvovirinae e Densovirinae
(BERNS et al., 1996). A primeira infecta vertebrados e a segunda, invertebrados,
principalmente insetos. A subfamlia Densovirinae est dividida em trs gneros:
Densovrus, Interavrus e Brevidensovrus. J a subfamlia Parvovirinae constitui-se
de outros trs gneros: Parvovrus, Erytrovrus e Dependovrus.
O Parvovrus responsvel por infeces de vrios animais, incluindo
ces, raposas, sunos e outros. O Erytrovrus, antes descrito como Parvovrus
B19, recebeu este nome por seu tropismo pelas clulas eritropoieticas. Este
o mais estudado, por estar associado, em humanos, a doenas como o eritema
infeccioso, a artropatia e a crise aplstica 9. Alm dos problemas causados na
gestao, como o aborto espontneo e a hidropsia fetal 10. Alm disso, a
infeco por esses vrus causam efeitos citotxicos e a inibio da eritropoiese
O Dependovrus pertence ao grupo vrus Adenoassociado, pois preci-
sam de um vrus auxiliar para uma fase especfica do ciclo (replicao do
DNA), seja ele um Adenovrus ou um Herpesvrus.
O vrion constitudo por um genoma de DNA linear de fita simples,
o qual apresenta de trs a quatro genes. A partcula viral tem um capsdeo com
simetria icosadrica, desprovido de envelope.
Os Parvovrus no podem induzir a sntese de DNA na clula hospedei-
ra e requerem a diviso celular para a sua replicao. Devido a isso, seus
efeitos patognicos esto relacionados a um estgio particular da diferenciao
celular. Tais efeitos so mais evidentes no desenvolvimento fetal, especifica-
mente no epitlio intestinal e no sistema hematopoietico.
9
Evento agudo, transitrio, que complica a anemia hemoltica crnica, caracterizado por uma parada
transitria da eritropoiese e uma ausncia de precursores de eritrcitos na medula ssea (Oliveira
1994).
10
caracterizada pelo acmulo anormal de lquidos nos tecidos ou em determinadas cavidades do corpo.
A disseminao do vrus ocorre pelas fezes, urina, saliva, secrees

nasais e provavelmente por contato com fluidos genitais. Os Parvovrus no se
replicam adequadamente em cultura de clulas, por isso, geralmente no se
consegue detectar seu efeitos citopticos. Alm disso, no so patognicos na
maioria dos hospedeiros adultos. Entretanto, em jovens de algumas espcies,
os Parvovrus podem causar drsticos efeitos patognicos.
10.2. Papillomaviridae
At o sexto relatrio de 1995, do ICTV, os gneros Papillomavirus
e Polyomavirus pertenciam famlia Papovaviridae. No stimo relatrio foi
criada a famlia Papillomaviridae, sendo includo o gnero Papillomavirus. O
nome papilomavrus deriva da combinao dos termos papila, de origem
latina, diminutivo de papula, projeo ou salincia em forma de mamilo; e
oma, de origem grega, que representa as tumoraes ou os entumescimentos.
Os vrus desta famlia apresentam capsdeo no envelopado, com
simetria icosadrica, com dimetro de 40 a 55 nm e com 72 capsmeros.
O genoma representa 10-13% do peso do vrion e alberga uma fita dupla
de DNA circular, no segmentado, com 5.300 a 8.000 nucleotdeos;
sendo a guanina e a citosina responsveis por 40-50% do contedo.
Os vrus dessa famla infectam vertebrados, mais especificamente ma-
mferos, incluindo o homem. A famlia Papillomaviridae constituda pelos
16 gneros, incluindo centenas de tipos virais.
Os gneros definidos pelo ICTV so: Alphapapillomavirus ,
Betapapillomavirus , Gammapapillomavirus , Deltapapillomavirus ,
Epsilonpapillomavirus , Zetapapillomavirus , Etapapillomavirus ,
Thetapapillomavirus , Iotapapillomavirus , Kappapapillomavirus ,
Lambdapapillomavirus , Mupapillomavirus , Nupapillomavirus ,
Xipapillomavirus, Omikronpapillomavirus e Pipapillomavirus.
Virologia | 173
As espcies de Papilomavrus tm a nomenclatura de acordo com o

grupo de seres que elas infectam: Bovine papillomavirus (BPV), Canine
papillomavirus, Cottonnail rabbit papillomavirus, Deer papillomavirus, European
elk papillomavirus, Human papillomavirus e Ovine papillomavirus.
O Papilomavrus humano (HPV) o mais conhecido, sendo o causador
de tumores benignos e malignos de pele e das mucosas. O desenvolvimento
desses tumores depende de vrios fatores, como tabagismo, alcoolismo, mlti-
plos parceiros sexuais, incio precoce da vida sexual e gravidez, principalmente
antes dos 18 anos. Pertencem ao gnero Papillomavirus e espcie Human
papillomavirus. So ainda classificados em gentipos, de acordo com as
sequncias do gene L1.
O HPV uma das causas de Doenas Sexualmente Transmissveis (DST).
A transmisso do HPV ocorre, na maioria dos casos, pelo contato sexual, no
precisando necessariamente haver a penetrao, mas apenas com um contato
ntimo. Outras formas de contgio, menos frequentes, podem ocorrer pelo
uso de instrumentos ginecolgicos no esterilizados, compartilhamento de rou-
pas ntimas contaminadas, dentre outros. Aps a entrada do vrus no organis-
mo, inicia-se o perodo de incubao, que varia de trs semanas a oito meses.
Em alguns casos, no ocorrem sintomas da doena (portador assintomtico) e
em outros pode levar a neoplasias.
O diagnstico pode ser feito atravs dos exames clnico e laboratorial,
como Papanicolaou11, Colposcopia12 e bipsia das leses suspeitas. Os m-
todos moleculares, como a PCR, so os mais adequados para a caracterizao
dos sorotipos virais. O tratamento feito atravs de cauterizao das leses e
em casos mais graves recomenda-se a retirada cirrgica da rea afetada.
11
Exame ginecolgico que consiste na coleta de material do colo uterino para exame em laboratrio por
microscopia.
12
Exame clnico onde o mdico avalia as alteraes, usando uma lente de aumento.
Para a preveno, o uso da camisinha o mais adequado, uma vez que

outros preservativos no so eficazes. Uma consulta anual pode minimizar as
consequncias da infeco por HPV.
10.3. Polyomaviridae
O prefixo desta famlia deriva do grego, onde poli significa muito e
oma, tumores. Apesar do significado do nome, os Polyomavrus no
costumam produzir tumores nos seus hospedeiros naturais.
Os vrus desta famlia apresentam em seu genoma o DNA, o qual
circular e de fita dupla, sendo associado s histonas ( H2a, H2b, H3 e H4),
obtidas do hospedeiro. O vrion com simetria helicoidal, no apresenta enve-
lope e infecta principalmente mamferos, especialmente humanos. A famlia
Polyomaviridae contm apenas um gnero, o Polyomavrus. A replicao do
vrus ocorre no ncleo e os vrions so liberados por lise celular.
Os Polyomavrus humanos, BKV e JCV so membros do gnero
Polyomavrus. As infeces primrias por estes vrus ocorrem principalmente na
infncia e so geralmente assintomticas. Os vrus podem persistir aps a
infeco primria na forma latente em vrios rgos, especialmente nos rins. Em
pacientes com deficincia imunolgica, principalmente pela AIDS, esses vrus
podem ser reativados e causar algumas doenas. A reativao do BKV acarreta
doenas do trato urinrio, como a cistite hemorrgica e outras nefrites, enquan-
to a reativao do JCV leva a leucoencefalopatia multifocal progressiva.
Aproximadamente 80% dos adultos do mundo inteiro mostram evi-
dncia sorolgica para a infeco por JCV, mas, na sua maioria, sem
nenhuma manifestao clnica ou histrica de doena. A maioria das pesso-
as soropositivas apresentam histrico de infeco na infncia. A via de
transmisso no tem sido muito bem definida, mas sugerida a transmisso
pela gua e alimentos contaminados.
Virologia | 175
Da mesma forma, estima-se que 80% dos adultos de todos os conti-

nentes apresentem sorologia positiva para BKV, mas no h evidncias de que
o BKV cause doena na populao imunocompetente. Neste tipo de infec-
o, as vias de transmisso tambm ainda no esto bem definidas, embora
tambm haja a possibilidade de transmisso pela gua e alimento contamina-
dos. importante ressaltar que o BKV estvel na gua durante vrias sema-
nas, aumentando, assim, as chances de transmisso por esse meio. Estudos
mostram que o BKV est associado a doenas que afetam os rins, pulmes,
olhos, fgado e crebro. No entanto, h fortes evidncias da associao do
BKV com cistites hemorrgicas e nefrites. Alm disso, o vrus tem mostrado
uma relao com doenas renais em pacientes transplantados e com a rejeio a
enxertos de 2% a 5%.
10.4. Adenoviridae
Os Adenovrus foram descobertos em 1953 por Wallace Rowe e cols,
que isolaram o vrus da adenoide, por isso o nome Adenovrus. Em 1962,
John Trentin e sua equipe mostraram que o Adenovrus humano do tipo 12
causava cncer em hamsters jovens. Esta foi a primeira demonstrao de uma
atividade oncognica desencadeada por um vrus que infecta humanos. Desde
ento, os Adenovrus tm sido ligados induo de alguns cnceres. Alm
disso, estudos experimentais com os vrus dessa famlia vm contribuindo com
descobertas no campo da biologia molecular das clulas eucariticas, pela
facilidade da sua replicao em culturas in vitro.
A famlia adenoviridae infecta apenas os vertebrados, principalmente o
homem, e classifica-se em quatro gneros: AviAdenovrus, MastAdenovrus,
AtAdenovrus e SiAdenovrus, os quais infectam os seguintes grupos de
hospedeiros:
AviAdenovrus - aves.
MastAdenovrus - mamferos.
AtAdenovrus - rpteis, aves e mamfero.

SiAdenovrus - anfbios e aves.
O ICTV est estudando um novo gnero que infecta uma espcie de
peixe, mas que ainda no foi definida.
As seis espcies virais existentes nessa famlia so classificadas de acordo
com as caractersticas: molecular, fsico-qumica e imunolgica, o que permite a
separao em seis espcies distribudas de A a F (Quadro7). No gnero
MastAdenovrus foram descritos at o momento 51 sorotipos que causam
infeces em humanos.
Quadro 7. Espcie e sorotipos com seus respectivos locais de infeco.

Adaptado de Santos, 2008
Espcie Sorotipos Local de Potencial oncognico

infeco
Tumorigenicidade Transformao
in vivo de clulas
A 12, 18, 31 Trato Elevada +
gastrointestinal
B 3, 7, 11, 14, Trato urinrio, Fraca +
16, 21, 34, pulmes
35, 50
C 1, 2, 5, 6 Trato respiratrio Nenhuma +
D 8-10, 13, 15, Conjuntitiva, Nenhuma +
17, 19, 20, trato
22-23, 33, gastrointestinal
36-39, 42-
49, 51
E 4 Trato respiratrio, Nenhuma +
conjutiva
F 40, 41 Trato Nenhuma +
gastrointestinal
Virologia | 177
O genoma de DNA de dupla fita no segmentado contm aproximada-

mente 30 genes. O capsdeo icosadrico tem de 80 a 110 nm de dimetro,
com 252 capsmeros, dos quais 12 so pentgonos ( pentons) e 240 hex-
gonos (hexons). As espcies so caracterizadas pela presena de antgenos
especficos encontrados no capsmero hexagonal. O vrion possui uma longa
projeo que se estende do vrtice at cada um dos 12 capsmeros pentagonais.
A projeo de hemaglutinina antigenicamente distinta em cada sorotipo.
Dessa forma, possvel se determinar o tipo especfico de vrus utilizando-se
um teste de inibio da hemaglutinao.
A transmisso pode ocorrer por contgio direto ou indireto, seja pela
via oralfecal, atravs da gua e alimentos contaminados, seja pelos aerossis,
alm das secrees oculares e respiratrias. A replicao viral ocorre no epitlio
das vias respiratrias superiores, na conjuntiva e tambm no epitlio intestinal.
Aps a sua adeso clula hospedeira, o vrus sofre desnudamento e seu
DNA migra para o ncleo. Os genes precoces so transcritos pela RNA
polimerase DNA-dependente da clula. O RNA mensageiro (RNAm) pre-
coce transcreve as futuras protenas no estruturais no citoplasma. O RNAm
tardio transcreve as futuras protenas estruturais. Finalmente, a partcula viral
montada no ncleo e o vrus liberado por lise da clula hospedeira.
Os Adenovrus apresentam distribuio mundial, com caractersticas
endmicas na maior parte das regies. Alguns surtos em locais de contato
estrito, como no caso de alojamentos, foram relatados. As infeces podem
ocorrer em todas as estaes do ano, apresentando ocorrncia maior no final
do inverno, na primavera e no incio do vero. No inverno, os Adenovrus
tm sido responsveis por 25% de hospitalizao por febre e doenas do
trato respiratrio inferior em recrutas militares. A maioria das infeces bran-
da, sendo os casos fatais e de sequelas associados aos pacientes
imunocomprometidos. Estima-se que essa infeco seja responsvel por 2% a
5% de todas as infeces respiratrias, ocorrendo em todas as faixas etrias,
com predominncia na infncia.
10.5. Herpesviridae
O nome da famlia vem de um verbo grego herpein, que significa
rastejamento. O nome se refere ao fato de os membros da famlia causarem
infeces latentes recorrentes com progresso lenta. A famlia Herpesviridae
representada por vrus que infectam os vertebrados, incluindo aves, peixes e
vrios mamferos, principalmente humanos. Apresentam uma grande importn-
cia mdica por estarem envolvidos em muitas doenas. Essa famlia possui uma
grande variao de vrus, devido ampla ocorrncia e diversidade, e classifi-
cada em 3 subfamlias: Alphaherpesvirus, Bethaherpesvrus e Gammaherpesvirus.
A subfamlia Alphaherpesvirus inclui os gneros vrus Herpes Simplex 1
e 2 (HSV-1 e HSV-2), responsveis, respectivamente, pela infeco da
mucosa labial e genital e so vulgarmente conhecidos como Herpes. Essa
subfamlia inclui tambm o Vrus da Varicela-zoster (HHV-3, Human Herpesvirus-
3), cuja doena conhecida como catapora. A segunda subfamlia compreen-
de o Citomegalovirus (ou HCMV, Human Cytomegalovirus, ou HHV-5,
Human Herpesvirus-5), que causa um tipo de mononucleose infecciosa, os
Herpesvirus 6 e 7 (HHV-6 e HHV-7, Human Herpesvirus-6 e 7), respon-
sveis pela doena infantil infecciosa rosola. A ltima subfamlia tem como
representantes o vrus Epstein-Barr (EBV)-4, agente etiolgico da infeco
popularmente conhecida como doena do beijo ou mononucleose infeccio-
sa, alm de estar envolvido na patognese de alguns tumores, como o linfoma
de Burkitt e o carcinoma nasofaringeal e o Herpesvirus-8 (HHV-8, Human
Herpesvirus-8, ou KSHV), associado ao sarcoma de Kaposi.
Esta famlia agrupa vrus que apresentam tamanho mdio de 120 a 200
nm de dimetro, com fita dupla de DNA. Geneticamente a segunda famlia
mais complexa de vrus, pois existem 160 genes em cada espcie. O vrion
icosadrico com 162 capsmeros, envelopado, apresentando morfologia que
vai de esfrica at pleomrfica. O genoma no segmentado e contm fita
dupla de DNA com 120 mil a 220 mil nucleotdeos, dos quais 35-75% so
Virologia | 179
guanina e citosina. O genoma viral codifica protenas estruturais e no estrutu-

rais localizadas no envelope e no capsdeo. Os lipdios virais so derivados das
membranas nuclear e celular da clula hospedeira.
Como descritos anteriormente, os gneros so acompanhados por n-
meros e esto associados a diferentes patologias, entretanto, eles possuem
como caracterstica principal, o fato de desenvolverem no hospedeiro, infeco
crnica, mantendo-se latentes por longos perodos dentro da clula, sem
destru-la. So vrus extremamente infecciosos, porm com prognstico geral-
mente benigno. Estima-se que 97% da populao mundial j tenha tido
contato com esse vrus e uma grande parte no apresentou nenhum sintoma.
Alguns vrus desta famlia podem apresentar neurotropismo, levando ao desen-
volvimento de encefalites; outros so linfotrpicos, isto , possuem afinidade
pelos linfcitos, o que poder desencadear distrbios do sistema imunitrio,
inclusive, tornando-se um problema de sade pblica, por causar infeces
graves em pacientes imunodeficientes, por exemplo, com AIDS.
Quadro 8. Patologia, transmisso e diagnstico

Vrus Patologia Transmisso Diagnstico
Herpes simplex 1 e 2 Gengivoestomatite e Contato direto com Pesquisa de
Herpes labial a mucosa lesionada antgeno (mtodos
(HSV1); Herpes moleculares e
genital (HSV2); sorolgicos)
Conjuntivite, queratite
e encefalite herptica,
principalmente em
doentes
imunodeprimidos, e
Herpes neonatal
Varicella-zoster - VZV3 Vesculas cutneas nas Contato direto com Isolamento em
reas central e laterais as leses e aerossis cultura celular,
do corpo imunofluorescencia
indireta e PCR
Epstein-Barr EBV4 Mononucleose Contato direto com Mtodos sorolgico

infecciosa, Doena a saliva e molecular
linforreticular
progressiva,
Leucoplasia de clulas
em cabeleira, Linfoma
de Burkitt, Carcinoma
nasofaringeo
Citomegalovrus - Infeco congnita, Contato com Isolamento em

CMV5 causando nascimento secrees e sangue cultura celular,
prematuros e infectados sorologia e diagns-
malformaes no feto. tico molecular
Vrus HH6, HH7 e HH6,HH7 - Contato ou por Mtodos
HH8 Exantema sbito aerossis sorolgicos e
HH8- Sarcoma de molecular
Kaposi, Linfoma de
clulas B e Doena de
Castleman
10.6. Iridoviridae
O prefixo derivado de ris, deusa grega do arco-ris, uma vez que
alguns componentes desta famlia apresentam iridescncia, um fenmeno
tico que faz certos tipos de surpefcies refletirem as cores do arco-ris.
Esta famlia est dividida em cinco gneros: Chloriridovirus, Iridovirus,
Lymphocystivirus, Megalocytivirus e Ranavirus. Os dois primeiros so pa-
rasitas estritos de invertebrados, apesar do Iridovirus j ter sido relatado em
lagartos. Os gneros Lymphocystivirus e Megalocytivirus j foram encon-
trados em peixes e o Ranavrus em anfbios, rpteis e, recentemente, foi
relatada a infeco em leopardos, provenientes da Etipia.
Virologia | 181
Os vrus dessa famlia apresentam de 140 a 303 kb, o genoma

DNA de fita dupla, apresentando de 150 mil a 280 mil nt, e simetria
icosadrica. Em relao ao envelope, ele pode estar ausente ou presente,
dependendo da maneira de como o vrus sai da clula (lise ou brotamento).
O gnero Iridovrus entra na clula hospedeira atravs de viropexia
(endocitose).
A importncia desta famlia est muito ligada ao fato de causar doen-
as em uma variedade de peixes comercialmente importantes e de ser uma
das famlias virais mais prevalentes em insetos.
10.7. Poxviridae
O prefixo Pox de Poxviridae de origem inglesa e significa vesculas,
as quais caracterizam a infeco por esses vrus. Esta famlia divide-se em
duas subfamlias, Chordopoxvirinae e Entomopoxvirinae . A primeira com-
preende os gneros: Orthopoxvirus (espcie: Vaccinia vrus), causador da
varola bovina ( cowpox) e da varola humana (smallpox); Parapoxvirus (es-
pcie: Orf vrus); Avipoxvirus (espcie: Fowlpox vrus); Capripoxvirus
(espcie: Sheeppox vrus ); Leporipoxvirus ( espcie: Myxoma vrus) ;
Suipoxvirus (espcie: Swinepox vrus); Molluscipoxvirus (espcie: Molluscum
contagiosum vrus); Yatapoxvirus (espcie: Yaba monkey tumor vrus). E a
segunda subfamlia engloba os Gneros: Entomopoxvirus A (espcie:
Melolontha melolontha entomopoxvirus) ; Entomopoxvirus B (espcie:
Amsacta moorei entomopoxvirus) ; Entomopoxvirus C (espcie: Chironomus
luridus entomopoxvirus).
Os membros dessa famlia so considerados um dos maiores e mais
complexos vrus que infectam animais. Apesar disso, esses vrus apresentam
aparncia e constituio bioqumica primitivas. Somente a transcrio e

replicao do DNA, que ocorrem no citoplasma da clula, que usam as
enzimas codificadas pelo vrus.
Esses vrus infectam tanto vertebrados quanto invertebrados artrpodes.
O vrion apresenta envelope tubular ou globular com protenas estruturais,
so geralmente ovoides, pleomrficos, e medem de 160 a 190 nm de
dimetro ou altura. O genoma de DNA no segmentado e apresenta fita
dupla contendo aproximadamente de 130 mil a 375 mil nucleotdeos,
dos quais 20% (nos Entomopoxvrus) e 35% a 64% (nos demais) so
constitudos por guanina e citosina.
O prottipo dessa famlia o Vrus Vaccinia, o qual foi usado com
sucesso como vacina e, graas as Campanhas de Vacinao na dcada de
1970 (sculo XX), foi possvel erradicar o vrus da varola. O vrus vaccinia
penetra nas clulas, principalmente por fuso celular, mas ainda no se
conhece o receptor responsvel pela ligao do vrus clula.
Outra espcie de Poxvirus, Molluscum contagiosum virus (MCV),
conhecida por infectar especificamente humanos. Esta causa uma infeco
na pele e na mucosa (pequenas vesculas), normalmente benigna. A trans-
misso ocorre por meio do contato com o local infectado e caracterstica
da primeira infncia. No adulto, j foi encontrada na regio genital, por
isso, tem sido considerada causadora de Doena Sexualmente Transmissvel
(DST). O diagnstico feito atravs da clnica, mas quando h dvidas, o
material das vesculas submetido aos ensaios histolgicos.
Virologia | 183
Figura 9. Microcospia eletrnica do Poxivrus - Foto cedida pela Dra Monika

Barth/IOC do Laboratrio de Morfologia e Morfognese Viral - IOC/Fiocruz.
10.8. Hepadnavridae
O nome Hepadnaviridae derivado da palavra latina hepa, que
significa fgado. Esses vrus recebem esse nome devido s infeces que
causam neste rgo.
Esta famlia pequena, possuindo dois gneros: Orthohepadnavrus,
que infectam mamferos, e Avihepadnavrus, que infectam aves. O primeiro
gnero inclui as espcies: Woodchuck hepatitis virus (HWV), Ground squirrel
hepatitis vrus (GSHV), Woolly monkey hepatitis virus (WMHV) e Hepatitis
B virus (HBV). Estes infectam, respectivamente, marmotas, esquilos, macacos
e o homem. Dentre os membros dessa famlia, o vrus da hepatite B tem
grande importncia para humanos, sendo responsvel por milhes de casos
crnicos no mundo inteiro.
O vrion do HBV (partcula Dane) possui envelope, morfologia
esfrica, simetria icosadrica e mede entre 40 a 48 nm de dimetro. O
genoma contm uma molcula de DNA circular, segmentado, de fita du-
pla, com 3.020 a 3.320 nucleotdeos. O acido nucleico codifica os
antgenos: HBsAg, HBeAg, HBcAg e HBxAg. Outra caracterstica da

espcie HBV apresentar partculas filamentosas, as quais so incompletas
e, portanto, no infecciosas.
Durante o curso da infeco pelo HBV, os antgenos e anticorpos virais
(marcadores sorolgicos) so passveis de ser detectados no sangue do indiv-
duo. Cada um desses marcadores apresenta um significado clnico. No incio
da infeco pelo HBV, o primeiro marcador sorolgico a ser detectado o
HBsAg, pois na fase aguda da doena seus ttulos so elevados. Este mesmo
antgeno tende a desaparecer na evoluo normal para a cura e, quando
persiste aps esse perodo, a evoluo geralmente crnica. O segundo o
HBeAg, que normalmente indica alto grau de replicao viral. No caso de
evoluo normal, o anti-HBe produzido. O terceiro o anti-HBc IgM, na
fase aguda, e, em seguida, o anti-HBc IgG, em nveis gradativos, o qual
persiste para a vida toda, podendo indicar que o indivduo teve pelo menos
um episdio de infeco pelo HBV. O anti-HBs indica recuperao da infec-
o e imunidade contra o HBV. Para a deteco desses marcadores, o mtodo
mais utilizado o Ensaio Imunoenzimtico (ELISA). Entretanto, podem ser
realizadas tcnicas moleculares de deteco do DNA viral, como a Hibridizao,
o branched-DNA, ou b-DNA Chiron, e a PCR. Alm disso, existem
outros marcadores sorolgicos da infeco pelo HBV, como o AgHBx e o
anti-HBx, mas estes so pouco utilizados nos exames de rotina, ficando seu
uso voltado para pesquisa.
A transmisso do HBV pode ocorrer pelo sangue contaminado (atra-
vs das vias sexual, transplacentria e perinatal), por compartilhamento de
seringas e agulhas contaminadas, por transfuso de sangue ou hemoderivados,
ou ainda por acidentes com material biolgico. As consequncias da infec-
o pelo HBV so muito variveis, podendo o indivduo infectado ser um
portador assintomtico. Pode ainda apresentar quadros clnicos que resultem
na hepatite fulminante ou apresentar a forma crnica, que pode desencadear
Virologia | 185
a cirrose ou o carcinoma de fgado. A forma aguda da doena caracteriza-

da por um longo perodo de incubao de 45 a 120 dias, com sintomas
mais comuns de anorexia, nuseas e vmitos. A ictercia geralmente acontece
aps uma semana de infeco, assim como a urina escura, a pele plida e os
altos nveis de bilirrubina e transaminases, embora aproximadamente 50%
dos casos sejam anictricos.
A infeco pelo HBV pode, no entanto, ser prevenida por vacinas. As
primeiras vacinas eram derivadas de plasma de pacientes com infeco crnica,
com o HBsAg inativado por mtodos fsico-qumicos. Atualmente se utilizam
vacinas desenvolvidas pela tecnologia do DNA recombinante.
10.9. Coronaviridae
Esta famlia pertence ordem Nidovirales, e apresenta dois gneros:
Coronavrus e Torovrus. Os primeiros isolados dos Coronavrus foram o vrus
da bronquite infecciosa, em 1930, o vrus da hepatite de camundongo e o da
gastroenterite de porcos, em 1940. Estes dois gneros apresentam similar
organizao genmica e uma estratgia de replicao. Entretanto, existem dife-
renas na morfologia do vrion entre os dois gneros.
Os Coronavrus so divididos em trs grupos sorolgicos. O I e o II
tm sido isolados em mamferos, enquanto o III, em aves. O sorogrupo II
representado pelos prottipos HCoV-229E e HCoV-NL63, dentre outros,
e o Grupo III representado pelos prottipos MHV, OC43 e HKU1,
SARS-CoV. O SARS-CoV (Coronavrus associado a Sndrome Respiratria
Aguda Severa) relacionado, apesar de distante, com todos os outros
coronavrus sequenciados.
A partcula completa, ou vrion, apresenta-se com morfologia esfri-
ca, envelopada e com cerca de 100 a 160 nm de dimetro. O genoma
alberga um RNA de fita simples, polaridade positiva e com tamanho de
aproximadamente 32 Kb.
Dentre as protenas estruturais do vrion existem as espculas de

glicoprotenas, que so receptores de ligao e especificidade. Estes realizam a
fuso com a membrana da clula hospedeira, a protena de membrana, a
hemaglutinina e a protena do nucleocapsdeo, que uma pequena protena
de envelope.
A maioria dos Coronavrus replica-se inicialmente nos tratos respiratrio
e entrico. Em contraste com a grande maioria dos vrus deste gnero, a
infeco do trato respiratrio inferior pelo SARs-CoV resulta em srias compli-
caes, requerendo muitas vezes que o paciente seja internado. Uma extensa
epidemia, evidenciada inicialmente na China e depois na Europa, Amrica do
Norte e em outras partes da sia, foi devido a este vrus, e ocorreu entre os
anos de 2002 e 2003, levando morte milhares de pessoas. Esta infeco
caracterizada por febre acima de 38 graus Celsius, acompanhada de dor de
cabea e outros sintomas. Os sintomas respiratrios so usualmente amenos no
incio, mas aps poucos dias, o paciente desenvolve tosse seca e produtiva,
apresentando dispneia.
A transmisso do Coronavrus ocorre principalmente atravs de aerossis
de secrees nasais. Para o diagnstico laboratorial utiliza-se, principalmente, a
imunomicroscopia eletrnica e a sorologia. At o momento, no existem vaci-
nas no mercado capazes de prevenir esta infeco, mas vrias vacinas se encon-
tram em estudos clnicos, e podem ser promissoras.
10.10. Flavivridae
O prefixo flavi vem do grego e significa amarelo, uma vez que os
sinais clnicos associados a esse vrus podem levar colarao amarelada, que
aparece na pele e nos olhos do paciente. A famlia Flaviviridae composta por
trs gneros: Hepacivirus, Pestivirus e Flavivirus. O primeiro gnero tem como
unica espcie, at hoje identificada, o Virus da Hepatite C. O segundo,
agrupa os vrus que infectam mamferos no humanos, com destaque para os
Virologia | 187
vrus da diarreia bovina e o vrus da peste suna. O ltimo, de acordo com o

VIII Relatrio do Comit Internacional em Taxonomia Viral (ICTV), agrupa
aproximadamente 50 espcies de vrus de difcil identificao morfolgica e
taxonmica, dividindo o gnero em 10 grupos, antigenicamente relacionados.
Entre eles, o virus da Febre Amarela, o grupo do Dengue virus (DENV), o
grupo do Mammalian Tick-borne virus (TBEV), o grupo do Aroa virus
(AROAV) e o grupo do Japanese encephalitis virus (JEV).
Os vrus desta famlia possuem como cido nucleico o RNA de cadeia
linear simples, polaridade positiva e comprimento mdio entre 9,5 a 12,3 kd.
Apresentam capsdeo icosadrico, o que lhes confere um aspecto esfrico,
recoberto pelo envelope. E as partculas virais possuem um dimetro com cerca
de 40 a 60 nm.
Os representantes dessa famlia so considerados Arbovrus, pois pos-
suem artrpodes como vetor. A palavra arbovrus de origem inglesa, arthropod-
borne virus, que significa vrus carregado por um artrpode. Os vrus ficam,
ento, armazenados no vetor e por vezes proliferam, sem causar danos.
Duas espcies dessa famlia representam um grande problema de Sade
Pblica no Brasil, o Virus da Dengue e o Vrus da Febre Amarela. Em relao
a dengue foram notificados no Brasil, no perodo de 1981 a 2006,
4.243.049 casos, incluindo 5.817 casos de dengue hemorrgico/sndrome
de choque dengue (FHD/SCD), perfazendo um total de 338 mortes. Se-
gundo dados do Laboratrio de Flavivrus do IOC/Fiocruz (2007), embora a
doena tenha afetado todas as regies brasileiras, o maior nmero de casos foi
relatado no Nordeste e no Sudeste. Os Virus da Dengue (DENV) 1 e 4
foram isolados pela primeira vez na regio amaznica do Brasil, em 1981 e
1982. A doena se tornou um problema de sade pblica nacional no estado
do Rio de Janeiro, em 1986 e 1990, com circulao de DENV-2 e 1,
respectivamente. A introduo do DENV-3 em 2000, tambm no estado do
Rio de Janeiro, levou a uma epidemia com 288.245 casos notificados de
dengue e 91 bitos. Cepas de vrus identificados em 2002, durante a epide-

mia, mostrou que o DENV-3 se expandiu para novas reas, algo que merece
uma avaliao mais aprofundada.
A febre amarela uma doena infecciosa, que se mantm endmica nas
florestas tropicais das Amricas e frica. A transmisso para humanos (ciclo
urbano) s possvel pela picada de insetos hematfagos da famlia Culicidae,
em especial do gnero Aedes. O ciclo silvestre deste vrus se mantm em
macacos, que atuam como hospedeiros amplificadores, e insetos do gnero
Haemagogus e Sabethes, que atuam como vetores. Em torno de 90% dos
casos, a doena se apresenta de forma benigna, evoluindo para a cura, en-
quanto em 10% apresentam complicaes, podendo ocorrer o bito em
torno de 50% desses casos. Os mtodos de diagnstico incluem o ELISA
(IgM), a Cultura de Clulas (isolamento viral), a Imuno-histoqumica e a
PCR. A zoonose (ciclo silvestre) dificilmente ser erradicada, mas a doena
em humanos (ciclo urbano) prevenvel mediante a vacinao com a cepa
17D do vrus amarlico (ver tem 7 deste captulo).
10.11. Arenavridae
Os membros da famlia Arenaviridae (do grego, arena, que significa
areia) esto associados a diferentes espcies de roedores (reservatrios natu-
rais). Esses vrus so esfricos, envelopados e apresentam um dimetro mdio
de 110 a 130 nm. O cido nucleico composto por duas fitas de RNA
circular, segmentado e envolto por protena NP do nucleocapsdeo.
Esses vrus apresentam carter zoontico e possuem elevado poder
infectante, pois devido s suas caractersticas serem semelhantes as da clula
hospedeira, atravessam facilmente a membrana plasmtica. Causam febres
hemorrgicas severas, com extravasamento capilar e alteraes hemorrgicas,
levando elevada taxa de mortalidade.
Virologia | 189
Essa famlia dividida em dois gneros: Arenovrus do novo mundo

e Arenovrus do velho mundo. Dentre os causadores de doenas em
humanos esto:
Lassa virus Febre de Lassa (frica) - Velho mundo;
Junin virus Febre hemorrgica Argentina, reservatrio: Callomys
musculinus Novo mundo;
Machupo virus Febre hemorrgica da Bolvia, reservatrio: Callomys
callosus - Novo mundo;
Guanarito virus Febre hemorrgica da Venezuela - Novo mundo;
Sabia Febre hemorrgica do Brasil - Novo mundo.
A transmisso ocorre pelo contato direto com a pele ou quando o
indivduo entra em contato com as excrees, ou material contaminado
por elas, de roedores infectados. Pode ocorrer, ainda, por picada de
artrpode infectado.
Os sinais clnicos dessa infeco esto associados, principalmente, a
febres com extravasamento capilar e alteraes hemorrgicas, as quais po-
dem culminar com o agravamento do processo, levando a uma sndrome
vascular, a hepatite, ou ainda a uma doena neurolgica. A febre de Lassa
iniciada como uma gripe que se torna severa posteriormente.
Como medida de preveno, deve-se procurar reduzir a populao
de roedores nos reservatrios, evitar contato com as fezes desses animais e
tomar medidas de higiene. O paciente infectado deve ser submetido ao
isolamento respiratrio e a droga frequentemente empregada a Ribavirina,
via intravenosa.
O diagnstico realizado por isolamento viral em camundongo ou
em cultura de clulas, alm disso, podem ser empregados mtodos
moleculares e sorolgicos (deteco de IgM especficas).
10.12. Caliciviridae
Os integrantes desta famlia so de grande importncia como causadores
das gastroenterites humanas. So quatro os gneros desta famlia: Lagovrus e
Vesivrus, que acometem apenas hospedeiros animais e so representados,
respectivamente, pelos vrus da doena hemorrgica do coelho e vrus do
exantema vesicular de sunos. E Norovrus e Sapovrus, que acometem huma-
nos e animais e so representados, respectivamente, pelos Vrus Norwalk e
Vrus do tipo Sapporo.
O vrion que representa esta famlia desprovido de envelope, apresenta
estrutura icosadrica e o seu capsdeo, com dimenso entre 27 a 40 nm, tem
uma depresso em forma de taa. Por isso que o prefixo da famlia recebeu a
designao de calici. O genoma de aproximadamente 8,3Kb, constitui-se de
RNA, fita simples, linear, no segmentado e com polaridade negativa.
A Histria dos Norovrus iniciou-se em 1929, quando Zahorsky props
o nome de doena do vmito do inverno, a fim de descrever as epidemias de
gastroenterites virais. Em 1968, O Center Disease Control (CDC) investigou
uma epidemia causada pela doena do vmito ocorrida em uma escola de
Norwalk, nos Estados Unidos, onde aproximadamente 50% dos alunos e pro-
fessores desenvolveram gastroenterite. As partculas virais das fezes dos voluntri-
os infectados foram identificadas pela imunomicroscopia eletrnica.
Os Norovrus apresentam cinco grupos genmicos. Dentre eles, o I, II
e IV esto envolvidos nas infeces em humanos. O estudo destes agentes
um grande desafio, haja visto que no existe nenhum modelo animal pequeno
que reproduza a doena clnica, e nem culturas de clulas sucetveis.
A prevalncia deste vrus bastante elevada em vrios pases e, nos
EUA, ocorrem cerca de vinte e trs milhes de infeces por ano, durante
todo o ano, principalmente nos meses mais frios. Mais de 70% das epide-
mias de gastroenterites esto associadas a este agente. A transmisso deste
vrus se d por via oral-fecal e sua infecciosidade est associada a baixas
Virologia | 191
doses, seja nas fezes ou no vmito. A diarreia pelo Norovrus considerada

comum em viajantes.
O perodo de incubao do vrus dura de 24 a 48 horas, podendo
variar de 18 a 72 horas. Os sintomas gastrointestinais mais comuns so:
nuseas, vmitos, dor abdominal e diarreia (4 a 8 evacuaes dirias). J os
sintomas sistmicos so, principalmente, mialgia, dor de cabea, febre acima
de 38 graus Celcius, etc. A imunidade ao vrus no duradoura, de um
modo geral especfica, ou seja, acarreta pouca reao cruzada.
O mtodo laboratorial mais eficaz para o diagnstico deste vrus a
PCR, capaz de detectar o vrus em amostras clnicas de fezes e vmitos ou em
amostras ambientais (alimentos e gua). A microscopia eletrnica mais usada
para identificar partculas virais nas fezes. Alm disso, os mtodos sorolgicos
tambm so usados para detectar os anticorpos especficos. O tratamento e o
controle desta infeco devem visar a higiene adequada das mos, dos alimen-
tos e dos locais onde existam indivduos infectados, j que doses baixas so
suficientes para uma transmisso eficiente. At o momento, no existem vacinas
no mercado para prevenir esta infeco, mas algumas vacinas encontram-se em
estudos clnicos.
10.13. Togavridae
O prefixo desta famlia vem do latim toga, que significa capote, uma
vez que estes vrus, ao serem visualizados no microscpio eletrnico, apresen-
tam morfologia em forma de capote. Esta famlia est dividida em dois gneros:
o Alphavrus e o Rubivrus, os quais so responsveis por vrias doenas, tais
como encefalite equina, rubola, dentre outras.
O vrion consiste de envelope, capsdeo icosadrico, e mede cerca de
40 nm de dimetro. O seu genoma possui uma fita simples de RNA linear,
no segmentado, com polaridade positiva, e apresenta de 9.700 a 11.800
nucleotdeos. A estabilidade do vrus sob condies in vitro ocorre em pH
alcalino, entretanto, so sensveis aos solventes orgnicos e detergentes que

solubilizam as lipoprotenas do envelope.
A espcie Rubella vrus, do gnero Rubivrus, responsvel por uma
das doenas exantemticas da infncia, a rubola. Esta doena apresenta carac-
terstica sazonal, ocorrendo principalmente na primavera, e transmitida por
contato direto com aerossis de indivduos infectados. A transmisso do vrus
da rubola durante os trs primeiros meses da gestao de extrema gravida-
de, j que esse vrus tem a capacidade de atravessar a placenta e infectar o
embrio, causando a Sndrome da Rubola Congnita, que caracterizada por
aborto, parto prematuro, anomalias congnitas e morte fetal.
O perodo de incubao de duas a trs semanas e a transmisso se d
uma semana antes do aparecimento do exantema. A doena geralmente tem
evoluo benigna e mais da metade dos infectados so assintomticos. As
manifestaes clnicas mais comuns so: febre de at 38 graus Celsius, aumen-
to dos linfonodos do pescoo, e exantemas cutneos, inicialmente na face,
passando para outras partes do corpo. Esta doena de difcil diagnstico
clnico por se assemelhar as outras doenas exantemticas. O mtodo de
diagnstico mais usado o ELISA, o qual permite a deteco de anticorpos
especficos. Na Campanha de Vacinao Brasileira, de 2008, foram
disponibilizadas vacinas para indivduos de 20 a 39 anos, de ambos os sexos.
10.14. Picornaviridae
Os vrus pertencentes famlia Picornaviridae foram uns dos primeiros a ser
reconhecidos, pois estudos mostraram que muitas das doenas causadas por eles
j tinham histrico no passado. Uma importante caracterstica desta famlia a sua
diversidade, uma vez que existem mais de 200 sorotipos definidos neste grupo.
O prefixo pico derivado do grego, pequeno, e essa nomenclatura foi
atribuda a esta famlia por apresentarem os menores vrus RNA, quando compa-
rados grande maioria de vrus que contm esse cido nucleico.
Virologia | 193
A classificao dessa famlia baseada nas propriedades antignicas.

A famlia compreende atualmente oito gneros: Enterovrus, Cardiovrus,
Aphtovrus, Hepatovrus, Parechovrus, Erbovrus, Kobuvrus e Teschovrus.
Essa famlia contm vrus que infectam vrios tipos de vertebrados, incluin-
do o homem, e causam doenas de grande importncia mdica, como
febre aftosa, poliomelite, hepatite A e rinovirore.
Essa famlia apresenta os vrus RNA de fita simples, linear no seg-
mentado e de polaridade positiva. Os vrions consistem de um capsdeo
no envelopado, com simetria icosadrica, dimetro de 27 a 30 nm e 12
capsmeros. O genoma completo apresenta de 7.000 a 8.500
nucleotdeos e o vrus apresenta replicao citoplasmtica.
Dentre as doenas causadas por vrus desta famlia, a Hepatite A
tem sido mostrada como uma das doenas mais antigas da humanidade.
de extrema gravidade em pases em desenvolvimento, j que a dissemina-
o do vrus, pela gua ou pelos alimentos, envolve as condies sanitrias
e de higiene pessoal (ciclo oral-fecal). Uma vez na corrente sangunea,
esse vrus pode atingir os hepatcitos, desencadeando um processo infec-
cioso (hepatite), que poder levar ao aparecimento de sintomas clnicos
importantes para o aparelho digestivo.
A hepatite A segue um curso de manifestaes clnicas geralmente
nos primeiros trinta dias da infeco, apresentando perfis variados, sendo
as formas crnicas muito raras. A infeco compreende desde o estado de
portador (assintomtico) at o sintomtico, que apresenta ictercia. No
perodo prodrmico, uma minoria de indivduos infectados relata sintomas
clssicos, como febre, dores musculares, cansao, mal-estar, inapetncia,
nuseas e vmitos. medida que a ictercia vai surgindo, os sintomas e
sinais prodrmicos podem desaparecer. Neste perodo, tambm pode ocorrer
de as fezes ficarem amarelo-esbranquiadas e a urina, escura.
O diagnstico laboratorial realizado pela pesquisa de anticorpos

no soro dos indivduos suspeitos. Nveis de IgM anti-HAV podem ser
detectados at uns quatro meses, principalmente pelo mtodo ELISA.
Como em toda doena viral, os pacientes infectados devem ter uma boa
alimentao e repouso.
A preveno da hepatite A envolve principalmente as medidas de res-
ponsabilidade das esferas governamentais, tais como o saneamento bsico,
campanhas de vacinao e informativas sobre a doena e sua preveno. Al-
guns cuidados pessoais podem ser tomados a fim de evitar a transmisso. So
eles: higiene pessoal e alimentar (lavagem e clorao), clorao ou fervura da
gua para a inativao do vrus.
Existem no mercado, vacinas licenciadas disponveis para indivduos aci-
ma de dois anos de idade. Esta vacina ainda no est inserida em Campanhas
Nacionais de Imunizao, entretanto, o Ministrio da Sade disponibiliza esta
vacina para alguns Centros de Sade.
10.15. Birnaviridae
O nome da famlia Birnaviridae tem o prefixo dividido em duas partes.
A primeira tem como origem a palavra grega bi que significa dois e a
segunda se refere sigla RNA (cido Ribonucleico), que constitui o genoma
do vrion. Dessa forma, esses vrus apresentam dois segmentos de fita dupla de
RNA linear. Esta famlia subdivide-se nos gneros Aquabirnavirus, Avibirnavirus
e Entomobirnavirus. Nesses gneros esto includos o Vrus da necrose pan-
cretica infecciosa (IPNV), que infecta peixes, o Vrus da doena infecciosa
da bursa (IBDV) e outros vrus, que infectam galinhas, patos e perus.
Os vrus so esfricos de 70 nm de dimetro, com capsdeo no
envelopado, apresentando simetria icosadrica, composto por 132 capsmeros.
O genoma completo tem de 5.880 a 6.400 nucleotdeos e representa
9,7% do peso do vrion.
Virologia | 195
Dentre as doenas causadas por vrus dessa famlia, o IBDV tem uma
grande importncia, devido ao prejuzo que causa nas indstrias avcolas do
mundo inteiro. O IBDV produz uma doena contagiosa, denominada Doena
de Gumboro que acomete galinhas, desencadeando uma imunodeficincia
secundria pela destruio da Bursa de Fabricius. Essa doena apresenta as
formas clnicas e subclnicas com um perodo de incubao bem pequeno, j
que as aves comeam a apresentar sinais clnicos de 2 a 3 dias aps a exposi-
o. Os efeitos dos vrus nas aves envolvem a destruio de clulas de rgos
do sistema imunolgico, como a Bursa de Fabricius, tonsilas cecais, bao e
outros rgos linfoides. Estudos demonstram que uma regio do gene viral
pode ser detectada em vrus isolados da Bursa de Fabricius pela tcnica de
PCR/RFLP. Ainda no se tem uma determinao especfica para o controle do
IBDV em aves, pois a vacina de vrus vivo de baixa passagem no recomen-
dada, j que o vrus vacinal mantm as caractersticas do vrus selvagem e assim
pode desencadear a doena.
Outro vrus importante dessa famlia o IPNV, que infecta vrias esp-
cies de peixes, como o salmo e a truta, alm de infectar tambm moluscos e
crustceos. A mortalidade das espcies suscetveis est relacionada com o
padro de virulncia da cepa viral, assim como a idade ou condies fsicas
delas. O vrus tem sido encontrado em leuccitos e macrfagos presentes nos
rins e bao dessas espcies. Estudos relacionados sua replicao nesses locais
tm sido associados disseminao da doena nas espcies propensas infec-
o em pases da Europa, sia, Amrica do Norte e Amrica do Sul.
A transmisso do IPNV tem sido mais registrada por contato direto
dentro de uma mesma espcie, embora j tenha sido encontrado em ovas de
algumas espcies de peixes, representando mais de 90% de mortalidade nos
alevinos. Nos salmondeos, a doena causa uma gastroenterite aguda e destrui-
o do pncreas (necrose focal), principalmente nos indivduos jovens, j que
nos sobreviventes, at seis meses aps a infeco, o perfil inaparente ou
subclnico. Mesmo assim, os principais aspectos de patogenicidade desta do-

ena ainda no esto bem esclarecidos, dificultando, dessa forma, o controle e
a preveno por vacinas. O diagnstico laboratorial desta infeco tem sido
feito atravs do isolamento do vrus em cultura de clulas de linhagens suscep-
tveis, como a Chinook salmon embryo (CHSE-214), a Rainbow trout gonad
(RTG-2) e a Bluegill fry (BF-2). Uma vez isolado, a identificao do vrus
normalmente realizada por tcnicas como o teste de neutralizao por anticorpos
monoclonais e policlonais, a imunoperoxidase e o ELISA.
10.16. Retroviridae
Esta famlia est dividida em duas Subfamlias: Orthoretrovirinae e
Spumaretrovirinae, as quais apresentam os seguintes gneros: Alpharetrovirus,
Betaretrovirus, Deltaretrovirus, Epsilonretrovirus, Gammaretrovirus, Lentivirus,
Spumaretrovirus, sendo este ltimo da Subfamlia Spumaretrovirinae. Os v-
rus da famlia Retroviridae apresentam uma gama de hospedeiros, como smios,
bovinos, aves, mamferos e, inclusive, humanos. O nome desta famlia se
deve presena da enzima Transcriptase Reversa, responsvel pela transcrio
reversa do vrus, possibilitando a formao de um DNA complementar, o
qual pode ser incorporado ao DNA da clula hospedeira.
Dentre as doenas causadas pelos membros da famlia Retroviridae, a
Sndrome da Imunodeficincia Adquirida (AIDS) a mais importante, haja
vista que a mesma leva a grandes ndices de morbidade e mortalidade em
humanos de todo o mundo. A AIDS foi reconhecida em 1981, a partir
da investigao clnica e laboratorial em pacientes homossexuais do sexo
masculino, residentes na cidade de Nova York, nos Estados Unidos. Estes
indivduos apresentavam grande incidncia de Sarcoma de Kaposi e pneu-
monia (causada pelo Pneumocystis carini), que so quadros clnicos carac-
tersticos de imunodeficincia. Os casos de AIDS tambm foram relatados
em outros grupos de indivduos, como os hemoflicos e os usurios de
Virologia | 197
drogas intravenosas, os quais apresentavam infeces graves causadas por

microrganismos oportunistas.
Um aumento considervel do nmero de casos da doena em vrios grupos
de indivduos, que no homossexuais, foi observado nos Estados Unidos aps
1982. Desta forma, a doena avanou de forma alarmante para outras cidades de
todo o mundo. Atualmente, segundo dados da Organizao Mundial da Sade,
existem aproximadamente mais de 40 milhes de infectados no mundo.
A classificao do Vrus da Imunodeficincia Humana (HIV) bastante
complexa, constituindo Tipos, Subtipos, Grupos, alm de formas recombinantes.
Os tipos so: HIV-1 e HIV-2. O Tipo 1 encontrado em todo o mundo,
enquanto que o Tipo 2 limitado frica Ocidental e a algumas regies da
Europa. Os Subtipos identificados so: M, N e O, os quais so baseados,
principalmente, nas diferenas genticas das protenas do envelope, do capsdeo.
O Subtipo M rene onze Subtipos: A1, A2, B, C, F1, F2, G, H, J e K,
os quais apresentam formas recombinantes, como do CFR01 ao CFR12.
A partcula completa do HIV-1 envelopada e apresenta forma esfri-
ca, com cerca de 110 nm de dimetro. O genoma constitui-se de RNA de
fita simples, de polaridade positiva, no segmentado. Dentre as protenas
estruturais mais importantes do vrion existem:
Glicoprotena (gp) 120 - inserida no envelope e com a funo de se
ligar ao receptor CD4 presentes no linfcitos e macrfagos, que so as
clulas-alvo do HIV;
gp41 - inserida no envelope e com a funo de se ligar aos correceptores
CCR5 e CXR4 D4, presentes nos linfcitos e macrfagos. A ausncia
desta ligao impede a entrada do HIV na clula hospedeira;
Protena (p) 17 - presente na matriz, associada a membrana e
adjacente ao nucleocapsdeo;
p6, a p7 e a p24 - localizadas no nucleocapsdeo, sendo que as p6

e p7 so associadas ao RNA genmico.
J dentre as protenas no estruturais existem:

p66/51 (transcriptase reversa) - responsvel pela transcrio reversa,
formando o DNA complementar; a p32 (integrase) permite a integrao
do DNA complementar viral ao DNA da clula hospedeira e a p11
(protease) inibe as proteases da clula hospedeira.
A infeco pelo HIV crnica, ou seja, uma vez tendo infectado o

indivduo, o vrus vai persistir por toda a vida. A infeco evolui lentamente
atravs de vrios estgios especficos. No incio da infeco, durante aproxi-
madamente dois meses, o indivduo apresenta elevados ttulos de vrus no
sangue e queda de clulas CD4, caracterizando a fase aguda da doena.
Nesta fase, surgem os sintomas inespecficos, que so, principalmente, fe-
bre, dor de garganta e dor de cabea. Logo aps, surgem os anticorpos no
sangue, observando-se a queda dos ttulos virais e a progresso da doena
para a fase conhecida como assintomtica, a qual pode durar, aproximada-
mente, de oito a dez anos. A doena progride ento para a fase conhecida
como sintomtica, caracterizada pela presena de sintomas especficos da
doena, associados aos microrganismos oportunistas. Nesta fase, observa-
mos um aumento da carga viral no sangue e a queda das clulas CD4 e
consideramos o indivduo com AIDS. Caso no haja um controle rpido e
eficaz, o indivduo pode chegar ao bito.
O diagnstico laboratorial da doena deve ser feito aps o terceiro ms
da possibilidade de contgio e baseado na deteco de anticorpos no
sangue, pela tcnica ELISA. O resultado positivo confirmado por outros
mtodos como a Imunofluorescncia e o Western Blot. O monitoramento da
doena deve ser feito pela dosagem da carga viral e das clulas CD4, presen-
Virologia | 199
tes no sangue do indivduo, atravs dos mtodos moleculares, como a PCR e

a Citometria de Fluxo.
Atualmente, no mundo, o tratamento da doena baseado em uma
combinao de agentes antirretrovirais, denominada Highly Active Anti-Retroviral
Therapy (HART). Estas drogas possuem a capacidade de inibir vrias etapas
do ciclo de replicao do vrus, como fuso, transcrio reversa, integrao e
protease. Os pacientes, quando submetidos a este tratamento, e de um modo
geral, tm uma reduo considervel da carga viral no sangue; consequentemente,
as infeces oportunistas ocorrem de forma menos frequente. A forma de
preveno da doena se d evitando principalmente o contato com sangue,
secrees genitais, como smen, dentre outras secrees biolgicas. O uso de
preservativos durante as relaes sexuais a forma mais eficaz de prevenir a
transmisso sexual desta doena. At o momento, nenhuma vacina encontra-se
disponvel no mercado, mas vrios estudos relacionados a esta rea encontram-
se em andamento.
10.17. Astroviridae
O prefixo astro vem do grego e significa estrela, fazendo uma aluso
ao aspecto morfolgico desses vrus, que se assemelham a estrelas com cinco a
seis pontas. Esta famlia est dividida em dois gneros: Mamastrovirus e
Avastrovirus. O primeiro inclui as seguintes espcies: Bovine astroviru, Feline
astrovirus, Human astrovirus, Ovine astrovirus, Porcine astrovirus e Mink
astrovirus. O segundo tem como representante as espcies: Chicken astrovirus,
Duck astrovirus e Turkey astrovirus. Os membros dessa famlia infectam aves e
mamferos, inclusive o homem.
Essa famlia possui genoma RNA de fita simples linear, no segmentado, de
polaridade positiva, capsdeo icosadrico e ausncia de envelope. O tamanho do
genoma varia entre menos de cinco at mais de 20 kb. A entrada do vrus na clula
hospedeira feita por endocitose, mediada por receptores de membrana.
Esses vrus acometem crianas e adultos e so descritos como importan-

tes enteropatgenos. As principais manifestaes clnicas da infeco por esses
vrus incluem o comprometimento gastrointestinal, tais como, diarreia, nusea,
vmito, febre e dor abdominal. Alguns estudos mostram que a durao dos
sintomas pode levar de trs a quatro dias. Quadros mais severos podem levar
a desidratao e ao bito, principalmente em pacientes imunodeprimidos.
Os mtodos de diagnstico mais empregados para a deteco desses
vrus so: Microscopia eletrnica, ELISA, Imunofluorescncia e a PCR.
No existe ainda tratamento antiviral ou vacinas, entretanto, como o
ciclo se faz por transmisso oral-fecal importante o saneamento bsico e
medidas profilticas, quanto a higiene pessoal e cuidados com a gua e alimen-
tos ingeridos.
10.18. Reoviridae
O prefixo desta famlia se refere a sigla formada por trs letras (REO):
R - respiratrio, E - entrico e O - orfo. Esta designao foi devido ao
primeiro Reovirus ter sido isolado dos tratos respiratrio e entrico de animais
e humanos, os quais no apresentavam sintomas especficos de nenhuma doen-
a, por isso rfo.
Esta famlia uma das mais complexas, consistindo de nove gneros,
como Orthoreovirus, Orbivrus, Coltvrus, Rotavrus, Aquareovrus, Cypovrus,
Phytoreovrus, Fijivrus e Oryzavrus; os quais infectam vrias espcies, como
os mamferos, aves, rpteis, anfbios, peixes, invertebrados e plantas.
Dentre os gneros da famlia Reoviridae, o Rotavrus de extrema
importncia em humanos, pois responsvel por quase um milho de mortes
por gastroenterite em crianas de todo o mundo, principalmente em pases em
desenvolvimento. A mortalidade de crianas abaixo de dois anos de idade
apresenta como maior causa viral a infeco pelo Rotavrus, ficando atrs ape-
Virologia | 201
nas dos vrus causadores de infeces respiratrias. Esta infeco raramente

acomete indivduos adultos e, quando ocorre, geralmente so mais amenas.
O vrion apresenta morfologia esfrica, medindo cerca de 80 nm de
dimetro, desprovido de envelope e com trs capsdeos, apresentando sime-
tria icosadrica. O genoma de 15 a 27 kb, possui cido nucleico de RNA
linear, fita dupla, com cerca de 11 a 12 segmentos e com polaridade positiva.
As enzimas requeridas para a transcrio da fita dupla de RNA esto presentes
no prprio vrus.
Dentre as protenas estruturais, a VP7 (glicoprotena ou protena G) e a
VP4 (protease clivada ou protena P) compem o capsdeo externo e definem
o sorotipo viral, alm de estarem relacionadas com a induo da reposta
imunolgica protetora.
O capsdeo interno composto pela VP6, a qual, de acordo com sua
especificidade antignica, permite a classificao dos Rotavrus em sete distintos
grupos, designados de A-G. Somente os grupos A, B e C foram identifica-
dos em humanos.
Os Reovrus replicam-se totalmente no citoplasma celular das
microvilosidades do intestino delgado, gerando corpos de incluso no citoplasma
das mesmas. Este vrus apresenta uma protena no estrutural, a NSP4, que
uma enterotoxina responsvel pela descamao das clulas intestinais na luz do
intestino, acarretando uma grande liberao de vrus nas fezes. Esta excreo
viral pode durar cerca de dois a doze dias.
A diarreia causada pelo Rotavrus devido alterao na absoro de
sdio e glicose, j que as clulas destrudas so substitudas por clulas imaturas
da cripta, as quais so incapazes de fazer absoro. Os sintomas tpicos da
infeco pelo Rotavrus so: diarreia, febre, dor abdominal e vmito, resultan-
do em desidratao. Os pacientes que apresentam a doena mais branda
permanecem com os sintomas durante aproximadamente trs a oito dias, recu-
perando-se totalmente aps este perodo.
Em adultos, a doena bastante rara, todavia j ocorreram epidemias

nestes indivduos devido ao grupo B. O tratamento da gastroenterite pelo
Rotavrus deve ser a reposio hdrica e eletroltica oral ou parenteral nos casos
mais graves. A preveno da doena pode ser feita atravs de vacina e tambm
por medidas de saneamento bsico. Atualmente, existe uma vacina oral, a qual
administrada em duas doses.
O diagnstico laboratorial baseia-se na evidenciao dos vrus presentes
nas fezes de indivduos infectados recentemente. Para o referido diagnstico,
utilizam-se os seguintes mtodos: Imunomicroscopia eletrnica, imunodifuso
ou ELISA. Outras tcnicas usadas so: a Eletroforese do cido nuclico viral e
tambm a Reao em Cadeia da Polimerase (PCR).
10.19. Orthomyxoviridae
Esta famlia est inserida na ordem Mononegavirales e inclui agen-
tes virais associados s infeces do trato respiratrio, sendo os mais frequen-
tes agentes causadores de quadros sintomticos em humanos.
A famlia Orthomyxoviridae constituda de cinco gneros, os Influenzavirus
A, B e C, os Isavirus e os Thogotovirus. Os trs primeiros gneros apresentam
os agentes causadores da influenza em vertebrados, como aves, humanos e
outros mamferos. Os Isavrus infectam o Salmo e os Thogotovrus infectam
vertebrados e invertebrados, como os insetos. (Quadro 1)
Os gneros Influenzavirus A, B e C so identificados por diferenas
antignicas na nucleoprotena e na protena de matriz, infectando os seguintes
vertebrados:
Influenza A Humanos, outros mamferos e aves. Responsveis por
todas as pandemias de influenza.
Influenza B Principalmente humanos.
Influenza C Humanos e porcos.
Virologia | 203
Quadro 8 gneros Influenzavrus A, B e C e suas respectivas espcies e

sorotipos ou subtipos.
Gneros Espcies Sorotipos ou subtipos

Influenzavrus A Vrus influenza A H1N1, H1N2, H2N2,
H3N1, H3N2,H3N8,
H5N1, H5N2, H5N3,
H5N8, H5N9, H7N1,
H7N2, H7N3, H7N4,
H7N7, H9N2, H10N7
Influenzavrus B Vrus influenza B
Influenzavrus C Vrus influenza C
Isavrus Vrus da anemia infecciosa
do salmo
Thogavrus Vrus Thogoto
Vrus Dhori Vrus Batken, Vrus Dhori
Os vrions associados famlia Orthomyxoviridae so esfricos,

pleomrficos, com nucleocapsdeo medindo cerca de 80 a 120 nm de dime-
tro, envelopados, e apresentam no seu genoma um RNA de fita simples, com
polaridade negativa e com 13,6 Kb. A estrutura viral constituda de nove
protenas, incluindo a hemaglutinina (HA) e a neuraminidase (NA).
No que se referem aos influenzavrus tipos A e B, os seus RNA
apresentam oito segmentos, enquanto o influenza C apresenta apenas sete
segmentos.
Na constituio proteica do Influenzavrus esto presentes as seguintes
protenas estruturais e no estruturais:
Polimerases (PB1, PB2 e PA).
Neuraminidase, a qual catalisa a reao de remoo de resduos de
cido silico da clula hospedeira, permitindo a entrada do vrus atravs
da mucosa.
Hemaglutinina (HA), que permite a ligao do vrus (adsoro) aos

resduos de cido silico na membrana da clula hospedeira, mediando
a fuso viral com o endosoma.
Protena do nucleocapsdeo (NP).
Protenas de matriz (M1 e M2). A M1 prov a rigidez e a M2 est
relacionada ao canal inico, presente somente no influenza A.
Protenas no-estruturais (NS).
Dentre as protenas mencionadas, a hemaglutinina e a neuraminidase
apresentam propriedades importantes, como a que est relacionada a sua
habilidade de alterao devido a mutaes e recombinaes gnicas, sem
alterao da sua funo. As recombinaes gnicas ocorrem devido ao
genoma ser segmentado. Esses processos acarretam o drift e o shift
antignicos. Os drifts so mutaes menores no genoma viral, levando a
epidemias anuais. J o shift so as mutaes mais extensas, levando
possibilidade de pandemias. Estas grandes mutaes acarretaram grandes
epidemias e pandemias na histria da humanidade, onde milhes de indiv-
duos morreram. Como exemplo, a Gripe Espanhola de 1918, causada
pelo vrus H1N1, com mais de vinte milhes de mortes no mundo; a
Gripe de Hong Kong, de 1968-69, causada pelo vrus H3N2, com
mais de 30 mil mortes nos Estados Unidos; a Gripe Asitica, de 1957-
58, causada pelo vrus H2N2, dentre outras ocorrncias, inclusive recen-
temente, em 2009, a Gripe A, inicialmente chamada Gripe Suna, que
ocorreu primeiramente no Mxico e posteriormente em outros pases, in-
clusive no Brasil.
A nomenclatura do Influenzavrus baseada nos seguintes aspectos:
tipo de vrus (A ou B), local de isolamento do vrus, designao da
linhagem, ano de isolamento, subtipo de hemaglutinina e neuraminidase,
por exemplo: A/Texas/1/77/H3N2.
Virologia | 205
As manifestaes clnicas clssicas da infeco causada pelo Influenzavrus

geralmente surgem de forma abrupta e so, principalmente, febre alta, dor de
cabea, calafrios, dores musculares, tosse seca, dentre outro sintomas. Geral-
mente, a febre e os sintomas sistmicos persistem por trs dias. J os sintomas
respiratrios duram de trs a quatro dias. Desta forma, a fase aguda da doena
dura aproximadamente de quatro a oito dias, seguida do perodo de convales-
cena de uma a duas semanas. A infeco pelo Influenzavrus pode ter como
consequncia a pneumonia, a miosite e complicaes neurolgicas, as quais
so evidenciadas principalmente em idosos, imunodeficientes e outros indiv-
duos com alteraes cardacas e pulmonares.
O diagnstico laboratorial baseia-se principalmente no isolamento viral
(em cultura de clulas), na identificao dos antgenos virais e do cido nucleico.
A maioria dos mtodos de diagnstico requerem como material clnico a
secreo de nasofaringe, obtida por aspirao ou por swab.
Para a preveno e tratamento desta infeco podem ser usados, respec-
tivamente, vacinas de vrus inativados e drogas, como o cloridrato de amantadina
e seu anlago, a rimantadina (Quadro 4).
10.20. Paramyxoviridae
O termo myxo vem do grego, que significa mucosas, e identifica a
especificidade dos Paramyxovrus aos mucopolissacardeos e glicoprotenas pre-
sentes nos receptores de superfcie das clulas. Os vrus deste grupo podem
acometer humanos e muitos animais, como artrpodes e vertebrados.
A famlia Paramixoviridae possui os gneros: Morbilivrus, Paramixovrus
e Pneumovrus; sendo o primeiro destes o mais conhecido dos que infectam
humanos, o qual causador do sarampo. Os Paramixovrus tm como repre-
sentante o vrus da Parainfluenza e os Pneumovrus so representados pelo vrus
da caxumba. Como caractersticas importantes, os vrus deste grupo apresen-
tam a aglutinao de hemcias em mamferos e aves, alm da atividade da

enzima neuraminidase.
A forma do vrus completamente irregular, variando de esfricos a
filamentosos com dimetro de 150 a 300 nm, sendo considerados pleomrficos.
O envelope apresenta projees na superfcie, com espculas distintas de
hemaglutinina e neuraminidase. O capsdeo alongado e exibe simetria heli-
coidal, sendo o nucleocapsdeo filamentoso e com extenso que varia de 600
a 800 nm, dependendo do gnero.
Os vrions so compostos de 30% de lipdios em relao ao seu peso
e os mesmos esto localizados no envelope. Os vrions so sensveis ao
tratamento com solventes lipdicos, detergentes no inicos, formaldedo, agentes
oxidantes e calor. As protenas constituem aproximadamente de 75 a 80% do
peso da partcula, sendo estas estruturais e no estruturais, codificadas pelo
genoma viral. Os carboidratos representados pelas glicoprotenas so encon-
trados no vrion e constituem 6% do seu peso seco.
Os membros desta famlia contm no genoma uma molcula de RNA,
de fita simples, linear, com polaridade negativa. Os vrions medem de 150 a
200 nm de dimetro e de 1.000 a 10.000 nm em extenso.
Esses vrus se ligam a receptores especficos localizados na superfcie da
membrana celular e entram na clula hospedeira via fuso do envelope viral,
com a superfcie da clula em um ambiente de pH neutro. Durante o seu ciclo
biolgico, os vrions tm uma fase extracelular e o capsdeo viral envelopado,
maturando-se naturalmente atravs da adeso com a clula hospedeira. A
replicao do genoma ocorre de maneira similar aos outros vrus RNA, que
possuem polaridade negativa. A transcrio, a sntese de protenas e a replicao
do genoma ocorrem no citoplasma da clula hospedeira. As glicoprotenas
virais so sintetizadas e processadas como as glicoprotenas da clula. Os
vrions maduros ligam-se membrana plasmtica hospedeira e saem da clula.
Virologia | 207
Das doenas causadas por vrus desta famlia, o sarampo constitui

uma das mais estudadas e importantes. Esta doena pode causar trs formas
de encefalite: 1) infeco direta dos neurnios; 2) encefalite ps-infec-
o, que se acredita ser mediada imunologicamente; e 3) panencefalite
esclerosante subaguda (SSPE), causada por uma variante defectiva do vrus
durante a fase aguda da doena. O Vrus SSPE age lentamente e causa
sintomas e efeitos citopticos em neurnios, muitos anos aps a fase aguda
da doena. O desenvolvimento de um programa efetivo de vacinao
tornou o sarampo uma doena rara nos Estados Unidos. Em reas sem um
bom programa de vacinao, a epidemia se mostra cclica, repetindo ciclos
epidmicos de 1 a 3 anos, quando j se tem um nmero acumulado de
pessoas suscetveis.
Atualmente, existem algumas vacinas no mercado que so capazes de
proteger apenas contra alguns sorotipos virais, sendo isso, uma grande limita-
o desta forma de preveno. Outra desvantagem o elevado custo.
10.21. Rhabdoviridae
O prefixo desta famlia vem do grego rhbdos, que significa formato
de basto. A famlia Rhabidoviridae infecta uma variedade de hospedeiros,
incluindo artrpodes, o grupo dos vertebrados e vegetais. Existem aproxima-
damente 200 espcies de Rabdovrus reconhecidas pelo ICTV. Entretanto,
poucas so bem caracterizadas e associadas a gneros. A complexidade genmica
e de transcrio, mostradas por esses vrus, indicam a grande diversidade da
famlia. Os gneros de importncia em animais so:
Vesiculovirus (Vesicular stomatitis virus, VSV)
Lyssavirus (Rabies virus, vrus da raiva)
Ephemerovirus (Bovine ephemeral fever virus)
Novirhabdovirus (Infectious hemathopoietic necrosis virus )
O genoma contm apenas uma fita de RNA, no segmentado e de

polaridade negativa, exceto em 5% dos membros dessa famlia. O genoma
completo tem de 11 mil a 15 mil nucleotdeos. O peso da partcula viral
constitudo por aproximadamente 65% a 75% de protenas e o restante de
lipdeos totais, sendo 50% a 60% de fosfolipdeos e 30% a 40% de
esteris e fosfolipdeos. Outro componente importante das partculas virais so
os carboidratos, que constituem 3% da sua composio. A semelhana entre
a composio dos lipdeos virais e da membrana plasmtica eles sugere que
tenham sido originados da clula hospedeira.
O vrion desta famlia apresenta o envelope e o nucleocapsdeo medin-
do de 45 a 100 nm de dimetro. As projees da superfcie so densamente
dispersas com espculas. O capsdeo de simetria helicoidal.
A infeco por Vesiculovirus acarreta a formao de ppulas, as quais
progridem para vesculas, e quando estas se rompem pode ocorrer infeco
secundria, agravando o processo. Com o vrus da raiva (Lyssavirus), o desen-
volvimento dos sinais clnicos em humanos podem ser divididos em trs fases
gerais: perodo prodrmico, fase neurolgica aguda (agitao, hipersalivao e
paralisia) e a fase de coma, precedendo a morte. Em casos em que a hiperatividade
predominante, a doena classificada como raiva furiosa. Naqueles em que
a paralisia predominante, chamada raiva paraltica. Na infeco por
Ephemerovirus, o primeiro sinal clnico a febre, em torno de 40 a 42C,
progredindo para quadros de anorexia, depresso e fraqueza muscular.
O diagnstico laboratorial post mortem do vrus da raiva dever ser
realizado com espcimens clnico do sistema nervoso central (SNC), pelas
tcnicas de Imunofluorescncia ou Imuno-histoqumica para a deteco do
antgeno viral. Para o diagnstico de Vesiculovirus, utilizam-se amostras de
fluido vesicular ou do epitlio da leso para o isolamento viral em culturas de
clulas, em animais de laboratrio ou em ovos embrionados. Outros mtodos,
como Imunofluorescncia e a neutralizao viral, tambm podero ser utilizados
Virologia | 209
para o diagnstico. E ainda, para a deteco de Ephemerovirus, empregam-se

as tcnicas sorolgicas ELISA ou neutralizao viral.
Como preveno da infeco por Lyssavirus humano (raiva) indicada
a profilaxia ps-exposio (soroterapia).
10.22. Filoviridae
Os vrus desta famlia so taxonomicamente classificados na ordem
Mononegavirales. O Gnero Marburgvrus foi descrito em 1967, na Alema-
nha, aps seu isolamento, a partir de 31 pessoas infectadas; e o gnero
Ebolavrus foi descrito em 1976, na frica subsaariana.
Nesta famlia, os vrus possuem capsdeo viral envelopado, com simetria
helicoidal. O genoma de RNA de fita simples linear, no segmentado e
possui polaridade negativa, constituindo 1,1% do peso da partcula. Os
vrions desta famlia so filamentosos e pleomrficos, medindo 80 nm de
dimetro, podendo chegar a 1.400 nm em extenso.
O gnero Marburgvirus apresenta a nica espcie Lake Victoria
Marburgvirus, responsvel pela febre hemorrgica de Marburg e o gnero
Ebolavrus apresenta quatro espcies: Zaire ebolavirus (EBOV-Z), Sudan
ebolavirus (EBO-S), Reston ebolavirus (EBOV-R) e Ivore Coast ebolavirus
(EBOV-IC). Causa a febre sbita, dor muscular, dor de cabea e leses
orais. As enfermidades causadas por esses vrus induzem grandes processos
hemorrgicos em humanos e em primatas no humanos, causando, dentre
outros sintomas graves, diarreia, erupes cutneas, hemorragias, interna e
externa, e vmito com sangue, alm de petquias, sintomas que podem levar
ao choque hipovolmico e bito em poucos dias.
A transmisso viral pode ocorrer atravs de vrios fludos orgnicos,
como sangue, fezes, suor, saliva, vmito, smen e outras secrees, principal-
mente sanguinolentas. O perodo de incubao ocorre de 2 a 21 dias. O
diagnstico laboratorial consiste em analisar amostras, como saliva, urina e

outros fludos, pelas tcnicas ELISA e Imunofluorescncia, alm de mtodos
moleculares.
Para controle e preveno dessas infeces, devem ser tomadas medi-
das, como o adequado isolamento do paciente, esterilizao de materiais que
entraram em contato com as amostras, ou mesmo com o paciente infectado,
utilizao de equipamentos de proteo individual especial pelos profissionais
de sade e dos contactantes (ver captulo 1 do volume 1).
Ainda no existe vacina e terapia antiviral especfica, por isso, o trata-
mento para essas infeces paliativo, ou seja, a busca da reduo do quadro
hemorrgico, a hidratao hdrica e eletroltica parenteral e oral.
10.23. Bunyaviridae
A famlia Bunyaviridae consiste em mais de 300 sorotipos que infectam
vertebrados, invertebrados e vegetais. Os gneros definidos nessa famlia
so: Nairovirus, Phlebovirus, Hantavirus, Orthobunyavirus e Tospovirus.
Esses vrus so transmitidos por mosquitos, flebotomneos e carrapatos, com
exceo do gnero Hantavirus, que infecta roedores e so transmitidos por
inalao de aerossis dos dejetos destes animais . Os membros desta famlia
so conhecidos por causarem infeces graves no homem, dentre as quais
destacamos: a febre do Vale Rift, a febre hemorrgica do Congo e da
Crimia e a encefalite da Califrnia.
Os vrus pertencentes a esta famlia so vrus de RNA circular de fita
simples, trissegmentado, sendo dois segmentos de polaridade negativa e um
de polaridade positiva. O virion carrega, tambm, uma enzima, polimerase
(cap-dependente), denominada L. As extremidades dos segmentos de
RNA servem como stio de reconhecimento para a polimerase. O vrion
apresenta simetria helicoidal, possui envelope e exibe um tamanho de 90 a
100 nm de dimetro. provvel que o mecanismo de viropexia ocorra
Virologia | 211
durante a entrada do vrus na clula, subsequentemente observado o

desnudamento parcial do capsdeo e a partir da a transcrio e traduo das
protenas virais no citoplasma. Os vrus migram para a regio interna da
membrana celular e finalmente saem da clula por pinocitose (brotamento),
carreando parte da bicamada lipdica da clula hospedeira, para formar,
assim, seu envelope.
O vrus mais conhecido desta famlia o Vrus Hantaan, o qual perten-
ce ao gnero Hantavrus. Este vrus infecta roedores e causa diferentes doen-
as, como a febre hemorrgica, com sndrome renal, na sia e na Europa, e a
sndrome pulmonar e cardiovascular, que ocorre nas Amricas. A Sndrome
pulmonar caracterizada por extravasamento de lquidos do compartimento
intravascular para o interstcio pulmonar, podendo levar a grave insuficincia
respiratria. Esses vrus so transmitidos ao homem por inalao de aerossis
disseminados pelos excrementos e saliva de roedores infectados, mas foi des-
crita tambm a possibilidade de contgio direto ou indireto entre humanos. O
primeiro caso registrado no Brasil ocorreu na dcada de 1980, no estado do
Par. Em 1993, trs casos graves, inclusive um deles com bito, aconteceram
no estado de So Paulo, em Juquitiba. O nmero de casos associados a este
vrus tem aumentado, disseminando-se para o sul do pas, tendo, como qua-
dros clnicos, caractersticas da sndrome pulmonar cardiovascular. Alguns des-
ses casos mostraram evoluo de uma grave pneumonia intersticial nos dois
pulmes, com febre intensa e insuficincia respiratria.
A confirmao dos casos pelo diagnstico laboratorial pode ser eviden-
ciada pela Reao em Cadeia da Polimerase precedida de uma Transcrio
Reversa (RT-PCR), assim como a deteco de anticorpos IgM especficos no
soro, atravs do ELISA. O incio da doena caracterizado pelos seguintes
sintomas clnicos: dispneia, insuficincia respiratria grave, calafrios, nuseas,
vmitos e, em alguns casos, diarreia e dores abdominais. Como esses sintomas
podem ocorrer em diversas sndromes, importante que se realize o mto-

do ELISA na pesquisa de anticorpos IgM, a fim de caracterizar a fase
aguda da doena.
Para evitar a propagao dessa doena, deve-se orientar as pessoas que
moram na zona rural ou em qualquer outro lugar de risco sobre a possibilidade
de os roedores silvestres (subfamlia Sigmodontinae) serem reservatrios dos
vrus. Outro cuidado importante deve ser dispensado aos profissionais de
sade, uma vez que j foram relatados alguns casos de mdicos e funcionrios
contaminados por pacientes ou fmites.
O tratamento da sndrome pulmonar e cardiovascular baseia-se na
oxigenao, ventilao dos pulmes e controle da presso arterial. Por esse
motivo, pacientes com esse quadro necessitam de uma internao em unidade
de terapia intensiva (UTI). Estudos sugerem que drogas antivirais, como a
Ribavarina, possam reduzir a gravidade do quadro clnico do paciente grave-
mente acometido.
11. Viroides e P rons

Prons
11.1. Viroides
O conceito de viroide foi proposto por Diener em 1971, quando estu-
dava a doena do tubrculo da batata, onde detectou RNA nos ncleos das
clulas vegetais doentes. O viroide uma partcula infecciosa de RNA menor
que os vrus, apresentando, ainda, outras diferentes caractersticas: Consiste em
apenas uma molcula de RNA circular com baixo peso, no apresenta capsdeo
e envelope, no produz protenas, pode ser copiado apenas no ncleo da clula
hospedeira e, para a sua deteco, necessria a identificao de sequncias de
nucleotdeos do RNA, diferindo dos vrus, por no ser possvel a sua visualizao
em tecidos infectados sem a utilizao dessas tcnicas.
Virologia | 213
Os viroides so classificados na taxonomia moderna em famlias, gneros e

espcies, segundo suas caractersticas biolgicas e moleculares. E constituem os
menores e menos complexos fitopatgenos conhecidos. Ainda no est claro
como os viroides causam doena, mas devem utilizar protenas celulares para
efetivar seu ciclo infeccioso. A morte celular pode ocorrer devido alterao do
metabolismo, pois este interfere na capacidade de as clulas processarem o RNA
mensageiro, impedindo, assim, a produo de protenas celulares.
11.2. Prons
Os prons so partculas proteicas infecciosas, extremamente peque-
nas, resultantes de protenas normais modificadas por mutao, nomeada por
Stanley Prusiner, em 1982. Diferente de outras protenas que aparecem em
membranas plasmticas de muitas clulas, os prons se ligam a estas membra-
nas internamente formando fibrilas que, como no podem ser organizadas
corretamente, formam agregados que, por sua vez, ao longo do tempo,
acabam por matar as clulas.
Desde 1920, vrias doenas tm sido atribudas a esse agente infeccio-
so, algumas delas acometem o ser humano e causam degenerao mental,
outras esto relacionadas a infeces de caprinos e bovinos, como a encefalopatia
e a doena da vaca louca, respectivamente. Vrios aspectos da infeco por
prons ainda no esto elucidados, entre eles a forma como uma doena
causada por pron se propaga.
O Prmio Nobel de Medicina, de 1987, foi dado a Prusiner por seu
estudo, onde ele identifica as cinco caractersticas desse agente infeccioso:
no so inativados pelo calor a 90 oC;
o tratamento com radiao no tem efeito nas infeces por prons,
nem formol;
resistem s enzimas que digerem DNA ou RNA;
so destrudos por agentes qumicos, como o fenol, a ureia e hidrxido

de sdio 1M, responsveis pela desnaturao de protenas;
possuem pareamento direto de aminocidos.
Atualmente, sabe-se que a inativao dos prons s possvel em
autoclave, temperatura de 130o C.
12. Vrus Oncog nicos

Oncognicos
So vrus com capacidade de modificar o acido nucleico, formando
associao estvel com o genoma da clula hospedeira, mudando a sua estrutu-
ra e a funo no organismo. Os oncogenes so fragmentos de DNA de vrus
tumorais que causam a diviso descontrolada da clula hospedeira, j o proto-
oncogene similar ao oncogene, mas formado a partir da captura de genes
extras da clula hospedeira por alguns vrus RNA tumorais.
A maioria dos vrus oncognicos codifica a informao para divises
ilimitadas, pois so mutantes que contm delees ou substituies. Essas
mutaes alteram o material codificado por estes genes.
A maioria dos vrus tumorais conhecidos at o momento so vrus DNA,
tais como o vrus de Epstein-Barr (EBV), o Papilomavrus humanos (HPV) e o
Vrus da hepatite B (HBV); entretanto, alguns vrus RNA esto associados a
cnceres, como, por exemplo, o HTLV-1 e o HIV.
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| 221
Captulo 3
Bacteriologia
Joseli Maria da Rocha Nogueira
Lucieny de Faria Souza Miguel
1. Introduo
A Microbiologia (do grego: mikros, pequeno; bios, vida e logos,
cincia) o estudo dos organismos microscpicos e de suas atividades.
Quando partimos para esta disciplina, devemos considerar que variados mi-
crorganismos podem provocar infeces, e que inmeras tambm so as formas
de diagnstico e identificao dos agentes etiolgicos destas enfermidades.
Para identific-los, devemos analisar sua morfologia, estrutura, reproduo,
fisiologia e metabolismo. Dentro desta cadeira so avaliados tambm os con-
ceitos de distribuio natural, suas relaes simbiticas e as alteraes fsicas e
qumicas que provocam no meio ambiente.
Neste caso, os microrganismos seguem as caractersticas comuns a todos
os sistemas considerados biolgicos: habilidade de se reproduzir, capacidade de
ingerir ou assimilar substncias (metabolizando-as para suas necessidades energticas
e de crescimento), habilidade de excreo de metablitos, capacidade de reagir
a alteraes ambientais (irritabilidade) e suscetibilidade a mutaes.
A Microbiologia pode tambm auxiliar na demonstrao dos princpios

da Biologia, facilitando o estudo de sistemas especficos para a investigao
das reaes fisiolgicas, genticas e bioqumicas, que so a base da vida. Os
microrganismos so instrumentos ideais para a pesquisa dos fenmenos biolgi-
cos, pois, alm de crescerem e se reproduzirem rapidamente, com metabolis-
mo semelhante a de outros organismos mais complexos, em tubos de ensaio
ou frascos, exigem menos espao e cuidados de manuteno.
Os principais organismos estudados em Microbiologia so as bactrias,
os fungos, as algas e os protozorios. Os vrus, apesar de no serem conside-
rados vivos, tm algumas caractersticas de clulas vivas e por isso so estuda-
dos como microrganismos.
Quando pensamos em desenvolver um captulo bsico de Bacteriologia
geral, clnica e laboratorial, levamos em conta inicialmente os conceitos bsicos,
aliados importncia destes microrganismos como participantes da microbiota e
como causadores de doenas. Na parte do diagnstico bacteriano, a necessi-
dade de comentar as metodologias simples e complexas, que permitem a
obteno de resultados corretos (j que, na maioria das vezes, o paciente
depende do resultado de um exame para o incio do tratamento), levou-nos
no s a tratar os agravos em funo do microrganismo, mas a pesquisar, de
acordo com a regio anatmica em que ele pode ocorrer.
2. Histrico da Bacteriologia
Uma das primeiras hipteses, associadas Bacteriologia, de que se tem
notcia foi postulada no sculo XIII, por Roger Bacon, que sugeriu que as
doenas eram produzidas por seres vivos invisveis. A ideia foi novamente
recomendada por Girolamo Fracastoro de Verona (1483-1553), mas a pri-
meira observao descrita e documentada dos organismos bacterianos foi reali-
zada pelo naturalista holands Antony Van Leeuwenhoek (1632-1723),
com a ajuda de um microscpio simples de sua prpria construo. Ele infor-
Bacteriologia | 223
mou sua descoberta Sociedade Real de Londres, em 1683, mas a Bacterio-

logia, como cincia, no se estabeleceu at meados do sculo XIX.
Apesar das tentativas iniciais de associar as bactrias s doenas, como
nos antigos trabalhos do pesquisador Marcus Anton Von Plenciz (1705-
1786), que procurou estabelecer a natureza do contagium e do miasma
(o primeiro, derivando do organismo doente, enquanto o segundo, que era
gerado fora do corpo, se espalhava pelo ar), por vrios anos se acreditou que
bactrias eram produzidas atravs de gerao espontnea.
Foram requeridos os esforos de vrios qumicos e bilogos para provar
que as bactrias, como todos os organismos vivos, s surgiam de outros
organismos semelhantes. Este fato fundamental foi finalmente estabelecido em
1860, pelo cientista francs Louis Pasteur (1822-1895). Com seus traba-
lhos associados aos de Robert Koch (1843-1910), outro brilhante estudio-
so, praticamente inicia-se a era da Bacteriologia.
Em 1840, depois dos primeiros trabalhos de Pasteur, Friedrich Gustav
Jacob Henle (1809-1885), em uma notvel publicao, exps as suas ideias,
estabelecendo condies bsicas para que um agente microscpico particular
pudesse ser considerado causador de uma doena infecciosa ou infectocontagiosa.
Estas condies correspondem aos Postulados de Henle:
O agente causador da infeco deve ser encontrado com constncia
no corpo do doente.
Deve ser possvel isol-lo e, com tal agente isolado, reproduzir expe-
rimentalmente a doena.
Os dois postulados citados seriam aperfeioados e mais tarde impostos
aos bacteriologistas pelos trabalhos de Robert Koch (primeiro a isolar o M.
tuberculosis):
Um microrganismo especfico pode sempre ser encontrado em associ-
ao com uma dada doena.
O organismo pode ser isolado e cultivado, em cultura pura, no

laboratrio.
A cultura pura produzir a doena quando inoculada em animal
sensvel.
possvel recuperar o microrganismo, em cultura pura, dos animais
experimentalmente infectados.
Seguindo as ideias de Pasteur, que ao destruir a teoria da gerao
espontnea, John Needham 1745, afirmou estar o ar cheio de micrbios, e
levando em conta que as fermentaes e as putrefaes so tambm obras de
microrganismos, o mdico Oliver W. Holmes (1809-1894) insistia que a
febre puerperal era contagiosa e, provavelmente, ocasionada por um agente
transmitido de uma me para outra, por intermdio dos mdicos e das partei-
ras. Quase na mesma poca, o mdico hngaro Ignaz P. Semmelweis (1818-
1865) introduziu o uso de antisspticos na prtica obsttrica. Com base
nestes estudos, o Dr. Joseph Lister (1827-1912) concluiu em 1867 que
deveria ser possvel evitar as infeces ps-operatrias, desinfetando previa-
mente os instrumentos cirrgicos, o campo operatrio e as mos do cirurgio.
O perodo de 1880-1900 representa a poca urea da Bacteriologia,
com a descoberta de vrias bactrias patognicas. Durante um congresso inter-
nacional, ocorrido em Londres em 1881, Louis Pasteur teve a oportunidade
de tomar conhecimento da introduo, por Robert Koch, dos meios slidos
(gelatina, gar, etc.) na Bacteriologia (at ento Pasteur s usava meios lqui-
dos, o que praticamente impossibilitava o isolamento bacteriano). Koch tam-
bm desenvolveu tcnicas de fixao e colorao, muitas das quais utilizamos
at os dias de hoje.
Nos ltimos anos, com o advento da Biologia Molecular, a Microbiologia
evoluiu extraordinariamente e est se mostrando, cada vez mais, uma cincia
multidisciplinar. Hoje, associamos velhos conhecimentos com os novos, facili-
tando os diagnsticos e os tratamentos.
Bacteriologia | 225
Com certeza, em poucos anos, teremos maiores avanos nesta rea, que
no para de crescer, e contamos com vocs, estudantes, para, no futuro
desenvolverem novas tcnicas e fazerem novas descobertas, auxiliando, assim,
a evoluo desta cincia.
3. Morfologia e citologia bacteriana

Para iniciarmos nossos trabalhos em Bacteriologia importante reforar
que o tamanho das bactrias da ordem de milsimos de milmetro, ou seja,
micrmetros (mm), podendo, no entanto, serem observadas em microscopia
pttica (ver captulo 3 - item sobre Microscopia), o que no ocorre com os
vrus, que, possuidores de dimenses inferiores a 0,2 mm (limite de visibilida-
de do microscpio tico), no podem ser observados neste instrumento.
A maioria das bactrias estudadas nos laboratrios de Microbiologia
mede de 0,5 a 1,0 mm de dimetro por 2,0 a 5,0 mm de comprimento.
3.1. Morfologia
Outro dado relevante que as bactrias podem se apresentar em trs
tipos morfolgicos fundamentais:
3.1.1. Bastonetes ou bacilos
Bastonetes longos ou curtos com extremidade reta ou de ponta arre-

dondada, ou ainda curvos, em forma de vrgula.
3.1.2. Espirilos
Forma de hlice, sacarrolha, ou espiralar.
3.1.3. Cocos
Podem ser esfricos, elpticos, em forma de ponta de lana, riniformes, etc.

Os cocos podem formar diferentes arranjos, de acordo com a sua

diviso celular (em plano nico, ou em mais planos):
Diplococos Cocos agrupados 2 a 2 (diviso em um nico
plano).
Estreptococos Vrios cocos dispostos em cadeia, similar a um
cordo de prolas. (diviso em um nico plano).
Ttrades Grupos de 4 cocos unidos (diviso em 2 planos).
Sarcinas Grupos de 8 cocos unidos, de forma semelhante a um
cubo (diviso em 3 planos).
Estafilococos Cocos agrupados de forma aleatria, semelhante
ao formato de um cacho de uvas (diviso em muitos planos).
Os bastonetes (ou bacilos) no se dispem em tantos arranjos
como os cocos, sendo que, na sua grande maioria, se apresentam de
forma isolada. Porm, ocasionalmente podem ocorrer aos pares
(diplobacilos) ou em cadeias (estreptobacilos). Dependendo do gne-
ro, fase de crescimento ou da composio do meio de cultura, estas
bactrias podem tambm apresentar arranjos diferenciados, como cresci-
mento em paliada ou letras chinesas ( Corynebacterium /Difteria).
Quando os bastonetes so muito curtos, podemos encontrar alguns
autores denominando-os cocobacilos.
Os espirilos ocorrem, predominantemente, como clulas isoladas.
Exibem, porm, ntidas diferenas em relao ao comprimento, largura,
nmero e amplitude dos espirais.
Bacteriologia | 227
Bacilos ou Bastonetes Cocos
Espirilo Diplococos
Estafilococos Estreptococos
Sarcina Ttrade
3.2. Citologia
Quanto parte de Citologia bacteriana, no pretendemos nos estender
neste assunto, porm gostaramos de comentar que as bactrias so seres
procariticos, ou seja, desprovidos de membrana nuclear (tambm chamada de
carioteca). Elas no possuem todas as estruturas internas das clulas eucariticas,
sendo mais simples em todos os nveis, menos no seu envoltrio celular. Para
se ter uma ideia, citaremos os principais elementos estruturais das bactrias:
3.2.1. Parede celular

Responsvel pela forma, rigidez bacteriana, diviso celular e muitas vezes
manuteno osmtica, com uma espessura de aproximadamente 10 a 20 mm
formada, entre outras substncias, por um complexo macromolecular, conheci-
do como mucocomplexo (tambm chamado de peptidoglicano, murena,
mucopeptdio ou glicopeptdio), de importncia prtica na taxonomia bacteriana.
Nas bactrias chamadas Gram-negativas (Figura 1), este complexo representa
uma frao menor do total da parede em relao s Gram-positivas (Figura 2).
A parede celular nas bactrias Gram-negativas quimicamente mais complexa,
possuindo maior quantidade de aminocidos e de lipdeos. Sua frao de LPS
(lipopolissacardio) externa determina sua toxigenicidade e antigenicidade. As
bactrias Gram positivas possuem como poro caracterstica os cidos teicoicos.
Algumas bactrias com paredes estruturalmente Gram-positivas possu-
em uma modificao importante que pode ser utilizada na taxonomia; nestas
bactrias, os lipdios esto em maior quantidade e fortemente ligados (cerca
de 60% do peso seco da parede), alm disso, elas possuem tambm em
sua composio cidos miclicos. O gnero Mycobacterium o exemplo
mais importante de microrganismo onde ocorre esta modificao, devido ao
carter hidrofbico de sua parede, sua colorao pelo mtodo de Gram
dificultada, mas ele poder ser diferenciado pela capacidade de lcool-cido
resistncia (Ver item 5.2 deste captulo).
Bacteriologia | 229
Figura 1. Estrutura bsica da parede celular Gram-negativa
Figura 2. Estrtura bsica da parede celular Gram-positiva
Existe um grupo de bactrias chamado micoplasmas, que no possui parede

celular nem peptidoglicano, apesar de estudos moleculares os colocarem prximos
das bactrias Gram negativas, estes so incapazes de serem corados pelo mtodo
clssico de Gram, j que no possuem parede. Alguns deles possuem esteris em
suas membranas, diferenciando-os mais ainda dos outros procariotos. Outro fato
interessante que eles acabam se tornando resistentes aos antibiticos, que tm a
parede bacteriana comum como alvo (ver item 10 deste captulo).
A parede celular das arqueobactrias (ver item 4 deste captulo) tam-
bm no acompanha o mesmo esquema das bactrias comuns, podendo apre-
sentar uma parede rgida (pseudomurena) ou uma simples camada S (geral-
mente glicoprotenas).
3.2.2. Membrana celular ou membrana citoplasmtica bacteriana

Tambm chamada de membrana plasmtica constituda de fosfolipdios
e protenas, sua estrutura semelhante a dos organismos no procariticos,
todavia, com exceo dos grupo bacteriano dos micoplasmas, no possuem
esteris. Trata-se de uma membrana semipermevel, seletiva, sede de vrias
enzimas, que limita o citoplasma. Importante, no s para o transporte de ons
e metablitos (ex.: enzimas permeases e porinas), ela tambm atua em nume-
rosos processos biossintticos.
A membrana celular das arqueobactrias pode conter lipdios nicos e
longos, sem grupamento fosfato. O que, segundo alguns autores, pode con-
tribuir para suas atividades em ambientes incomuns (alta concentrao de sal,
baixo pH ou altas temperaturas).
3.2.3. Citoplasma
A clula bacteriana apresenta no seu citoplasma diferentes regies, que
podem ser divididas didaticamente. Uma rea chamada citoplasmtica, de apa-
rncia granular e rica em RNA, uma rea chamada de cromatnica ou nuclear,
rica em DNA, e uma poro fluda, com nutrientes dissolvidos.
Na rea chamada citoplasmtica, temos, juntamente com o RNA, part-
culas proteicas, formando corpsculos com cerca de 20 nm de dimetro,
chamados ribossomas. Estes possuem enzimas que atuam na biossntese da
clula (so responsveis pela sntese proteica, possuindo em sua composio,
aproximadamente, 60% de RNA e 40% de protenas).
Como j dissemos, as bactrias no possuem membrana nuclear e nem
aparato mittico. Na rea cromatnica, temos o chamado nuclolo ou nucleoide,
composto por um cromossomo de DNA de dupla hlice, em sua grande
maioria na forma de uma molcula nica circular (algumas bactrias, como o
Vibrio cholerae, podem possuir mais de um cromossomo; e outras, como a
Borrelia burgdorferi, possuem um cromossomo linear). O cromossomo possvel
Bacteriologia | 231
de ser caracterizado em cultura de clulas jovens tratadas com HCl, a fim de

destruir o RNA citoplasmtico, seguido de colorao, pelo mtodo de Giemsa
(Apndice 1).
3.2.4. Outras estruturas

Alguns elementos podem estar presentes, ou no, em determinados
gneros bacterianos. Podendo, muitas vezes, alm de sua funo para a pr-
pria clula, nos auxiliar na taxonomia:
Grnulos ou incluses citoplasmticas Podem ser visualizados atravs de
coloraes especiais, pois geralmente so refringentes. Sua natureza varia de
acordo com o organismo, porm sua funo sempre de armazenamento.
Encontrando-se reservas de glicognio, amido, fosfatos, enxofre, etc.
Alguns destes grnulos podem auxiliar na identificao presuntiva da presena
de determinadas bactrias, como no caso de Corynebacterium, que acumulam
polifosfatos. Esses grnulos so s vezes denominados grnulos de volutina ou
metacromticos, uma vez que, com corantes azuis, se diferenciam, corando-se
em vermelho. Uma alternativa para realizar essa distino atravs do mtodo
de Albert Laybourn (Ver item 5.3.1 deste captulo).
Plasmdeo - Estrutura de DNA circular extracromossomial, de duplica-
o independente (replicon), localizada no citoplasma da clula (menor
que o cromossoma), que no responsvel por caractersticas essenciais
da bactria. Geralmente se apresentam com vrias cpias, no possuin-
do homologia com o cromossomo, mas capacidade de conferir vrias
vantagens seletivas (ex.: resistncia a antibiticos), podendo, inclusive,
ser transferidos para outras bactrias. Essas estruturas tm sido largamen-
te utilizadas, na atualidade, na engenharia gentica.
Glicoclice Camada externa viscosa que cerca a parede celular e
pode ocorrer em muitas bactrias. Sua natureza qumica, na maior parte
polissacardica, variada, e depende da espcie bacteriana. Os termos
cpsula e camada limosa ou slime so usados, frequentemente, e al-

guns autores os diferenciam baseando-se na organizao mais ou menos
definida de sua estrutura. Alm de fornecer um envoltrio protetor,
possui seu papel ligado virulncia e imunogenicidade, j que pode
atuar na defesa da bactria contra a fagocitose, bacterifagos e, princi-
palmente, auxiliar na aderncia bacteriana a algumas superfcies Um bom
exemplo o Streptococcus mutans, que forma a placa bacteriana dentria.
Flagelos So estruturas de locomoo formadas por apndices muito
finos, compostos de flagelina (protena), e se encontram presentes em
algumas bactrias. O flagelo apresenta trs componentes: uma estrutura
basal, uma similar a um gancho e um longo filamento externo parede
celular. O seu comprimento geralmente vrias vezes o da clula,
contudo, seu dimetro uma pequena frao do dimetro celular (10 a
20 nm). Podem ser nicos ou mltiplos, polares ou peritrquios (em
todo corpo bacteriano), auxiliando, desta forma, em estudos taxonmicos.
Apesar destas estruturas estarem categoricamente ligadas locomoo
bacteriana, algumas bactrias podem se movimentar por outros meios,
como, por exemplo, o deslizamento provocado pelo fluxo
protoplasmtico.
Pili ou fmbria - So apndices filamentosos compostos de pilina (pro-
tena) encontrados em algumas bactrias Gram-negativas, mais finos,
mais curtos e geralmente mais numerosos que os flagelos. De acordo
com sua estrutura, podem desempenhar duas funes de grande impor-
tncia: a aderncia a superfcies (atravs das adesinas localizadas em suas
extremidades) e como pili sexuais, permitindo a fixao de clulas doa-
doras e receptoras, servindo como porta de entrada para material gen-
tico na conjugao bacteriana.
Esporos (endosporos) Essas estruturas so produtos de uma respos-
ta ao meio ambiente e podem ser formadas em alguns gneros bacterianos
Bacteriologia | 233
(ex.: Bacillus e Clostridium), so refringentes aos corantes e altamente

resistentes a agentes fsicos e qumicos. Formam-se quando o meio se
torna inadequado para a sobrevivncia da bactria em sua forma
vegetativa (ex.: escassez de gua ou nutrientes). Cada clula forma
um nico esporo, que liberado quando a bactria morre. Sua com-
posio se caracteriza por alto teor de clcio associado ao cido
dipicolnico, relacionado desidratao e alta resistncia, inclusive
trmica. Essas estruturas permitem a manuteno de microrganismos em
forma esporulada (latente ou em repouso), por longos anos, no ambi-
ente, sendo consideradas notveis estratgias de sobrevivncia, j que
podem reverter forma vegetativa quando o local se torna vivel
novamente para sua sobrevida.
4. Taxonomia bacteriana
Taxonomia
Taxonomia (do grego tassein = para classificar e nomos = lei, cincia,
administrar) considerada a cincia da classificao. A classificao necessita
da criao de um sistema que facilite identificar os seres. O primeiro sistema de
classificao foi o de Aristteles, no sculo IV a.C., que ordenou os animais
pelo tipo de reproduo e por terem ou no sangue vermelho. Vrios sistemas
foram posteriormente criados a partir destas ideias.
Inicialmente, os seres vivos eram divididos em dois reinos: Plantas e
Animais. Como muitos seres simples no cabiam nesta diviso, Ernst Heinrich
Haeckel props, em 1866, a categoria Protista, incluindo algas, fungos,
protozorios e bactrias. Posteriormente, em 1959, a classificao mais aceita
passou a ser a de Robert H. Whittaker (1920-1980), composta por cinco
reinos: Protista (protozorios e algumas algas), Monera (bactrias procariontes
e cianobactrias ou algas azuis), Fungi, Plantae e Animalia. Em 1987, a
anlise filogentica molecular levou o microbiologista Carl Richard a mudar o
rumo da taxonomia de procariontes e a propor em 1990 o domnio Archaea
para as arqueobactrias (consideradas representantes das formas mais primitivas

de vida na terra) e mais dois outros domnios: as outras bactrias (Bactria) e
os eucariontes (Eucarya) - fungos, protozorios, plantas e animais.
Ento como estamos vendo, o paradigma atual da taxonomia para as
bactrias, reside no entendimento das relaes evolutivas, fundamentado qua-
se que exclusivamente na filogenia de sequncias de rRNA 16S e em novas
metodologias moleculares que esto surgindo a cada dia. No h mais um
consenso sobre o conceito estrito de espcie em procariontes, mas diferentes
modelos evolutivos, de um lado baseados em seleo natural, e de outro na
transferncia gentica horizontal. Para testar estes modelos, sero necessrias
futuras pesquisas sobre evoluo, filogenia, e gentica de populaes procariontes
com dados obtidos atravs de estudos moleculares como Multi Locus Sequence
Analysis (MLSA) (Ver captulo 2 do volume 3) e outras tcnicas que esto
sendo aperfeioadas para essas anlises.
4.1. Nomenclatura taxonmica

Considerando que todos os seres vivos, e mesmo objetos inanima-
dos, podem estar dentro de vrios tipos de classificao, todos devero
possuir um nome para que sejam reconhecidos como pertencentes quele
txon ou categoria.
A nomenclatura taxonmica se iniciou com este objetivo, em 1735,
com os estudos de um sistemtico botnico sueco chamado Carolus Linnaeus
(Carl Von Linn). Ele desenvolveu um sistema binominal, baseado em um
plano de organizao, que serviria a todos os seres vivos, incluindo os organis-
mos bacterianos. Esse sistema possua dois princpios bsicos:
1. O uso de palavras latinas, para nomear os grupos de organismos.
2. O uso de categorias de classificao, estabelecendo uma hierarquia.
Inicialmente, as categorias propostas por Lineu foram: reino, classe,
ordem, gnero e espcie.
Bacteriologia | 235
Devido evoluo das tcnicas taxonmicas e do grande nmero de

organismos descritos aps as propostas de Linnaeus, foi necessria uma subdi-
viso das cinco categorias. Assim, atualmente usamos: reino, filo, classe,
ordem, famlia, tribo, gnero e espcie. Alguns especialistas sugerem que,
de acordo com cada caso, podem ser adicionadas outras categorias, como
subfilo, superclasse e subespcie.
A organizao taxonmica havia, ento, sido criada com o intuito de
classificar, ordenar e identificar os microrganismos, passando a se dividir em
classificao, nomenclatura e identificao:
A. Classificao - Divide os microrganismos em grupos, de acordo com
as caractersticas artificiais ou naturais. As classificaes artificiais so baseadas
nas caractersticas fenotpicas (expresso), principalmente morfolgicas e fisio-
lgicas dos microrganismos. J as classificaes naturais, como j falamos, so
baseadas nas relaes filogenticas moleculares das bactrias, atravs de com-
paraes na sequncia de vrias macromolculas ou genes (genotpica).
B. Nomenclatura (no nosso caso bacteriana) - Refere-se ao nome do
microrganismo, seguindo o Cdigo Internacional para Nomenclatura de
Procariontes (International Committee on Systematic of Prokaryotes). Este
contm todos os princpios e recomendaes para a descrio de uma nova
unidade de classificao (ou txon, no plural taxa), em espcie, gnero ou
famlia. As regras do cdigo internacional baseiam-se no sistema binominal
desenvolvido por Linnaeus: O nome de uma espcie bacteriana proveniente
da combinao, em latim, formada de duas partes, o nome do gnero, segui-
do pelo nome da espcie bacteriana. Como, por exemplo: Escherichia coli
(Escherichia o gnero, e coli a espcie).
Seguindo a regra, apenas a primeira letra do nome do gnero escrita
em maiscula, e o nome completo dever ficar em itlico ou sublinhado.
Exemplo: Escherichia coli ou Escherichia coli.
No caso de bactrias em que os sorotipos possuem grande importncia,

eles so citados aps o nome da espcie, mas no se muda a grafia para itlico,
o que poder causar confuso.
Exemplo: Salmonella enterica, subespcie (subsp.) enterica sorotipo
Typhi. Muitas vezes encontraremos escrito Salmonella Typhi.
Para se estabelecer um nome de um txon, este dever ser avaliado pelo
Cdigo Internacional para Nomenclatura de Procariontes. Aps validao, o
novo nome divulgado comunidade cientfica atravs da revista International
Journal of Systematic Bacteriology (IJSB).
C. Identificao - um processo que determina as caractersticas do
microrganismo, sua relao com microrganismos similares ou diferentes, e, pos-
teriormente, com base nesses achados, indica-lhe o nome.
Normalmente o nome da espcie determina uma caracterstica
morfolgica ou bioqumica ou pode homenagear uma pessoa ou lugar.
Para citar uma espcie que no tenha sido identificada, mas que conhe-
cemos o gnero, faz-se uso da abreviatura sp., que significa espcie. Por
exemplo, Klebsiella sp., ou seja, uma espcie qualquer do gnero Klebsiella.
Se for necessrio fazer referncia a vrias espcies do gnero, a abreviatura a
ser utilizada spp., espcies: Klebsiella spp. Deve ser observado que sp.
ou spp. no so escritos em itlico ou sublinhados.
Atualmente, a taxonomia e a nomenclatura so realizadas por determina-
es genticas (homologia do DNA, anlise de sequncia do DNA, anlise
do RNA 16S ribossmico). Permitindo sistemas taxonmicos mais estveis,
onde as modificaes de nomes sejam menos frequentes.
Nos ltimos anos, a classificao taxonmica ganhou apoio da Bio-
logia computacional e da bioinformtica, empregando o mtodo das rvo-
res filogenticas para facilitar a taxonomia dos seres vivos.
Bacteriologia | 237
4.2. Conveno taxonmica

Sufixos usados para determinao de ordens, famlias e tribos:
Ordens: sufixo ales. Ex.: Eubacteriales
Famlias: sufixo aceae. Ex.: Bacillaceae
Tribos: sufixo eae. Ex.: Proteae (Proteus)
4.3. Regras de modificao na nomenclatura

Os nomes dos microrganismos podem ser modificados aps estudos
mais detalhados (Biologia Molecular), e estes devem ser registrados no IJSB,
de acordo com as seguintes regras:
a. Quando se transferir uma espcie de um gnero para outro, a esp-
cie ser mantida.
Ex.: Campylobacter pylori mudou para Helicobacter pylori.
b. Quando a cepa pura (cepa tipo) pertencer a outro gnero, o gnero
desta cepa dever ser considerado nulo.
Ex.: Enterobacter agglomerans mudou para Pantoeae agglomerans.
c. Quando um microrganismo estiver em duas ou mais designaes de
gnero e espcie, o nome do gnero/espcie da cepa tipo dever ser
considerado como o nome vlido.
5. P rincipais mtodos de visualizao e colorao

Principais
comuns na prtica laboratorial
Considerando o captuuloMicroscopia, do volume 1 desta cole-
o, vimos que as bactrias s podem ser visualizadas com auxlio dos
diferentes tipos de microscpio. Vamos tratar aqui das tcnicas associadas
ao microscpio tico, forma mais simples e comum de se examinar estes
microrganismos no laboratrio.
De uma maneira geral, as bactrias podem ser observadas de duas

formas, a primeira a fresco, atravs de observao de suspenso bacteriana
entre lmina e lamnula, ou pela gota pendente, e a segunda atravs de um
esfregao fixado e corado.
Geralmente, a observao a fresco utilizada para visualizao da mobi-
lidade e morfologia de bactrias espiraladas (que podem ficar distorcidas se
fixadas), ou mesmo em outras bactrias, para observar alteraes na diviso
celular e formao de esporos. Neste caso, utiliza-se geralmente um microsc-
pio de campo escuro, pois as bactrias ao microscpio de campo claro tendem
a aparecer transparentes, sendo necessria, muitas vezes, a utilizao de filtros
de densidade neutra para diminuir a intensidade luminosa e facilitar a visualizao.
Quando utilizamos material fixado e corado, temos vrias vantagens,
pois alm de as clulas ficarem mais visveis aps a colorao, podemos trans-
portar estas lminas sem risco (pois o material est fixado), bem como diferen-
ciar clulas de afinidades distintas aos corantes e de morfologia variada.
O esfregao do material deve ser pouco espesso e homogneo. Deve
ser feito em rea de segurana biolgica, a partir de um caldo preferencilamente,
ou do material diludo em salina, espalhado com ala bacteriolgica em lmina
de vidro limpa, desengordurada e seca. Posteriormente, a lmina dever ser
seca ao ar. Aps a secagem, o material dever ser fixado lmina, atravs do
calor ou quimicamente.
A maioria das bactrias tem afinidade por um grande nmero de corantes,
principalmente aqueles do grupo dos derivados bsicos da anilina (azul de
metileno, violeta de genciana, tionina, fucsina bsica, etc.). Quando fazemos
uma colorao com apenas um corante e observamos a morfologia da bactria,
chamamos de colorao simples. Quando utilizamos mais de um corante ou
reagente, com o intuito de evidenciar diferenas entre clulas bacterianas,
damos o nome de colorao diferencial ou seletiva.
Bacteriologia | 239
Atravs do estudo das bactrias e de seu comportamento diante

de diferentes corantes, verificou-se que h diferentes reaes caractersti-
cas de determinados grupos bacterianos, o que facilita, neste caso, a
identificao destes grupos, baseada na resposta da amostra ao determi-
nado mtodo de colorao.
Dentre os mtodos diferenciais existentes, aqueles que apresentam mai-
or importncia dentro de um Laboratrio de Anlises Clnicas so o mtodo
de Gram, o mtodo de Ziehl-Neelsen e o mtodo de Albert-Laybourn. A
seguir explicaremos estas tcnicas comuns e tambm o mtodo de Fontana-
Tribondeau, que apesar de no ser diferencial, ainda utilizado em alguns
laboratrios, com certa frequncia.
Existem ainda os mtodos de colorao pouco usados na rotina
laboratorial, mas que podem ser teis quando se necessita corar alguma estru-
tura especfica, como a colorao de flagelos, esporos e cpsula, que discutire-
mos no final deste tpico.
5.1. Colorao de Gram

Desenvolvida pelo mdico dinamarqus Hans Christian Joachim Gram,
em 1884. Tem como fundamento o fato de que as bactrias, quando coradas
por derivados prximos da rosanilina (violeta genciana, cristal-violeta, metil-
violeta, etc.) e depois de tratadas pelo iodo (soluo iodo-iodetada, conheci-
da como lugol), formam um composto de colorao escura, entre o iodo e o
corante, chamado iodopararosanilina. Este composto, nas bactrias Gram-po-
sitivas, fortemente retido e no pode ser facilmente removvel pelo tratamen-
to posterior com o lcool, ao passo que nas Gram-negativas este composto
facilmente descorado pelo lcool.
Aps a ao do lcool, feita uma segunda colorao pela safranina ou
fucsina de Ziehl, diluda a 1/10. Neste caso, as bactrias Gram-negativas
aparecero vermelhas, devido a cor do corante de fundo, e as Gram-positivas

aparecero roxas, pois conservam a cor do corante inicial (Figura 3).
Esta distino muito importante na sistemtica bacteriana e ocorre com
base nas diferenas existentes na parede celular das bactrias Gram-positivas e
Gram negativas j estudadas em Citologia bacteriana. Todavia, importante
sempre utilizar culturas jovens para no haver falsos resultados.
Atravs de nossa experincia, podemos formular duas regras simples:
Os cocos geralmente so Gram +, com exceo do gnero Neisseria
(gonococo e meningococo).
Os bastonetes geralmente so Gram, com exceo de Corynebacterium,
Listeria (cocobacilo), Bacillus e Clostridium.
5.1.1. Mtodo de Gram (Clssico)
A partir de um esfregao delgado, homogneo, seco e fixado:

Corar por 1 minuto, com soluo cristal violeta fenicada (alguns auto-
res sugerem violeta genciana ou violeta de metila).
Alguns autores sugerem, ainda, a lavagem da lmina com gua, para
melhorar a visualizao. Todavia, esta etapa desnecessria.
Escorrer o corante e cobrir por 1 minuto o esfregao com soluo de
lugol (soluo iodo-iodetada).
Alguns autores sugerem a lavagem com gua, nesta etapa. Realmente,
a retirada do excesso de corante melhora a observao, contudo, esta
etapa tambm no obrigatria.
Descorar com lcool absoluto ( 30 segundos)*.
Lavar com gua (obrigatoriamente).
Corar com safranina ou fucsina de Ziehl diluda a 1/10 ( 30 segun-
dos) Alguns autores sugerem que ao corar organismos anaerbios a
opo seja a carbol-fucsina, que permite melhor penetrao.
Bacteriologia | 241
Lavar com gua (obrigatoriamente) e secar.

Observar em objetiva de imerso (100 X).
* Em alguns livros, podemos encontrar modificaes utilizando lcool-acetona,
mas a tcnica preconizada atualmente pelo Ministrio da Sade sugere a
utilizao de lcool 99,5oGL e, como corante de fundo, a safranina.
5.1.2. Preparao de corantes
A. Cristal Violeta Fenicada

Cristal violeta (violeta de genciana)..............1,0 g
lcool 95........................................10 mL
Fenol fundido ......................................2,0 g
H2O destilada..................................100 mL
Dissolver o corante no lcool, adicionar o Figura 3. Bactrias coradas

fenol fundido pouco a pouco e acrescentar pelo mtodo de Gram
a H2O destilada. Filtrar aps 24 horas de
repouso.
B. Lugol
Iodo metlico.................1,0 g
Iodeto de potssio............2,0 g
H2O destilada...............300 mL
Triturar e misturar o iodo metlico ao iodeto de potssio e adicionar a
H2O destilada aos poucos.
C. Fucsina de Ziehl
Usa-se diluda a 1/10 (vide fucsina fenicada de Ziehl) ou safranina
diluda em gua.
Safranina......................................2,5 g
gua destilada............................500 mL
Misturar bem o p na gua at a completa dissoluo.
5.2. Colorao de Ziehl-Neelsen

Desenvolvida pelo bacteriologista Franz Ziehl e pelo patologista alemo
Friedrich Carl Adolf Neelsen, em 1882. Baseia-se na propriedade de poucos
gneros bacterianos (Micobacterium e Nocardia) de resistirem ao descoramento
com uma soluo de lcool-cido, aps tratamento pela fucsina fenicada aquecida,
permanecendo coradas de vermelho (BAAR- Bacilo-lcool-cido-Resisten-
te), diferentemente das outras bactrias, que, por no possurem esta proprie-
dade, tomam a cor do corante de fundo, normalmente feita com azul de
metileno ou cido pcrico saturado (Figura 4).
A lcool-cido-resistncia est relacionada existncia na parede celular
destas bactrias de lipdeos fortemente ligados (ex.: cido miclico), que
provocam hidrofobicidade, dificultando a penetrao de corantes aquosos, a
ao dos mordentes e dos diferenciadores, o que no ocorre em outros
gneros bacterianos.
5.2.1. Mtodo de Ziehl-Neelsen

Esfregao homogneo, delgado e fixado.
Cobrir o esfregao com soluo de fucsina de Ziehl, deixar agir por 5 a
10 minutos, aquecendo com chama branda (evitar a fervura), at des-
prendimento de vapores (essa etapa pode ser realizada em banho-maria,
todavia, o tempo de aquecimento dobra para at 20 minutos).
Bacteriologia | 243
Lavar em gua corrente e descorar com soluo de lcool-cido clor-

drico a 1%.
Cobrir o esfregao com azul de metileno, por aproximadamente 30
segundos.
Lavar e deixar secar.
5.2.2. Preparo dos corantes

Figura 4. Micobacterium
A. Fucsina de Ziehl spp. corado pelo mto-
Fucsina bsica .........................1,0 g do de Ziehl-Neelsen
lcool absoluto (etanol)............10 mL

Dissolver e acrescentar:
Fenol aquoso (*) ......................5 mL
H2O destilada ......................100 mL
Repousar por 48 horas e filtrar em papel de
filtro de mdia porosidade.
B. Azul de Metileno
Azul de metileno.................... 2,0 g
lcool absoluto (etanol) ...........10 mL
Dissolver e acrescentar:
Fenol (*) aquoso..................... 2,2 g
Agitar e completar com:
H2O destilada ......................100 mL
(*) Fenol aquoso (relao): l00 g de fenol crist. para 100 mL de
H2O.
5.3. Colorao de Albert-Laybourn

Foi sugerida inicialmente por Henry Albert, em 1920, e modificada
por Ross Laybourn, em 1924. Baseia-se no fato de algumas bactrias apre-
sentarem corpsculos citoplasmticos localizados nas regies polares (corps-
culos metacromticos ou corpsculos de Babes Ernst), que se coram pelo
Lugol forte (de cor marrom), se evidenciando, em contraste com o corpo
bacilar, que se cora em verde-azulado pela soluo de Laybourn (Figura 5).
Tais caractersticas so observadas nas corinebactrias e sua presena associa-
da aos sintomas clnicos caractersticos da difteria, o que possibilita um diagns-
tico presuntivo da doena, pela microscopia tica.
5.3.1. Mtodo de Albert-Laybourn

Esfregao homogneo, delgado e fixado.
Cobrir o esfregao por 3 a 5 minutos, com a soluo de Albert-
Layborn.
Escorrer (sem lavar).
Cobrir com soluo Lugol forte, por aproximadamente 2 minutos.
Lavar e secar.
Figura 5. Amostra de
Corynebacterium corada pelo
5.3.2. Preparo de corantes mtodo de Albert Layborn
A. Soluo de Albert-Laybourn
Azul de toluidina.............0,15 g
Verde de malaquita ........ 0,20 g
cido actico glacial ...........1 mL
lcool 95......................2 mL
H2O destilada ..............100 mL
Bacteriologia | 245
B. Soluo de Lugol Forte

Iodo metlico........................... 2,0 g
Iodeto de potssio..................... 3,0 g
H2O destilada ...................... 300 mL
Guardar em frasco mbar ao abrigo da luz.
5.4. Mtodo de Fontana-Tribondeau

Desenvolvido em 1920, no um mtodo de colorao verdadeiro.
Na realidade, trata-se de uma tcnica de impregnao pela prata usada para
auxiliar a visualizao de bactrias espiraladas, as quais, geralmente, so muito
finas e se coram de forma insuficiente pelo Gram (ex.: Treponema pallidum e
Leptospira interrogans). A partir desta tcnica, as espiroquetas aparecem em
cor marrom-escura ou negra, sobre um fundo amarelo-castanho ou marrom-
claro (Figura 6). Atualmente, os laboratrios tm utilizado mais a microscopia
de campo escuro a fresco para visualiz-las, ou os mtodos de imunoflorescncia
(Ver captulo 1 deste volume).
5.4.1. Tcnica de Fontana-Tribondeau
Secar o esfregao ao ar.

Derramar sobre a lmina algumas gotas da soluo fixadora (renov-la
3x, por 30 segundos, para desemoglobinizar o esfregao).
Cobrir com soluo mordente, aquecendo a lmina at emitir vapores.
Aguardar 30 segundos.
Lavar em gua corrente.
Tratar pela soluo impregnadora (nitrato de prata amoniacal), aque-
cendo ligeiramente a lmina at a emisso de vapores, deixando agir por
30 segundos (a preparao toma a cor marrom).
Lavar bem em gua corrente. Figura 6. cultura de

Secar com papel de filtro. Leptospira interrogans
corada pelo mtodo de
Examinar com objetiva de imerso. Fontana Tribondeau
5.4.2. Preparo de corantes
A. Lquido de Ruge (fixador):

cido actico glacial....1 mL
Formalina 40% .......................2 mL
gua destilada.............. 100 mL
B. Mordente
cido tnico 5 g
cido fnico (fundido)... 1 mL
gua destilada............. 100 mL
Dissolver o cido fnico na gua.
Colocar o cido tnico em um balo, adicionar cerca de 10 mL da gua
fenicada e misturar bem, para dissolver o mximo possvel. Acrescentar
o restante da gua fenicada para completa dissoluo. Filtrar no dia
seguinte, se necessrio.
C. Nitrato de Prata Amoniacal (soluo impregnadora)

Nitrato de prata... 5 g
gua destilada..100 mL
Reservar 5 mL da soluo acima e, aos 95 mL restantes, adicionar
amnia, gota a gota (misturando sempre), at que o precipitado de cor
castanho-acinzentada, que se forma, se dissipe. Adicionar, ento, as
Bacteriologia | 247
gotas da soluo de nitrato de prata reservada, at desenvolver uma leve

opalescncia que persiste aps agitao. Armazenar em frasco escuro.
5.5. Colorao para flagelos

Os flagelos so estruturas bacterianas responsveis pela motilidade,
as quais possuem, em sua constituio, molculas proteicas denominadas
flagelinas. O flagelo formado por milhares de monmeros polimerizados
desta protena, dispostos de forma a compor um nico flagelo (tpico 2).
Algumas dificuldades podem ser encontradas quando se deseja de-
monstrar este tipo de organela atravs de microscopia tica, j que a
produo bacteriana de flagelos no contnua e depende de diferentes
fatores, como o meio de cultura usado, a temperatura, o estgio do cresci-
mento, etc. Outro fato importante que, devido sua delicadeza, os
flagelos podem ser acidentalmente extrados pela pipetagem ou
homogeneizao vigorosa. Contribuindo ainda para essa dificuldade, os
flagelos se despolimerizam com facilidade, isto , se dissociam em
monmeros de flagelina com frequncia (temperaturas acima de 60C e
pH cido ( pH 4,0), quando a bactria est em presena de solventes
orgnicos, de lcalis e de ureia).
Devido a esses problemas, necessrio aplicar algumas tcnicas para
aumentar o dimetro dos flagelos, de forma a torn-los visveis pela
microscopia. O cido tnico contido no corante se ligar ao flagelo tornan-
do-o mais espesso. A demonstrao do flagelo ocorrer devido ligao
do corante ao cido tnico. (Semelhante ao que acontece no Fontana
Tribondeau). Por aparecerem muito tnues na lmina, no conseguimos
obter nenhuma foto com nitidez suficiente para expor aqui.
5.5.1. Tcnica de visualizao de flagelos
Cultivar a bactria em estudo, de acordo com suas preferncias fsicas,

em uma placa de gar infuso de crebro-corao (BHI) ou em gar
soja tripticase (com ou sem sangue).
Coletar delicadamente uma alquota do crescimento com uma ala de
platina e transferi-la para um tubo, contendo cerca de 3 mL de gua
destilada. Inverter o tubo uma vez para homogeneizar a suspenso.
Colocar uma gota desta suspenso sobre uma lmina inclinada a 45 o e
deixar secar ao ar.
Cobrir a lmina com uma mistura de corantes, que inclui fucsina e
cido tnico (frmula abaixo), e deixar por 5 minutos, at que um
brilho metlico esverdeado cubra metade da rea. No deixar o corante
secar sobre a lmina.
Retirar o corante, enxaguando com gua. Secar e observar ao micros-
cpio, com objetiva de imerso.
Soluo A:
Fucsina (certificada para colorao de flagelo) ........... 0,5 g
lcool etlico a 95%......................................... 50 mL
Misturar e deixar em repouso durante uma noite, para dissolver.
Soluo B:
Cloreto de sdio................... 0,75 g
cido tnico ........................1,5 g
gua destilada...................... 100 mL
Bacteriologia | 249
Misturar vigorosamente as duas solues. Esta mistura de corantes pode

ser utilizada por at 2 meses, se mantida em refrigerao. Caso haja
formao de precipitado, procurar no homogeneizar com o restante da
soluo durante procedimento de colorao.
5.6. Colorao para esporos com verde

malaquita (Wirtz-Conklin)
A parede dos esporos constitui uma barreira eficaz contra a entrada e
sada de materiais do esporo, mas por sua impermeabilidade, geralmente
refringente e de difcil colorao. A exposio prolongada ao corante verde
malaquita, associado ao aquecimento, permite a penetrao do corante e a
colorao do esporo por um verde intenso. Como contraste (contracorante),
utiliza-se a safranina, que cora outras estruturas em vermelho, facilitando a
diferenciao dos esporos (Figura 7).
5.6.1. Tcnica para colorao de esporos
Preparar esfregao e fixar pelo calor.

Cobrir o esfregao com o corante verde malaquita;
Aquecer gua em um bquer, at a emisso de vapores. Colocar a
lmina sobre este bquer, mantendo o corante aquecido por 5 minutos.
Alternativamente, cobrir a lmina com verde malaquita e aproximar de uma
chama at que desprenda vapor, sem deixar que o corante ferva. Afastar
do fogo e, aps 1 a 2 minutos, repetir a operao por 3 a 4 vezes.
Lavar suavemente com gua, evitando o choque trmico, que poder
quebrar a lmina.
Adicionar a soluo de safranina por 30 segundos.
Lavar e secar.
Observar ao microscpio com objetiva de imerso.
Soluo A: Verde malaquita a 5%

Verde malaquita....................... 2,5 g
gua destilada........................ 50 mL
Figura 7. Esporos co-
Misturar e deixar em repouso durante uma rados pelo mtodo
noite para dissolver. de Wirtz-Conklin
Soluo B: Safranina
B.1 Soluo estoque
Safranina ........................50 g
Etanol a 95%.............2.000 mL
B.2 Soluo de trabalho
Soluo estoque de safranina (B.1)................300 mL
gua destilada......................................2.700 mL
5.7. Colorao de cpsula

A cpsula uma camada gelatinosa externa (polissacardeos, glicoprotenas
ou polipeptdeos) produzida por algumas bactrias e que envolve a parede
celular (ver item 2.2.4 - Glicoclice).
No existe em todos os microrganismos, todavia, os que a apresentam,
possuem maior capacidade de produzir doenas, uma vez que essa estrutura
protege a bactria das atividades fagocticas das clulas do hospedeiro. A
cpsula constitui um mecanismo de defesa das bactrias, e est relacionada com
a patogenicidade bacteriana.
A cpsula pode ser detectada por tcnicas imunolgicas, pois possibilita
a reao de isolados bacterianos com anticorpos anticapsulares, o que vai
Bacteriologia | 251
conduzir ao aparecimento de uma entumescimento capsular (reao de Quellung),

quando observada ao microscpio (ver captulo 1 deste volume).
A colorao da cpsula no simples, j que o material capsular
hidrossolvel e pode ser removido com a lavagem. Por outro lado, os esfregaos
no devem ser aquecidos (fixados) porque a contrao da clula pode criar
uma zona volta do microrganismo e produzir um artefato que pode ser
confundido com a cpsula. Todavia, possvel visualizar bactrias produtoras
de cpsula pela colorao negativa (tinta da China), pois a cpsula rejeita as
partculas deste corante, permitindo a observao das clulas descoradas sobre
fundo negro. Pode-se ainda adicionar fucsina diluda aos esfregaos j secos
com tinta da China, neste caso, visualizamos as clulas coradas em rosa, rodeadas
por halos incolores (cpsulas), no fundo negro. O mtodo de Hiss outra
alternativa para visualizar essa estrutura.
5.7.1. Tcnicas de colorao de cpsula
5.7.1.1. Mtodo da tinta da China (colorao negativa)
Como na tcnica dos flagelos, deve-se cultivar a bactria produtora de

cpsula em meio rico (BHI). Uma boa sugesto usar a Klebsiella
pneumoniae que produz geralmente essa camada externa em abundncia.
Colocar 1 ou 2 gotas de cultura em uma lmina.
Depositar na lmina uma gota de tinta da China ao lado das gotas
de cultura.
Cobrir com uma lamnula, comprimindo-a entre folhas de papel de
filtro, para se obter uma quantidade bem tnue de corante e material
(no se esquecer de usar luvas e descartar o papel em local aonde ser
autoclavado).
Observar ao microscpio ptico (40X).
5.7.1.2. Mtodo da tinta da China com fucsina diluda
Seguindo a mesma tcnica, depositar na lmina uma gota de tinta da

China ao lado das gotas de cultura.
Deslizar uma lmina sobre a primeira, fazendo um esfregao, e deixar
secar ao ar.
Corar com fucsina diluda, durante 2 minutos, e lavar suavemente
com gua.
Secar e observar em imerso.
5.7.1.3. Mtodo de Hiss
Neste mtodo, desenvolvido em 1905, utiliza-se, como corante pri-

mrio, o cristal violeta aplicado a um esfregao no fixado (o material capsular
aparece corado de roxo). Como descorante e corante de contraste, utiliza-se
a soluo de sulfato de cobre a 20%.
Ao contrrio da clula bacteriana propriamente dita, a cpsula neutra
e, por isso, o corante primrio, embora tenha aderido, no absorvido. Uma
vez que os constituintes da cpsula so hidrossolveis e podem ser perdidos
durante a lavagem, o sulfato de cobre usado como descorante. Ele remove o
excesso do cristal violeta que aderiu cpsula e, ao mesmo tempo, atua como
corante de contraste, pois absorvido pelo material capsular que ele desco-
rou. Assim, a cpsula aparece agora contrastando com o roxo da clula, como
uma zona mais clara (Figura 8).
Execuo prtica:
Preparar o esfregao para corar, sem o fixar.
Cobrir o esfregao com cristal violeta, deixando agir por 5 a 7
minutos.
Lavar o esfregao com uma soluo de sulfato de cobre a 20%;
Bacteriologia | 253
Secar com cuidado.

Observar ao microscpio luminoso, com objetiva de imerso.

Figura 8. Visualizao
Cristal violeta e fucsina diluda (veja colora- da cpsula bacteriana
es anteriores)
Soluo de sulfato de cobre a 20%:
CuSO4, 5H2O..................20 g
gua destilada..............100 mL
5.8. Consideraes
Outros mtodos diferenciais podem, e so, utilizados para evidenciar diver-
sos gneros bacterianos, bem como modificaes dos mtodos aqui apresentados.
Atualmente, por exemplo, em vez do cristal violeta, preconizado pelo Ministrio
da Sade a violeta de metila que, inclusive, j fixa a amostra lmina sem necessitar
da fixao na chama do bico de Bunsen. Todas as mudanas que so implementadas
a esses mtodos e a criao de novas tcnicas tm o intuito de melhorar e clarificar a
visualizao bacteriana no microscpio tico de campo claro, porm, temos a
certeza de que, na rotina diria de um laboratrio de anlises clnicas, estes mtodos
sero, sem dvida, os de maior utilizao e de aplicao mais global.
Outro fator importante o controle de qualidade das substncias a serem
utilizadas e das tcnicas. Sempre que for realiz-las, o ideal ter em mos bactrias-
padro, com comportamento conhecido diante dos corantes/reagentes que sero
usados no teste. Elas serviro de parmetro do funcionamento do mesmo, auxilian-
do tambm o observador na comparao do resultado esperado, com o obtido
na amostra em pesquisa.
6. Meios de cultura: preparo e utilizao

O cultivo dos microrganismos, em condies laboratoriais, um pr-
requisito para seu estudo adequado. Para que isto possa ser realizado,
necessrio o conhecimento de suas exigncias fsicas e nutritivas. Estas informa-
es resultaram no desenvolvimento de numerosos meios de cultura. Por causa
da grande diversidade das exigncias nutritivas das bactrias, h, tambm,
grandes diferenas na composio dos meios utilizados.
6.1. Meio de cultura

qualquer substncia, slida, semisslida ou lquida, que possua um conjun-
to de fontes de nutrientes e que seja utilizada para o cultivo de microrganismos.
6.2. Classificao dos meios de cultura

Os meios de cultura podem ser classificados segundo o seu estado
fsico, em funo da adio de agentes solidificantes, pela sua composio e
pelo seu objetivo de utilizao.
6.2.1. De acordo com o agente solidificante

(gelose ou gar-gar)
A partir de um meio lquido, pode-se adicionar gelatina (gelose) ou
gar-gar para torn-lo mais ou menos consistente. A gelose, muito utiliza-
da no passado, podia ser metabolizada por alguns microrganismos. Hoje,
no entanto, se utiliza muito mais o gar-gar, que somente tem papel
solidificante.
O gar-gar uma substncia coloidal e hidroflica (grupo das
mucilagens) extrada de algas vermelhas, que possui ponto fuso a aproxima-
damente 100oC e de solidificao a aproximadamente 40oC. A adio (de
diferentes quantidades) ou no desta substncia no meio vai conferir-lhe
diferentes consistncias.
Bacteriologia | 255
Meios Slidos Onde so adicionados geralmente de 1,0 g a

3,0 g % de gar (podem ser liquefeitos se aquecidos). A maio-
ria dos microrganismos crescem formando colnias.
Ex: gar nutritivo.
Meios Semislidos - Onde so adicionados, geralmente, de 0,1g a
0,7g% de gar. Servem, por exemplo, para visualizar a motilidade
bacteriana ou, muitas vezes, como base de meio de transporte.
Ex: Meio SIM e Cary & Blair.
Meios Lquidos - Sem adio de gar. So os chamados caldos. Sua
turvao sinal de crescimento bacteriano.
Ex: Caldo nutritivo, caldo simples e caldo Casoy.
O procedimento correto para obteno ideal de meio contendo
gar exige, aps sua adio, o aquecimento para sua dissoluo em gua
fervente at a soluo tornar-se cristalina e sem grumos. importante
tambm no refundir vrias vezes o meio (alterao no valor nutritivo,
percentual de gua, etc.). Outro detalhe importante que a aferio do
pH, nos meios slidos e semisslidos, deve ser feita a 50 oC e, nos meios
lquidos, temperatura ambiente.
6.2.2. De acordo com a composio qumica

Meios Sintticos - A composio qumica de todos os seus compo-
nentes conhecida (definidos).
Meios Complexos - A composio qumica de alguns dos seus com-
ponentes desconhecida (geralmente quando se adiciona soro, sangue
ou outro componente que no se tem total conhecimento da composi-
o qumica).
Os meios podem ser totalmente preparados no laboratrio, seguindo
formulaes (receitas), ou a partir de meios dessecados (geralmente s adicio-
na-se gua). Em ambos os casos, a gua utilizada deve ser limpa, recm-
destilada e neutra.
6.2.3. De acordo com o objetivo da utilizao
Meios bsicos - So os de uso geral e podem ser usados como

base no preparo de outros meios. O caldo simples o exemplo
mais comum.
Meios enriquecidos ou ricos Nestes meios, a adio de san-
gue, soro, extratos de tecidos animais ou vegetais ao caldo, ou
gar nutritivos, proporciona nutrientes acessrios, passando a per-
mitir o crescimento de organismos heterotrficos fastidiosos (mais
exigentes). Um exemplo clssico o gar chocolate, que permite
o crescimento de diversas bactrias exigentes. No confundir mei-
os enriquecidos com meios de enriquecimento, como os caldos
tetrationato de Kauffman e selenito, que geralmente possuem pro-
dutos seletivos ou proporcionam somente o crescimento de deter-
minado grupo bacteriano.
Meios Seletivos - A adio de substncias qumicas especficas ao
caldo ou ao gar nutritivo previne o crescimento de um grupo de bact-
rias sem agir sobre outro.
Ex1: Cristal-violeta impedindo o crescimento de Gram-positivos, sem
afetar o desenvolvimento dos Gram-negativos. Ex2: Alguns antibiticos
adicionados podem inibir um grupo de bactrias sensveis e no afetar
outro (resistentes).
Meios diferenciais ou indicadores - A adio de certos reagentes ou
substncias no meio pode resultar num tipo de crescimento ou reao,
aps a inoculao e a incubao, que permite ao observador distinguir
diferentes tipos de bactrias.
Bacteriologia | 257
Ex: Incorporao de lactose e um indicador de pH: fermentadores

ou no deste acar, lactose (+) e lactose (-) formaro colnias
com cores distintas.
Meios de dosagem - Meios de composio definida (meios sintticos).
So empregados para dosar vitaminas, aminocidos e antibiticos.
Meios para contagem - Tipos especficos de meios so indicados para
determinar o contedo bacteriano de materiais, como, por exemplo,
gua, urina, leite, etc. (podem ser ricos, seletivos ou diferenciais).
Meios de estocagem ou manuteno Geralmente meios mni-
mos. A manuteno da viabilidade e caractersticas fisiolgicas de
uma cultura pode exigir um meio diferente do recomendado para
um bom crescimento timo. Na preparao de um meio de
estocagem, prefervel omitir a glicose e utilizar uma substncia
tampo, evitando variaes de pH.
Meios de transporte Geralmente semisslidos, para evitar o
extravasamento. So semelhantes aos meios de manuteno e devem
ter o mnimo de nutrientes para a manuteno das bactrias sem que
estas se reproduzam ou acidifiquem o meio.
Um ponto importante neste tpico o controle de qualidade dos
meios, onde devemos observar os possveis erros na sua preparao
e seu armazenamento de forma ideal.
6.3. Substncias usadas no preparo de meios de cultura

Os nutrientes do meio de crescimento devem conter todos os elemen-
tos necessrios sntese biolgica de novos organismos.
6.3.1. Fonte de carbono
O carbono um elemento indispensvel sntese dos compostos celu-

lares, e deve ser fornecido bactria, seja na forma de composto orgnico,
como os acares, ou inorgnicos, no caso, o CO2. As bactrias capazes de

utilizar CO2 como nica fonte de carbono so autotrficas; enquanto as que
requerem, alm de CO2, uma fonte orgnica de carbono, so heterotrficas.
Em muitos casos, um mesmo composto pode funcionar como fonte de
carbono, doador de hidrognio e fonte de energia.
6.3.2. Fonte de nitrognio

O nitrognio tambm necessrio para a sntese de compostos indis-
pensveis clula. Algumas bactrias necessitam de fontes orgnicas de nitro-
gnio, como aminocidos ou sais orgnicos de amnio, enquanto outras so
capazes de utilizar fontes inorgnicas de nitrognio, como nitratos, amnio ou
o prprio nitrognio atmosfrico.
6.3.3. Outros compostos

As bactrias necessitam ainda de fontes de enxofre e fsforo, que so
geralmente fornecidos na forma de sulfatos e fosfatos. Alm disso, devem estar
presentes no meio, sais de sdio, potssio e magnsio, que so necessrios em
concentraes relativamente elevadas. Outros elementos, tais como zinco, ferro
e mangans, so necessrios em concentraes to baixas que so supridos como
impurezas dos demais componentes utilizados no preparo do meio.
As bactrias precisam tambm de vitaminas, que devero ser tambm
incorporadas ao meio de cultivo. Todavia, muitas podem sintetiz-las e, nestes
casos, as necessidades so supridas pelo prprio microrganismo.
6.4. Fatores ambientais que afetam o crescimento de

microrganismos
Alm do conhecimento dos nutrientes apropriados para a cultura das
bactrias, preciso saber quais as melhores condies fsicas ambientais para o
desenvolvimento microbiano.
Bacteriologia | 259
Assim como as bactrias variam grandemente, no que diz respeito as

suas exigncias nutritivas, tambm demonstram respostas diversas s condies
fsicas do ambiente.
Ex: Exigncias atmosfricas, pH, temperatura, presso osmtica (ver
item 8 deste volume).
6.5. Seleo dos meios de cultura primrios

Para um timo isolamento bacteriano essencial inocular a amostra no
meio de cultura primrio apropriado; porm, h vrias centenas de meios
disponveis no mercado. Na seleo para o uso rotineiro deve-se optar por um
nmero relativamente pequeno de meios seletivos e no seletivos.
Um exemplo de meio no seletivo muito utilizado o gar sangue
(permite o crescimento da maioria das bactrias). Podemos fazer outras opes
mais seletivas, com base na fonte ambiental ou anatmica do material e no
conhecimento das espcies bacterianas comumente encontradas nas amostras,
observando sempre se h suspeita de algum microrganismo em particular.
Uma populao microbiana, sob condies naturais, contm muitas es-
pcies diferentes. Os microbiologistas devem ser capazes de isolar, enumerar
e identificar as bactrias da amostra, para ento classific-las e caracteriz-las.
6.6. Isolamento e cultivo de culturas puras

Para determinarmos as caractersticas de um microrganismo, identific-lo e
apont-lo como suspeito de causar ou no uma patologia, ele deve estar em
cultura pura. Para realizar o isolamento, devemos optar pelo meio de cultura mais
adequado no deixando de considerar os fatores-chave para esta escolha:
Consideraes sobre a origem do material a ser analisado.
A espcie que se imagina estar presente nesta amostra.
As necessidades nutricionais dos organismos.
6.6.1. Tcnicas de isolamento de microrganismos
O material a ser analisado deve ser cultivado em meio slido. Este

processo pode ser feito das seguintes formas:
Tcnica de semeadura por espalhamento em superfcie, onde uma
quantidade definida da amostra diluda colocada na superfcie do gar
e, com o auxlio de uma ala de semeadura de vidro (ala de Drigalsky
- ver captulo 2 do volume 1), espalhada sobre todo o meio com
movimentos repetidos at absoro total do lquido. Posteriormente a
placa incubada. Essa tcnica muito usada para clculo de bactrias,
pois permite a obteno das colnias isoladas de forma homognea
sobre o meio, facilitando a contagem.
Mtodo de Pour-plate, ou placa derramada, onde a amostra diluda
em tubos contendo meios slidos liquefeitos (45 o C). Aps
homogeneizao, o contedo do tubo distribudo em placa de Petri e
aps a solidificao do meio, a placa incubada. As colnias se desen-
volvero tanto acima quanto abaixo da superfcie (colnias internas).
Esse mtodo tambm permite a contagem, j que o isolamento das
colnias ocorre de forma bem distribuda na placa.
Tcnica de esgotamento por meio de estrias superficiais, onde a amos-
tra semeada na superfcie do meio solidificado com ala bacteriolgica,
em movimentos de zigue-zague, para esgotar a populao, assim, em
algumas regies do meio aps a incubao, colnias individualizadas
estaro presentes.
Em cada uma dessas tcnicas o objetivo diminuir a populao
microbiana, assim, as clulas bacterianas individuais estaro localizadas a certa
distncia umas das outras. As clulas individuais produziro, se estiverem dis-
tantes o suficiente, uma colnia que no entra em contato com outras colnias.
Todas as clulas em uma colnia tm o mesmo parentesco. Para isolar uma
Bacteriologia | 261
cultura pura, uma colnia individual transferida do cultivo inicial para um tubo
de ensaio (geralmente tambm com meio de cultura).
6.7. Conservao das culturas puras

Uma vez que os microrganismos tenham sido isolados em cultura pura,
necessrio manter as culturas vivas por um perodo de tempo, com o objetivo
de estud-las.
Para armazenar por um perodo curto, as culturas podem ser mantidas
temperatura de refrigeradores (4 a 10oC).
Para armazenar por um perodo longo, as culturas so mantidas congela-
das em nitrognio lquido (-196oC) ou em freezers (-70 a -20oC), podendo
tambm ser desidratadas e fechadas a vcuo em um processo denominado
liofilizao. Esses mtodos so de grande valia para manter a cultura armazena-
da em uma coleo.
As colees de culturas so bancos de microrganismos e outras clulas
que esto disposio de pesquisadores, professores, investigadores de pa-
tentes, e todos que necessitem estudar um tipo particular de organismo (no
nosso caso, bactrias). As clulas so congeladas ou liofilizadas para resistirem
a qualquer variao que possa destruir a identidade da clula original.
7. Reproduo bacteriana e fases de crescimento

Quando temos uma cultura bacteriana inoculada em meio adequado e
incubada sob condies apropriadas vamos acabar tendo o aumento de clulas
bacterianas que pode ser facilmente evidenciado atravs de diversos mtodos,
como turvao do meio, determinao da massa celular, contagem de clulas,
entre outros.
O processo mais comum e mais importante que ocorre nestes microrga-
nismos a diviso binria transversal ou simples, onde o aumento da popula-
o ocorre em progresso geomtrica (1 2 4 8 16 .....2 n), sendo

n = no de geraes. O nmero de geraes em um determinado tempo varia
de acordo com a bactria, podendo ser extremamente curto ( E.coli 15
minutos) ou bastante longo (M. tuberculosis 932 minutos).
Atravs do estudo desta reproduo e de contagens praticadas a inter-
valos adequados, podemos traar uma curva de crescimento bacteriano in vitro
e estabelecer, desta forma, as vrias fases deste processo:
7.1. Fase estacionria (1a) ou fase Lag

No h reproduo. Inicia-se aps o momento da semeadura. A popu-
lao permanece temporariamente inalterada. Nesta fase, as clulas no esto
em repouso ou dormncia, elas aumentam no tamanho (alm do normal) e
fisiologicamente esto muito ativas - podem estar deficientes em enzimas e/ou
coenzimas que precisam sintetizar (Figura 9 A).
No final desta fase, as clulas iniciam a diviso e aumentam gradualmen-
te a populao at o trmino da fase Log.
7.2. Fase logartmica (fase Log ou exponencial)

A populao passa a ter capacidade de se dividir regularmente em ritmo
constante (o logaritmo resultante uma linha reta). A velocidade de cresci-
mento mxima nesta fase, com a populao uniforme - progresso geomtrica
(Figura 9 B).
7.3. Fase estacionria (2a) ou fase Plat

A fase log comea a decrescer (gradualmente) tendendo para o fim do
crescimento. Atribuda a uma srie de circunstncias, como exausto de alguns
nutrientes e a produo de produtos txicos. A populao permanece cons-
tante, resultado do equilbrio entre reproduo (clulas neoformadas) e morte
celular (Figura 9 C).
Bacteriologia | 263
7.4. Fase de declnio ou morte

A falta de nutrientes e de espao, aliada a toxidez do ambiente, leva os
microrganismos a morrerem mais rpido do que produzem novas clulas -
extermnio progressivo at a cultura se tornar estril (Figura 9 D).
Figura 9. Faces do crescimento bacteriano in vitro
8. Fatores ambientais que afetam o

crescimento bacteriano
Como j foi comentado, alm do conhecimento dos nutrientes apropri-
ados para o cultivo das bactrias, necessrio saber que condies fsicas
ambientais so melhores para o seu desenvolvimento.
Assim como existe grande variao, no que diz respeito as suas exign-
cias nutritivas, estes organismos tambm demonstram respostas diversas s con-
dies fsicas do ambiente.
8.1. Temperatura
Temperatura tima de crescimento: a temperatura de incubao,

que possibilita o mais rpido crescimento, durante menor tempo de
acordo com o perodo de gerao de cada gnero bacteriano (12 a
24 horas, para a maioria das bactrias comuns).
A temperatura tima de crescimento pode no ser a temperatura tima
de outras atividades celulares. Estes valores podem ser diferentes, dependen-
do dos autores consultados, porm, em mdia, obedecem ao critrio abaixo:
Bactrias psicrfilas So capazes de crescer a 0C ou menos,
embora seu crescimento timo esteja em temperaturas mais elevadas,
12C ou 20C. Diversas espcies de bactrias isoladas na Antrtica
podem crescer a -7C, mas seu desenvolvimento timo ocorre entre
20C a 30C.
Bactrias mesfilas Crescem melhor de 25C a 40C. Neste
grupo est a maioria dos patgenos bacterianos de importncia clnica, j
que esta temperatura coincide com a do nosso corpo.
Bactrias termfilas Crescem melhor de 45C a 60C. O limite
de crescimento de algumas bactrias termfilas se estende para a regio
mesfila, recebendo a designao de termfilas facultativas ou
euritermfilas.
Outras espcies do grupo termfilo se desenvolvem melhor em tempe-
raturas acima de 60C, no se desenvolvendo na faixa mesfila. So chamadas
bactrias termfilas verdadeiras, obrigatrias ou estenotermfilas.
8.2. Oxignio
Do ponto de vista do oxignio, podemos dividir as bactrias confor-
me a chave:
Bacteriologia | 265
Bactrias aerbias estritas - So aquelas que s crescem na presen-

a de oxignio, por utilizarem este composto como receptor final de
eltrons.
Ex.: Acinetobacter.
Bactrias anaerbias facultativas ou apenas facultativas Podem
crescer tanto em anaerobiose como em aerobiose.
Ex.: E.coli.
Bactrias anaerbias estritas - S crescem em anaerobiose, sendo
inibidas ou mortas na presena de O2, que no utilizado em seu
metabolismo.
Ex.: Clostridium botulinum.
Bactrias microaerfilas - S crescem em atmosfera contendo concen-
traes de oxignio menores que as encontradas no ar atmosfrico.
Ex.: Campylobacter
No laboratrio, muito simples cultivar bactrias aerbias ou facultati-
vas, visto que o oxignio est sempre no ar, contudo, para a obteno de
atmosferas isentas ou pobres de oxignio, usamos mtodos especiais.
O emprego de meios redutores e frascos bem fechados, que so

chamados comercialmente de jarras (Figura 10), juntamente com tcnicas
para diminuir ou eliminar o oxignio do seu interior, possibilitaro o estudo
das bactrias microaerfilas e anaerbias.
Pode-se gerar uma reao qumica, combi- Figura 10. Jarra hermtica
nando o O2 na formao de um novo com-
posto. Isso pode ser conseguido pela simples
queima de uma vela O2 dixido de
carbono, ou atravs de geradores comerciais
de atmosfera vendidos na forma de envelo-
pes, como bicarbonato de sdio e boro-
hidreto de sdio. Essas substncias combina-
das com gua liberam dixido de carbono e
hidrognio, que a partir de um catalisador de paldio contido na jarra
forma gua. Alm disso, o dixido de carbono tambm estimula o
crescimento de vrias bactrias.
Poderemos ter uma atmosfera de microaerofilia ou anaerobiose,
dependendo da tcnica e da forma de eliminar ou impedir a presen-
a do oxignio.
Outra possibilidade o emprego de meios especiais contendo agen-
tes redutores, como o meio de tioglicolato, que capaz de se combinar
com o oxignio dissolvido eliminando-o do meio de cultura. Pode-se
tambm adicionar um indicador de presena de oxignio, como o azul
de metileno.
Pode-se realizar a remoo mecnica do oxignio de um frasco fecha-
do, contendo tubos ou placas com meios inoculados o ar atmosfri-
co aspirado e substitudo por nitrognio, hlio ou por uma mistura de
nitrognio e dixido de carbono.
Bacteriologia | 267
8.3. pH
A grande maioria das bactrias cresce bem em meios com pH ao
redor de 6,5 a 7,5, apesar de muitas espcies tolerarem variaes de
pH entre 4,0 e 9,0.
Os meios de cultura so geralmente tamponados para evitar mu-
danas de pH, decorrentes da excreo de produtos do prprio meta-
bolismo bacteriano.
Os tampes so compostos que podem resistir s mudanas de pH.
A combinao de KH 2PO4 e K2HPO4 largamente utilizada nos meios
de cultivo, mas alguns ingredientes nutrientes do meio, tais como as peptonas,
tambm possuem a capacidade de tamponamento.
8.4. Outros fatores

Presso osmtica- Meios de cultura com presses osmticas meno-
res que o interior da bactria, geralmente no afetam sua viabilidade, uma
vez que a rigidez da parede celular impede a entrada excessiva de gua.
Todavia, meios de cultura com presses osmticas maiores que a encontra-
da no interior da bactria causam perda de gua intracelular (efeito
bacteriosttico ou bactericida).
Observao: Halofismo - Certas bactrias isoladas de salmouras, pacotes
de sal, alimentos e gua do mar, chamadas bactrias haloflicas ou halfitas
obrigatrias, crescem apenas quando o meio contm uma concentrao
inusitadamente elevada de sal (10% a 15%). Isto representa uma respos-
ta especial do microrganismo presso osmtica.
Luminosidade - Alguns organismos autotrficos fotossintticos de-
vem ser expostos a uma fonte luminosa, pois a luz sua fonte de ener-
gia. Outros liberam pigmentos quando expostos a luz, o que facilita na
sua taxonomia.
9. Controle dos microrganismos

Para proceder adequadamente ao controle dos microrganismos, lanamos mo
de processos de esterilizao e desinfeco, que podem ser fsicos ou qumicos (ver
captulo 2 do volume 1). Outras formas de controle bacteriano (principalmente in
vivo) podem ser realizadas utilizando quimioterpicos e antimicrobianos (tpico 9).
10. Quimioterapia e antibioticoterapia

(Mecanismos de ao dos antimicrobianos)
Graas aos trabalhos do mdico alemo Paul Erlich (1854 - 1915),
com a descoberta de dois agentes quimioterpicos entre 1909 e 1912, o
Salvarsan e Neosalvarsan (arsenobenzis), deu-se incio a era das substncias
capazes de atingir o microrganismo causador da doena, sem prejuzo ao
portador (doente).
Erlich introduziu o ndice quimioterpico, que era expresso pela razo
entre a dose mxima tolerada e a dose mnima curativa. De acordo com seus
trabalhos, um alto ndice quimioterpico alcanado pelas substncias que
apresentam um alto parasitotropismo e um baixo organotropismo.
Sintetizada em 1908 pelo qumico Paul Gelmo, que estudava corantes,
e pesquisada posteriormente em 1935 como substncia bacteriosttica pelo
Nobel de Fisiologia e medicina (1939) Gerhard Johannes Paul Domagk
(1895 1964), que batizou seu composto de prontosil, a sulfanilamida,
resultou at 1945 em 5488 derivados. Utilizada at hoje, mais conhecida
com o nome de sulfa (Figura 11):
Figura 11. Configurao do Prontosil.

Bacteriologia | 269
A partir desta descoberta, vrios outros produtos foram sintetizados,

com o objetivo de se encontrar preparaes cada vez menos txicas.
Em 1929, Sir Alexander Fleming (Nobel de Fisiologia e Medicina,
em 1945) observou, por casualidade, que um fungo contaminante no s
estava crescendo em uma placa de cultura que havia sido deixada aberta
por descuido, como tambm as colnias de estafilococos, crescidas na
placa, prximas a este fungo, estavam sofrendo lise. O pesquisador con-
cluiu ento que o Penicillium notatum (fungo que contaminou a placa)
produzia uma substncia bacterioltica - o antibitico que veio a ser conhe-
cido como Penicilina, dando incio a era dos antibiticos.
No ano de 1940, Selman Waksman (descobridor da estreptomicina)
definiu um antibitico como sendo uma substncia qumica produzida por
microrganismos, que tem a capacidade de inibir o crescimento de bact-
rias (ao bacteriosttica), e at mesmo a de destruir bactrias e outros
microrganismos (ao bactericida).
Atualmente, a denominao dos antimicrobianos feita assim:
Antibiticos Antimicrobianos cuja produo (fabricao) se d a
partir de microrganismos (fungos, bactrias, etc.).
Ex.: Penicilina - Produzida pelo fungo Penicillium notatum .
Quimioterpicos Antimicrobianos cuja produo (fabricao) se
d atravs de substncias sintetizadas em laboratrio.
Ex.: Fluoquinolonas, Aspirina, etc.
Em Microbiologia, nos dedicamos aos agentes antimicrobianos, que

formam um grupo especial de agentes quimioterpicos usados para tratar
doenas causadas por microrganismos.
10.1. Seleo de agentes antimicrobianos

Agentes antimicrobianos so frmacos ativos no tratamento de infeces
em razo de sua toxidade seletiva (destroem o microrganismo invasor sem
afetar as clulas do hospedeiro). Em muitos casos, a toxidade seletiva no
absoluta, exigindo que a concentrao do antimicrobiano seja controlada cui-
dadosamente, de modo a afetar o microrganismo em nveis tolerveis para o
hospedeiro. A terapia seletiva com antimicrobianos usa como vantagem as
diferenas bioqumicas existentes entre os microrganismos e os seres humanos.
Para se selecionar o agente antimicrobiano mais apropriado, deve-se ter
conhecimento da identidade do microrganismo e sua sensibilidade aos agentes em
particular, o stio de infeco, os fatores ligados ao paciente e o custo da terapia.
Os antimicrobianos podem ser usados de trs maneiras gerais como
terapia emprica, como terapia definitiva e como terapia preventiva ou profiltica.
Na terapia emprica ou inicial, o antibitico dever cobrir todos os microrga-
nismos provveis (Gram-positivos e Gram-negativos), visto que o patgeno, ou
patgenos, que esto causando a infeco, no foram identificados. Esse tipo de
terapia poder ser realizada com mais de um antimicrobiano (terapia combinada) ou
com apenas um (monoterapia), e usada frequentemente com agentes de amplo
espectro. No entanto, com o microrganismo j identificado, a terapia antimicrobiana
definitiva dever ser iniciada com um esquema de espectro estreito e baixa toxicidade,
baseado no resultado do antibiograma.
Quando o uso de um antimicrobiano est indicado na terapia profiltica,
como no caso de cirurgias ou extraes dentrias, devemos no s escolher aquele
agente que seja ativo contra o microrganismo ou microrganismos, infectantes mais
provveis, mas o que possua o menor potencial de causar toxidade ou reaes
alrgicas no paciente que ser exposto ao risco de infeco.
Bacteriologia | 271
10.2. Antimicrobianos usados na terapia das infeces
10.2.1. Sulfas e sulfonas
A combinao do trimetoprim com o sulfametoxazol (antimicrobiano

pertencente a classe das sulfas), torna-o clinicamente eficaz, pois, quando dois
frmacos atuam sobre diferentes etapas da reao enzimtica obrigatria nas
bactrias, o resultado de sua combinao sinrgico. Na maioria dos pases, a
combinao conhecida como cotrimoxazol, mas o trimetoprim est disponvel
no mercado isoladamente (Figuras 12 e 13).
A associao dos frmacos permite uma melhor ao no microrganismo
do que quando administrados separados. A este fato chamamos de otimizao
da ao do antimicrobiano.
A ao destes antimicrobianos ocorre por inibio de duas etapas da via
enzimtica, para sntese do cido tetraidroflico: A inibio da incorporao
do cido p-aminobenzoico (PABA) no cido flico, pela sulfonamida, en-
quanto o trimetoprim impede a reduo do diidrofolato em tetraidrofolato
(folato essencial para reaes de transferncia de carbono).
A toxidade seletiva destes antimicrobianos se d atravs de:
Clulas de mamferos que utilizam folatos pr-formados da dieta e no
sintetizam o composto.
Trimetoprim, que um inibidor seletivo da diidrofolato redutase en-
contrada somente em organismos inferiores, logo, para este frmaco
inibir a enzima redutase humana, necessria uma quantidade 100 mil
vezes maior da que usada em bactrias.
Outras sulfas tambm so comercializadas, como, por exemplo:
sulfadiazina, sulfacetina, sulfamoxol, sulfametoxipiridazina, sulfaleno, sulfatalidina,
nitrosulfatiazol, etc.
Na classe da sulfonas, temos como representante principal a dapsona

(Figura 14). Esta famlia de frmacos possui o mesmo modo de ao das sulfas
(inibio da incorporao do cido p-aminobenzico (PABA) no cido flico).
As sulfas so ativas contra algumas espcies da famlia Enterobacteriaceae,
Chlamydia, Pneumocystis e Nocardia. Enquanto a dapsona age com ao
bacteriosttica em Mycobacterium leprae.
Figura 12. Sulfametoxazol (sulfa)
Figura 13. Trimetoprim
Figura 14. Dapsona (Sulfona)
10.2.2. Quinolonas
O cido nalidxico (Figura 15) o membro mais antigo dessa classe de

antimicrobianos sintticos, sendo muito usado no tratamento de infeces do
trato urinrio. Este frmaco no possui grande importncia, devido sua limita-
o teraputica e o desenvolvimento de resistncia bacteriana. Por esse moti-
vo, foi necessrio adicionar, na molcula deste antimicrobiano, a 4-quinilona
fluorada, dando origem a fluoquinolona. Representada pela ciprofloxacina,
ofloxacina, norfloxacina, gatifloxacina, levofloxacina, moxifloxacina e
lomefloxacina. Este fato representou um grande avano teraputico, visto que
as fluoquinolonas possuem uma ampla atividade antimicrobiana e grande efic-
Bacteriologia | 273
cia aps administrao via oral no tratamento de diferentes infeces, causadas

por microrganismos Gram-negativos (Figura 16).
A ao destes antimicrobianos se d na DNA-girase (enzima respons-
vel pela forma espiral do DNA) e na topoisomerase IV (enzima que separa
molculas-filhas de DNA interligadas (encadeadas), que so o produto da
replicao do DNA) bacteriana.
As quinilonas possuem uma excelente toxidade seletiva, pois s inibem
a topoisomerase II das clulas eucariticas em concentraes bastante elevadas
(100 a 1.000 mg/mL).
Figura 15. cido nalidixico (Quinolona) Figura 16. Norfloxacina

(Fluoroquinolona)
10.2.3. Antisspticos
Em uma infeco do trato urinrio, inibem o crescimento de muitas

espcies bacterianas, porm no podem ser utilizados no tratamento de infec-
es sistmicas, pois no se obtm concentrao eficaz no plasma com a
administrao de doses seguras. Por se concentrarem nos tbulos renais, esses
frmacos podem ser utilizados por via oral no tratamento de infeces urinrias.
A nitrofurantona (Figura 17), representante desta classe, um nitrofurano
sinttico utilizado na preveno e no tratamento de infeces urinrias. Inibe
tanto bactrias Gram-positivas, quanto Gram-negativas, devendo ser utilizado
em microrganismos comprovadamente sensveis a este frmaco.
O mecanismo de ao da nitrofurantona se inicia quando as bactrias

reduzem (metabolizam) o antimicrobiano, produzindo um produto que inibe
vrias enzimas, principalmente a acetil coenzima A (ciclo de Krebs), lesando o
DNA bacteriano. Esta atividade maior quando a urina est com pH (poten-
cial de hidrognio) cido.
A nitrofurantona pode ter ao bacteriosttica ou bactericida de-
pendendo da concentrao utilizada (bactericida 100 m g/mL;
bacteriosttica 32mg/mL).
As clulas de mamferos no reduzem to rapidamente a nitrofurantona
quanto s clulas bacterianas, logo, acredita-se que esta seja a atividade
antimicrobiana seletiva deste frmaco.
Figura 17. Nitrofurantona
10.2.4. Betalactmicos
So antimicrobianos que possuem em sua molcula um anel b-lactmico

(Figura 18A), importantssimo para sua atividade bactericida (ao que
leva o microrganismo morte).
Bacteriologia | 275
Penicilinas
Fazem parte de um dos grupos mais importantes entre os antimicrobianos
(Figura 18B), possuem grande eficcia e esto entre os frmacos menos txi-
cos, sendo amplamente usado em diferentes doenas infecciosas.
Cefalosporinas
So antimicrobianos b-lactmicos correlacionados diretamente com
as penicilinas, tanto do ponto de vista estrutural como funcional, e possu-
em anlogos estruturais, conhecidos por cefamicinas (cefoxitina). A produ-
o das cefalosporinas semissinttica (adio qumica de cadeias laterais -
Figura 18C).
As cefalosporinas so classificadas em: primeira, segunda, terceira,
quarta e quinta gerao. Essa classificao foi criada levando-se em consi-
derao os padres de sensibilidade bacteriana e a resistncia b-lactamases
(enzimas que conferem resistncia s cefalosporinas de amplo espectro,
penicilinas, monobactans e aztreonam). Estas enzimas foram denominadas
ESBL b-Lactamases de Espectro Ampliado devido ao fato da maioria
dessas enzimas serem codificadas por genes localizados em plasmdios, que
geralmente carregam genes de resistncias a outros antimicrobianos.
Os mecanismos de ao das penicilinas e cefalosporinas so:
Inibio da transpeptidase (impedem que a ltima molcula de glicina
se ligue ao quarto resduo do pentapeptdeo, assim prejudicando a
formao de peptidoglicana que compe a parede celular).
Evitam a formao do glicopeptdeo da parede celular, atravs de sua
fixao nas protenas de ligao da penicilina (PBP). Logo, no h
elongao posterior da cadeia glicopeptdica.
De modo geral, podemos dizer que as cefalosporinas so inibidoras
seletivas da sntese da parede celular bacteriana.
Carbapenens
Esse grupo possui um anel b-lactmico fundido a outro anel no b-
lactmico de cinco membros (Figura 18D), se diferenciando das penicilinas
por terem o segundo anel insaturado e conter um tomo de carbono em lugar
do tomo de enxofre. Esse antimicrobiano possui espectro de atividade mais
amplo do que outros antibiticos b-lactmicos.
Esta classe representada pelo imipenem (Figura 18E), meropenem e
ertapenem. Sua ao se unir s protenas de ligao da penicilina, interrom-
pendo a sntese da parede celular bacteriana e provocando a morte dos micror-
ganismos. muito resistente hidrlise pela maioria das b-lactamases.
No mercado, comercializado em combinao com a cilastatina, um
frmaco que inibe a degradao do imipenem por uma dipeptidase do
tubular renal. Essa associao mostra-se eficaz no tratamento de infeces
causadas por bactrias Gram-positivas, Gram-negativas fermentadoras e
no-fermentadoras, e anaerbias.
Figura 18. Betalactmicos

Bacteriologia | 277
Monobactmicos
Os representantes desta classe so o aztreonam (Figura 19), o carumonam,
o tigemonam e o pirazmonam. Sendo o aztreonam um b-lactmico isolado da
bactria Chromobacterium violaceum. Sua ao se d pela interao com as
protenas ligadoras de penicilinas (PBP), interrompendo a sntese da parede
celular. Possui ao contra bacilos Gram-negativos aerbios.
Figura 19. Aztreonam (Monobactmico).
10.2.5. Aminoglicosdeos e tetraciclinas
Os aminoglicosdeos possuem aminoacares ligados a um anel

aminociclitol por ligaes glicosdicas. Estes frmacos so utilizados primaria-
mente no tratamento de infeces causadas por bactrias Gram-negativas
aerbicas, em pacientes alrgicos a penicilina, alm de tratarem infeces por
Chlamydia, Mycoplasma, Ureaplasma, Corynebacterium diphtheriae e Legionella
pneumophila. Por serem importantes drogas, amplamente utilizadas, a grave
toxicidade dos aminoglicosdeos uma das principais limitaes de sua utiliza-
o. As toxidades mais comuns so as nefrotoxicidade e a ototoxicidade. Seus
principais representantes so a estreptomicina (Figura 20), a neomicina, a
gentamicina, a canamicina (Figura 21), a tobramicina, a amicacina e a netilmicina.
Sendo estes dois ltimos aminoglicosdeos sintticos e os outros naturais.
Os antimicrobianos aminoglicosdeos caracterizam-se pelo efeito ps-

antibitico (persistncia de uma atividade bactericida aps a queda da concen-
trao srica). Agem inibindo a sntese de protenas e reduzindo a fidelidade
da traduo do mRNA no ribossomo. Apesar da rpida ao bactericida,
essas substncias no atuam sobre bactrias intracelulares, como o
Mycobacterium, por exemplo.
As tetraciclinas possuem quatro anis fusionados com um sistema de
duplas ligaes conjugadas (Figura 22). Tm como representante desta
classe a tetraciclina, a doxiciclina e a minociclina. Sua ao se d pela
ligao do frmaco com a subunidade 30S do ribossoma bacteriano, blo-
queando o acesso do aminoacil-RNAt ao complexo ribossoma RNAm,
para, assim, inibir a sntese de protena pelo microrganismo. So eficazes
contra bactrias e outros microrganismos ( Corynebacterium acnes ,
Haemophilus influenzae, Vibrio cholerae , Rickettsia rickettsii, Aspergillus
spp., Nocardia spp., Chlamydia spp., Mycoplasma spp., etc.).
Figura 20. Estreptomicina. Figura 21. Canamicina.
Figura 22. Tetraclina.

Bacteriologia | 279
10.2.6. Macroldeos, lincosamidas e anfenicis
Os macroldeos so frmacos com estrutura lactnica macroltica. Sendo

a eritromicina o primeiro antimicrobiano a ter aplicao clnica, em indivdu-
os alrgicos aos b-lactmicos. A claritromicina, forma metilada da eritromicina
(Figura 23), e a azitromicina possuem determinadas caractersticas comuns
e algumas particulares. A azitromicina possui um anel lactnico maior, o
que a torna superior a eritromicina. No mercado, foi lanada tambm a
diritromicina, que possui similaridade com a eritromicina em espectro
antibacteriano, tendo como vantagem o uso da dose unitria diria.
As lincosamidas tm como representantes a lincomicina e a
clindamicina. A clindamicina (Figura 24) usada em tratamentos de infec-
es causadas por bactrias anaerbias, como o Bacteroides fragilis. Tam-
bm muito eficaz em cocos Gram-positivos no enteroccicos.
Tanto os macroldeos quanto as lincosamidas possuem o mesmo me-
canismo de ao, fazendo ligao com a subunidade 50S do ribossoma
bacteriano, que inibem a translocao de RNAt, permitindo o bloqueio da
unio de aminocidos (AA) para a sntese de protenas.
Os anfenicis tm como principal representante o cloranfenicol (Fi-
gura 25). Este frmaco usado em infeces causadas por bactrias Gram-
positivas e Gram-negativas, mas, por serem muito txicos, so usados
somente em infeces graves para as quais no haja outro antimicrobiano.
Sua ao se d por inibir a fixao do RNAm aos ribossomos, ligando-se
na subunidade 30S, alm de impedir a unio de aminocidos na formao
do polipeptdeo.
Figura 23. Claritomicina Figura 24. Clindamicina
Figura 25. Cloranfenicol
10.2.7. Glicopeptdeos
Esta classe de antimicrobiano tem como principais representantes a

vancomicina e teicoplanina. A vancomicina (Figura 26) produzida pelo
Streptomyces orientalis. J a teicoplanina produzida pelo Actinoplanes
teichomyceticus. So muito utilizadas em infeces por bactrias Gram-positi-
vas. Agem na inibio da sntese de parede celular por antagonizarem (interfe-
rncia de uma substncia na ao de outro composto) competitivamente a
polimerizao das cadeias de peptidoglicano.
Bacteriologia | 281
Figura 26. Vancomicina
10.2.8. Polimixinas
So antimicrobianos polipeptdicos (Figura 27) que possuem ao
antimicrobiana por se ligarem a constituintes lipoproteicos da membrana
plasmtica, destruindo sua barreira osmtica seletiva. Estes frmacos agem
em bactrias Gram-negativas (incluindo Pseudomonas aeruginosa), no
possuindo atividade sobre bactrias Gram-positivas.
Figura 27. Polimixina.
10.2.9. Inibidores da -lactamase
A lise do anel b-lactmico, pode ocorrer por clivagem enzimtica (por

ao da enzima b-lactamase) ou por cido, destruindo a atividade antimicrobiana.
Os frmacos que representam esta classe possuem um anel b-lactmico, porm,

destitudos da atividade antimicrobiana. So capazes de inibir a clivagem
enzimtica, impedindo, assim, a ao das b-lactamases e tornando-as inativas.
Desta forma, estes antimicrobianos se tornam substratos para tais enzimas. No
mercado estas substncias encontram-se em formulaes contendo derivados
penicilnicos, que so protegidos pelos inibidores de b-lactamases. Esses
inibidores so: cido clavulnico (Figura 28), sulbactam e tazobactam.
Figura 28 cido clavulnico
Como j dissemos, diversos so os antimicrobianos utilizados na

terapia das infeces, e o seu uso consciente ainda uma grande arma na
batalha das infeces. Devemos, porm, evitar seu uso indiscriminado e, s
vezes, desnecessrio. A seguir montamos um pequeno resumo da ao
dos antibiticos discutidos aqui:
Bacteriologia | 283
11. Testes de sensibilidade aos antimicrobianos

Testes
Em 1929, Alexander Fleming observou, por casualidade, que um fun-
go contaminante no s estava crescendo em uma placa de cultura que havia
sido deixada aberta por descuido, como tambm as colnias de Staphylococcus,
crescidas na placa prximas a este fungo, estavam morrendo. O pesquisador
concluiu ento que o Penicillium notatum (fungo que contaminou a placa)
produzia uma substncia que inibia as bactrias - a substncia que veio a ser
conhecida como PENICILINA deu incio era dos antibiticos.
Apesar da descoberta e sntese de diferentes antimicrobianos e seu uso
cotidiano hoje em dia, o que pode ocorrer que, muitas vezes, o microrganis-
mo que est causando determinada infeco resistente ao antimicrobiano
prescrito, tornando a terapia inadequada.
A partir dos estudos de Fleming, vrios mtodos foram criados para
testar se os microrganismos isolados de uma doena so ou no sensveis ao
tratamento com determinado antimicrobiano.
a) Mtodo de Fleming da escavao em valeta (Figura 29)
Remove-se uma tira de gar, de
Figura 29. Mtodo de Fleming
modo a formar uma valeta na placa, e
coloca-se nela um meio de cultura con-
tendo extratos de fungos (penicilina).
A seguir, inocula-se os organismos em A E
estudo em forma de estrias mltiplas
B F
perpendiculares ao sulco (A, B, C,
C G
D, E, F, G, H).
D H
Este foi um dos primeiros
testes a serem processados,
porm, s se testava um
antimicrobiano; nenhum tipo de padronizao ou determinao de
concentrao.
b) Foster & Woodruff (1943)
Comunicaram pela primeira vez o uso de tiras de filtro impregnadas com
uma soluo de antibiticos.
Bacteriologia | 285
Assim, poderia ser testado mais de um antibitico para cada mi-

crorganismo isolado.
c) Vicent & Vicent (1944)
Introduziram os discos de papel, aumentando ainda mais o nmero de
antibiticos.
d) Morely (1945)
Demonstrou que os discos de papel com soluo antibitica podiam
ser secos e posteriormente utilizados sem perder sua atividade.
Na atualidade, utilizamos basicamente dois mtodos, cada um com
seus pontos, positivos e negativos:
Mtodos usados para a avaliao da sensibilidade aos
antimicrobianos:
Testes de diluio Fornecem uma estimativa quantitativa da

suscetibilidade ao antibitico. So utilizadas diferentes concentraes
do antibitico em caldo.
Testes de difuso Envolvem o cultivo dos organismos em uma

placa com gar e a aplicao de discos de papel de filtro contendo
os antibiticos.
Siglas usadas no teste de sensibilidade a antimicrobinos (TSA):
Concentrao inibitria mnima (CIM) Menor concentrao

de antibitico em mg/mL que inibe o crescimento in vitro das bact-
rias (ao bacteriosttica).
Concentrao bactericida mnima (CBM) Menor concentra-

o de antibitico em mg/mL que mata a bactria em estudo
(ao bactericida).
11.1. Provas de sensibilidade por diluio em caldo
11.1.1. Teste da macrodiluio em tubos
Uma das primeiras tcnicas utilizadas para a avaliao da sensibilidade

dos antimicrobianos, e que at hoje tem utilidade, o teste que envolve a
preparao de diluies seriadas e logartmicas (log2) de antimicrobianos (ex:
1, 2, 4, 8, 16 mg/mL) em um meio de cultura lquido (com volume final de
1 a 2 mL por tubo), semeado com a bactria teste.
Os tubos contento antimicrobianos, aps inoculao com uma suspen-
so bacteriana padronizada em torno de 5 X 105 UFC/mL (UFC Unidade
Formadora de Colnia), passaro por um perodo de incubao de 16 a 20
horas, a 35C 2, dependendo do gnero bacteriano e do antimicrobiano
testado. Passado este tempo, os tubos devero ser observados para se visualizar
o crescimento bacteriano (presena de turbidez). Um tubo lmpido demons-
trar que no houve crescimento bacteriano, e o primeiro tubo da srie com
esta caracterstica representa a CIM, ou seja, a menor concentrao de
antimicrobiano capaz de inibir o crescimento bacteriano (Figura 30).
Figura 30. Teste de macrodiluio em

tubo A figura ao lado mostra que a
concentrao inibitria mnima (CIM)
do antimicrobiano testado de 16 mg/
mL. Aps as diluies de 4, 8, 16 e
32 mg/mL serem inoculadas em pla-
cas, respectivamente com as letras A,
B, C e D, e incubadas por 16 horas,
foi observado que no houve cresci-
mento bacteriano na placa D. Logo, a
concentrao bactericida mnima
(CBM) de 32 mg/mL.
Bacteriologia | 287
Vantagens:
Determinao de resultado quantitativo, a CIM.
Desvantagens:
A quantidade de reagentes utilizada.
O espao necessrio para o armazenamento dos tubos.
A possibilidade da ocorrncia de erros durante a preparao das
concentraes antimicrobianas.
O trabalho manual dispendioso na preparao do teste.
11.1.2. Teste da Microdiluio em caldo
Esta tcnica corresponde miniaturizao da tcnica de macrodiluio

em tubos.
Em vez de se utilizar vrios tubos com meio de cultura e antimicrobianos,
usamos microdiluio em caldo, que so inoculados em placas plsticas
estreis, com 96 cavidades e fundo em forma de U, para melhor
visualizao do crescimento bacteriano.
Na placa de microdiluio, pode ser colocado um nmero variado
de at 12 antimicrobianos, em diferentes concentraes (4 a 8 diluies
logartmicas). As placas podem conter o antimicrobiano liofilizado ou con-
gelado, ou o prprio operador dever realizar a distribuio. Tanto os
antimicrobianos como as bactrias a serem testadas so inoculadas com o
auxlio de uma micropipeta (Figura 31), com o propsito de se obter uma
concentrao bacteriana final de aproximadamente 5 x 10 4 - 105 UFC/mL
por poo. Os painis de microdiluio devem ser incubados a 352C,
por 16 a 20 horas (dependendo do gnero bacteriano e do antimicrobiano
testado). Aps esse tempo, a leitura da placa ser realizada visualmente e,
de preferncia, com luminosidade ambiente, para facilitar a leitura.
Figura 31. Microdiluio em caldo
Vantagens:
A economia de espao e de reagentes.
A possibilidade de preparar uma grande quantidade de placas a
partir da mesma srie de diluies de antimicrobianos.
A gerao de um resultado quantitativo (CIM).
Utilizao de placas pr-fabricadas e sistemas computadorizados,
fornecidos pelos fabricantes.
Em alguns sistemas atuais automatizados permitido que se faa a
identificao da espcie bacteriana paralelamente com o teste de sensibili-
dade, pela incorporao de provas bioqumicas s placas de microdiluio.
Desvantagens:
A inflexibilidade na escolha dos antimicrobianos a serem testados,
quando se utilizam as placas pr-fabricadas.
O custo de cada placa de microdiluio.
Bacteriologia | 289
11.2. Prova de sensibilidade com discos de papel em meio

slido
11.2.1. Mtodo de Anderson
A partir deste mtodo, iniciou-se a ideia de standartizar (padroni-

zar) os mtodos, permitindo a reprodutibilidade dos testes.
Este mtodo realizado dispensando-se os discos de antimicrobianos
sobre a placa e seguindo algumas recomendaes:
Padronizao dos discos com antibitico - Utilizou-se um nico
disco com antibitico em concentrao conhecida.
Padronizao do meio - gar tripticase soja.
Padronizao do inculo - Concentrao de 10 8 organismos/mL.
Padronizao do tempo de incubao 18 horas.
Medio do dimetro das zonas de inibio Atravs de
paqumetro ou rgua milimezeada padronizada. Os resultados so
interpretados de acordo com uma tabela de converso.
11.2.2. Prova de Bauer-Kirby
Com a mesma normatizao para

Figura 32. TSA em placa
padronizao que o anterior. Este m-
todo serviu de base para a maioria das
padronizaes atualmente adotadas por
organismos internacionais.
Com uma ala microbiolgica,
tocar a superfcie de quatro a cinco
colnias bacterianas de uma cultura
pura, isoladas em um meio de gar.
Transferir este inculo para um tubo contendo 4 a 5 mL de salina, para

obter turvao equivalente ao do padro 0,5 de Mac Farland. (escala
de turvao correspondente ao crescimento bacteriano em caldo).
Inocular o caldo com auxlio de um swab estril, em placa de gar
Meller-Hinton. Recomenda-se estriar o inculo por induto contnuo
(semeadura prxima e contnua), em pelo menos trs direes.
Esperar pelo menos de 5 a 15 minutos para a secagem do gar,
antes da colocao dos discos com os antibiticos, que devero ter
uma distncia mnima, para que no haja dificuldade na leitura poste-
rior dos halos.
Incubar a 37C por 24 horas.
Medio do dimetro das zonas de inibio com rgua milimetrada e
os resultados interpretados de acordo com uma tabela de converso.
Paralelamente, usam-se organismos-padro, como o S.aureus (ATCC
25923), o E.coli (ATCC 25922) e o P. aeruginosa (ATCC 27853).
Como, atualmente, existem diversas padronizaes baseadas nesta pro-
va, importante comentar que vrias modificaes foram implementadas para
melhoria da qualidade do teste, mas que vrios parmetros ainda so usados.
Considerando a tcnica e o que sabemos hoje, reforamos que a
aplicao do inculo bacteriano realizada com aproximadamente 1 a 2 x
10 UFC/mL. As placas so incubadas por 16 a 24 horas, podendo ser
mantidas a 5% de CO2 a 35 2C (dependendo do gnero bacteriano
e do antimicrobiano testado). Os dimetros dos halos de inibio do
crescimento bacteriano ao redor de cada disco, medidos em milmetros, so
relacionados sensibilidade da amostra bacteriana e velocidade de difuso
do antimicrobiano no gar.
Atualmente, os resultados do teste de disco-difuso so interpretados
comparando o valor do halo de inibio com os critrios publicados pelo CLSI
Bacteriologia | 291
(Clinical and Laboratory Standards Institute), que a cada ano atualiza suas
edies. Desta maneira, as amostras bacterianas so categorizadas em sensveis
(S), resistentes (R) ou intermedirias (I).
Vantagens do mtodo de disco-difuso em gar:
Execuo fcil.
Reprodutibilidade.
Utilizao de reagentes de baixo custo.
Resultados de fcil interpretao.
Flexibilidade de escolha dos antimicrobianos e sem exigncias especiais
para leitura e interpretao.
Limitaes:
Este mtodo no aplicvel a microrganismos de crescimento lento.
Se for necessria uma incubao prolongada para alcanar o crescimento
suficiente e obter uma zona de inibio detectvel, o antibitico pode dete-
riorar a ponto de fornecer leituras imprecisas. Tambm inadequado em
antibiticos que se difundem lentamente em gar, tais como a polimixina B.
O mtodo de Bauer-Kirby no til na determinao de sensibilida-
de dos anaerbios, pois estes possuem crescimento lento, tornando difcil
estabelecer esquemas interpretativos confiveis.
Muitos antimicrobianos so ativos contra os anaerbios (ampicilina-
sulbactam, cloranfenicol, imipenem e ticarcilina-clavulanato), apesar disso,
outros podem no ter a mesma atividade, sendo interessante realizar o
TSA (Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos) concomitantemente com
o incio do tratamento.
11.2.3. Fatores importantes que influenciam no resultado da

prova de sensibilidade em placa por difuso
Numa prova de sensibilidade por difuso com disco, a velocidade de

difuso de uma droga no gar e o tamanho da zona de inibio do crescimento
depende de vrios fatores associados ao meio:
Concentrao do gar - 1,5% a 2,0% de gar adequado para as
exigncias tcnicas da prova e permite a livre difuso da droga no meio.
pH - Alteram a zona de inibio. Para a medida de controle de
qualidade, o pH de cada lote do Meller-Hinton deve ser determina-
do, devendo estar entre 7,2 e 7,4. A incubao da prova no deve
ser realizada sob concentraes elevadas de CO 2 e os carboidratos
fermentveis no devem ser adicionados.
Concentraes de ons no gar - Concentraes de ctions Ca++ e Mg
++
alteradas influenciam na prova de sensibilidade da P. aeruginosa diante
de aminoglicosdeos. Recomenda-se o ajuste da concentrao final de
Mg++ para 25 a 30 mg/L e Ca++ para 50 a 100 mg/L de caldo
Meller-Hinton para obter valores prximos dos nveis fisiolgicos in vivo.
Caractersticas nutritivas - Resultados insatisfatrios podem ocorrer,
em meios contendo altas concentraes de timidina usando trimetoprim
ou combinaes de trimetoprim e sulfametoxazol. Pode ser adicionado
ao meio de Meller-Hinton timidina fosfocilase, para inativar a timidina
presente neste meio. O importante observar se pode haver alterao
no crescimento dos microrganismos.
Altura da camada do gar depositado na placa de Petri - O
meio deve alcanar uma espessura de 4 mm. Em meios com espessu-
ra menor que esta, os antibiticos tendem a difundir mais em direo
lateral, aumentando o tamanho das zonas de inibio. O inverso
tambm pode ocorrer.
Bacteriologia | 293
11.2.4. Outros fatores importantes que devem ser considerados
Inculo - Controlar a concentrao bacteriana para no produzir varia-

es dirias no tamanho das zonas de inibio dos organismos. Quando
a concentrao muito baixa, torna-se necessrio um perodo maior
para as clulas proliferantes formarem uma massa suficientemente grande
para resistirem ao efeito do antibitico na borda da zona de inibio.
Perodos prolongados resultam em uma zona de inibio grande e inculo
denso, alm de fornecer zonas falsamente pequenas.
Temperatura - Os dimetros das zonas de inibio aumentam medida
que a temperatura de incubao sofre uma elevao dentro da faixa
fisiolgica. Isso acontece devido a uma diminuio da viscosidade do
gar e um aumento intrnseco da sensibilidade dos microrganismos a
certos antibiticos.
Discos com antibiticos - Os discos devem ser colocados a aproxima-
damente 20 mm um do outro e 15 mm da parede da placa, para evitar
que as zonas de inibio de crescimento se sobreponham ou se esten-
dam at a margem do gar.
11.2.5. Realizao do teste de sensibilidade aos

antimicrobianos (TSA) por disco-difuso na atualidade
Mtodo de suspenso direta da colnia:
Inicialmente, a cultura dever ter um crescimento de no mnimo 24

horas e as bactrias devem estar isoladas.
Com o auxlio da ala bacteriolgica, transferir 3 a 4 colnias com a
mesma morfologia e inocul-las em 3 a 4mL de caldo de Trypticase Soy
Broth (TSB), soluo fisiolgica a 0,9%, ou caldo de Meller-Hinton.
Comparar o inculo com tubo 0,5 da escala de McFarland.
Observao: Para obter o inculo desejado, incubar o Trypticase Soy Broth

(TSB) ou o caldo Meller-Hinton 35 2C at a turbidez da cultura no
caldo atingir 0,5 da escala de McFarland, o que geralmente ocorre entre 2 a
6 horas.
Inoculao da placa
Dentro de 15 minutos aps o ajuste do inculo, proceder semeadu-

ra, introduzindo um swab estril na suspenso bacteriana, ajustada a 0,5
da escala de McFarland. Comprimir o swab contra a parede interna do
tubo para retirar o excesso do inculo e semear a superfcie do gar em
trs direes diferentes.
Deixar a placa semeada secar por Figura 33. A seta mostra a de-
5 minutos temperatura ambiente, formao na zona de inibio do
disco, causada pelo deslizamento
para que o inculo seja completa-
do disco no meio
mente absorvido pelo gar antes de
aplicar os discos. No ultrapassar o
perodo de 15 minutos entre a se-
meadura e a colocao dos discos.
Caso o disco seja colocado com a
placa ainda muito molhada, poder
ocorrer o deslizamento deste no
gar (Figura 33).
Aplicao dos discos
Placas de 150 mm: colocar no mximo 12 discos.

Placas de 90 mm: colocar 5 discos.
Para alguns microrganismos, como, por exemplo, Haemophilus spp.,
Streptococcus spp. e Neisseria gonorrhoeae, colocar no mximo 9
Bacteriologia | 295
discos nas placas de 150 mm, pois o dimetro dos halos de alguns
antibiticos pode ser muito grande.
Somente retirar os discos da geladeira ou do congelador uma a duas
horas antes da sua utilizao.
Aps a colocao dos discos, pressionar levemente, com um auxlio
de uma pina, a superfcie de cada disco.
No remover do lugar o disco que j foi colocado (ou caiu) no gar,
pois a difuso da droga imediata.
Incubao das Placas

Incubar as placas invertidas no mximo 15 minutos aps a colocao
dos discos.
A temperatura mxima da estufa deve ser 352C.
O tempo de incubao deve ser de 16 a 18 horas, com exceo
da avaliao da sensibilidade oxacilina, vancomicina para
Staphylococcus spp., e vancomicina para Enterococcus spp., que
deve ser de 24 horas.
As bactrias so incubadas em estufa aerbia, com exceo de alguns
microrganismos que precisam de uma atmosfera de 5% CO2.
Leitura das placas
Aps o perodo de incubao, realizar a leitura das placas pelo fundo

da placa.
No gar Mller-Hinton sangue, abrir a placa e ler, com o auxlio de
uma rgua ou halmetro, o mais prximo possvel do crescimento, utili-
zando uma fonte de luz sobre a placa.
A leitura de oxacilina e vancomicina para Staphylococcus spp., e
da vancomicina para Enterococcus spp., deve ser feita com auxlio
de uma fonte de luz. Quando h colnias pequenas dentro dos

halos, estas devem ser verificadas antes de ser liberadas como cepas
resistentes a estes antimicrobianos, pois podem ser clones resistentes
ou contaminao.
Considere os halos de inibio a partir do ponto onde no se observa
o crescimento bacteriano a olho nu.
Interpretao dos Resultados
Os halos de inibio para cada antimicrobiano testado devem ser

interpretados, de acordo com as categorias do CLSI, em sensvel, inter-
medirio ou resistente.
11.2.6 - E-Test
O E-test uma fita plstica que se Figura 34. Gradiente de sensi-

encontra disponvel no mercado. Ela bilidade do E-Test.
impregnada por concentraes crescentes
de antimicrobiano na face ventral e
marcada, na face dorsal, com a escala das
concentraes testadas, a fim de facilitar a
leitura do resultado. A base deste teste
est fundamentada no gradiente de difu-
so do antimicrobiano existente na fita no
gar, determinando, assim, a sensibilida-
de da amostra bacteriana ao antimicrobiano
testado (Figura 34). O preparo do
inculo desta tcnica o mesmo para o
teste de disco difuso.
Bacteriologia | 297
Vantagens
A flexibilidade na escolha dos agentes antimicrobianos a serem

testados.
A fcil execuo e o fornecimento de um resultado quantitativo (CIM).
Desvantagens
O alto custo das fitas.

O nmero limitado de antibiticos testados por placa.
Resultados atpicos
Organismos mveis podem produzir crescimento invasivo quando

cultivados em superfcies de gar, formando um vu fino que penetra
nas zonas de inibio ao redor dos discos. Esta zona de invaso
deve ser ignorada, devendo-se medir a borda externa (ex. Proteus).
A presena de colnias definidas dentro da zona de inibio no
representa invaso. Estas colnias podem representar mutantes mais
resistentes ao antibitico do que a maior parte da cepa, onde esta
no pura e as colnias separadas so de uma espcie diferente.
Pode ocorrer dificuldade da leitura dos dimetros quando existe
uma superposio de zonas de inibio ou quando estas se esten-
dem para alm da borda do gar.
Se uma placa deficientemente inoculada e as estrias so irregula-
res, deixando espaos entre as reas de crescimento e tornando as
bordas das zonas de inibio no ntidas, elas no devem ser lidas.
11.3. Combinaes de agentes antibacterianos

Muitas vezes, dois antimicrobianos podem ter uma combinao inte-
ressante ou desinteressante in vivo ou in vitro. importante o conhecimen-
to deste fato, pois, no caso do antibiograma, dois agentes sinrgicos ou
antagnicos entre si podem dificultar a leitura dos halos de inibio. O
mesmo pode ocorrer in vivo, quando tratamos o paciente com antimicrobianos
diferentes.
Figura 35. Sinergismo
SINERGISMO - Os antimi-
Reparem o
crobianos tornam-se mais eficazes aumento da
do que quando utilizados em se- espessura do
parado - aumento dos efeitos indi- halo
viduais (Figura 35).
Figura 36. Antagonismo

ANTAGONISMO - Menos efe- Observem a
tivos do que quando usados indi- inibio da
vidualmente. Um pode prejudicar sensibilidade
o efeito do outro (Figura 36). prximo ao
antimicrobiano B
11.4. Controle de qualidade dos testes

O TSA, assim como toda tcnica realizada em laboratrio, dever
seguir padres de controle da sua qualidade, permitindo a confiana nos
resultados obtidos. No caso do antibiograma, so utilizadas periodicamente
cepas padro, com sensibilidade e/ou resistncia conhecidas, que semeamos
Bacteriologia | 299
seguindo as normas j determinadas para esse ensaio. O resultado da leitura

obtido aps a incubao necessria e comparado com uma tabela padronizada
para este fim. Qualquer modificao do resultado esperado significa uma no
conformidade no teste.
As cepas padro para controle da qualidade de discos para TSA por
difuso em gar so: E.coli ATCC 25922, S.aureus ATCC 25923 e P.
aeruginosa ATCC 27853.
As cepas controle para testes com anaerbios so: Bacteroides
thetaiotaomicron ATCC 29741, C.perfringens ATCC 13124 e Eubacterium
lentum ATCC 43055.
12. Gentica bacteriana

O conjunto das caractersticas de todos os seres que conhecemos
influenciado por dados hereditrios atravs dos genes. A informao gentica,
na maioria dos organismos, armazenada na forma de sequncia de bases
nitrogenadas, chamada de DNA (cido desoxiribonucleico). Ocasionalmente,
organismos como os vrus podem armazenar as informaes da forma de RNA,
isso ser tratado no captulo 2 deste volume.
Quando pensamos em evoluo e gentica, temos pensar em diversida-
de, j que esta uma condio prvia para a evoluo. Estudaremos, neste
captulo, as bases deste processo, j que a mutao e a recombinao de
genes aumentam a diversidade dos organismos e a seleo natural permite a
manuteno dos mais bem adaptados a determinados ambientes.
12.1. Gentipo e fentipo

O gentipo de um organismo determinado pelo seu arcabouo gen-
tico (informaes genticas) que no necessariamente esto ou estaro todas
expressas. O fentipo, todavia, a sua manifestao, ou seja, as propriedades
genticas que podem ser evidenciadas naquele momento. Em outras palavras,

o gentipo a coleo dos genes e o fentipo baseia-se direta ou indireta-
mente nas protenas que foram formadas. A informao gentica do DNA
transcrita em mRNA, permitindo sua traduo em protenas, que vo gerar o
que anteriormente chamamos de fentipo.
12.2. Genes e reproduo

Os organismos procariontes (com fitas duplas de DNA), na sua maio-
ria, possuem os dados genticos codificados no cromossoma (disperso no
citoplasma). Sendo que aproximadamente 90% destes genomas consistem em
uma nica molcula de DNA circular bastante torcida e espiralada, que ocupa
quase 10% do volume celular. Algumas poucas excees, como j comenta-
do, podem ocorrer em algumas bactrias, como, por exemplo, Brucella e
Burkholderia, que podem possuir mais de uma molcula de DNA, ou ento
Streptomyces coelicolor que apresenta o cromossoma em forma linear. Alm
disso, muitas bactrias podero possuir genes adicionais em plasmdeos (tpi-
co1), que podem apresentar mais de 30 cpias em uma nica clula bacteriana.
Outro dado interessante a variao do tamanho do cromossoma bacteriano,
que pode conter de 580 kbp at mais de 5220 kbp, enquanto o DNA
plasmidial tem no mximo uns 100 kbp.
As informaes contidas nos plasmdeos, apesar de no serem essenciais
ao crescimento bacteriano, podem ser extremamente importantes para o suces-
so do espcime, podendo mediar desde resistncia antimicrobiana at as pr-
prias informaes que possibilitam a transferncia, aquisio e rearranjo de
DNA entre bactrias.
A replicao do DNA possibilita o fluxo de informaes genticas para
as novas geraes. Geralmente, os organismos bacterianos reproduzem-se
assexuadamente por diviso binria transversa. Inicialmente ocorre a replicao
do cromossomo, que se inicia em determinado ponto, prosseguindo em ambas
Bacteriologia | 301
as direes (replicao bidirecional). No processo, as duas fitas de DNA

original so separadas e usadas como modelo para a sntese de novas fitas
(replicao semiconservativa). Os nucleotdeos livres presentes no citoplasma
so pareados com as bases expostas do DNA de fita simples, seguindo
sempre a ordem da adenina se ligando a timina e da guanina se ligando
citosina. Todo este processo, inclusive de correo, caso uma base errada
seja encaixada, mediado por enzimas, incluindo a do DNA polimerase,
que age colando s bases correspondentes. O ponto em que a replicao
ocorre chamado de forquilha de replicao e, j que a replicao
bidirecional, teremos nos cromossomos circulares duas forquilhas ocorrendo
ao mesmo tempo.
Logo aps o princpio da replicao, inicia-se o desenvolvimento de
uma invaginao na membrana plasmtica e na parede celular (mesossoma),
que posteriormente dividir a bactria original em duas novas clulas. Quando
a nova parede formada no se separa completamente em duas paredes, pode-
se formar uma cadeia (ou filamento) de bactrias. A fisso binria no o
nico mtodo reprodutivo entre as bactrias, mas outras formas so menos
comuns: O gnero Streptomyces pode produzir vrios esporos reprodutivos
ao mesmo tempo, cada um originando um novo indivduo; bactrias filamentosas
do gnero Nocardia podem aumentar seu filamento e fragment-lo em peque-
nas clulas bacilares ou cocoides; espcies do gnero Hyphomicrobium po-
dem reproduzir-se por brotamento.
12.3. Mutaes
Como comentamos no incio deste tpico, os mecanismos que levam s
mutaes genticas so de grande importncia evolutiva, aumentando a diversi-
dade dos organismos. A mutao nada mais que uma alterao na sequncia
de bases nitrogenadas do DNA, modificando o produto codificado. Essas
mutaes ocorrem espontaneamente ou so induzidas com a presena de um
agente mutagnico (radiao ou agentes qumicos). Muitas das mutaes que

ocorrem acabam no causando nenhuma modificao e so chamadas de neu-
tras. Outras, porm, podero ser desvantajosas ou benficas, dependendo do
produto gerado.
Pares de bases do DNA podem ser deletados ou adicionados ao DNA,
causando uma mutao chamada de troca de fase de leitura. Outro tipo de
mutao aquela que acaba por causar a substituio de um aminocido ou
que cria um cdon de finalizao, j que um par de bases pode ser substitudo
por outro diferente. claro que vrias enzimas trabalham na reparao do
DNA alterado, mas, apesar da eficincia destes sistemas, os erros, embora
raros, na replicao natural existem e podem ser aumentados por exposio a
agentes mutagnicos em at mil vezes. Esses agentes podem ser utilizados em
engenharia gentica para fins comerciais. Um exemplo clssico pode ser evi-
denciado atravs das mutaes induzidas pela exposio do fungo Penicillium
(produtor de penicilina) aos mutagnicos, resultando numa variante produtora
de quantidades mil vezes maiores de penicilina que o fungo original.
12.4. Recombinao gentica

Alm destas possibilidades, direcionadas ou no, algumas bactrias po-
dem realizar troca de informaes genticas. Tal recombinao gentica pode
ocorrer por conjugao, transformao ou transduo.
Na conjugao, duas bactrias geneticamente diferentes trocam DNA
diretamente, ou seja, necessrio o contato entre os dois organismos, o que
implica a transferncia de DNA plasmidial. A bactria Escherichia coli tem
servido de modelo para estudar esse fenmeno, j que possui linhagens F- e
F+. As clulas F+ possuem pili e contm um plasmdeo conhecido como
fator F (fertilidade). Quando uma clula F+ entra em contato com uma clula
F-, os pili organizam um tubo de conjugao oco (Pili sexual ou pili F), que
Bacteriologia | 303
conecta a clula F+ clula F-, permitindo que o DNA migre de uma

bactria para outra.
Na transformao, a clula bacteriana incorpora fragmentos de DNA
livres, em soluo, geralmente liberados por outra bactria que se rompeu.
Este mecanismo tem sido usado experimentalmente para mostrar que os genes
podem ser transferidos de uma bactria para outra e que o DNA a base
qumica da hereditariedade. Para que isso ocorra, a clula precisa estar com-
petente para assimilar o DNA livre, e isso ocorre no s devido ao ambiente,
mas a uma srie de fatores fisiolgicos da prpria clula que induzem esse
processo. Esse processo foi demonstrado pela primeira vez em Streptococcus
pneumoniae, mas no ocorre naturalmente em muitos gneros bacterianos.
Na transduo, genes bacterianos so carregados de uma bactria para
outra, dentro de um bacterifago (vrus que possui como alvo um organismo
bacteriano). Quando o bacterifago entra numa clula bacteriana, o DNA do
vrus mistura-se com uma parte do DNA hospedeiro, de modo que o vrus ao
sair da clula passe a carregar parte do DNA bacteriano. Se o vrus infecta uma
segunda bactria, o DNA da primeira pode incorporar-se com o DNA da
segunda. Esta nova informao gentica ento replicada a cada nova diviso
(ver vrus lticos e lisognicos, no captulo 2 deste volume). A transduo
pode ser especializada (onde ocorre a transferncia de genes especficos) ou
generalizada (onde qualquer gene pode ser transferido).
Alm das formas de recombinao descritas, outros mecanismos podem
levar a alteraes genticas, como os plasmdeos, j estudados anteriormente
(item 3.2.4), e os transposons, tambm chamados de genes saltadores.
Os transposons so pequenos segmentos de DNA, que podem se
deslocar em baixa frequncia, para diferentes posies dentro do genoma de
uma nica clula, ou mesmo para um plasmdeo num processo chamado trans-
posio. Neste processo, h um intercmbio de material gentico, podendo
causar mutaes e modificar a quantidade de DNA no genoma. Eles foram
descobertos por Barbara McClintock (Nobel em 1983). Como so capazes

de se transportar para plasmdeos, podem tambm ser levados a outras clulas
ou vrus, sendo considerados hoje como potenciais mediadores da evoluo
entre organismos.
Todos estes conhecimentos atuais sobre a gentica de procariotos levou
a Bacteriologia e toda a Microbiologia a um patamar mais alto. Devemos
lembrar que vrios dos alimentos que consumimos so produzidos por micror-
ganismos, bem como antibiticos, diferentes substncias qumicas e enzimas
utilizadas em processos industriais. Na atualidade, tcnicas de Biotecnologia
propiciam, atravs do DNA recombinante, que uma bactria Escherichia coli
seja capaz de produzir interferon gama, uma protena humana usada na medici-
na. Outros avanos esto ligados ao diagnstico molecular de vrias doenas,
como a tcnica da PCR e vrios outros processos comentados no captulo 2
do volume 3, desta coleo.
13. Mecanismos de patogenicidade e defesa bacteriana

A capacidade que tem um agente infeccioso tem de, uma vez instalado
no organismo do homem e de outros animais, produzir sintomas em maior ou
menor proporo, chama-se patogenicidade. Portanto, microrganismos
patognicos so aqueles capazes de causar enfermidades em condies apro-
priadas. O grau de patogenicidade dentro de um determinado gnero ou
espcie chamado de virulncia. A virulncia no est atribuda a um nico
fator, e sim, depender de vrios fatores relacionados com o microrganismo,
ao hospedeiro e interao entre os dois. A virulncia envolve duas caracters-
ticas de um microrganismo patognico: infecciosidade (capacidade de poder
iniciar uma infeco) e a gravidade de condio da infeco. Podemos caracte-
rizar as cepas em: com alto grau de virulncia, com mdio grau de virulncia ou
sem virulncia (avirulentas), dentro de um gnero ou espcies de microrganis-
mos que na maioria das vezes so considerados patognicos.
Bacteriologia | 305
13.1. Como se inicia a patogenicidade?
Para se estabelecer um processo infeccioso, o microrganismo dever

penetrar no hospedeiro e iniciar uma infeco. A capacidade do microrga-
nismo de se aderir e sobreviver nas superfcies das mucosas do hospedeiro
leva ao primeiro contato. A unio dos microrganismos em superfcies
epiteliais, muitas das vezes no invade os tecidos mais profundos. Nesses
casos, uma ou mais toxinas produzidas pelo patgeno so responsveis
pela patologia. Os microrganismos aderem s clulas das mucosas epiteliais
e em seguida atravessam esta barreira, posteriormente multiplicao em
tecidos subepiteliais, causando a destruio dos tecidos. H organismos
altamente invasivos que podem aderir e atravessar a superfcie epitelial,
multiplicando-se e invadindo tecidos mais profundos, podendo eventual-
mente chegar corrente sangunea e causar infeco generalizada. Existem
bactrias que se aderem, invadem, multiplicam-se, e se adaptam para con-
tinuarem no hospedeiro, mas normalmente dentro das clulas do sistema
reticuloendotelial.
Ex.: Micobactrias.
H algumas bactrias que so especficas, pois infectam um determi-
nado tipo de tecido. O Streptococcus pneumoniae, por exemplo, pode
habitar a garganta e a nasofaringe, mas quando causa doena, infecta pre-
ferencialmente o trato respiratrio inferior. A afinidade tecidual pode estar
relacionada com a presena de receptores especficos para aderncia
bacteriana ou presena de nutrientes. Temos como exemplo da depen-
dncia nutricional, a Brucella abortus, que causa abortos contagiosos no
gado. Esta bactria necessita do lcool-acar eritritol, que est presente
em elevadas concentraes nos tecidos uterinos e placentrios bovinos,
logo, esse microrganismo poder habitar o trato genital bovino devido a
essa preferncia nutricional.
13.2. Fatores de virulncia
13.2.1. Adeso
Capacidade das bactrias de se fixar nas clulas e tecidos do organismo. A
adeso se d pela presena de estruturas da superfcie da clula bacteriana, definida
como adesinas. As adesinas funcionam quando interagem com os receptores que
existem no organismo. Estes receptores se localizam na superfcie da clula ou so
protenas da matriz extracelular. As adesinas bacterianas incluem fmbrias, compo-
nentes da cpsula, cidos lipoteicoicos (item 3 deste captulo) das bactrias Gram-
positivas, Gram-negativas, ou outro antgeno de superfcie celular.
As bactrias podem se aderir, por exemplo, a superfcies de vasos sangu-
neos ou a diferentes dispositivos plsticos usados em medicina, onde formam os
chamados biofilmes. Estes so microcolnias ou agregados bacterianos que so
envolvidos por uma pelcula de exopolissacardeos produzida pela bactria que se
forma na superfcie dos dispositivos plsticos, quando colocados no organismo.
Funcionam como uma fonte permanente de bactrias que podem causar infeco em
rgos distintos. Nos biofilmes, as bactrias esto bem resguardadas das defesas do
organismo e da ao dos antimicrobianos. Estes podem se formar tanto em superf-
cies plsticas quanto em mucosas (fibrose cstica), nos dentes (placa dentria) e nas
tubulaes em geral. Observe a figura abaixo, que mostra a formao de biofilme
por uma bactria em um vaso sanguneo.
Bacteriologia | 307
13.2.2. Invaso
Alm de aderir, as bactrias tambm podem invadir diferentes clulas

do nosso organismo para causar infeco. A penetrao bacteriana nas clu-
las do organismo se d pelo processo que chamamos de fagocitose (defesa
inata mais eficiente (ver captulo 1 deste volume). H dois tipos de
fagocitose: uma exercida por clulas fagocitrias e a outra pelas clulas
epiteliais ou clulas no fagocitrias. A fagocitose exercida pelas clulas
fagocitrias um processo que acontece naturalmente, com o objetivo de
proteger o organismo da bactria. A fagocitose causada por clulas epiteliais
ou por clulas no fagocitrias induzida pela bactria, e tem como objetivo
proteg-las das defesas do organismo. Quanto aos mediadores das duas
fagocitoses, temos, na fagocitose natural, o auxlio de anticorpos e do com-
plemento. J na fagocitose induzida, temos a ao de diferentes protenas,
chamadas de invasinas. As invasinas podem se localizar na membrana externa
da bactria ou podem ser introduzidas no citosol. Podemos dizer que ambos
os tipos de fagocitose envolvem o citoesqueleto de actina, tanto nas clulas
fagocitrias como nas no fagocitrias, com projees de extenses celulares
chamadas pseudpodos, que envolvem a clula bacteriana em vacolos.
Cada bactria invasora dotada de diferentes mecanismos prprios de inva-
so e estes serviro ao propsito de cada uma delas.
As respostas das clulas do nosso organismo podem ser vrias, as que
mais conhecemos incluem a produo de citocinas e prostaglandinas.
As citocinas, tambm chamadas de interleucinas, so produzidas por
macrfagos ativados e estimulam o amadurecimento do linfcito. J as
prostaglandinas podem causar morte celular por necrose (diminuio de nu-
trientes) ou por apoptose (morte celular programada).
Com relao s bactrias, o mais importante a necessidade de regular

a expresso dos seus genes de virulncia para se adaptarem aos organismos
onde vivem.
Bactrias intra e extracelulares
O crescimento e a multiplicao de clulas bacterianas podem ocor-
rer dentro (intracelular) ou fora (extracelular) das clulas do nosso organis-
mo. Algumas bactrias so classificadas como intracelulares obrigatrias,
por precisarem de nutrientes produzidos pela clula hospedeira. Sua loca-
lizao intracelular permite que sejam protegidas de anticorpos, da fagocitose
e de alguns antimicrobianos.
Siderforos
ons metlicos, como o ferro, esto entre as necessidades do metabolis-
mo bacteriano. Os siderforos so compostos de baixo peso molecular que
tm grande afinidade por ferro e formam complexos importantes para as clu-
las. Dentro das clulas, o ferro reduzido a uma forma solvel (Fe II). O
complexo siderforo-ferro necessrio porque Fe insolvel no pH fisiolgi-
co e, portanto, no pode ser transportado entre clulas por meio de canais de
ons. A produo de siderforos uma estratgia bastante interessante para as
bactrias presentes em nosso corpo. Para que este processo no ocorra, o
nosso organismo criou um mecanismo para retirar o ferro dos lquidos corpreos.
Assim, o ferro que existe no sangue est quase que todo ligado hemoglobina
nas clulas vermelhas (eritrcitos), transferrina no plasma e lactoferrina no
leite e em outras secrees (lgrima, muco, etc.). Quando se inicia uma
infeco, nosso organismo aumenta a produo de protenas que sequestram a
maior quantidade de ferro, tornando-o pouco disponvel para a bactria. Desta
forma, bactrias que no competem eficazmente com o hospedeiro pelo ferro
disponvel so pouco patognicas e as que secretam os siderforos (com ferro
ligado) possibilitam sua internalizao pela clula bacteriana, aps ligarem-se a
receptores especficos.
Bacteriologia | 309
13.2.3. Toxinas
o termo usado em Microbiologia para nomear qualquer substncia de

origem bacteriana capaz de causar danos no organismo animal. As toxinas
bacterianas so classificadas, desde o sculo XIX, em: endotoxinas e exotoxinas.
13.2.3.1. Endotoxinas
O LPS (lipopolissacardeo) a endotoxina presente principalmente na

membrana externa de membros da famlia Enterobacteriaceae. Sua estrutura
composta por trs partes: lipdeo A (glicopeptdeo composto de dissacardeo
que se liga aos cidos graxos), cerne (pequeno nmero de acares comuns,
como o cido deoxioctanoico (KDO) e a heptose) e antgeno O (composto
formado por uma variedade de resduos oligossacardicos, que protegem a
bactria da ao de substncias hidrofbicas). O lipdio A a parte toxignica
das bactrias Gram-negativas, como, por exemplo, Neisseria spp.
O LPS induz a liberao de substncias vasoativas, ativa o sistema
complemento pela via alternativa, atravs da ao sobre o componente C3
(ver captulo 1 deste volume), e ativa a cascata de coagulao, provocando
obstruo intravascular. Todos estes processos podem resultar em instabilidade
cardiovascular e hemodinmica, levando a uma septicemia. Manifestaes se-
melhantes podem ser causadas por bactrias Gram-positivas, devido a compo-
nentes de sua parede bacteriana.
13.2.3. Exotoxinas
As exotoxinas podem ser divididas em trs grupos ou tipos: I, II, III.

Essa diviso de acordo s interaes com as clulas do hospedeiro.
Grupo I
As toxinas pertencentes a este grupo correspondem aos superantgenos
e s toxinas da famlia ST (termoestveis).
Os superantgenos no sofrem a ao dos macrfagos, mas possuem a

capacidade de se ligar s molculas de MHC da superfcie dos macrfagos e
aos receptores na superfcie dos linfcitos. Isso permite que haja a produo
de grandes quantidades de interleucinas, interferons e outras citocinas por
outras clulas alm dos linfcitos. Um exemplo de bactria que produz
superantgeno o Staphylococcus aureus.
Assim como o superantgenos, as toxinas ST agem somente na superf-
cie das clulas. As toxinas ST compreendem uma famlia de pequenos peptdeos
no imunognicos produzidos por algumas bactrias, como, por exemplo, a
Escherichia coli.
Grupo II
As toxinas deste grupo tm como caracterstica lesar a membrana
citoplasmtica, atravs da formao de poros, que leva a morte da clula.
Como os glbulos vermelhos (hemcias) so as clulas mais estudadas em
relao a essas toxinas, estas receberam o nome de hemolisinas, mas isso no
quer dizer que outras clulas no possam ser lesadas. A virulncia dessas
toxinas demonstrada, principalmente, pela capacidade de matarem os fagcitos,
rompendo a membrana dos fagossomas, e lisar as hemcias para captura do
ferro da hemoglobina. Outros mecanismos tambm podem estar envolvidos,
como a presena de toxinas que retiram o fosfato dos fosfolipdeos (fosfolipases),
desestruturando a membrana.
Grupo III
Este grupo possui o maior nmero de toxinas e fatores de virulncia, por
esse motivo acreditamos ser o grupo mais importante. As toxinas deste grupo
possuem uma caracterstica comum entre elas, que a presena das subunidades
A e B em sua molcula. A subunidade A corresponde poro enzimtica e
ativa da toxina, penetrando na clula e exercendo os efeitos biolgicos da
toxina (na maioria das vezes, remove a ADP-ribose da NAD e as transfere
Bacteriologia | 311
para diferentes protenas das clulas, que perdem as suas funes normais). A
subunidade B (vem de binding) responsvel pela ligao da toxina ao seu
receptor celular. Essas toxinas tambm recebem o nome de toxinas A-B.
13.2.3.3. Enzimas hidrolticas

Enzimas como hialuronidase, colagenase e proteases so hidrolticas,
sendo capazes de degradarem componentes da matriz extracelular, desorgani-
zando toda a estrutura dos tecidos. Esta degradao forma vrios nutrientes
que so utilizados pelas bactrias. Dificilmente se consegue distinguir o papel
desenvolvido pelos fatores bacterianos daquele desenvolvido pelo processo
inflamatrio, visto que os fagcitos tambm produzem enzimas hidrolticas.
14. Microbiota autctone

O conceito de microbiota autctone ou, como antigamente era conhe-
cida, flora normal se refere aos microrganismos que habitam a pele e as
mucosas de pessoas normais e sadias.
A microbiota normal se origina inicialmente do ambiente, no momento
do nascimento e da alimentao, podendo haver relativa variao entre indi-
vduos com o passar do tempo, mas que geralmente engloba microrganismos
frequentemente encontrados em determinado local, e numa determinada
idade, entre indivduos saudveis. Sua presena no essencial vida,
porm, ela desempenha um papel bem definido na manuteno da sade e
das funes normais.
Os microrganismos membros da microbiota podem ser extremamente
benficos existindo como mutualistas, protegendo o hospedeiro, competindo
pelos nichos onde se encontram e pelos nutrientes, de forma mais eficiente
que os microrganismos externos, inibindo e dificultando a colonizao de
outros microrganismos, produzindo nutrientes importantes (sntese de vitamina
K e B) e tambm contribuindo para o desenvolvimento do sistema imunolgico.
Na grande maioria, a microbiota se compe de comensais, quando

mantm associaes aparentemente neutras sem benefcios ou malefcios
detectveis. Contudo, em algumas ocasies, esses microrganismos po-
dem agir como oportunistas, quando causam doenas em indivduos
imunocomprometidos (portadores de AIDS, pessoas que utilizam terapia
imunossupressora, quimioterapia, radioterapia, que possuem queimadu-
ras extensas, etc.). Ainda existem os casos em que se os microrganismos
normais forem retirados por algum motivo do local onde so considera-
dos comensais, e introduzidos em outro ambiente corpreo, eles pode-
ro agir como patognicos, j que neste outro nicho eles no fazem
parte da microbiota.
A microbiota normal pode ser classificada em dois grupos: A
microbiota residente, que considerada fixa de uma determinada rea em
determinada idade, e que, se perturbada, prontamente se restabelece. E a
microbiota transitria, proveniente do meio ambiente, que pode permane-
cer no indivduo por algumas horas ou at mesmo semanas. Geralmente, se
a microbiota residente se mantm intacta, a microbiota transitria no apre-
senta maiores problemas, principalmente porque ela no se mantm de
forma permanente. Porm, se houver algum distrbio com a primeira, os
microrganismos transitrios podero colonizar o local e, posteriormente,
caso sejam patognicos ou oportunistas, virem a produzir doenas.
A existncia de microrganismos residentes em determinado local do
corpo vai depender de diversos fatores ambientais, como temperatura,
umidade, pH, secrees, presena de lisozima, oxignio, etc.
Existem ainda os locais de nosso corpo desprovidos de microbiota,
como o crebro, a medula espinhal, os rins e os pulmes, onde qualquer
microrganismo detectado deve ser considerado com cuidado.
Bacteriologia | 313
14.1. Cavidade oral

A composio da microbiota oral se altera com a idade, hbitos
alimentares, hormnios, fluxo salivar, condies imunolgicas e outros fato-
res, como higienizao e ingesto de lcool. Todavia, de um modo geral, a
alta umidade, o pH prximo da neutralidade, a temperatura constante
(entre 34 e 36C) e a disponibilidade de nutrientes da boca possibilitam
o estabelecimento de uma microbiota bacteriana bastante complexa que
habita as diversas reas da cavidade oral. Entre as bactrias mais comuns,
podemos identificar os Lactobacillus spp., os Streptococcus spp., os
anaerbios e as espiroquetas . Muitas dessas bactrias podem estar associ-
adas formao de cries e ocorrncia de doenas periodontais.
14.2. Nasofaringe
A faringe aprisiona a maioria das bactrias que so inaladas. Mui-
tas bactrias orais tambm podem ser encontradas neste local. O trato
respiratrio superior a porta de entrada para a colonizao inicial por
muitos patgenos. Na nasofaringe podemos encontrar portadores sadios
de vrios gneros bacterianos de importncia mdica, com Staphylococcus
e Neisseria . J o trato respiratrio inferior (brnquios e alvolos)
normalmente estril, porque partculas do tamanho de bactrias no con-
seguem atingi-lo prontamente.
14.3. Esfago
Quando est anatomicamente normal e sadio, o esfago um rgo
praticamente estril e, se presentes, as bactrias da saliva e alimentos so
apenas transitrias. Apesar disso, condies patolgicas podem alterar a ana-
tomia do esfago e predispor o rgo ao estabelecimento de uma microbiota
residente constituda de microrganismos potencialmente patognicos.
14.4. Trato gastrointestinal

Devido s rigorosas condies ambientais, no estmago, os microrga-
nismos so comumente transitrios e sua densidade populacional mantida
baixa. A quantidade de bactrias imediatamente aps as refeies estima-
da em aproximadamente 103 a 106 bactrias por grama do contedo esto-
macal, sendo aps a digesto praticamente indetectvel. Todavia, quando
consideramos as pores posteriores desse trato, sabemos da existncia de
grande quantidade e variabilidade de espcies bacterianas habitando esses
ambientes. A quantidade e o nmero de espcies presentes em dado seg-
mento do trato gastrointestinal so afetados pelo pH e pelo tempo de
reteno de seu contedo.
Como j foi dito, o baixo pH do contedo estomacal e o fluxo rpido
de contedo do intestino delgado tende a inibir o crescimento de muitas
bactrias. Por outro lado, o pH relativamente neutro e a prolongada manuten-
o do contedo ingerido no intestino grosso permitem o desenvolvimento da
grande diversidade microbiana comentada anteriormente.
As bactrias residentes do trato gastrintestinal contribuem para a dieta
fermentando carboidratos indigerveis, como a celulose em cidos graxos, que
so fontes de energia para as clulas do epitlio intestinal e facilitam a absoro
de sdio e gua, alm de sintetizarem protenas e vitaminas K e B.
14.5. Vagina
A microbiota vaginal varia de acordo com o indivduo, a idade, o pH
local e os nveis hormonais. As maiores alteraes acontecem quando ocorre
uma infeco bacteriana vaginal. As bactrias que colonizam a vagina formam
um grupo multi-especfico e complexo de Gram-positivos e Gram-negativos,
com predominncia de anaerbios.
Prevalecem, no primeiro ms de vida, as bactrias do gnero Lactobacillus,
mantendo o pH vaginal cido em torno de 5. A partir deste estgio at o
Bacteriologia | 315
incio da puberdade, a acidez vaginal diminui elevando o pH para 7, onde

predominam S. epidermidis, Streptococcus spp. e Escherichia coli. Entre a
puberdade e a menopausa, devido ao do hormnio estrognio, ocorre
produo de glicognio e a microbiota passa a ser predominantemente de
membros dos gneros Lactobacillus, Corinebacterium , Staphylococcus,
Streptococcus e Bacteroides. Devido prevalncia da espcie Lactobacillus
acidophilus, o pH do trato vaginal decresce novamente e se estabelece em
torno de 5. Aps a menopausa, com a diminuio da produo de estrognio,
a secreo de glicognio diminui e o pH vaginal se eleva novamente para
chegar em torno de 7, neste perodo a composio da microbiota volta a ser
aquela caracterstica da pr-puberdade.
14.6. Pele
Vrios nichos ecolgicos diferentes esto disponveis na superfcie da
nossa pele j que possumos regies mais secas e mais midas, apresentando
menores ou maiores quantidades da microbiota. Nas regies mais secas predo-
minam Staphylococcus epidermidis e Propionibacterium acnes. Nas reas mais
midas, como virilhas, axilas, espaos interdigitais, genitlia e perneo, predo-
minam Staphylococcus aureus e Corynebacterium sp. Nesses locais, as condi-
es ambientais, como umidade, maior temperatura e abundncia de lipdios
cutneos, favorecem o crescimento bacteriano. De modo geral, ocorre a pre-
dominncia das bactrias Gram-positivas na superfcie corporal, j que estas
possuem um alto grau de especificidade na adeso s superfcies epiteliais e
nem todas as bactrias possuem esta habilidade.
14.7. Conjuntiva
A regio da conjuntiva, apesar da sua constante exposio ao ambiente
externo e, consecutivamente, contaminao microbiana, apresenta mecanis-
mos de proteo bastante eficazes. A ao de remoo da sujeira e dos
microrganismos que entram em contato com a conjuntiva pelas lgrimas

atravs dos movimentos das plpebras um deles. A lgrima, alm de ser
um meio de cultura pobre, possui em sua composio imunoglobulinas
(IgG), que inativam vrios microrganismos; alm disso, possui lactoferrina,
que atua sequestrando o ferro (essencial para o metabolismo bacteriano).
A lgrima possui tambm lisozima, que uma enzima que dificulta a forma-
o de paredes celulares bacterianas. Como j explicamos, quando ocorre
o desequilbrio entre a microbiota residente e a transitria, pode haver o
desenvolvimento de doenas. No caso da conjuntiva, o uso indiscriminado
de colrios contendo agentes antimicrobianos ou corticoides pode levar a
esse problema.
15. Seleo, coleta, transporte e processamento de

lquidos biolgicos
A coleta para o laboratrio de anlises clnicas no s o ponto
de partida do trabalho do bacteriologista, como tambm o mais impor-
tante. Se no fizermos uma coleta correta, todo restante do trabalho ter
sido em vo. Portanto, necessrio que observemos alguns parmetros
bsicos, que devem ser seguidos, sempre que possvel, na obteno de
fludos biolgicos para anlise.
15.1. Parmetros bsicos para uma coleta correta

Coletar as amostras direto do stio de infeco
A amostra dever ser colhida do local real da infeco, tendo o
cuidado de no contamin-la nos stios adjacentes, a assepsia neste caso
muito importante (existem algumas excees a esta regra quando a coleta
se torna prejudicial ao paciente, como no caso de sinusite seios da face
e nos casos de suspeita de Difteria, que comentaremos posteriormente).
Bacteriologia | 317
Coletar no momento ideal

Para seguir esse parmetro, importante conhecer a fisiopatologia da
doena, considerando quando e onde, de acordo com a rota esperada de
aquisio e disseminao do microrganismo, devemos coletar o material para
conseguirmos realizar o diagnstico com maior facilidade. Um exemplo clssico
a coleta de material suspeito de Leptospirose, que dever ser feita por coleta de
sangue no incio da doena (pesquisa pela PCR e pela hemocultura), e aps a
primeira semana a pesquisa, passa para o soro onde detectaremos anticorpos.
Obter quantidades suficientes
O volume de material colhido dever ser suficiente para realizarmos
todas as tcnicas necessrias ao cultivo. Aproveitando este tpico, importan-
te comentar que, em alguns casos, o excesso de material tambm pode preju-
dicar o exame.
Utilizar dispositivos adequados
Devem ser utilizados recipientes estreis, que permitam uma colheita
fcil, e adequados a suspeita indicada. Como um bom exemplo, o uso de
swabs com hastes bem finas e de material atxico indicado para coletas de
uretrite, no sendo necessrios para coleta comum de orofaringe (custo X
benefcio). Outro excelente exemplo no caso de suspeita de microrganismos
anaerbios, em que devemos utilizar dispositivos de coleta direcionados
preservao destes agentes.
Obter amostras antes da administrao de antimicrobianos (se pos-
svel)
O antibitico poder, em alguns casos, dificultar ou inviabilizar o
isolamento do microrganismo. claro que tambm no se pode descartar
qualquer amostra, principalmente aquelas de difcil coleta, como, por exem-
plo, o lquido cefalorraquidiano. Nestes casos, o profissional deve usar
sempre o bom-senso.
Rotular (especificar suspeita)

Alm da rotulagem normal, em que devero constar o nome do paci-
ente, data e forma da coleta, a especificao da suspeita extremamente
importante, principalmente quando houver a possibilidade de isolamento de
um microrganismo com exigncias especiais (ex.: anaerbio). Devemos lembrar
que, em boa parte das vezes, o pessoal do laboratrio no tem contato com o
paciente, mas somente com a amostra. Se no houver indicao da suspeita,
fica muito mais difcil realizar o diagnstico.
15.2. Stios anatmicos

De um modo geral, devemos sempre nos preocupar, em primeiro lugar,
com o uso de equipamentos de proteo individual (EPIs) adequados a estas
atividades, como luvas, mscaras e material estril. O jaleco, ou guarda-p,
somente deve ser utilizado no ambiente de trabalho, no devendo ser portado
fora deste local para evitar contaminao cruzada (ver captulo 1 do volume 1
desta coleo).
15.2.1. Trato respiratrio superior
A microbiota da boca, garganta e nasofaringe bem numerosa. Na

maioria dos casos, os swabs de orofaringe so realizados para isolar estreptococos
b-hemolticos do grupo A que causam faringite.
Nestes casos, deve-se dirigir um foco de luz brilhante para a cavidade
oral aberta e tentar visualizar o foco de infeco, instruir o paciente para que
respire profundamente, e abaixe a lngua suavemente com um abaixador. Nes-
te momento, tocar com o swab delicadamente no local visualizado. Nos casos
em que no houver nenhum indcio visual, desliza-se o swab entre os pilares
tonsilares e atrs da vula. Aps a coleta, o swab deve ser colocado em um
tubo estril adequado ao seu transporte para o laboratrio.
Bacteriologia | 319
Quando a infeco de orofaringe possui suspeita clnica de Difteria,

alguns cuidados na coleta devem ser destacados, pois nestes casos no se
deve coletar direto do stio de infeco (pseudomembrana), j que a
toxina poder difundir-se no organismo do paciente agravando muito seu
quadro (ver item 16 deste captulo).
Existem ainda procedimentos um pouco diferenciados para colhei-
ta de material do trato respiratrio superior, como no caso de suspeita
de portadores de alguns microrganismos, como Neisseria meningitidis
(Meningite) e Staphylococcus aureus (MARSA entre outros), onde o
material coletado da nasofaringe.
15.2.2. Trato respiratrio inferior
Escarro e coleta direta das vias respiratrias inferiores:

A coleta do escarro deve ser feita preferencialmente pela manh, quan-
do o paciente se levanta, e em jejum. De um modo geral, h muita dificuldade
na coleta deste material, pois a contaminao das amostras pelos prprios
microrganismos pertencentes microbiota muito comum.
Os gargarejos com gua, imediatamente antes da coleta, ajudam a dimi-
nuir esta contaminao, todavia, no se recomenda o uso de antisspticos
bucais ou dentifrcios antes deste procedimento.
Em casos onde a produo de escarro insuficiente ou o paciente no
tem condio de prover este material, lana-se mo de outras tcnicas, como,
por exemplo, a nebulizao, a aspirao translaringeana ou mesmo a broncoscopia
fibrtica (tcnica da escova bronquial).
15.2.3. Trato urinrio
Para uma coleta correta nas mulheres, deve-se lavar a rea periuretral e o
perneo com gua e sabo e enxaguar completamente (de preferncia com gua
ou salina estreis). Enxugar bem a regio. Os lbios devem ser separados e o

primeiro jato da urina desprezado. Colhe-se ento o jato mdio da mico em
recipiente estril. Este deve ser mantido no gelo at a entrega no laboratrio.
Em certas ocasies necessria a obteno de uma amostra de
urina para cultura de outras formas. Para exemplificar estes casos, temos a
coleta por aspirao suprapbica e as amostras obtidas atravs de
cateterismo (ver item 18.2 deste captulo).
15.2.4. Trato genital

As culturas de amostras vaginais podem muitas vezes no apresentar
resultados significativos. Em caso de vaginite supurativa, deve-se montar lmi-
nas a fresco logo aps a coleta e examinar. Geralmente no so boas amostras
para deteco de agentes bacterianos, mas podem servir para visualizao de
protozorios ou fungos (Trichomonas vaginalis ou Candida albicans).
Nos casos suspeitos de endometrite, o mdico ginecologista deve ob-
ter amostras visualizando o local diretamente, atravs de um espculo vaginal e
introduzindo a ponta de um swab para cultura, atravs de um cateter de luz
estreita colocado na abertura cervical (reduo da contaminao).
15.2.5. Sangue
A maior chance de deteco de positividade para hemocultura ocorre

quando o exame realizado no momento da bacteremia (presena da bactria
no sangue). Nos casos de septicemia, esse cuidado menos importante, pois
os microrganismos esto disseminados e se reproduzindo. Existe uma latncia
de aproximadamente uma hora entre a ocorrncia do pico febril e da bacteremia
(os microrganismos e seus produtos txicos atuam como pirognio exgeno e
nossa resposta imune produz pirognio endgeno. Estas substncias, associa-
das a vrios processos fisiolgicos, iro estimular a produo de febre cerca de
60 a 90 minutos aps o desencadeamento do processo). Quando ocorre a
Bacteriologia | 321
febre, nosso organismo j est se defendendo, da a coleta ideal ser aquela

anterior a este momento.
As hemoculturas podem ser obtidas utilizando-se agulha e seringa
ou mtodos de vcuo, como o sistema fechado. O local da puno deve
ser descontaminado de forma adequada. A execuo de pelo menos trs
hemoculturas em um perodo de 24 horas satisfatria, devendo ser
obtidas de diferentes locais de puno com no mnimo 1 hora de diferen-
a, colhendo sempre dois frascos, um aerbio e outro anaerbio, com o
volume de 10 mL de sangue em adultos e 1 a 5 mL em crianas. Este
sangue deve ser adicionado de caldo na proporo de 1:10 ou 1:5,
dependendo da tcnica.
15.2.6. Lquido cefalorraquidiano (lquor)

Obtido por um mdico neurologista, por puno lombar, aps desin-
feco conveniente da pele e anestesia local. colhido um volume total
mximo de 10 mL (adultos) dividido em 3 tubos, o primeiro para Bioqumica,
o segundo para bacteriologia e o terceiro hematologia. O tubo enviado para
bacteriologia dever ser mantido temperatura ambiente ou na estufa, pois a
refrigerao fatal para os microrganismos que mais comumente causam Me-
ningite (Neisseria meningitidis e Haemophilus influenzae).
15.2.7. Leses cutneas
As superfcies das feridas geralmente no refletem a verdadeira causa do

processo infeccioso, j que, frequentemente, esto colonizadas por bactrias
do ambiente. Por esta razo, o mtodo mais aconselhvel a aspirao do
material purulento localizado nas profundidades da ferida com agulha e seringa
estreis. As margens da leso devem ser, sempre que possvel, descontaminadas
com lcool 70%. Se houver atraso no procedimento, o material deve ser
transferido para recipiente anaerbio. No caso da impossibilidade de obten-
o do material pela tcnica descrita, pode-se utilizar um swab de forma

profunda, tendo o cuidado de separar as bordas da ferida (luvas), e transport-
lo em reagente anaerbio.
15.2.8. Olhos e ouvidos
O material supurativo ocular deve ser colhido do fundo do saco

inferior ou do canto interno, realizando sempre colorao de Gram para
determinar a presena e o tipo da bactria, antes da cultura.
As culturas de material do canal auditivo externo dificilmente refle-
tem a causa de uma otite mdia, a no ser que tenha havido rompimento
da membrana timpnica. Nos casos agudos, o microrganismo causador
pode ser cultivado a partir de material da nasofaringe posterior.
A puno do material proveniente dos seios frontais no comum.
Geralmente, o tratamento emprico. O material, se extremamente neces-
srio, colhido por aspirao do ps, e as culturas realizadas, buscando
bactrias aerbias e anaerbias. Nos casos de sinusite crnica podem
ocorrer infeces polimicrobianas, incluindo espcies anaerbias.
15.2.9. Trato gastrointestinal
A confirmao laboratorial de uma infeco intestinal efetua-se, usu-

almente, pela deteco de ovos e parasitas, por montagens de material
fecal com soluo salina ou iodada, ou isolando-se bactrias de amostras
de fezes.
O material deve ser colhido em recipientes estreis de boca larga e
com tampa hermtica, ou mesmo swabs retais e processadas o mais rpido
possvel. Se for previsto atraso no transporte, o material deve ser colocado
em conservante ou geladeira, dependendo do caso.
Bacteriologia | 323
15.3. Transporte da amostra

O objetivo primrio do transporte manter a amostra o mais prximo
possvel do estado natural e com mnima deteriorao, evitando condies
ambientais adversas de temperatura, presso ou ressecamento.
So recomendados meios mnimos, tais como o meio de Stuart, Amies
e Cary-Blair, que preservam as bactrias sem multiplicao dos microrganismos
durante o transporte.
O tioglicolato de sdio adicionado como agente redutor para melhor
isolamento de anaerbios, e o gar fornece consistncia, evitando a oxigenao
e o extravasamento.
Para o envio de materiais biolgicos pelo correio, existe uma srie de
normas recomendadas pelo Departamento de Aviao Civil, pela Empresa
Brasileira de Correios e Telgrafos, pela Diviso de Sade dos Portos e demais
rgos competentes, que devem ser seguidas. Recomendaes que vo desde
o uso de recipiente prova de choque e s alteraes de presso, at a
correta rotulagem desta embalagem em que devero constar o nvel de risco do
microrganismo, o smbolo do risco biolgico, advertncia ao transportador e
recomendaes quanto manuteno (ex.: temperatura).
15.4. Processamento da amostra

Cada amostra recebida pelo laboratrio de Microbiologia deve ser
analisada, micro e macroscopicamente, para avaliar se est adequada ao
processamento. Se houver evidncia de coleta ou transporte inadequados,
quantidade insuficiente, recipiente imprprio ou atraso na remessa, deve ser
colhida uma segunda amostra.
Existem critrios de excluso para as amostras biolgicas. claro, po-
rm, que determinados materiais de difcil coleta, como o lquor, no podem
ser excludos com os mesmos critrios que um de fcil coleta. Para tal,
necessrio que o profissional encarregado de receber os espcimens biolgicos

seja devidamente treinado para agir nestas situaes, inclusive dando todas as
informaes necessrias do porqu de o material estar sendo rejeitado e explican-
do como a segunda amostra deve ser colhida e transportada adequadamente.
16. Noes sobre as principais bactrias de

importncia clnica
Neste tpico, abordaremos sucintamente os principais grupos bacterianos,
importantes para o homem e os animais. Separamos os grupos de acordo com
a morfologia e a colorao (baseada na estrutura da parede celular).
Apesar de muitas vezes vocs encontrarem os nomes dos grupos
bacterianos escritos de forma cotidiana (ex.: estafilococos), prestem ateno
nos nomes dos gneros e espcies que devero sempre estar escritos em itlico
(ou ento sublinhados).
16.1. Cocos Gram-positivos
Staphylococcus
So esfricos, imveis, possuem aproximadamente 1m de dimetro e
so encontrados predominantemente sob a forma de cachos irregulares. Al-
guns representantes destes microrganismos compem a flora normal da pele e
das mucosas do homem, enquanto outros so responsveis por vrios tipos de
infeces, podendo levar a septicemias fatais.
O gnero Staphylococcus pertence famlia Staphylococcaceae e pos-
sui, atualmente, mais de 30 espcies, sendo que trs delas aparecem com
frequncia como agentes importantes em bacteriologia mdica (S.aureus,
S.epidermidis e S.saprophyticus). Alguns exemplares destas bactrias podem
desenvolver resistncia a antimicrobianos, sendo responsveis por grande par-
Bacteriologia | 325
cela de multirresistncia em infeces hospitalares e criando problemas

teraputicos de difcil soluo.
Os estafilococos podem ser cultivados em grande parte dos meios de
cultura, em condies de aerobiose. A temperatura ideal para o seu cresci-
mento de 37oC. As colnias em meio slido so esfricas e brilhantes,
podendo haver formao de vrias tonalidades de pigmentos.
O Staphylococcus aureus, a espcie considerada como mais patognica
do gnero, geralmente hemoltica, podendo produzir um pigmento amarelo.
Caracteriza-se pela produo da enzima coagulase e fermentao do manitol.
Por produzir vrias enzimas e toxinas extracelulares causa de vrias doenas,
desde intoxicaes de fundo alimentar a sndromes gravssimas, como a do
choque txico.
A caracterstica da leso causada por esta bactria o aparecimento de
abcessos localizados e de supuraes focais. A partir do foco, o microrganis-
mo pode se disseminar por via linftica e sangunea para outras partes do
corpo. Doenas como osteomielite, pneumonia, meningite e endocardite, po-
dem ter associao com este microrganismo (mais informaes no item 22.1.1).
Streptococcus
Os microrganismos pertencentes a este gnero esto dentro dos inte-
grantes da famlia Streptococcaceae. So esfricos, com aproximadamente 1 a
2m de dimetro, agrupando-se geralmente em cadeias, sendo o comprimento
da cadeia varivel em funo das condies ambientais. Crescem bem em
meios slidos, principalmente contendo sangue ou extratos de tecidos. A
temperatura ideal da sua incubao de 37oC, formando colnias esfricas de
1 a 2 mm de dimetro.
So considerados anaerbios tolerantes ao oxignio, pois apesar de
crescerem em ambiente aerbio, s processam fermentao e nunca respirao.
So ainda responsveis por vrias doenas humanas, desde crie dentria,

at febre puerperal, erisipela, escarlatina e mesmo septicemias.
um grupo muito diversificado de bactrias. Sua capacidade de pro-
duzir hemlise em diferentes escalas constitui um dado importante na sua
classificao laboratorial.
b-hemolticos Formao de hemlise total em torno da colnia

(lise dos eritrcitos de carneiro a 5%). Considerados os principais
patgenos do gnero, so responsveis por vrias doenas (faringites,
infeces dos tecidos moles e srias complicaes). Estas cepas so
ainda subclassificadas em grupos, de acordo com diferentes
polissacardeos de parede celular (A a V). Sendo as do grupo A,
as mais importantes na clnica humana ( Streptococcus pyogenes),
envolvidas em diferentes enfermidades; seguidas das do gupo B
(S.agalactiae), envolvidas, principalmente, em meningites, septicemi-
as neonatais e infeces ps-parto (ver diferenciao no tpico 20 e
pelo hipurato no apndice).
a-hemolticos Hemlise parcial em torno da colnia (a hemoglobina

dos eritrcitos adquire colorao esverdeada).
Podem causar, entre outros problemas, pneumonia, meningite
(Streptococcus pneumoniae) e endocardite subaguda (grupo viridans).
g-hemolticos ou anemolticos No formam hemlise.

Mais informaoes sobre este gnero podero ser estudadas no item 22.2.2.
Enterococcus
Anteriormente descrito dentro do gnero Streptococcus (grupo D de
Lancefield), este microrganismo elevou-se a categoria de novo gnero
Enterococcus e hoje faz parte da famlia Enterococcaceae. Conforme indica sua
Bacteriologia | 327
denominao, estes organismos fazem parte da microbiota entrica e muitas

vezes do trato genitourinrio, podendo ser encontrados como causadores de
problemas nas vias urinrias (principalmente em pacientes com anomalias ou
manipulados), ou mesmo em feridas e bacteremias, principalmente em
imunodeprimidos.
Podem apresentar diferentes tipos de hemlise ( a, b e g) e so
considerados microrganismos extremamente resistentes, podendo crescer em
condies de alta salinidade (pH 9,6) e temperaturas de 10 a 45C, bem
como em detergentes e bile. Possuem uma resistncia intrnseca aos
antimicrobianos, sendo, diferentemente dos estreptococos, somente inibi-
dos pela penicilina e no mortos por ela. So resistentes as cefalosporinas e
alguns tambm a aminoglicosdeos, quando administrados em monoterapia.
Na dcada de 1980, comearam a aparecer algumas cepas com resistncia a
vancomicina o que causa at hoje grande preocupao em hospitais, pois,
apesar de ser considerado um patgeno de baixa virulncia, ele possui a
capacidade de transferir sua resistncia atravs de plasmdeos para outros
gneros bacterianos, como, por exemplo, o S. aureus.
16.2. Cocos Gram-negativos
Neisseria
Gnero pertencente famlia Neisseriaceae. Apesar de compreender
vrias espcies, que podem ser diferenciadas por meio de provas bioqumicas,
enfatizamos duas espcies patognicas para o homem: a Neisseria meningitidis,
conhecida tambm como meningococo (meningite) e a Neisseria gonorrhoeae,
conhecida como gonococo (Gonorreia). Ambas se apresentam como diplococos
Gram-negativos, com morfologia semelhante a rins (riniformes) ou a gros de
feijo. Alguns autores sugerem, ainda, semelhana a gros de caf. Medem
aproximadamente 0,8m de dimetro e so imveis. As colnias apresentam-se

convexas, brilhantes e mucoides, com 0,5 a 1 mm de dimetro.
Substncias como sangue e protenas animais estimulam seu crescimento,
sendo que uma atmosfera com 10% de CO2 ideal para seu total desenvol-
vimento. Ambas as espcies possuem resistncia natural vancomicina e
polimixina, o que facilita a seleo de contaminantes quando adicionados ao
meio de cultura para seu isolamento (meio de Thayer-Martin).
O Meningococo, responsvel pela meningite, pode ser dividido em
10 grupos sorolgicos, sendo a maioria das infeces causadas pelos grupos
A, B, C, Y e W/35. Ele inicia sua colonizao, geralmente, pela nasofaringe
(onde pode ser encontrando em elevado percentual de indivduos normais) de
onde pode ganhar a circulao e migrar para as meninges ou at causar outras
infeces.
O Gonococo, responsvel pela gonorreia, doena sexualmente
transmissvel, tem na uretrite sua principal forma clnica no homem. Na mulher,
apresenta principalmente cervicite, mas, eventualmente, pode causar em ambos
protite, faringite gonocccica e conjuntivite neonatal. Ocasionalmente, pode
invadir a circulao, causando artrites, endocardites, meningites e leses cutneas.
16.3. Bastonetes Gram-positivos
Clostridium
O Gnero pertence Famlia Clostridiaceae. So anaerbios formado-
res de esporos resistentes, tendo como habitat natural o trato intestinal de
animais e do homem.
De maneira geral so bastonetes mveis, Gram-positivos, grandes e
longos, com comprimento variando entre 3 a 8m. Os esporos so geralmente
mais largos e de difcil colorao.
Bacteriologia | 329
Clostridium botulinum
Responsvel pelo botulismo, doena que, na maioria das ve-

zes, causada pela ingesto de alimentos contaminados com
toxina botulnica (termolbil), que causa paralisia flcida. O
tratamento consiste em aplicao de soro antitoxina, e o diag-
nstico se baseia na demonstrao da toxina.
Clostridium tetani
Responsvel pelo ttano, doena cuja causa a infeco de

ferimento por esporos deste microrganismo, provenientes de
solo ou poeira.
Trata-se de uma bactria que produz potente toxina neurotrpica

chamada tetanospamina, que causa paralisia esptica (trismo) e
pode levar morte. O tratamento consiste, principalmente,
em aplicao de soro antitoxina, remoo cirrgica do tecido
necrosado e administrao de antibiticos.
No diagnstico, a bacterioscopia com visualizao da forma-

o de esporos terminais facilita sua identificao (forma de
raquete). O agente causador pode tambm ser isolado em
culturas anaerbias a partir da ferida, porm, o tratamento no
deve esperar esta confirmao.
Clostridium perfringens
Tambm formador de toxina, este microrganismo, que se apre-

senta isolado ou aos pares, pode produzir vrias toxinas, cau-
sando quadros clnicos diversos. Entre eles, intoxicao ali-
mentar, gangrena gasosa (mionecrose), infeces intra-abdo-
minais, cutneas e subcutneas.
Na gangrena gasosa, o microrganismo introduzido sob forma

de esporos em uma ferida. A infeco se alastra em 1 a 3
dias, com desprendimento de gases nos tecidos que circun-
dam o ferimento.
O diagnstico e o tratamento procedem da mesma forma que

no caso anterior.
Clostridium difficile
Podendo ser encontrado como habitante normal do intestino humano,
este microrganismo agente de doena entrica, associada a antibitico. Com
quadros que variam de diarreia autolimitante a colite pseudomembranosa, capaz
de produzir trs fatores principais de virulncia. Uma enterotoxina, uma citotoxina
e uma substncia inibidora da motilidade intestinal. O diagnstico feito por
coloscopia e tambm por isolamento e demonstrao de toxina nas fezes. O
tratamento se baseia em antimicrobianos, com chance de recidivas de 30%.
Bacillus
O gnero Bacillus a espcie tipo da famlia Bacillaceae, compreende

espcies facultativas e formadoras de esporos. Sua maioria saprfita, sendo
apenas duas espcies consideradas importantes clinicamente para o homem.
Bacillus anthracis
Causador do antraz ou carbnculo (doena primria do gado), a
contaminao se processa via contato com animal doente. A infeco adqui-
rida via introduo de esporos atravs da pele ou mucosas lesadas e raramente
inalao, causando, na fase vegetativa, edemas, congesto de tecidos, e se
disseminando pelas vias linfticas.
No homem, a forma mais comum a pstula maligna, uma mcula
inflamada com vescula no centro, circundada por um edema. A evoluo
Bacteriologia | 331
lenta e possui letalidade de 20% em casos no tratados. A forma pulmonar

bastante rara e mais grave, com elevada taxa de mortalidade pela dificulda-
de do diagnstico. A inalao de esporos que inicia com quadro gripal,
evolui rapidamente para a disseminao, levando ao sistmica da toxina,
choque e morte.
O diagnstico feito por esfregaos das leses corados pelo Gram
que revelam estes bacilos, se forem feitos quando a leso ainda recente.
Quando no forem evidenciados, recorre-se ao cultivo deste material. No
caso, disseminado, pode-se proceder cultura de sangue ou testes de ELISA.
Bacillus cereus
Este organismo pode estar associado de forma eventual a diferentes
patogenias, como infeces cutneas, bacteremia e septicemia, entre outras.
Porm, a sua importncia clnica, mais frequente relatada em casos de intoxi-
cao alimentar. Por serem capazes de resistir coco dos alimentos e em
condies de m conservao, os esporos desta espcie podem germinar e
produzir enterotoxinas.
Existem duas sndromes distintas. Uma ocorre geralmente aps a
ingesto de carnes, vegetais, massas, bolos e leite, com perodo de incubao
de 8 a 16 horas; e apresenta dores abdominais e diarreia (toxina produzida
pela multiplicao bacteriana). A outra ocorre com perodo de incubao
curto (@5hs), ocorrendo nusea e vmito aps ingesto de arroz, massas, leite
e derivados (toxina termoestvel pr-formada).
Seu isolamento feito em alimentos e fezes, com base em estudos
quantitativos (105UFC/Mg).
Corynebacterium
Este grupo, de bastonetes Gram-positivos, pertence famlia

Corynebacteriaceae e mede de 0,5 a 1m de dimetro, tendendo a se apre-
sentar em paliada ou letras chinesas, e em forma de clava, devido a grnulos

metacromticos em seu interior. O gnero compreende um nmero relativa-
mente grande de espcies, entre elas, muitos membros da microbiota huma-
na. Algumas espcies podem ter correlao clnica para os seres humanos,
principalmente como oportunistas. Todavia, somente uma espcie possui
grande patogenicidade para o homem, o Corynebacterium diphtheriae, cau-
sador da Difteria.
Corynebacterium diphtheriae
Tambm conhecido como bacilo de Klebs-Loeffler, esta bactria
se localiza nas amdalas, garganta e nariz, causando reao inflamatria
local, e podendo formar falsas-membranas (bactrias, clulas epiteliais,
leuccitos e fibrina) e se estender traqueia e brnquios. Este microrga-
nismo elabora potente exotoxina, codificada por um fago lisognico. Esta
exotoxina circulando no organismo pode lesar clulas do msculo cardaco,
sistema nervoso e renal.
O diagnstico final, aps testes de colorao, cultivo e provas bio-
qumicas, est na comprovao da atividade toxignica (teste de ELEK).
Mycobacterium
Apesar de sua composio de parede, sugerir que este gnero seja
estudado entre as bactrias Gram-positivas, estes bastonetes finos, variando
entre 0,3 a 0,6m por 0,5 a 4,0m, no se coram com facilidade por mtodos
comuns, possuindo a caracterstica de ser lcool-cido resistentes (BAAR),
devido a presena de cido miclico e outros lipdeos complexos em sua
parede (Figura 4). Alm disso, no formam esporos e so aerbios. O
gnero Mycobacterium pertence famlia Mycobacteriaceae e contm grande
nmero de espcies, porm a maioria s apresenta importncia clnica como
oportunistas de imunocomprometidos. Duas espcies, em especial, so res-
ponsveis por duas doenas importantes, a Hansenase e a Tuberculose.
Bacteriologia | 333
Mycobacterium tuberculosis
Causadora da tuberculose, doena infecciosa, crnica de longa dura-
o, causa de mortalidade em muitos pases, que pode ser pulmonar, renal,
ssea, cutnea, menngea ou genital. Esta bactria, tambm conhecida como
bacilo de Koch, se apresenta de formas retas e delgadas, dispostas isolada-
mente ou em pequenos grupos.
O ponto de partida para seu diagnstico sua deteco do escar-
ro, lquor, lavados gstricos e outros, pela colorao de Ziehl-Neelsen. A
cultura tambm pode ser feita concomitantemente, mas seu crescimento
muito lento, portanto, o tratamento deve ser processado antes mesmo do
microrganismo ser cultivado.
Mycobacterium leprae
Causador da Hansenase (ou Lepra, como antigamente era chama-
da), doena que provoca desfiguraes na pele, caracterizada por leses
crnicas, s vezes mutilantes. Este bastonete, tambm conhecido como bacilo
de Hansen, semelhante ao de Koch em sua morfologia, podendo dispor-se
em aglomerados chamado globias que caracterizam este tipo de micobactria.
O diagnstico principalmente pautado em exame clnico e provas
bacterioscpicas, a partir da coleta de material proveniente de muco nasal e
leses cutneas. Este material deve ser fixado em lminas e corado pelo mto-
do de Ziehl-Neelsen.
At o momento, esta bactria ainda no foi cultivada in vitro, sendo
utilizado o tatu e o coxim plantar do camundongo para sua proliferao.
Listeria
Gnero pertencente famlia Listeriaceae. So bastonetes curtos, de
0,5 por 0,8 a 2,5 mm, considerados por muitos autores como cocobacilos,
podem variar morfologicamente, tendendo algumas vezes para formas cocoides
ou mesmo filamentosas. No formam esporos, so catalase positivos, oxidase

negativos e fermentam a glicose produzindo cido, mas no gs. Das diferentes
espcies que constituem o gnero, atualmente, a mais importante a Listeria
monocytogenes.
Listeria monocytogenes
Por ser ubiquitria, encontrada em diferentes habitats, incluindo
microbiota normal de diferentes animais e homem, bem como fontes ambientais,
como gua e solo. Sua transmisso ao homem ocorre pelo contato direto com
o animal ou fezes infectadas, ou pelo consumo via alimentos como, por exem-
plo, verduras, queijos e leite. Pode causar infeces assintomticas em indiv-
duos sadios, que podem se tornar portadores por curtos perodos de tempo.
A ingesto de Listeria pode levar a casos de infeco alimentar, com ndice
considervel de morte em casos no tratados, podendo causar ainda quadros
de meningoencefalite, meningite e septicemia, principalmente em pacientes
com doena de base ou imunossuprimidos. No caso de mulheres grvidas, a
listeriose pode afetar a placenta e o feto, levando ao aborto. O microrganismo
cresce bem em gar sangue e outros meios gerais, mas a conservao do
material clnico a baixas temperaturas aumenta o percentual de isolamento, o
que demonstra uma possibilidade real de manuteno e crescimento, em ali-
mentos mantidos sobre refrigerao.
16.4. Bastonetes Gram-negativos
16.4.1. Entricos
Enterobacteriaceae
Esta famlia engloba vrios gneros e espcies de bastonetes
Gram-negativos, com muitas propriedades comuns. Embora possam ser en-
contrados de forma ampla na natureza, a maioria habitante do intestino de
Bacteriologia | 335
animais e do homem. Seu diagnstico pautado na coprocultura, identificao

bioqumica e sorologia de um modo geral. Sua preveno, de um modo geral,
est na manipulao e preparo correto de alimentos, bem como a ingesto de
gua fervida e filtrada.
Devido riqueza de membros desta famlia, optamos por so-
mente assinalar as principais espcies que podem estar envolvidas nas
patogenias humanas.
Escherichia coli
Habitante constante do intestino normal humano, sua presena em
gua, pode indicar contaminao fecal. A doena mais comum causada pela
E.coli est relacionada ao trato urinrio, como no caso da UPEC ( Escherichia
coli uropatognica). Sua ocorrncia maior em crianas e mulheres grvidas.
Quando a bacteriria acusar contagem superior a 100 mil UFC por mL de
urina confirmada a infeco urinria. Alm disso, tambm podem estar envol-
vidas em septicemias, meningites e outros tipos de infeco.
Alguns biossorotipos de E.coli podem tambm causar problemas de
ordem intestinal, como as ETEC (enterotoxignica), EPEC (enteropatognica),
EIEC (enteroinvasora), EHEC (entero-hemorrgica), EAggEC
(enteroagregativa) e DAEC (aderncia difusa).
Shigella
Aerbios e imveis, podendo ser encontrados no trato intestinal do
homem, no formam cpsula ou esporos. Suas colnias so transparentes,
circulares, com at 2mm aps 24 horas. Causam, a partir da ingesto de gua
ou alimentos contaminados, a chamada shigelose ou disenteria bacilar, atravs
de leses no leo e do clon, caracterizada por reao inflamatria. Devido
invaso e destruio da mucosa, o paciente pode apresentar disenteria de
incio sbito, espasmos abdominais seguidos de diarreia e febre, com sangue e
muco nas fezes.
Salmonella
No esporulados, mveis, aerbios facultativos, com cerca de 0,5 a
0,7m, por 1 a 3m. Atualmente, o Gnero Salmonella dividido em duas
espcies, S.bongori e S.enterica, mas os estudos de hibridizao molecular
demostraram que existem sete grupos evolutivos. A maioria dos sorovares que
infectam humanos so classificados no grupo I e raros no IIIa e IIIb. A Salmonella
enterica dividida em vrias subespcies e sorotipos importantes com base na
composio antignica com relao aos antgenos O (somtico), Vi (capsular)
e H (flagelar).
Baseado na nomenclatura atual, os nomes dos sorotipos de Salmonella
da subespcie enterica no so mais escritos em itlico e aparecem com a
primeira letra maiscula (ex.: Salmonella Typhi). Os sorotipos das outras
subespcies de Salmonella enterica e aqueles de Salmonella bongori so desig-
nadas apenas por sua frmula antignica.
A Salmonella Typhi causa a febre tifoide e a mais importante das
Salmonelas causadoras de febres entricas. Caracterizada por febre contnua
e grave hemorragia intestinal a febre tifoide, se no for tratada, pode ser fatal.
O diagnstico compreende o isolamento do agente nas fezes ou sangue do
paciente e tambm sorologia diante do antgeno em questo.
De um modo geral, os demais sorotipos de Salmonella causam no
adulto normal apenas uma enterocolite que geralmente de origem alimentar.
Mas, em crianas, podem invadir a corrente sangunea (ex.: Salmonella
Typhimurium), provocando infeco em outros rgos.
Yersinia
Bastonetes pequenos, considerados por muitos autores como

cocobacilos, trata-se de um gnero facultativo, que compreende vrias espcies.
Sendo as espcies pestis, enterocolitica e pseudotuberculosis as principais envol-
vidas nas infeces humanas.
Bacteriologia | 337
Yersinia pestis Agente etiolgico da peste (zoonose). Tem

como seu reservatrio, roedores silvestres e domsticos. Sua
principal via de transmisso ocorre pela picada de pulgas
infectadas (peste bubnica), mas tambm pode ser transmitida
pessoa-a-pessoa, via inalao direta de aerossis de pessoa
infectada nos pulmes (peste pneumnica), podendo ou no
ter proliferao sistmica (septicmica). um microrganismo
considerado de alta letalidade.
Yersinia enterocolitica Pode causar diferentes doenas no

homem, como conjuntivite e osteomielites, mas tem na infeco
intestinal sua sndrome mais comum e importante, caracterizada
por febre e dor abdominal. Apresenta, algumas vezes, quadro
semelhante a apendicite aguda, decorrente de intensa inflama-
o do leo terminal e gnglios mesentricos (enterocolite). Em
casos de debilitados, a bactria pode ter disseminao sistmica,
levando o paciente aps a cura da infeco intestinal a artrite e
outras complicaes.
Yersinia pseudotuberculosis Embora primariamente considera-

da um patgeno animal, tambm pode estar envolvida em infec-
o intestinal, causando diarreia e linfadenopatia com necrose,
podendo levar ao desenvolvimento de ndulos esbranquiados
no fgado, bao e pulmes. A forma septicmica, embora no
muito comum pode levar morte em at dois dias.
Outras Enterobacteriaceae
Como j foi dito anteriormente, este grupo possui diversos gneros

bacterianos, sendo muito difcil descrever todos em apenas um tpico. Entre
aqueles considerados de mdia importncia, que fazem parte da microbiota

humana, mas que eventualmente apresentam-se como oportunistas, podemos
citar os gneros: Klebsiella, Edwardsiella, Citrobacter, Enterobacter, Hafnia,
Serratia, Proteus, Morganella e Providncia.
Vibrio
O gnero Vibrio, pertence famlia Vibrionaceae, constitudo de

bacilos Gram-negativos que diferem de outros bastonetes pela sua morfologia,
lembrando uma vrgula. Crescem melhor em meios alcalinos, com comprimento
aproximado de 2 a 4m. Este gnero compreende vrias espcies, sendo a mais
importante o Vibrio cholerae, responsvel pela clera. Outra espcie bastante
importante o Vibrio parahaemolyticus, que possui papel bastante definido
nas toxinfeces alimentares.
Vibrio cholerae
Bactria causadora da clera, doena sem febre ou clicas, carac-

terizada por nuseas, vmitos e diarreia profusa, que pode levar
em pouco tempo morte por desidratao, requerendo reidratao
contnua do paciente. Esta patologia ocorre geralmente onde no
h higiene, j que proveniente da ingesto de bactrias contidas
na gua ou alimentos contaminados por fezes. Seu perodo de
incubao varia de 2 a 3 dias, e a diarreia pode levar at 7 dias.
J causou diversas pandemias e hoje se apresenta sob forma
endmica, em vrios locais da terra.
O diagnstico se baseia na coprocultura inicial em gua peptonada
alcalina (APA) e posterior isolamento em meio de cultura pr-
prio (TCBS), seguido de bioqumica e sorologia.
Bacteriologia | 339
Vibrio parahaemolyticus
Encontrado geralmente em gua e frutos do mar, pode causar

infeco intestinal quando do consumo destes alimentos sem a
coco necessria. Seu perodo de incubao varia de 8 horas a
2 dias, e a diarreia leva em mdia 3 dias. Diferentemente da
clera, na diarreia por V.parahaemolyticus o paciente pode apre-
sentar clica e febre, sendo a frequncia de eliminao muito
menor. O diagnstico feito da mesma forma que o anterior.
Aeromonas
Pertencente a famlia Aeromonadaceae, esse gnero comumente

encontrado em corpos dgua, solo, verduras, animais de sangue frio e aves,
este gnero engloba microrganismos fermentadores da glicose, anaerbios fa-
cultativos, oxidase positivos, que podem causar infeces intestinais e extra-
intestinais. Possui cinco espcies de importncia clnica: A.hydrophila, A.sobria,
A.caviae, A.veronii e A.schubertii, sendo as duas primeiras mais implicadas
em doenas humanas.
Pseudomonas
Pertencente a famlia Pseudomonadaceae, compreende vrias espcies,

com aproximadamente 25 destas com alguma implicao humana, o grupo se divide
em diferentes gneros, sendo que o gnero Pseudomonas tornou-se bastante co-
nhecido, atravs do isolamento hospitalar constante de uma de suas espcies.
Pseudomonas aeruginosa Encontrada em pelo menos 70%

dos casos de infeco por Pseudomonas, um patgeno tipica-
mente oportunista, podendo causar vrias doenas, principalmen-
te em imunodeprimidos. Sua patogenia engloba desde infeces
localizadas (processos cirrgicos ou queimados) at septicemias
severas. Atualmente, considerado um patgeno alerta em infec-

es nosocomiais, devido a sua caracterstica de manuteno em
locais midos e elevada resistncia a muitos antibiticos e anti-
spticos, sendo possvel sua transmisso nestes ambientes hospi-
talares, por desinfetantes, respiradores, cateteres, alimentos, etc.
Podendo ser isolada facilmente pela cultura, a diferenciao
feita com base em provas bioqumicas (no fermenta glicose e
oxidase positiva) e na capacidade de algumas cepas produzirem
um pigmento azul-esverdeado chamado piocianina.
Burkholderia
Anteriormente pertencente ao gnero Pseudomonas, a Burkholderia

pertence hoje a uma famlia distinta (Burkholderiaceae), tendo como espcie
mais importante a B.cepacia. um organismo oxidase e catalase positivos,
mvel, aerbio, no fermentador, multirresistente e oportunista, geralmente
associada a surtos intra-hospitalares. J foi relatada causando septicemias em
neutropnicos e desmineralizao ssea em pacientes com fibrose cstica. Ou-
tra espcie de alta morbidade e letalidade para os equdeos e que pode
acometer o homem a Burkholderia mallei, causadora do mormo, doena que
causa leses nodulares nos pulmes e outros rgos, assim como danos ulcerativos
na pele e em mucosas da cavidade nasal.
Campylobacter
Constitudo de vrias espcies, este gnero pertence famlia

Campylobacteracea e apresenta-se incapaz de proliferar em presena do ar
atmosfrico ou na ausncia de oxignio, sendo considerados microaerfilos
estritos (crescem em 5% a 6% de O 2) e muitas vezes termoflicos.
Morfologicamente, so bastonetes curvos ou em forma de S. Existe um
grande reservatrio de Campylobacter em animais, principalmente aves, o que
Bacteriologia | 341
associa as infeces por esse patgeno, na maioria das vezes, ao consumo de

alimentos contaminados. Este organismo tem a capacidade de causar diarreia
do tipo disenteriforme, com sangue e muco, febre e dores abdominais, que
pode evoluir para invaso e bacteremia, especialmente em recm-natos e debi-
litados. Entre as espcies termoflicas que acometem o homem, podemos
destacar C. jejuni, C.coli e C. lari.
O diagnstico feito pelo isolamento (microaerofilia) em meios

seletivos e identificao por base na sua morfologia e propriedades bioqumi-
cas (ver prova do hipurato no apndice).
16.4.2. No entricos
Brucella
O gnero Brucella, pertencente famlia Brucellaceae, congrega

parasitas obrigatrios do homem, imveis, no formadores de esporos, e que,
morfologicamente, se apresentam como bastonetes curtos. Estes microrganis-
mos causam a Brucelose ou febre ondulante, que pode ser adquirida, princi-
palmente, pela sua penetrao atravs de leses ou pelo trato alimentar (ingesto
de leite ou queijos contaminados).
considerada uma zoonose, por sua associao a animais como

fonte primria. As espcies mais importantes para o homem so a B. melitenseis
(caprinos), a B. suis (sunos) e a B. abortus (bovinos). So parasitas intracelulares,
podendo se multiplicar no interior de macrfagos; sua disseminao aps a
infeco linftica, podendo localizar-se nos rins, bao ou fgado.
O diagnstico pode ser sorolgico (aglutinao em lmina ou tubo)

ou bacteriolgico (hemocultura no pico febril ou materiais obtidos por bipsia,
que devem ser incubados em 10% de CO2).
Bordetella
O gnero pertence a famlia Alcaligenaceae engloba trs espci-

es, sendo a mais importante para o homem a Bordetella pertussis (agente
da coqueluche).
A coqueluche uma infeco aguda transmitida por gotculas areas,

com colonizao dos clios das clulas do trato respiratrio e liberao de
diferentes toxinas, levando inicialmente a tosse catarral, que evolui para tosse
seca e paroxstica (tosses curtas com produo intensa de muco), seguida de
sibilos. Ocorre principalmente em crianas com at 10 anos, podendo compli-
car para anoxia do SNC, exausto e pneumonias secundrias. O diagnstico
geralmente clnico, devido a caracterstica da tosse, mas a cultura pode ser
feita por placa de tosse ou material da nasofaringe.
Legionella
Pertencente a famlia Legionellaceae, esse gnero engloba espcies

aerbias, mveis e oxidase negativas. De difcil cultivo em meios rotineiros de
laboratrio, esses organismos podem ser isolados em meios seletivos incuban-
do-se a 5% de CO2 com umidade relativa elevada. Considerada uma bact-
ria ambiental, este gnero pode ser adquirido por inalao do ar e poeira ou
de gua contaminada. A espcie principal, L. Pneumophila, pode acometer o
homem com sndromes semelhantes a gripe ou mesmo pneumonias atpicas
(doena dos Legionrios), dependendo principalmente do estado imunitrio
do hospedeiro.
Helicobacter
Esse gnero, atualmente, pertence a famlia Helicobacteraceae e cons-

titui-se de bastonetes mveis, curvos ou helicoidais, com 0,3 a 1 mm de
largura por 1,5 a 5 mm de comprimento, no esporulam e, em culturas velhas,
podem se tornar cocoides.
Bacteriologia | 343
Capaz de resistir acidez estomacal, a espcie tipo H. pylori reside

na camada de muco que reveste a mucosa gstrica, pois produz urease, con-
vertendo ureia em amnia, o que aumenta o pH local. Pode causar um
enorme espectro de problemas gastroduodenais, inclusive cncer de estma-
go, porm s causa doena clnica em 5% a 10% dos indivduos infectados.
diagnosticado por exame histolgico, cultura, testes de deteco de urease e
testes sorolgicos. Sendo tratado por combinao de antimicrobianos e drogas
cido-redutoras.
Haemophilus
Gnero pertencente famlia Pasteurellaceae. Possui clulas peque-

nas a mdias, podendo apresentar pleomorfismo, exigentes no crescimento de
fatores X e/ou V (gar chocolate) e timo de temperatura de 37 oC, compre-
ende vrias espcies, sendo o Haemophilus influenzae principalmente relacio-
nada ao homem. As principais doenas causadas por esta bactria esto ligadas
ao trato respiratrio, j que esta se encontra normalmente na nasofaringe.
O H.influenzae ainda a principal causa da meningite precedida

de otite em crianas de 3 meses a 2 anos. O diagnstico feito por
esfregaos corados pelo Gram e pela cultura precedida de identificao
sorolgica do tipo capsular. Outra espcie de importncia humana o
Haemophilus ducreiy, causador da doena sexualmente transmissvel cancro
mole, caracterizada por ulceraes genitais necrticas dolorosas, acompa-
nhadas ou no de adenopatia inguinal.
16.5. Espiroquetdios
Bactrias que ocorrem isoladas e possuem morfologia espiral, graas
conformao do peptidoglicano da parede que, de um modo geral, no se
coram bem pela tcnica de Gram.
So mveis, geralmente girando em seu eixo. Em virtude da dificuldade

de observao dos espiroquetas no microscpio comum, aconselha-se o em-
prego da microscopia de campo escuro com preparao a fresco, permitindo a
observao da motilidade caracterstica e facilitando o diagnstico. Sua
visualizao ao microscpio luminoso feita pela impregnao da prata (mto-
do de Fontana Tribondeau).
Leptospira
Principal gnero da famlia Leptospiraceae possui uma diviso fenotpica
em duas espcies, Leptospira biflexa e L.interrogans, sendo a segunda esp-
cie, patognica para o homem. Atravs de estudos moleculares, podemos
decompor o gnero em vrias espcies com potencial patognico, e subdividi-
los em diferentes sorogrupos e sorovares, causadores da leptospirose, zoonose
adquirida atravs do contato com a urina de animais infectados, principalmente
ratos (portadores assintomticos). A doena pode variar muito no que diz
respeito aos sintomas, podendo ocorrer estados semelhantes aos gripais, me-
ningites, danos hepticos e renais (doena de Weill) e at problemas
hemorrgicos graves, dependendo da virulncia do sorovar envolvido e do
estado imunitrio do hospedeiro.
Seu diagnstico realizado com base na tcnica da PCR (ver captulo 2
do volume 3 desta coleo), no cultivo bacteriano e nas reaes sorolgicas
com as amostras dos pacientes suspeitos.
Treponema
Gnero pertencente famlia Spirochaetaceae . Entre as espcies
patognicas, destacamos o Treponema pallidum , causador da sfilis. Esta
doena, de aquisio por contato sexual, pode se manifestar em leses no
pnis ou locais geniturinrios mais profundos, havendo a possibilidade da
Bacteriologia | 345
transmisso horizontal e vertical, j que este microrganismo capaz de

ultrapassar a barreira placentria.
Este microrganismo no cultivvel em meio de cultura. O diagns-
tico vai depender da fase da doena. Se a sfilis primria, o agente pode
ser demonstrado na secreo da leso (cancro duro), por microscopia de
campo escuro ou imunofluorescncia. Aps este estgio, o diagnstico
sorolgico (VDRL).
Borrelia
Pertencente a mesma famlia do gnero anterior, este possui uma
espiral irregular de 10 a 30 mm de comprimento e 0,3 mm de largura,
altamente flexvel e com movimento rotatrio. Engloba duas espcies de
importncia na clnica humana, a Borrelia recurrentis e a B.burgdorferi.
A primeira o agente da febre recorrente, que tem este nome
devido a sua caracterstica recidivante. Antigamente ocorriam surtos, mas
na atualidade so registrados apenas casos espordicos, sem praticamente
nenhuma ocorrncia no Brasil. transmitida pelo piolho humano e carrapa-
tos que picam roedores e depois transmitem as bactrias para o homem. O
diagnstico pode ser feito pelo cultivo e pela demonstrao bacterioscpica
da bactria no sangue do paciente.
A segunda o agente da doena de Lyme (cidade americana onde
foi descrita). As principais manifestaes da doena so o eritrema migra-
trio e a artrite, podendo haver comprometimento neurolgico e cardaco.
Possui tambm um animal invertebrado como vetor, o carrapato, que pica
camundongos e cervdeos infectados e transmite depois os microrganismos
para o homem. O diagnstico geralmente sorolgico atravs do ELISA
(Ver captulo 1 deste volume).
16.6. Outras bactrias
Mycoplasma e Ureaplasma
Pertencentes famlia Mycoplasmataceae, estes microrganismos no apre-
sentam parede celular verdadeira, nem rigidez, porm muitas espcies contm
colesterol na membrana (no existe em outras bactrias).
Espcies mais importantes para o homem:
Mycoplasma pneumoniae Espcie causadora de pneumonia atpica.
Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum (ambos causadores

de infeces no trato genital, como uretrites no gonoccicas).
A transmisso, em geral, interpessoal, sendo o M.pneumoniae de
aquisio aergena e outros mycoplasmas e ureaplasmas por contato sexual.
Possuem clulas variveis na morfologia e tamanho (100 a 250nm),
no se corando, devido ausncia da parede, pelo mtodo de Gram.
Usa-se o corante Diene ou Romanovsky (Giemsa) para visualizao (vide
apndice), porm, o diagnstico est pautado na sorologia, pois so mi-
crorganismos exigentes, necessitando de meios complexos para seu cultivo,
o que dificulta a cultura.
Rickettsiae
So bactrias pleomrficas, parasitas intracelulares estritas, que geral-
mente so transmitidas ao homem por artrpodes (com exceo da febre
Q). O gnero Rickettsiae pertence famlia Rickettsiaeceae e geralmente
no trabalhado em laboratrio clnico comum, necessitando de maiores
requisitos de cultivo (cultura de clulas e/ou ovo embrionado) e normas
mais rgidas de biossegurana na sua manipulao. So responsveis por
doenas como o tifo, a febre maculosa e a febre Q, sendo na maioria das
vezes seu diagnstico sorolgico.
Bacteriologia | 347
Chlamydia
Pertence famlia Chamydiaceae. Este gnero se compe de seis
espcies que tambm no possuem peptdeoglicano em suas paredes.
Alm de no se corarem pelo mtodo de Gram, so parasitas intracelulares
estritos e imveis, que se reproduzem no interior do citoplasma da clula
infectada. Podem ser cultivadas em ovos embrionados e culturas de clu-
las. Muitas vezes o diagnstico feito sorologicamente ou atravs de
biologia molecular. O gnero Chlamydia , possui trs espcies de impor-
tncia humana:
C. trachomatis Espcie causadora de infeces oculares, genitais

e respiratrias.
C. pneumoniae Infeces nas vias respiratrias.
C. psittaci Psitacose, pneumonia.
17. Diagnstico laboratorial das infeces

bacterianas no trato respiratrio
Apesar de o trato respiratrio ser um sistema contnuo e muitos
agentes infecciosos poderem se instalar em toda a sua extenso, geralmente
o que percebemos que, em muitos casos, existe um local preferencial
para o microrganismo ser encontrado. Deste local, ele pode ou no se
disseminar, dependendo de diversos fatores, como sua virulncia, at ca-
ractersticas de resposta do prprio hospedeiro.
Para facilitar nosso estudo, consideraremos o trato respiratrio supe-
rior e inferior em separado, lembrando que o trato superior (orofaringe,
fossas nasais, nasofaringe, laringe e traqueia) possui microbiota autctone,
que eventualmente pode agir como oportunista ou mesmo causar alguma
confuso no momento do diagnstico.
Outro fato importante para lembrar que algumas infeces respiratrias

(principalmente virais), podem se iniciar neste sistema e posteriormente se
disseminar pelo corpo, como no caso da caxumba, rubola e sarampo.
Como dificilmente em laboratrio clnico diagnosticamos viroses, vamos
dar maior nfase s infeces bacterianas encontradas neste trato.
17.1. Trato Respiratrio Superior (TRS)
17.1.1. Faringite e tonsilite

Na maior parte das vezes no h necessi-
dade de se fazer diagnstico laboratorial destas Figura 37. Tonsilite
doenas, j que 70% delas so de origem viral, bacteriana
e mesmo as de origem bacteriana (Figura 37)
tendem a no apresentar gravidade suficiente para
que se recorra ao exame. Porm, em alguns
poucos casos em que isso necessrio, o pro-
blema maior, no est na doena primria, e sim
nas possveis complicaes que podem ocorrer
aps esta infeco.
As bactrias associadas a essas doenas so:
Streptococcus pyogenes (b-hemoltico do grupo A) - Bastante

comum nestes casos (10% a 20% dos casos de faringite aguda),
seu diagnstico necessrio devido s complicaes que podem
ocorrer como febre reumtica, escarlatina, glomerulonefrite, otite
e sinusite. Manifesta-se repentinamente, principalmente em crian-
as (veja tpico 20).
Corynebacterium diphtheriae - J citada no tpico 14.3, esta

bactria causa uma faringite branda, mas, se for produtora de toxina
Bacteriologia | 349
diftrica, poder causar uma doena chamada difteria, que produz

obstruo da orofaringe e da nasofaringe, impedindo a respirao
normal. A disseminao da toxina pelo corpo pode comprometer
outros rgos e evoluir para forma fatal. Felizmente no ocorre com
frequncia, principalmente aps as campanhas de vacinao, onde h
a imunizao com o toxoide diftrico.
Haemophilus influenzae (tipo B) Alm das doenas citadas, as

complicaes causadas por esse microrganismo podem se associar a
epiglotites graves e at mesmo a casos de meningite em crianas
pequenas (veja item 21 deste captulo).
Borrelia Vincenti (Borrelia estirpe Vincenti) Essa espiroqueta,

que ocorre principalmente em adolescentes e adultos, forma um
complexo fusoespiralar em associao com bacilos fusiformes. Pode
causar lceras na garganta ou gengiva, mas geralmente no tem maio-
res complicaes.
17.1.2. Otite e Sinusite
Como no caso anterior, estas doenas so frequentemente de origem

viral, podendo estar associadas secundariamente a agentes bacterianos. Apesar
das otites no estarem diretamente associadas ao trato respiratrio, por sua
localizao e ligao anatmica, bem como os agentes associados vamos
consider-las neste tpico.
Otite mdia aguda Comum em crianas, devido ao fato de a
trompa de Eustquio ainda estar muito aberta, facilitando a invaso
viral e de bactrias residentes na nasofaringe. Os sintomas so bem
gerais, como febre, mas pode ocorrer at mesmo vmito e diarreia.
Os vasos do tmpano podem estar dilatados e ocorrer secreo no
ouvido mdio. O processo, se no tratado, pode levar ao rompi-
mento do tmpano e prejuzo audio (otite mdia crnica supurativa).

As bactrias mais comumente envolvidas nesse processo so:
S.pneumoniae, H.influenzae, S.pyogenes e S.aureus (todas j cita-
das anteriormente).
Otite externa O canal externo do ouvido (orelha externa)

possui microbiota bacteriana semelhante a da pele. Como o ambien-
te mido, favorece a colonizao por S. aureus e tambm pela
levedura Candida albicans. Eventualmente pode ocorrer tambm a
presena de bactrias Gram-negativas, como Pseudomonas aeruginosa
e Proteus. Geralmente, problemas causados por estes microrganis-
mos so facilmente tratados com preparados oto-oftlmicos conten-
do polimixina ou outro antibitico na frmula.
Sinusite aguda Clinicamente a Sinusite se associa a dor e

sensibilidade facial. Etiologicamente, semelhante Otite mdia.
Geralmente o tratamento emprico ou feito com base no material
colhido da nasofaringe, j que a aspirao do sinusoide no uma
prtica comum.
17.2. Trato Respiratrio Inferior (TRI)

Os principais rgos do trato respiratrio inferior so os pulmes, os
brnquios e os alvolos. Geralmente as infeces do TRI so mais graves,
podendo ser classificadas em infeces agudas e crnicas.
17.2.1. Agudas
Coqueluche Esta uma doena aguda do TRI, causada pela

bactria Bordetella pertussis (ver item 16.4). O quadro clnico
inicial duvidoso, mas, aps a manifestao da tosse seca e curta
(estgio paroxstico), geralmente no h dvidas. Os organismos
Bacteriologia | 351
podem ser isolados de swab de garganta ou em placas de tosse,

no meio de Bordet-Gengou ou gar-sangue-carvo, incubando-se
por 3 a 5 dias em atmosfera mida. O atibitico de escolha a
eritromicina, mas a preveno ocorre pela vacinao (trplice DPT).
Bronquite aguda uma inflamao aguda dos brnquios, geral-

mente causada por uma infeco. Resulta, geralmente, em tosse.
Diversos vrus atuam neste tipo de patogenia, porm, bactrias como o
Mycoplasma pneumoniae, Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae,
tambm podem possuir importante papel nesta condio. Devido a esse fato,
muitas vezes recomendado o uso de antimicrobianos.
Bronquiolite Doena exclusiva da infncia, causada frequente-

mente por vrus (75% so causadas pelo vrus respiratrio sincicial
VRS e 25% por outros vrus ocasionalmente pode-se ter
envolvimento de M.pneumoniae). Devido ao diminuto tamanho dos
bronquolos infantis, qualquer edema celular obstrui a passagem de
ar nos alvolos. Uma complicao comum deste tipo de doena a
pneumonia intersticial.
Pneumonia uma infeco do parnquima pulmonar. Variados

microrganismos como bactrias, vrus e fungos podem causar pneu-
monia logo, ela no uma doena nica e sim um conjunto de
infeces especficas, cada uma com sua epidemiologia, patognese,
apresentao clnica e curso clnico.
A Identificao etiolgica do microrganismo causador da pneumonia
um elemento de extrema importncia, visto que ele a chave para um
tratamento antibitico apropriado. Entretanto, devido natureza sria
da infeco, os pacientes necessitam receber antibioticoterapia emprica,
principalmente em casos de pneumonia grave, antes dos resultados
laboratoriais estarem disponveis. Alm disso, em cerca de um tero

dos casos, o agente etiolgico no consegue ser evidenciado.
As pneumonias virais so mais comuns em crianas e as bacterianas,
em adultos, podendo ser causadas, na maioria das vezes, por
S.pneumoniae e H.influenza. Podem ser ainda resultantes de alguns
oportunistas ps-virais, como S.aureus e K.pneumoniae. Existem
tambm as chamadas pneumonias atpicas bacterianas que so causa-
das por diversos outros agentes bacterianos, como, por exemplo,
Mycoplasma pneumoniae, espcies de Chlamydia e Legionella.
17.2.2. Crnicas
Tuberculose Doena infecciosa causada pelo Mycobacterium

tuberculosis (ver item 14.3). Apesar de ser uma doena primria
dos pulmes, pode disseminar-se para outros locais do organismo ou
mesmo evoluir para uma infeco generalizada (tuberculose miliar).
Muito sria em pases subdesenvolvidos e em desenvolvimento devi-
do a problemas sociais como misria, desnutrio e moradias inade-
quadas. Tor na-se extremamente grave em indivduos
imunocomprometidos. O bacilo de Koch se localiza intracelularmente
nos macrfagos, o que possibilita sua persistncia por longos pero-
dos no organismo.
O diagnstico com base no teste cutneo de tuberculina no
til em pases como o nosso, onde a maioria dos indivduos
recebeu a vacina BCG.
O diagnstico realizado inicialmente por bacterioscopia (mtodo
de Ziehl-Neelsen - ver item 5.2) e confirmado posteriormente
pela cultura (Loewenstein-Jensen - ver apndice) o mais confivel.
Bacteriologia | 353

bacterianas do trato urinrio
A infeco urinria uma infeco em qualquer parte do trato urinrio,
quer seja nos rins, ureteres, bexiga ou uretra. Pode atingir pessoas de
qualquer sexo e qualquer idade, mas mais frequente em mulheres e
bebs do sexo feminino. H uma estimativa de que 10% a 20% das
mulheres contraem infeco urinria em alguma poca de suas vidas, sem
considerar um nmero significante de infeces recidivantes. A maioria das
infeces aguda e de curta durao, porm contribui para taxa significati-
va de morbidade na populao. Quando ocorrem infeces graves podem
resultar em perda da funo renal e sequelas graves permanentes.
Nas mulheres, pode-se fazer distino entre o tipo de infeco,
entre cistite, uretrite e vaginite, porm o trato contnuo e os sintomas
podem aparecer superpostos.
O trato urinrio dividido em rins, ureteres, bexiga e uretra. Sendo
que somente na uretra devemos encontrar microbiota normal.
Quanto aquisio e etiologia, as infeces do trato urinrio so
causadas principalmente por bactrias, mas, ocasionalmente, outros micror-
ganismos, como vrus, fungos e parasitas, podem estar envolvidos.
18.1. Patognese das Infeces do TU

Um dos fatores predisponentes infeco urinria ser do sexo
feminino, pois a uretra feminina mais curta que a masculina e est mais
prxima ao nus. Alm disso, as relaes sexuais facilitam o movimento de
microrganismos at a uretra. Nas mulheres, h tambm a ocorrncia de
mudanas hormonais, afetando a mucosa do trato genitourinrio, sendo
que na gravidez ocorre dificuldade de esvaziamento pela conformao
anatmica da mulher.
Infeces urinrias no bacterianas

Infeces Virais so bastante raras, mas os vrus podem ser isolados na
ausncia de doena do trato urinrio. Como, por exemplo, o poliomavrus,
o citomegalovrus e o adenovrus (ver captulo 16 de Virologia).
Infeces fngicas tambm podem ocorrer, tendo como principais
causadores a Candida spp. e o Histoplasma capsulatum (ver captulo 4
deste volume).
Quanto aos parasitas, temos o protozorio Trichomonas vaginalis, que
pode causar uretrite em homens e mulheres (considerado a causa de vaginite)
e o helminto Schistosoma haematobium, que causa inflamao da bexiga (os
ovos penetram na parede da bexiga).
Infeces urinrias bacterianas

As infeces urinrias bacterianas so geralmente adquiridas por via as-
cendente, passando inicialmente pela uretra e posteriormente pela bexiga e
rins. Ocasionalmente, pode atingir a corrente sangunea e causar uma septice-
mia. Estas infeces so normalmente causadas por bacilos Gram-negativos,
como a E.coli. A espcie Proteus mirabilis, por exemplo, de frequente
associao com clculos urinrios, pois possui potente urease que, atuando na
ureia, produz amnia e torna a urina alcalina. Klebsiella, Enterobacter, Serratia
sp. e Pseudomonas aeruginosa tambm so bastante isolados, porm possuem
associao a infeces hospitalares (resistncia). No grupo dos Gram-positi-
vos, podemos citar o S.saprophyticus, em mulheres jovens sexualmente ativas,
e o S.epidermidis e Enterococcus sp., associados a pacientes hospitalizados.
A maioria dos patgenos do trato urinrio faz parte da microbiota fecal,
pois somente espcies aerbias e facultativas, como E.coli, possuem os atribu-
tos necessrios para colonizar e infectar o trato urinrio, sendo necessrio para
estes microrganismos ascender e se fixar (adesinas).
Bacteriologia | 355
Alguns sorogrupos de E.coli possuem capacidade de colonizar reas

periuretrais, podendo possuir um tipo peculiar de fmbrias (pili) que permite
sua adeso ao epitlio da uretra e da bexiga.
Algumas bactrias produzem endotoxinas que diminuem a funo das
vlvulas vesicouretrais, comprometendo o peristaltismo uretral e levando a um
refluxo de urina com bactria para os ureteres (afluxo bacteriano). Outras
possuem flagelos e podem mover-se contra a corrente (exceo: Enterococcus).
A produo de determinadas substncias, como hemolisinas, le-
so renal (E.coli), e urase, pielonefrite (Proteus), tambm funcionam como
fator de virulncia para estes microrganismos.
Com exceo da mucosa uretral, o TU normal resistente colonizao
bacteriana e geralmente elimina rpida e eficientemente os microrganismos.
Como mecanismos de defesa, podemos citar o pH, o contedo qumico, os
mecanismos normais de descarga, as prprias clulas da bexiga e do rim, que
produzem IgG e IgA, e a fagocitose.
Caractersticas Clnicas e Complicaes

A infeco pode envolver diferentes partes do TU, podendo ser ento
denominada as seguintes formas distintas, a saber:
Cistite - Infeco da bexiga, caracterizada por frequncia e urgncia

urinria e dificuldade de urinar (disria).
Pielonefrite aguda - Envolve parnquima renal e sistema coletor,

geralmente acompanha bacteremia, dor lombar localizada e sintomas
sistmicos (febre e prostrao).
Pielonefrite crnica - Termo confuso, pois se refere aparncia pato-

lgica do rim resultante de inflamao progressiva do interstcio renal
e tbulos.
Abcesso renal - um acmulo localizado de pus no tecido renal

(manifestao incomum). Pode ser confundido com a pielonefrite,
porm, no incio, os sintomas so mais acentuados.
Prostatite aguda - Infeco bacteriana da prstata, com febre e dor

perineal, associada a sintomas de disfuno irritativa e obstrutiva (a
prostatite crnica uma condio subaguda).
Urosepse - Bacteremia sintomtica, originria do trato urinrio. Pode

ser causada por pielonefrite ou abcesso renal ou ser adquirida no
hospital, geralmente devido instrumentao (ex: cateterizao).
18.2. Coleta do material

A coleta ideal feita antes da terapia antimicrobiana (se recebeu antibi-
tico nas ltimas 48 horas, dever relatar).
Amostra de urina por coleta de jato intermedirio

A coleta ideal para a pesquisa de infeco bacteriana no trato urinrio
dever ser realizada com a primeira urina da manh. Nos casos em que no
podemos aguardar este momento, sugerimos que o paciente faa um repouso
miccional de, no mnimo, 3 a 4 horas.
Deve-se processar uma lavagem cuidadosa dos lbios femininos ou da
glande masculina com sabo neutro e gua (no usar sabo antissptico), secar
o local e, utilizando um frasco estril e de boca larga, colher o volume interme-
dirio da urina, desprezando o primeiro jato.
Devemos considerar de forma especial a interpretao dos resultados nos
pacientes idosos ou acamados com dificuldade maior de coleta, crianas e gestante.
A obteno de amostras de fluxo intermedirio de bebs e crianas peque-
nas obviamente difcil, sendo que as amostras podem ser coletadas por colocao
Bacteriologia | 357
de uma bolsa plstica adesiva (saco coletor) no perneo (feminino) ou no pnis

(masculino). Estas amostras, muitas vezes, so contaminadas pelas fezes. Em alguns
casos, estes problemas so contornados pela aspirao suprapbica.
Amostra de urina por puno suprapbica

Desinfeta-se a pele da regio sobre a bexiga e injeta-se anestsico,
tal como lidocana, por via subcutnea. Com a ponta de uma lmina cirr-
gica, faz-se um pequeno corte atravs da epiderme e, pelo corte, intro-
duz-se cuidadosamente uma agulha espinhal calibre 18 de bizel curto e
aspira-se com seringa 10mL de urina.
Amostra de urina de catter

Os pacientes no devem ser cateterizados simplesmente para obteno
de amostras de urina. Nos que j possuem cateter in situ, amostras devem ser
obtidas pela retirada com seringa e agulha do tubo do cateter. A coleta da
bolsa do catter geralmente imprpria para cultura, pois a permanncia da
urina na bolsa de drenagem propicia a multiplicao dos microrganismos no
local, ocasionando falsos valores na contagem. Deve-se tomar precaues es-
peciais para que no ocorra a contaminao da amostra.
Amostragens diferentes para determinao de casos especiais:
Mycobacterium tuberculosis Coletar, em dias consecutivos, 3 amos-

tras da urina da manh.
Schistosoma haematobium Examinar os ltimos mililitros de uma

amostra matinal de urina aps exerccios fsicos.
Pacientes com infeco prosttica - aps esvaziamento da bexiga deve-
se fazer massagem prosttica. O final da urina sair com secrees prostticas
que acumulam. Nestes casos uma alta concentrao de material j pressupe
infeco prosttica.
18.3. Transporte do material

Dever ser transportado ao laboratrio envolvido no gelo, com o
mnimo de demora, pois a urina um excelente meio de cultura para muitas
bactrias e a multiplicao bacteriana provocar distores no resultado.
18.4. Procedimentos
Os espcimes que no puderem ser examinados no perodo de 1

hora da coleta devem ser refrigerados, sendo que as contagens bacterianas
permanecem viveis no mximo at 18 horas no refrigerador. No caso de
espcimes recebidas sem refrigerao, o ideal descart-las e solicitar uma
nova coleta (explicando ao paciente a forma correta de transporte).
Testes rpidos
O exame ao microscpico permite a emisso de um relato preliminar

rpido e um controle presuntivo da qualidade da amostra.
Colocar em uma lmina, sem espalhar, 10mL de urina homogeneizada,
sem centrifugar (usar pipeta automtica ou ala calibrada), esperar secar, fixar
e corar pelo Gram. Caso seja observada a presena de, pelo menos, 1
bactria por campo, em 20 campos analisados, trata-se de uma possvel
bacteriria significante (105 UFC/mL). Estes casos geralmente acompa-
nham picitos tambm.
A observao de clulas epiteliais descamativas e uma cultura mista
geralmente indica amostra proveniente do primeiro jato e contaminao, haven-
do nestes casos a necessidade de nova coleta. Existem outros mtodos rpidos
no disponveis em todos os laboratrios como, por exemplo, os aparelhos
automatizados, todavia, seu custo ainda inacessvel para laboratrios de
pouca rotina ou de pesquisa.
Bacteriologia | 359
Urinocultura
O objetivo deste teste estimar o nmero de bactrias viveis por
mililitro de urina e, nos casos considerados positivos ( 105 UFC/mL),
realizar sua identificao.
a) Urinocultura quantitativa
1. Tcnica da ala calibrada (Mtodo de Hoeprich)

Utiliza-se uma ala fabricada com diferentes calibragens: 0,1 mL (1/
10), 0,01 mL (1/100) e 0,001 mL (1/1000).
A ala inserida verticalmente na urina (j homogeneizada) e inoculada
no centro da placa contendo meio de cultura. Faz-se ento um
espalhamento com ala de Drigalski ou ala bacteriolgica.
2. Tcnica das diluies seriadas
A urina diluda em salina 1:10 / 1:100 / 1:1000
Semeando-se sempre 0,1mL de cada diluio em placa de cultura.
Pode-se semear em superfcie (Drigalski) ou pour-plate.
Meios utilizados
Para anlise quantitativa so utilizados meios ricos que propiciam o
crescimento da maior parte dos microrganismos presentes nas infeces urinrias.
O cultivo padro realizado no gar Brolacin, tambm conhecido como
CLED (azul de bromotimol - lactose-cistena - eletrlitos deficientes). O
meio alm de facilitar a contagem inibindo o swarm do gnero Proteus, permite
a diferenciao presuntiva das bactrias presentes (lactose E.coli - azul/
amarelo azul intenso Proteus).
Para anlise qualitativa (propicia a noo dos microrganismos presen-
tes), pode-se usar meios como gar sangue e meios seletivos para determina-
dos grupos (ex: gar MacConkey e EMB).
Incubao: as placas devero ser incubadas em estufa a 37 oC por 24

horas. Se no houver crescimento, devero ser incubadas mais 24 horas e se
ainda no houver crescimento, o resultado dever ser o seguinte: ausncia
de crescimento aps 48 horas de incubao.
Se houver crescimento, o microrganismo dever ser identificado (pro-
vas bioqumicas) e posteriormente realizado o seu TSA.
Interpretao dos resultados (anlise quantitativa)

A contagem de placa dever ser feita naquela que tiver um nmero
entre 30 e 300 colnias e dever ser feito com base no nmero de colnias
contado X fator de diluio = nmero de microrganismos por mililitro.
Se o resultado for menor que 104 colnias (10.000 UFC/mL), consi-
dera-se a amostra contaminada acidentalmente ou contedo da contagem pro-
veniente de microbiota autctone (no identificar). Nestes casos, devemos
reportar s o no total de UFC/mL. Porm, se no teste inicial pela colorao de
Gram a contagem foi positiva, as placas devem ser reincubadas.
Nos resultados com contagem maior ou igual a 105 colnias (100.000
UFC/mL), h indicao de infeco urinria. Nestes casos, as colnias devem
ser identificadas e, posteriormente, deve ser feito o teste de sensibilidade aos
antimicrobianos (TSA).
Se mais de 1 tipo de colnia estiver presente em grande quantidade,
ambas devero ser identificadas e o TSA de cada uma deve ser feito separada-
mente. Se foram isoladas mais de 2 espcies, h suspeita de contaminao do
material, principalmente se na colorao de Gram no foi observado nenhum
leuccito e houver presena de clulas epiteliais descamativas.
A presena de culturas mistas geralmente indica contaminao, porm,
pode ocorrer infeco mista, principalmente em pacientes fazendo uso de
cateter com doena renal crnica ou com leso obstrutiva.
Bacteriologia | 361
Se o resultado estiver entre 104 e 105 UFC/mL (resultados interme-

dirios), este caso deve ser analisado com muito cuidado, pois pode tratar-
se de contaminao, incio ou final de infeco ou paciente que iniciou o
tratamento com antimicrobiano. Como controle, devemos solicitar uma se-
gunda coleta para comparao de resultados.
Nos casos positivos, devemos sempre tentar identificar o microrganis-
mo, podendo tambm seme-los aps triagem para checagem e confirmao
bioqumica posterior.
Deteco de bacteriria significante

a caracterstica-chave para a certeza de infeco do trato urinrio.
Estudos recentes sugerem que os dados de isolamento geralmente so
mais precisos em mulheres e as consideraes utilizadas para determinar infec-
o (contagem igual ou acima de 100.000 UFC/mL) nem sempre podem ser
plotadas para indivduos do sexo masculino. Nos homens, h uma tendncia
atual de se considerar nmeros limites para urina mais baixos que nas mulheres,
pois a contaminao menos frequente.
Estes nmeros no se aplicam a amostras de urina coletadas de cateteres
ou por aspirao suprapbica. Nestes casos, qualquer nmero de microrganis-
mos pode ser significante, pois no h contaminao de microbiota.
b) Urinocultura qualitativa
Ao detectar a bacteriria significante na amostra, o profissional dever

fazer a identificao bioqumica da colnia isolada e realizar o TSA de acordo
com o item 11.

bacterianas sistmicas (hemocultura)
Como j comentado no item 15.2.5, o sangue desprovido de
microbiota, sendo que a presena de bactrias no sangue (bacteremia) pode
ocorrer de forma assintomtica com certa frequncia (mastigao vigorosa,
escovao, etc.), sem que haja maiores implicaes para o indivduo, pois,
possumos defesas especficas e inespecficas (ver captulo 1 deste volume)
que nos auxiliam ao combate destes intrusos. Todavia, em algumas ocasies,
a partir de focos intravasculares ou extravasculares, poder ocorrer bacteremia
sintomtica (transitria, intermitente ou contnua), levando manuteno ou
passagem de bactrias na nossa corrente sangunea. Essa situao, se no
resolvida, poder evoluir para doenas em determinados locais (como no caso
de uma meningite) ou infeces disseminadas (septicemia).
Geralmente, quando desenvolvemos a septicemia (multiplicao de mi-
crorganismos no sangue), podemos apresentar uma srie de sinais e sintomas
associados, que podem ser leves ou fatais, como febre e calafrios, leses de
pele, diarreia, queda da presso arterial, aumento do ritmo cardaco e choque.
Como uma infeco muitas vezes fatal, seu diagnstico deve ser realizado o
quanto antes, pois o tratamento de suprema importncia para manuteno da
vida do paciente.
A Hemocultura ou exame bacteriolgico do sangue utilizado para
demonstrar a presena de bactrias na corrente sangunea. Para se realizar
essa pesquisa necessria uma metodologia correta na coleta deste sangue
e a semeadura deste material em meios adequados (veja o item 15.2.5).
19.1. Diluio
Como o sangue dotado de poder bactericida, deve ser diludo no
meio para que no haja inibio do crescimento bacteriano. De um modo
Bacteriologia | 363
geral, so semeados 5 a 10 mL de sangue para 100 mL do meio de

cultura lquido.
19.2. Meios de cultura

A escolha do meio de cultura que ser utilizado vai depender do
microrganismo que queremos isolar; os mais comuns so meios ricos, como
tripcase soja, infuso de crebro e corao, columbia e gar Brucella.
Podemos tambm utilizar meios semisslidos, como, por exemplo, na
suspeita de Leptospirose, onde usamos o meio semisslido de EMJH ou
Fletcher, na proporo de 1, 2 e 3 gotas para 5mL de meio.
Alguns autores mais antigos preconizam o mtodo de Castaeda, onde
h combinao de meio slido com lquido no mesmo frasco de cultura. O
sangue introduzido, ao interior do frasco, atravs da rolha, por uma agulha e
o meio lquido diariamente inclinado sobre o meio slido, permitindo o
aparecimento de colnias, caso haja crescimento bacteriano.
Atualmente, existem meios comerciais para os diferentes fins de isola-
mento, que podem ser semeados por sistema fechado a vcuo, de agulha
dupla, evitando a contaminao do meio pelo ambiente. Estes frascos, geral-
mente, apresentam concentraes de 5% a 10% de CO2.
19.3. Formao de cogulos

Para evitar a formao de cogulos, aconselha-se o uso de prolas de
vidro ou adio de anticoagulantes, como o citrato de sdio (1% a 2 %). H
tambm um produto a base de polianetosulfonato de sdio (SPS, PSS ou
Liquoid) que funciona nas concentraes de 0,025% a 0,05%, como
anticoagulante e inibidor da ao bactericida do sangue (anticomplemento e
lisozimas detm a fagocitose e inativam concentraes teraputicas de
aminoglicosdeos). utilizado na proporo de 10mL sangue + 1mL do
produto a 1% em salina estril. Esta substncia, porm, pode inibir algumas

cepas de N.gonorrhoeae, N.meningitidis e Gardenerella vaginalis, portanto,
em pacientes suspeitos de septicemia por estes agentes, deve ser inoculado
tambm o sangue sem anticoagulante.
19.4. Uso de antimicrobianos

importante, para o isolamento na hemocultura, saber se o paciente
est fazendo uso de antimicrobianos. Em caso positivo, algumas providncias
devero ser tomadas para diminuir a impedincia do crescimento bacteriano
nos frascos.
Nos casos onde h tratamento por sulfas, preconiza-se a adio de 5
mg de cido p-aminobenzoico a cada 100mL de meio (suficiente para neutra-
lizar at 1,5 mg% da droga).
J em casos onde o tratamento feito com base nas penicilinas, adicio-
na-se penicilinase em doses de 50 unidades (0,5 mL de soluo a 100 u/mL
para 100mL de meio), porm este procedimento desaconselhado, pois o
risco de contaminao do caldo muito maior.
19.5. Exames de hemoculturas e subculturas

Os frascos de hemocultura, de um modo geral, so incubados de 35 a
37 C e examinados visualmente todos os dias, a fim de se detectar sinais de
o
crescimento. Deve-se realizar subculturas cegas em placas de gar sangue e de

gar chocolate a partir de todas as hemoculturas dentro de 18 horas aps a
coleta estas placas devem ser incubadas em 5% a 10% de CO2.
Todas as hemoculturas visualmente positivas devem ser subcultivadas em
condies aerbias e anaerbias, e as negativas no devem ser descartadas
com menos de 7 dias de incubao, quando se faz um subcultivo final, pois
alguns microrganismos exigentes, como certas cepas de Neisseria e Haemophilus,
podem requerer incubaes prolongadas.
Bacteriologia | 365
Alguns microrganismos possuem o crescimento extremamente lento

e sua deteco no depende de subcultivos, como no caso das leptospiras,
onde hemoculturas em meio semisslido s devem ser descartadas aps
90 dias da semeadura.
19.5.1. Interpretao dos resultados

Ao interpretar o resultado da hemocultura, importante avaliar a possi-
bilidade de contaminao acidental por microrganismo do ar ou de superfcie
cutnea, devendo sempre ter o cuidado de eliminar estes fatos. Preconiza-se a
semeadura em duplicata, para excluso desta possibilidade, e tambm a coleta
de locais diferentes (dois braos).
O ideal, como j foi dito no tpico de coleta, a retirada da amostra
no momento imediatamente anterior ao pico febril, o que difcil de precisar.
Alm disso, como nem sempre possvel coletar neste perodo, fazemos as
coletas de diferentes locais de puno venosa, com o espao de no mnimo
uma hora (o tempo suficiente para as defesas normais retirarem as bactrias de
circulao de 30 minutos), mas a repetio do exame em pelo menos trs
vezes pode esclarecer algumas dvidas comuns nesta metodologia.
Devemos avaliar se o isolamento est traduzindo uma septicemia
verdadeira ou somente uma bacteremia, pois, no primeiro caso, o micror-
ganismo, ou periodicamente lanado na corrente sangunea ou est se
multiplicando nela; j no segundo, este veiculado transitoriamente ou
lanado ocasionalmente.
Na septicemia, como j comentado, acompanham-se sinais e sintomas
clnicos, como calafrios e febre, mas que nem sempre so relatados ao profis-
sional do laboratrio, que dever verificar se a positividade da amostra est de
acordo com a suspeita mdica.
De qualquer forma, o isolamento verdadeiro de qualquer microrganismo
do sangue dever ser relatado, e a avaliao final dever ser feita pelo mdico,
j que alguns casos de bacteremia transitria possuem importncia clnica, como

Streptococcus viridans e Streptococcus pneumoniae.
20. Diagnstico laboratorial das infeces bacterianas

no trato gastrointestinal (coprocultura)
Uma ampla gama de patgenos capaz de infectar o trato
gastrointestinal, sendo que as infeces variam em efeitos, desde crises
brandas, autolimitadas a diarreias graves, fatais.
Nos pases em desenvolvimento, a doena diarrica a principal
causa de morbidade e mortalidade, principalmente em crianas de pouca
idade.
Nos pases desenvolvidos a diarreia ainda aparece como queixa co-
mum, porm geralmente branda e autolimitada, com exceo nos pacientes
muito jovens, idosos e imunocomprometidos.
Podemos interrelacionar fatores socioeconmicos e ambientais como
condicionantes da infeco intestinal, como, por exemplo, a desnutrio,
causando prejuzos na imunidade e predispondo as pessoas infeco
bacteriana.
Quanto s nossas defesas contra as infeces do trato gastrintestinal
podemos citar a nossa microbiota autctone (flora normal), pela sua com-
petio, pois, se houver reduo da microbiota, a resistncia infeco
intestinal tambm se reduz (ex. sndrome colite pseudomembranosa, cau-
sada por S.aureus, C. difficile e outros clostrdios aps administrao de
antimicrobiano). Nossa acidez estomacal tambm um mecanismo de de-
fesa, pois restringe o nmero e o tipo de microrganismo que penetra no
TGI. O peristaltismo ajuda na remoo das bactrias (poucas chances de
aderncia), permitindo que as fezes caminhem para o intestino grosso.
Bacteriologia | 367
20.1. Podemos dividir a sndrome intestinal em dois grupos:
20.1.1. Sndrome disenteriforme
Onde h mecanismo de invaso, com penetrao dos microrganismos

nos entercitos, multiplicao, produo de citotoxina e destruio da clula,
bactrias se localizando em nvel de submucosa. uma reao do tipo inflama-
tria (migrao de macrfagos e polimorfonucleares ao local). Por ser uma
regio vascularizada e prxima dos plexos nervosos, as fezes aparecem com
muco e sangue e o paciente sente clicas (ex.: Salmonella. Ultrapassa os
entercitos sem destru-los, possui localizao no nvel das submucosas. Devi-
do ao quadro de invasibilidade, pode ter localizao extraintestinal.)
20.1.2. Sndrome coleriforme
Onde h mecanismo toxignico, com ligao da clula bacteriana aos

receptores dos entercitos (fator de colonizao - CFA I, II, III - pili ou
fmbria), ocasionando liberao de toxinas, inverso do fluxo de absoro e
eliminao de gua, aumentando o fluxo de gua na luz intestinal. (ex.: EPEC:
as fezes apresentam-se aquosas e com muco. H fixao nas microvilosidades
dos entercitos). Nesta sndrome geralmente no h dor, mas pode ocorrer
desidratao, devido grande perda de lquidos e eletrlitos.
20.2. Patogenia da diarreia bacteriana

A porta de entrada sempre oral, e a partir desta penetrao no
corpo se d a colonizao, sendo o mecanismo diferente, dependendo do
microrganismo.
Sndrome disenteriforme Sndrome coleriforme

Invaso ou Citotoxina Enterotoxinas
E.coli (EIEC), E.coli (EHEC) V.cholerae O1
Shigella V.cholerae no O1
Salmonella E.coli (ETEC, EPEC)
Campylobacter Aeromonas
Yersinia enterocolitica S.aureus
V.parahaemolyticus Clostridium perfringens
Nas fezes:
Sndrome disenteriforme: Picitos, clulas mononucleares, muco e

hemcias;
Sndrome coleriforme: rara a presena de clulas, mesmo

descamativas.
20.3. Coprocultura
Nas fezes, habitam as mais variadas formas de bactrias (cerca de
10 bactrias por grama de fezes), alm de outros microrganismos. Deve-
11
mos, portanto, nos deter no isolamento daquelas bactrias que so consi-

deradas, atualmente, como patognicas mais comuns ao homem, ou seja,
E.coli de sorogrupos especficos (ETEC, EPEC, EIEC e EHEC), Salmonella,
Shigella, Yersinia, Campylobacter, Vibrio e, raramente, o S.aureus e
Aeromonas. As outras bactrias so consideradas, na maioria dos casos,
microbiota normal (Figura 38).
Bacteriologia | 369
Figura 38. Esquema da copnocultura
20.3.1. Diagnstico bioqumico
As colnias obtidas, mediante o cultivo em meios de enriquecimento e

meios seletivos, devem ser isoladas, antes de se proceder sua diferenciao
exata, aps confirmar a pureza da cultura pela observao do crescimento
colonial e, em alguns casos, como do Campylobacter, por uma anlise de seu
aspecto morfotintorial (Gram). Seleciona-se uma colnia e procede-se a uma
suspenso em salina para ento realizar a semeadura para uma srie de meios
de cultura indicadores, que auxiliaro, posteriormente, na sua classificao
bioqumica (tabela no apndice).
Como uma possibilidade de confirmao do comportamento
bioqumico do microrganismo, efetua-se a investigao sobre a classifica-
o sorolgica do mesmo.
Uma srie de reaes fundamentais recomendvel para a diferenciao

bioqumica das enterobactrias. Na maioria dos casos, na prtica, estas rea-
es, em combinao com a diferenciao sorolgica, conduzem a um diag-
nstico dentro de 48 horas, sempre que no existir um comportamento atpico.
As mesmas provas podem auxiliar na identificao de membros de ou-
tras famlias bacterianas, mas na maioria das vezes devero sofrer algum tipo de
adaptao, como no exemplo da famlia Vibrionaceae, onde devemos adicio-
nar em suas composies 1% de NaCl para permitir seu crescimento.
Principais provas bioqumicas
Prova de oxidase
Crescimento em gar Nutriente
Oxidase
Provas bioqumicas Sorologia
Vrias so as tcnicas sugeridas para este teste, cabendo ao tcnico

escolher a menos dispendiosa para seu uso.
1- Pingar sobre a colnia soluo aquosa 1% de Dimetil p-fenilenodiamina
cloridrato recm-preparada.
A positividade da reao caracterizada pelo surgimento de colorao
rsea. A colorao rsea, aps algumas horas, se tornar negra, o que caracte-
riza a morte dos microrganismos contidos naquela colnia.
Sugerimos preparar a soluo e impregnar uma tira de papel de filtro
(utilizar enquanto estiver mido). Esta tcnica economiza o reativo e permite
testar vrias amostras em somente uma tira, podendo reutilizar a colnia pos-
Bacteriologia | 371
teriormente para outras anlises. Aps a impregnao, tocar na colnia em

questo com um basto de vidro estril e depois pass-la tira impregnada
para o teste.
2- Comercialmente existe o teste Bact-Ident Oxidase - lminas de en-
saio, com a rea de reao impregnada com N,N-Dimetil para-fenilenodiamonio
cloreto, onde se goteja uma suspenso bacteriana espessa, em estudo, na rea
de reao. Os germes citrocromoxidase positivos tornaro a rea reativa com
colorao azul-violeta.
Observao: As Enterobacteriaceae so oxidase negativas, mas Campylobacter,
Vibrio e Aeromonas so oxidase positivas.
Prova de fermentao de acares (gar de TSI ou gar de Kligler) -
Esta prova indica se o germe fermenta (degrada) um acar especifico incorpo-
rado ao meio de cultura, resultando em formao de cido e/ou formao de
gs visvel. Para tal, o meio deve possuir um indicador da acidificao (indica-
dor de pH), e a presena de gar-gar, que tornar o meio slido, permitindo
que o gs formado fique retido em forma de bolhas.
Produo de H2S (gar de TSI, gar de Kligler ou meio de SIM) -
Esta prova detecta a liberao de H2S, por ao enzimtica, a partir de
aminocidos sulfurados (com enxofre), que reage com os ons frricos do
citrato de ferro amoniacal, existente na composio do meio, produzindo um
precipitado negro de sulfeto ferroso.
Motilidade (meio de SIM, meio MILI) - Devido consistncia do
meio de cultura ser semisslido, permite a migrao das bactrias mveis para
fora do ponto de repique.
Produo de indol (meio de SIM, meio MILI) - As bactrias que
possuem triptofanase hidrolizam e desaminam o triptofano produzindo indol,
cido pirvico e NH3. O indol verificado pela formao de um complexo
de colorao vermelha com o grupo aldedo de paradimetilaminobenzaldeido,
que est presente nos reagentes usados na prova. Devemos usar um meio de
cultura rico em triptofano.
Reativo de Braun & Silberstein (1940):
p-dimetilaminobenzaldedo ................................. 5,0 g
Metanol .................................................. 50,0 mL
cido ortofosfrico ......................................10,0 mL
Embeber tiras de papel de filtro e deixar secar em estufa a 37C por 2
a 3 dias.
Usar no tubo com meio de SIM no momento da semeadura.
Degradao da ureia (caldo de ureia ou garureia) - A urease
uma enzima presente em muitas espcies de microrganismos e que degrada
a ureia com liberao de amnia e CO 2. A amnia reage, em soluo,
formando carbonato de amnio, que alcaliniza e aumenta o pH do meio.
A alcalinizao do meio de cultura indicada pela mudana da
colorao amarela para vermelha, mediante a presena de vermelho de
fenol encontrado na composio do meio. Ou se o indicador de pH for
outro, de acordo com sua colorao na faixa alcalina.
Prova vermelho de metila e de Voges-Proskauer - (caldo de VM-
VP seg. Clark e Lubs) - A prova vermelho de metila (VM) se baseia no
uso de um indicador de pH, devido ao fato de o vermelho de metila em
pH 6,0 ser amarelo e em pH 4,4 se tornar vermelho. Esse indicador
revela o germe que produz ou no grandes quantidades de cidos a partir
da glicose, atravs da via de fermentao. Somente os germes que mantm
o pH baixo aps 24 a 48 horas, ultrapassando o sistema tampo do meio,
podem ser considerados VM positivos.
Bacteriologia | 373
Indicador de VM:
Vermelho de metila............................ 0,1 g
lcool etlico 95........................... 300 mL
H2O destilada ............................. 200 mL
Gotejar no cultivo bacteriano: Resultado positivo - cor vermelha.
A prova de Voges-Proskauer (VP) se baseia no fato de certas bactrias
utilizarem glicose produzindo cido pirvico e que determinadas bactrias pro-
duziro butileno-glicol, que um produto de reao neutra. Antes, porm,
de chegar ao butileno-glicol, h formao de acetil-metil-carbinol (acetona)
que em presena de KOH se converte a diacetil, e que, em 24 a 48 horas,
toma colorao vermelha. Para acelerar o processo, usa-se da ao cataltica do
a-naftol e da creatina.
Para 1mL da cultura, adicionar 0,6 mL da soluo de a-naftol e 0,2 mL da
soluo de KOH. Agitar bem. Ler de 5 a 15 minutos: positivo - cor vermelha.
Degradao do Citrato (gar citrato seg. Simmons)
Algumas bactrias podem obter energia utilizando citrato como nica
fonte de carbono. A prova verificada pela produo de produtos alcalinos.
As bactrias que utilizam citrato retiram N 2 de sais de amnio, alcalinizando o
meio e produzindo NH4OH. O indicador azul de bromotimol fica azul em
pH acima de 7,6. Positivo - cor azul.
Descarboxilao da Lisina (meio de LDS, meio LIA, meio MILI)
O meio ajustado pH em 5,6 apresenta cor amarela, devido ao indica-
dor prpura de Bromocresol que atua como indicador de pH. Neste pH as
enterobactrias crescem escassamente. Porm, devido formao de cadaverina
pela descarboxilao da lisina, o pH do meio se alcaliniza, dando melhores
condies de crescimento (pH 7,0). Este efeito promove uma viragem do
indicador que passa de amarelo para violeta (na parte profunda do tubo).
Positivo - cor violeta.
Observao 1: Esta prova poder ser usada com a arginina e a ornitina, com
resultados semelhantes.
Observao 2: O meio poder ser adicionado de glicose e mantido com pH
neutro a bactria ter ento que crescer, utilizar a glicose, gerando cido,
para depois ocorrer o resto da reao. (neste caso, o meio no semeado
apresenta cor prpura, como no resultado positivo).
Degradao do malonato (caldo malonato-fenilalanina)
Capacidade de uma bactria em utilizar malonato como nica fonte de
carbono, alcalinizando o meio. O malonato liga-se competitivamente a
desidrogenase succinica, impedindo sua ao cataltica sobre o cido succinio e
impossibilitando seu desdobramento em cido fumrico. H um acmulo de
cido succinio e uma interrupo do ciclo de Krebs, tirando da bactria sua
principal fonte de energia e impedindo a formao de outros intermedirios
necessrios ao metabolismo.
Uma bactria s cresce em malonato se puder utiliz-lo como nica
fonte de carbono. Positivo - cor azul.
Desaminao da fenilalanina (caldo malonato-fenilalanina)
Entre as enterobactrias, apenas o gnero Proteus e Providencia possu-
em a enzima capaz de desaminar a fenilalanina em cido fenilpirvico, que
detectado pela adio de uma soluo de cloreto frrico a 10% (FeCl3-12 g;
HCL-2,5 mL; H20 destilada-100 mL). Positivo - desenvolvimento de cor
verde, ao contato do FeCl com a superficie do meio cultivado.
Outras provas podem ser utilizadas, porm as provas descritas anterior-
mente so suficientes para uma identificao bastante precisa das enterobactrias.
Para identificao de espcies do gnero Vibrio, sugerimos colocar uma
concentrao de NaCl de 1% nos meios, para permitir seu crescimento,
sendo que a prova do halofilismo (crescimento diante de diferentes concentra-
es salinas), facilita bastante a identificao de algumas destas espcies.
Bacteriologia | 375
Para auxiliar na possvel identificao do Staphylococcus aureus, ob-

serve a figura 39, onde h uma descrio das provas para esta espcie.
Essas provas esto explicadas no item 22.2.1.
21. Diagnstico laboratorial nas infeces

bacterianas do sistema ner voso cental
O crebro e o cordo espinhal so protegidos de presses mecnicas
ou deformaes por estarem contidos em compartimentos rgidos (crnio e
coluna vertebral) e tambm agem como barreiras na disseminao das infec-
es. Os vasos sanguneos e nervos que atravessam as paredes do crnio e da
coluna vertebral so as principais vias de invaso, sendo a invaso via corrente
sangunea a mais comum.
21.1. Membranas que revestem o SNC

O crebro e a medula so estruturas ocas e contm o lquido cfalo-
raquidiano. So recobertas por 3 membranas (as meninges), denominadas
dura-mter, aracnoide e pia-mter.
21.2. Invaso do SNC
Via corrente sangunea

Passagem atravs da barreira hematoenceflica, provocando encefalite,
ou atravs da barreira hematoliqurica, produzindo meningite.
Via nervos perifricos

Principalmente utilizada por vrus. Estes penetram nos nervos perif-
ricos e migram para o SNC, alcanando as clulas gliais e os neurnios,
onde se multiplicam.
21.3. Meningite assptica e bacteriana

A meningite bacteriana, tambm conhecida como sptica, um proces-
so inflamatrio que envolve as meninges. Resulta da introduo de microrganis-
mos atravs de leses penetrantes, infeces no crnio, extenso de um foco
primrio de infeco via hematognica durante, por exemplo, uma septicemia.
Nestes casos, o lquor se mostra com turvao caracterstica.
As meningites asspticas geralmente so virais, mas podem ser tambm
causadas por leptospiras ou fungos. Nestas, o aspecto do lquor lmpido.
21.3.1. Principais agentes etiolgicos bacterianos

associados s meningites
Neisseria meningitidis - diplococo Gram-negativo, extra ou

intracelular, com cpsula polissacardea;
Haemophilus influenzae tipo B - cocobacilo, Gram-negativo,

capsulado, pleomrficos;
Streptococcus pneumoniae - diplococos, Gram-positivos, capsulados.

No caso de imunocomprometidos, pode ocorrer tambm meningite por
Listeria monocitogenes, (cocobacilo Gram-positivo).
21.4. Diagnstico laboratorial

O material de escolha o lquor, e sua coleta feita por puno
lombar. O volume total do lquor de um indivduo adulto de 80 a 150 mL,
e o material colhido de aproximadamente 10 mL. Este material colhido em 3
tubos, o primeiro ir para bioqumica, o segundo para cultura e lminas e o
terceiro para citologia total e especfica.
O aspecto normal do lquor lmpido, semelhante guas de rochas,
mas, em condies patolgicas, pode apresentar anormalidades.
Bacteriologia | 377
No caso de retculo fibrinoso, o lquor se apresenta claro, porm, em

repouso, forma-se um retculo fibrinoso semelhante teia de aranha. Pode
tambm apresentar-se opalescente ou turvo.
O transporte deste material e os procedimentos devem ser rpidos, porm
se o lquido no puder ser processado imediatamente, dever ser mantido tempe-
ratura ambiente ou em estufa, pois a refrigerao letal para duas espcies que
comumente causam meningite: N.meningitidis e Haemophilus influenzae.
O lquor deve ser processado inicialmente pela centrifugao de 3 mil
rpm por 15 a 30 minutos, com o objetivo de concentrar os microrganismos.
Aps este procedimento, um profissional capacitado deve realizar um exame
direto pelo mtodo de Gram.
Uma colorao de Ziehl tambm indicada, pois, nas preparaes de
Gram, os fragmentos de muitas amostras clnicas adquirem colorao vermelha,
o que mascara os organismos em vermelho-alaranjados.
Pode-se proceder em conjunto o teste de Quellung (H.influenzae tipo
B, S.pneumoniae e N.meningitidis), onde se coloca uma gota de antissoro
equivalente ao microrganismo, uma gota do sedimento obtido pela centrifugao
e uma gota de soluo aquosa de azul de metileno. Cobrir com lamnula e em
10 minutos observar o intumescimento da cpsula (mudana no ndice de
refrao), comparando com um controle negativo.
Pode-se tambm detectar antgenos no lquor com ltex (aglutinao
macroscpica).
A partir da bacterioscopia, vamos escolher o tipo de meio de cultura a
ser utilizado.
No geral, dever ser semeado em um caldo rico, em placa de gar
sangue de carneiro a 5% (que dever ser incubado a 37oC em estufa) e em
gar chocolate 5% suplementado por isovitalex (incubado a 37oC em jarra
com 3% de CO2 e umidade).
Aps observao do crescimento, so feitas provas bioqumicas e testes

especficos para cada um dos possveis microrganismos, seguindo esquema de
identificao (Figura 39).
Figura 39. Esquema de identificao das bactrias no lquor
22. Cultura bacteriana de secrees orgnicas
22.1. DSTs
As doenas sexualmente transmissveis continuam, como no passado,
um problema bastante preocupante do prisma da sade pblica e individual.
As tcnicas corretas de coleta das amostras, bem como seu rpido
processamento, podem ser o diferencial no que diz respeito ao diagnstico
rpido e ao tratamento correto.
Bacteriologia | 379
22.1.1. Coleta de amostras para diagnstico de DST
O local e a forma de coleta das amostras vo depender da suspeita

do mdico, elaborada a partir do exame clnico e anamnese, sempre obe-
decendo a uma abordagem sindrmica (de acordo com a sndrome que o
paciente apresenta).
Em pacientes do sexo masculino, colhemos a secreo uretral buscando
o diagnstico de uretrite gonoccica/clamdia. Deve-se fazer exame a fresco,
buscando Gardnerella vaginalis, Trichomonas sp. (protozorio) e Candida sp.
(fungo). Existem novos testes com amostras de urina, porm esto em estudo
e ainda sem a eficincia desejada.
Em pacientes do sexo feminino colhemos a secreo endocervical e
uretral.
Somente em crianas e mulheres histerectomizadas a coleta de secreo
vaginal indicada (ver item 15.2.4), da mesma forma que nos pacientes
masculinos, nesta coleta busca-se o diagnstico de Gardnerella vaginalis,
Trichomonas sp. e Candida sp..
A colheita da secreo uretral indicada em casos de uretrite e, haven-
do indicao, faz-se uma combinao com a coleta endocervical, aumentando
a possibilidade de diagnstico de Neisseria gonorrohea (gonococo) ou
Chlamydia trachomatis.
Em alguns casos, outras amostras podero ser utilizadas para diagnstico
laboratorial das DST, como a secreo ocular, necessria nos casos de oftalmia
(Gonoccica ou por Chlamydia) em recm-nascidos, a secreo anal, em
casos suspeitos de infeco gonoccica anal, e a secreo orofarngea, em
pacientes com sintomas clnicos indicativos.
Durante a coleta das amostras, devemos prestar muita ateno aos poss-
veis impedientes e dificuldades na obteno do material para exame. Destaca-
mos o uso de diferentes tipos de swab, dependendo da finalidade da coleta.
Nos casos de bacterioscopia, exame a fresco e algumas culturas bacteriolgi-

cas, pode-se usar swab com haste plstica, alumnio ou madeira e algodo no
tratado. Todavia, na cultura do gonococo, o swab dever ser montado com
algodo alginatado ou com carvo, pois os cidos graxos do algodo comum
inativam o gonococo e impedem seu crescimento em meios de cultura.
importante saber tambm que no devemos utilizar swab tratado com carvo na
coleta de amostras para pesquisa de Chlamydia trachomatis, pois o carvo
deixa resduos que interferem na qualidade da amostra. Caso precise usar swab
tratado com carvo na coleta para cultura de gonococo, colher antes a amostra
para Chlamydia com outro swab, para no alterar o resultado.
Para serem utilizados em testes, como imunofluorescncia direta IFD,
ensaio imunoenzimtrico ELISA e cultura de clamdias, o swab dever ser de
haste plstica ou de alumnio, pois o alumnio possui o dimetro mais adequa-
do para coleta de secreo uretral.
22.1.2. Teste de escolha para o diagnstico da

uretrite gonoccica
Para o sexo masculino, preconiza-se a bacterioscopia pela colorao de

Gram, que rpida e econmica, com sensibilidade de 95% nos pacientes
masculinos.
A cultura do gonococo tambm pode ser feita, mas est reservada a
casos de suspeita de resistncia bacteriana aos antimicrobianos e bacterioscopia
negativa, porm com forte suspeita clnica. Nestes casos, tambm podemos
semear as amostras de secreo anal, orofarngea e ocular.
J nas mulheres, preconiza-se diretamente a cultura do gonococo, j
que a bacterioscopia feminina apresenta baixa sensibilidade.
Bacteriologia | 381
22.1.3. Testes de escolha para o diagnstico das

infeces por Chlamydia
O mtodo padro ouro a cultura celular, porm de difcil execu-

o e disponvel em poucos laboratrios do pas. O PN-DST/AIDS do
Ministrio da Sade recomenda, em servios com pequeno nmero de
amostras, o teste de imunofluorescncia direta (IFD); para servios com
grande rotina, os testes imunoenzimticos do tipo ELISA e nas amostras
reagentes, o teste confirmatrio por blocking (reao de bloqueio) ou IFD
(ver captulo 1 deste volume).
22.1.4. Semeadura e armazenamento das amostras
22.1.4.1. Suspeitas de N.gonorrhoeae para cultura

Geralmente utiliza-se o meio de Amies, que composto de sais
balanceados e carvo, para transportar o material suspeito para o laboratrio.
Este meio de transporte preserva o gonococo vivel para a semeadura, at no
mximo 8 horas.
A semeadura feita no meio de Thayer-Martin modificado, que
possui, alm da base especfica para gonococos, hemoglobina, vitaminas e
antibitico. Este meio, aps o preparo e semeadura, dever ser incubado a
35oC em local com umidade e atmosfera de 3% a 7% de CO2.
22.1.4.2. Suspeitas de outros agentes para cultura

As uretrites, vaginites e cervicites so, na sua grande maioria (95%),
causadas por Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Candida sp. e
Gardnerella vaginalis. Para excluso de agentes, procede-se tambm semea-
dura em outros meios, como o tioglicolato, o gar sangue e o gar MacConkey.
Geralmente utiliza-se o meio de Stuart no transporte de amostras no gonoccicas
(bastonetes Gram-negativos e cocos Gram-positivos), pois preserva as bact-
rias vivas at 24 horas.
22.2. Outras secrees e lquidos biolgicos

Entre os possveis agentes de infeces supurativas, na maioria das ve-
zes, isolamos cocos Gram-positivos aerbios. Trataremos aqui, dos gneros e
das espcies principais, de interesse para o laboratrio de anlises clnicas.
22.2.1. Staphylococcus
Como j foi comentado, este gnero possui trs espcies de importncia

humana (S. aureus, S. epidermidis e S. saprophyticus). So microrganismos esfri-
cos, imveis, Gram-positivos, que crescem geralmente formando cachos irregulares.
Causam diferentes doenas supurativas no homem, tais como: furncu-
lo, impetigo, osteomielite, abscessos de tecidos, pneumonia, meningite, artrite
purulenta, etc. Algumas estirpes produzem uma enterotoxina, levando os paci-
entes a um quadro agudo de intoxicao alimentar (S. aureus), e outras causam
infeces do trato urinrio (S. aureus, S. saprophyticus).
Podem crescer em meios de cultura simples, mas em laboratrio clnico
so normalmente cultivados em meio de gar sangue. O meio de gar sangue
pode ser feito utilizando-se como base os meios de gar Casoy, gar crebro,
corao ou gar sangue (base), e acrescentamos 5% de sangue desfibrinado
estril de carneiro. muito utilizado tambm o meio de Chapmam-Stone, ou
de manitol salgado, que possui concentrao de sal um pouco maior que os
meios comuns, e o manitol, facilitando o diagnstico de algumas espcies
deste gnero.
Suas colnias so redondas, elevadas de 1 a 2 mm de dimetro, opa-
cas, de colorao amarelo-dourado a branco. Crescem em presena de altas
concentraes de NaCl, sendo este, inclusive, um fator de estimulao da
produo da enzima coagulase.
So inibidos pela presena de corantes (azul de metileno, violeta de
genciana, etc.).
Bacteriologia | 383
Exame bacteriolgico
O material suspeito semeado em gar sangue e incubado a 37C por
18 a 24 horas. Havendo o crescimento de colnias tpicas (descritas anterior-
mente), fazemos a colorao de Gram para observarmos a presena de cocos
Gram-positivos dispostos em grupos ou isolados. Para diferenciarmos o
Staphylococcus do Streptococcus, utilizamos a prova da Catalase.
Prova da catalase
Destina-se a verificar a presena da enzima catalase. A prova pode
ser efetuada com os germes crescidos praticamente em qualquer meio de
cultura, devendo-se somente evitar meios contendo sangue, para no interferir
com falsos-positivos.
Em uma gota de soluo fisiolgica, sobre uma lmina de vidro,
emulsionamos a colnia de bactria em estudo. Sobre a suspenso, pingamos
uma gota de gua oxigenada a 30%. A formao imediata de bolhas de O 2
indica prova positiva.
GNEROS CATALASE
Estreptococos
Estafilococos +
Prova do manitol
Usar o meio de cultura gar manitol salgado. Distribuir em tubos
inclinados ou em placas. Fazer semeadura da bactria em estudo, em estrias, e
incubar por 18 a 24 horas a 37C.
Leitura: Positivo - amarelo na zona de repique. Negativo - cor
natural (vermelho).
UTILIZAO DO MANITOL
S. aureus +
S. epidermidis
S. saprophyticus
Prova de coagulase
A prova verifica a capacidade do microrganismo em coagular o plas-
ma atravs da enzima coagulase. A coagulase estafiloccica se apresenta em
duas formas: coagulase ligada e coagulase livre. A coagulase ligada converte
fibrinognio em fibrina diretamente, sem o envolvimento dos fatores de coagu-
lao, e pode ser detectada em teste direto em lmina (suspenso de
Staphylococus + 2 gotas de plasma citratado e em movimentos circulares,
observar formao de cogulo num tempo de 1 a 2 minutos).
Pode se tornar mais sensvel o teste em tubo, devido a este detectar
tanto coagulase livre como coagulase ligada, sendo a prova de escolha. A
coagulase livre reage com o fator de coagulao do plasma, o CRF, formando
uma substncia semelhante (mas no idntica) trombina, que, agindo indire-
tamente, converte fibrinognio em fibrina. Utilizando plasma citratado humano
ou de coelho, estril, dilumos numa proporo 1:4 em soluo fisiolgica e
distribumos 0,5 mL em tubos 13 x 100.
Segundo alguns autores, a produo da enzima coagulase se intensi-
fica quando a bactria cultivada em meio com alta concentrao de NaCl,
portanto, aconselhamos utilizar, para a prova, colnias crescidas em meio gar
manitol salgado. Este procedimento aumentar a sensibilidade do teste.
Semear uma alada do germe em estudo em um tubo contendo o
plasma diludo e incubar a 37C por 24 horas.
Bacteriologia | 385
S.aureus S.epidermidis S.saprophyticus

COAGULASE +
A menor coagulao considerada prova positiva. Devem ser feitas

leituras peridicas (a cada 2 horas), pois algumas espcies tambm produzem
estafiloquinase, que ativa o fibrinognio gerando plasmina que dissolve a rede
de fibrina (cogulo formado).
Aconselhamos, tambm, utilizar sempre um teste-controle positivo
com uma amostra de S.aureus previamente conhecida, como controle da qua-
lidade do teste.
Prova DNase
A presena de DNA no meio de cultura facilita a deteco de
DNase de bactrias, especialmente para a identificao de S.aureus, assim
como para outras espcies bacterianas.
Usar o meio de gar DNase, distribudo em placas de Petri. Colocar
na superfcie do gar um ponto definido de semeadura (spot) com a bactria
em estudo. Incubar em 35 a 37C, por 18 a 24 horas.
Leitura: Gotejar, sobre o crescimento bacteriano, cido clordrico 1N e aguar-
dar a turvao do meio. Caso o teste se apresente positivo, observaremos um
halo claro ao redor do repique.

COAGULASE +
Sensibilidade a discos impregnados com Novobiocina e Polimixina B:
SENSIBILIDADE NOVOBIOCINA POLIMIXINA B

S. aureus S R
S.epidermidis S R
S. saprophyticus R S
Resumo:

CATALASE + + +
MANITOL +
DNase +
SENSIBILIDADE A S S R
NOVOBIOCINA
SENSIBILIDADE A R R S
POLIMIXINA B
22.2.2. Streptococcus
O gnero apresenta como espcies de interesse mdico os Streptococcus

viridans, os Streptococcus, produtores de hemlise b (Streptococcus pyogenes),
o Streptococcus pneumoniae, e o Streptococcus faecalis (atualmente no
gnero Enterococcus). Morfologicamente, se apresentam em forma de cadeia
ou em pares e tintorialmente como Gram-positivos.
Bacteriologia | 387
Os Streptococcus foram descritos, em 1874, por Billroth, causando

pus em leses de erisipela e em feridas. Em seguida, foram isolados do
sangue de pacientes em estado febril e de garganta de criana com escarlatina.
Em 1903, Schottmller props que os estreptococos fossem classifica-
dos conforme a capacidade de lisar hemcias in vitro e, em 1919, Brown
chamou de alfa (a), beta (b) e gama (g) as lises observadas nas hemcias em
placa de gar sangue (item 16.1 deste captulo).
Os estreptococos alfa-hemolticos apresentam zonas de hemlise, pos-
suindo hemcias ntegras, na parte mais interna junto a colnia, e hemlise
maior, na parte mais externa. Frequentemente, aparece uma colorao esverdeada
na rea de hemlise (devido alterao das hemoglobinas pelo sistema oxi-
redutor da clula bacteriana), que originou a qualificao estreptococos do
grupo viridans. O Streptococcus pneumoniae apresenta hemlise alfa e uma
colnia puntiforme, com um aprofundamento no pice da colnia (parecendo
um pequeno vulco).
Os estreptococos beta-hemolticos produzem uma zona de hemlise
total, no se observando hemcias integras (microscpio tico com objetiva de
10 X). O Streptococcus pyogenes apresenta dois tipos de hemolisinas O e
S. A hemolisina O inibida pela ao do oxignio atmosfrico e, portanto,
s demonstrada em colnias crescidas em profundidade no gar sangue. A
hemolisina S estvel ao oxignio do ar e produz hemlise, mesmo nas
colnias crescidas na superfcie do meio de cultura. Como cerca de 15% dos
Streptococcus apresentam hemolisina O, se torna necessrio a semeadura pela
tcnica do gar-fundido ou pour plate (gar sangue resfriado a 45C e
incorporado suspenso bacteriana em estudo). Alguns microbiologistas pre-
ferem produzir pequenas fendas nas placas ( stabs) para introduzir a bactria no
interior do meio de cultura.
Os estreptococos gama no produzem hemlise e a espcie associada
patogenia humana foi para o gnero Enterococcus (Streptococcus faecalis).
Cultura (Pour Plate)

Fazer uma suspenso do material colhido em um tubo contendo 1
mL de soluo fisiolgica estril e adicionar a uma placa de Petri estril. Juntar
o gar sangue resfriado e promover movimentos circulares para espalhar o
inculo por todo o meio.
Incubar a 37C por 18 horas em atmosfera de microaerofilia (me-
lhor rendimento), ou jarra com vela.
Leitura: observao do tipo de hemlise em gar sangue:
Provas:
A. Optoquina
Colocar um disco de optoquina na superfcie do gar sangue
(pode-se incluir no antibiograma). Havendo impedimento do crescimento
das colnias ao redor do disco de optoquina (2 cm de dimetro), trata-se
de teste positivo.
B. Solubilidade da bile em caldo
Usada para identificao do S. pneumoniae, atravs do desoxicolato
(reagente biliar ) que ativa as enzimas autolticas do microrganismo (capa-
zes de lisar seletivamente o S. pneumoniae, quando adicionados s clulas
Bacteriologia | 389
bacterianas em fase de crescimento). A prova realizada conforme esque-

ma que se segue:
a) A 1,0 mL de cultura em caldo, (18-24h/35C) adicionar uma
gota de vermelho de fenol (1% em gua).
b) Acertar pH em torno de 7,0 com NaOH 0,1 N (cor rsea).
c) Adicionar aproximadamente 4 gotas (0,5 mL) de desoxicolato
de sdio (10%) ou bile. Incubar juntamente com um tubo sem bile (adiciona-
do de 0,5 mL de salina) em estufa ou banho maria a 35 oC por 3 horas,
observando a cada hora.
Resultado: Solvel em bile: Clareamento visvel da suspenso do
tubo com desoxicolato (o outro fica inalterado) positivo. Insolvel em bile:
Inalterado, idntico ao tubo controle negativo.
C. Bacitracina
Utilizar discos impregnados com bacitracina (0,05 U) colocados na
superfcie do meio de cultura semeado com o germe em estudo (pode-se
incluir no antibiograma) e incubar em 35 a 37 oC por 24h, em atmosfera com
baixo teor de O2.
Interpretao - Grupo A - sensvel a bacitracina.
Demais grupos Resistentes.
Na prtica do laboratrio, sabemos que 10% das cepas de
estreptococos do grupo C e G e 5% das do grupo B tambm podem ser
sensveis, por isso sugere-se fazer essa prova associada com a sensibilidade ao
sulfametoxazol-trimetoprim, pois os microrganismos do grupo C e G so usu-
almente sensveis.
D. Crescimento a 56C
Para evitar dvidas entre estreptococos e enterococos, submeter a
cultura a um aquecimento de 56C por 30 minutos. Somente os Enterococcus
resistem a este tratamento.
E. Crescimento em meio de Chapman

Os enterococos toleram altas concentraes de NaCl, como acontece
com os estafilococos. Isso diferencia os enterococos de estreptococos do grupo D
(S.bovis e S.equinus). Podemos tambm semear a amostra em meio lquido,
porm, com 6,5% de NaCl, incubar de 18 a 24 horas e verificar o crescimento.
F. Crescimento em gar EMB
Os enterococos crescem na presena do corante azul de metileno.
G. Teste de CAMP (Christie, Atkins e Mnch-Petersen)
Usado para identificao presuntiva de estreptococos do grupo B
(S.agalactiae). Este teste realizado usando uma cepa (ATCC 25923) de
Staphylococcus aureus produtora de b-hemolisina, que tem sua atividade
hemoltica intensificada por uma protena extracelular (fator CAMP), forma-
da por estreptococos do grupo B (hemolticos ou no), produzindo uma
hemlise sinrgica em gar sangue. Essa prova deve ser realizada em con-
junto com outras, pois alguns estreptococos do grupo A tambm podem
promover tal reao.
23. Apndice
A. Mtodo de Giemsa
O Giemsa um corante utilizado em Microbiologia, Hematologia e Histologia
para colorao de clulas.
Aps confeco de um esfregao fino, deix-lo secar ao ar e fix-lo por 3
minutos com lcool etlico.
Cobrir a lmina com a soluo de Giemsa diluda e deixar corar de 20 a 30
minutos.
Aps o tempo necessrio, lavar com forte jato de gua e secar entre papel
de filtro.
Bacteriologia | 391
- Diluio do corante:
A soluo de Giemsa dever ser diluda com gua destilada neutra (pH 7 a
7,2) no momento do uso.
A diluio deve ser feita pelo gotejamento do corante sobre a gua sem
agitao vigorosa.
A diluio para a colorao de 30 minutos corresponde a 2 gotas por mL de
corante.
B. Meio de Loewenstein-Jensen
Utilizado para isolamento primrio de micobactrias, este meio vem sendo
substitudo por outros mais sensveis para recuperao de amostras clnicas,
como o gar 7H10 e 7H11 de Middlebrook, porm ainda usado em
muitos laboratrios clnicos.
Componentes:
Fosfato monopotssico anidro....................................2,4 g
Sulfato de magnsio 7 H2O....................................0,24 g
Citrato de magnsio..............................................0,60 g
L-Asparagina........................................................3,6 g
Fcula de batata......................................................30 g
Ovos homogeneizados........................................1000 mL
Glicerina bidestilada...............................................12 mL
gua destilada....................................................600 mL
Soluo de verde de malaquita a 2%............................20 mL
Soluo de verde de malaquita 2% - Frmula:

Verde de malaquita .................................................2 g
gua destilada ...................................................100 mL
Preparo da soluo de verde de malaquita:
1. Pesar o verde de malaquita e adicionar a gua.
2. Homogeneizar bem at dissolver o corante.
3. Esterilizar em vapor fluente durante 30 minutos.
4. Reservar a soluo.
Preparo do meio:
a) Dissolver os sais e a asparagina na gua (dissolver aquecendo lentamente);
b) Juntar os outros componentes, menos os ovos e o verde de malaquita, e
autoclavar a 120oC por 30 minutos.
c) Resfriar a base 45 - 50C.
d) Tomar 2 dzias de ovos frescos, lavar bem com gua e sabo, escovando
cada ovo individualmente com uma escova macia, e imergir durante 30 minutos
em lcool etlico a 70. Sec-los com pano estril.
e) Quebrar os ovos semiassepticamente em frasco estril, tranferindo-os para
uma proveta estril de 1000 mL at completar o volume.
f) Agitar para homogeneizar (poder utilizar liquidificador estril ou balo
estril com prolas de vidro).
g) Filtrar em quatro camadas de gaze passando para o balo que contm a
base fria.
h) Adicionar o verde de malaquita.
i) Homogeneizar bem.
j) Deixar repousar durante 30 minutos para as bolhas da superfcie estourarem.
Bacteriologia | 393
k) Distribuir 10 a 12 ml por tubo de rosca estril.

l) Colocar os tubos no coagulador, inclinados (ngulo de 45), durante 50
minutos a 85C - se no tiver coagulador, pode-se coagular os ovos em
banho de areia 85C colocado em estufa de esterilizao, tambm por 50
minutos, tendo o cuidado de verificar a temperatura constantemente. Pode-se
tambm usar o forno a 85 oC ou mesmo em autoclave fechada, sem expulso
do ar (verificar temperatura).
m) Incubar por 48h a 36oC (teste de esterilidade), proteger contra a evapo-
rao e conservar em geladeira. Usar, no mximo, at um ms aps o preparo.
C - Hidrlise do hipurato
Verifica a capacidade do microrganismo de hidrolisar o hipurato de sdio em
glicina e cido benzico. Pode ser utilizado para diferenciar distintos microrga-
nismos como estreptococos do grupo B (S.agalactiae) ou mesmo espcies
termoflicas de Campylobacter (C.jejuni + e C.coli -).
O microrganismo semeado em caldo com o hipurato de sdio e incubado
por 18 a 24h a 35C. Aps este perodo o caldo centrifugado e no
sobrenadante (0,8 mL) adicionado 0,2 mL de cloreto frrico (FeCl) for-
mando um precipitado abundante que, se perdurar por mais de 10 minutos,
evidencia a presena do cido benzoico (prova do hipurato positiva).Outra
alternativa usar o reagente de ninhidrina que detecta a glicina livre. Neste
caso h a formao de colorao azul-escura.
No caso de Campylobacter, suas exigncias de crescimento dificultam a incuba-
o descrita, ento uma massa de clulas proveniente de crescimento anterior
acrescentada ao caldo hipurato para realizao da prova.
D- Mtodos de teste de sensibilidade aos antimicrobianos para anaerbios

sugerido pelo CLSI
Mtodo de diluio em gar:
Escolher o antimicrobiano a ser testado.
Diferentes concentraes dos antimicrobianos so misturadas ao gar Wilkins-
Chalgren, o qual fundido e vertido em placas de Petri.
At 36 isolados so testados para cada placa por inoculao pontual (repicador
de Steers ou similar).
Aps 48h em jarra hermtica tipo GasPak ou cmara de anaerobiose, faz-se
a leitura (determina a CIM).
Este mtodo, apesar de muito funcional, complicado para Clostridium sp.
que apresentam crescimento disseminado.
Mtodo de diluio em caldo em microtubos (DM)

A CIM dos diferentes antimicrobianos determinada em placas de
microtitulao.
Os meios de escolha de acordo com o CLSI so o caldo BHI, o caldo de
Schaedler modificado e o de Wilkins-Chalgren (WC) J outros rgos
padronizadores, como o IUMC, sugerem Difco Anaerobe Broth.
O meio com as diferentes concentraes dos antimicrobianos (0,5, 1, 2, 4,
8, 16, 32 e 64 mg/mL) distribudo em placa de microtitulao - 0,1mL
para cada uma das 96 cubetas da placa com pipeta semiautomtica. Estas
placas podero se armazenadas em plsticos e congeladas em freezer a -70 oC,
de 4 a 6 meses.
No momento da utilizao, descongela-se a placa em temperatura ambiente
e adiciona-se o cultivo ativo (18 a 24hs) em caldo Schaedler, diludo 1:100
incuba-se por 48hs em anaerobiose.
Podemos, ento, ler a CIM (menor concentrao que inibe completamente o
crescimento), que corresponde cubeta lmpida.
Tabela de percentuais de positividade, para diferenciao bioqumica, simplificada das principais Enterobacteriaceae estudadas na clnica
Bacteriologia | 395
Obs1: Shigella grupo A, B, C diferenciao: Grupo A: manitol (-), Grupo B e C: manitol (+). A diferenciao final sorolgica.
Obs2: Para identificao completa de Salmonella e Escheria coli, dever ser realizada sorologia complementar.
(Tabela de Farmer et al., 1985, atualizada com informaes contidas em Koneman, 2001 e Jawetz et al., 2009.)
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| 399
Captulo 4
Micologia
Aurea Maria Lage de Moraes
Rodrigo de Almeida Paes
Vernica Leite de Holanda
1. Introduo micologia
Os fungos so organismos que convivem conosco todos os dias. Estes
organismos so encontrados praticamente em qualquer local do ambiente que
nos cerca, inclusive no ar, onde estruturas reprodutivas, na forma de esporos
ou condios, esto prontas para, ao cair em um substrato adequado, desenvol-
ver novas estruturas vegetativas e reprodutivas.
Estes organismos, muitas vezes, nos so teis, decompondo resdu-
os orgnicos, causando a decomposio ou a degradao de alimentos, ou
mesmo atacando seres vivos, parasitando-os e, eventualmente, causando a
sua morte.
Os fungos so importantes, tanto do ponto de vista ecolgico quanto
econmico. Ecologicamente, so considerados os lixeiros do mundo, pois
degradam todo tipo de restos orgnicos, independente da origem, transfor-
mando-os em elementos assimilveis pelas plantas. J, economicamente, tm
implicaes em vrias reas: Medicina humana e veterinria, Farmcia, Nutri-
o, Fitopatologia, Agricultura, Biotecnologia, entre outras.
Os fungos tiveram seu grupo reconhecido como um reino a partir da

descrio de cinco reinos por Whittaker em 1969. Esses organismos foram
alocados em reinos com base na morfologia e no modo de nutrio dos seres
vivos, sendo criado, ento, o reino Fungi. Em 1990, Carl Woese props o
agrupamento dos cinco reinos estabelecidos por Whittaker em trs domnios:
Archaea, Eubacteria e Eukaria, onde o reino Fungi faz parte do domnio
Eukaria, que rene todos os eucariontes.
A Micologia , portanto, a rea da Biologia destinada ao estudo
dos fungos.
1.1. Elementos fundamentais dos fungos e Citologia

Os fungos so organismos eucariontes, unicelulares (leveduriformes) ou
multicelulares (filamentosos), haploides (homo ou heterocariticos), com pa-
rede celular contendo quitina e a-glucano. No apresentam plastos ou pig-
mentos fotossintticos.
Todos os fungos conhecidos, com poucas excees, tm origem nos
esporos (reproduo sexuada) ou condios (reproduo assexuada), corps-
culos que podem ser comparados s sementes das plantas superiores, embora
no sejam morfologicamente semelhantes a estas.
Os esporos ou condios, para germinarem, necessitam de calor e
umidade e o resultado desta germinao a formao de um ou mais filamentos
finos, conhecidos como tubos germinativos. Estes tubos se ramificam em
todos os sentidos formando uma massa filamentosa, chamada miclio, que
constitui o sistema vegetativo, responsvel pelo desenvolvimento fngico e
pela absoro dos alimentos. Os filamentos simples ou ramificados que
formam o miclio so denominados hifas. Na maioria dos casos, o sistema
vegetativo encontra-se no interior dos tecidos parasitados, no solo ou na
matria orgnica em decomposio.
Micologia | 401
Com a formao dos esporos ou condios necessrio que estes

tenham acesso livre ao ar, para assegurar sua disseminao. Realiza-se, ento,
uma diferenciao das hifas vegetativas, geralmente levantadas verticalmente
sobre o plano do miclio, conhecido como esporforo ou conidiforo, e
sobre estes se originam os esporos ou condios. As hifas, por sua vez,
podem ser apocticas (com septo) ou cenocticas (sem septo).
O ciclo de vida dos fungos compreende duas fases. Uma somtica,
caracterizada por atividades alimentares, e outra reprodutiva, onde os fun-
gos podem realizar reproduo sexuada ou assexuada. Em ambos os casos,
um grande nmero de estruturas formado, dependendo da espcie. As
estruturas assexuadas, como tambm as sexuadas, podem ser formadas
isoladamente ou em grupos, neste caso, formando corpos de frutificao.
Assim, condios podem ser formados em conidiforos isolados ou agrupa-
dos, constituindo ento os conidiomas. Os esporos podem ser formados
em ascomas (onde so formados os ascos) ou basidiomas (onde so for-
mados os basdios).
De acordo com tipo de reproduo realizada, os fungos podem ser
divididos em trs grupos:
Holomorfo: aquele que no ciclo de vida realiza ambas as reprodu-
es, sexuada e assexuada.
Anamorfo: aquele que no ciclo de vida realiza apenas a reprodu-
o assexuada.
Teleomorfo: aquele que no ciclo de vida realiza apenas a reprodu-
o sexuada.
Esquema do ciclo de vida geral do fungo.
1.2. Nutrio, metabolismo e habitat

Os fungos so considerados seres heterotrficos, necessitando de materiais
orgnicos j formados, que servem como fonte de energia e como constituintes
celulares. Por causa da rigidez da parede celular, sua nutrio por absoro de
nutrientes solveis simples. Realizam respirao celular ou fermentao para obten-
o de energia, e sua reserva energtica sob a forma de glicognio.
Devido ausncia de clorofila nos fungos, torna-se necessrio que o
substrato fornea as substncias j elaboradas indispensveis alimentao,
obrigando os fungos a viverem em estado de saprofitismo, parasitismo, simbiose
(liquens, por exemplo) ou mutualismo. Eles podem ser subdivididos em:
Saprfitas obrigatrios Fungos que vivem exclusivamente em matria
orgnica morta, no podendo parasitar organismos vivos.
Parasitas facultativos ou saprfitas facultativos Fungos capazes de
causar doenas ou de viver em restos orgnicos, de acordo com as
circunstncias.
Micologia | 403
Parasitas obrigatrios Fungos que vivem exclusivamente atacando

organismos vivos.
Os fungos so considerados seres cosmopolitas, pois esto presentes
em qualquer parte do planeta. Sendo amplamente distribudos pela natureza,
so encontrados na gua, no ar atmosfrico, no solo, sobre os animais e
vegetais vivos, na matria orgnica em decomposio, nos produtos alimentci-
os e industriais.
A maioria dos fungos tm como necessidades nutricionais, os elemen-
tos C, O, H, N, P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Mo, Fe e Zn. Muitas espcies
no necessitam de luz para seu desenvolvimento, j outras necessitam para
formar suas estruturas de reproduo, podendo ser consideradas fototrficas
(que buscam a luz). A temperatura ideal para o crescimento dos fungos fica
entre 0 a 350C, mas o timo para a maioria fica entre 20 a 300C e a
umidade ideal fica em torno da saturao.
1.3. Posio sistemtica dos fungos

O reino Fungi dividido em sete filos, (Chytridiomycota,
Neocallimastigomycota, Blastocladiomycota, Microspordia, Glomeromycota,
Ascomycota e Basidiomycota), e um grupo, os fungos anamrficos. Este
grupo no possui valor taxonmico, sendo seus membros relacionados aos filos
Ascomycota e Basidiomycota.
A taxonomia dos fungos tradicionalmente baseada em caracteres
citolgicos e morfolgicos. Mas, atualmente, com o desenvolvimento de tc-
nicas bioqumicas e moleculares, novos caracteres foram adicionados como
auxlio na identificao das espcies fngicas. Tais como as tcnicas baseadas
em PCR (RAPD, RFLP, AFLP), sequenciamento de DNA, isoenzimas e
cromatografia (TLC, HPLC, CG, espectometria de massa).
1.3.1. Filo Chytridiomycota
Os representantes do filo Chytridiomycota so considerados cosmo-

politas e saprfitos aquticos. A maioria de gua doce poucos so
marinhos. A principal caracterstica do grupo a formao de zosporo
flagelado, estruturas de propagao no ambiente aqutico, onde o flagelo
ajuda na sua movimentao.
Ex: Chytriomyces sp.
1.3.2. Filo Neocallimastigomycota
So encontrados no sistema digestivo dos grandes mamferos herbvoros

e possivelmente em outros ambientes anaerbios terrestres e aquticos. Tratam-
se de zosporos no flagelados.
Ex: Neocallimastix sp.
1.3.3. Filo Blastocladiomycota

Seus representantes apresentam reproduo assexuada com zosporo
de um nico flagelo, e reproduo sexuada atravs da fuso de planogametas.
So habitantes restritos de gua e solo e parasitos de insetos.
Ex: Allomyces sp. e Coelomomyces sp.
1.3.4. Filo Microspordia
Organismos eucariontes sem mitocndria e flagelo desconhecido. So

parasitas obrigatrios de animais, e comumente atacam peixes e insetos. Estes
organismos foram includos no reino Fungi aps estudos filogenticos.
1.3.5. Filo Glomeromycota
O filo Glomeromycota representado por fungos de micorrizas

arbusculares (FMA). Participam de uma associao mutualstica com as razes
Micologia | 405
de algumas plantas, na qual a planta, atravs da fotossntese, fornece energia e

carbono para a sobrevivncia e multiplicao do fungo, enquanto este absorve
nutrientes, minerais e gua do solo transferindo-os para as razes da planta.
Tambm so considerados cosmopolitas. Foi includo neste grupo os represen-
tantes do antigo filo Zygomycota, que tem como principais caractersticas, hifas
cenocticas e a formao de zigospornangio, por reproduo sexuada; e
esporngio, por reproduo assexuada. Os esporngios so estruturas forma-
doras de propgulos para disperso.
Ex: Mucor sp. e Glomus sp.
1.3.6. Filo Ascomycota
O filo Ascomycota compreende o maior grupo do reino Fungi, consti-

tudo de aproximadamente 75% de todos os fungos descritos. Seus represen-
tantes so considerados cosmopolitas e so encontrados na natureza como
saprfitos, parasitas (especialmente de plantas), ou em associao mutualstica
(com algas unicelulares) formando os liquens.
A principal caracterstica do grupo a presena de asco contendo
ascosporos, geralmente oito, que representam a estrutura de propagao do
grupo. So produzidos por reproduo sexuada.
A reproduo assexuada tambm pode ser encontrada. O asco for-
mado em uma estrutura denominada ascocarpo (corpo de frutificao), que
pode ser encontrado nas seguintes formas: apotcio (ascocarpo em forma de
taa), cleistotcio (ascocarpo totalmente fechado, que se rompe com a matu-
ridade), e peritcio (ascocarpo em forma de balo, com um poro na sua
ponta). A ausncia da formao de ascocarpo tambm observada, sendo
este considerado como ascos nus.
Ex: Eurotium sp. e Emericella sp.
1.3.7. Filo Basidiomycota
Os representantes do filo Basidiomycota so considerados cosmopolitas

e saprfitos. So comumente denominados cogumelos. Tm como principal
caracterstica a presena de basdio contendo basidiosporos, geralmente qua-
tro, produzidos por reproduo sexuada.
A reproduo assexuada tambm pode ser encontrada. O basdio
formado a partir de um basidiocarpo, sendo este constitudo, basicamente, por
pleo (o chapu do cogumelo), lamela (estrutura pregueada abaixo do pleo,
onde se encontram os basidios) e estirpe (estrutura que sustenta o pleo).
Ex: Agaricus sp. e Rhodotorula sp.
1.3.8. Fungos Anamrficos
Os Fungos Anamrficos formam um grupo de fungos onde a reprodu-

o assexuada predominante, com a formao de condios como estrutura de
propagao.
A reproduo sexuada ausente, desconhecida ou teve a capacidade
perdida. Esse grupo est relacionado a gneros do filo Ascomycota e
Basidiomycota por comparao de sequncias gnicas. So considerados como
cosmopolitas, saprfitos, e parasitas de animais e plantas.
Os condios so formados por clulas conidiognicas, presentes nos
conidiforos, que so prolongamentos de hifas modificadas, com funo
reprodutiva. Os condios podem ter diferentes formas, tamanhos e cores,
podem possuir ou no a superfcie texturizada, ornamento ou septo.
Ex: Aspergillus sp e Penicillium sp.
2. Por que estudamos os fungos

Por
Os fungos so conhecidos da humanidade h vrios sculos, tanto por
seus benefcios quanto pelos problemas que causam. Muitas doenas huma-
Micologia | 407
nas, de animais e plantas (micoses) so causadas por fungos. Em humanos e

animais os fungos podem causar alergias respiratrias e cutneas leves ou inten-
sas, dependendo da suscetibilidade e pr-disposio do indivduo. Podem
causar infeces em mucosas e outros tecidos subcutneos, assim como infec-
es crnicas e letais envolvendo rgos inteiros. Cada tecido ou rgo do
corpo humano pode ser afetado, com exceo dos dentes.
Ns dependemos da agricultura para nos fornecer alimentos, principal-
mente os gros de cereais (milho, trigo, aveia, amendoim, etc.) que alimentam
tanto os humanos quanto os animais. Doenas fngicas em cereais causam
perdas significantes na agricultura, tanto para o consumo interno quanto para a
exportao de gros atividade to importante em nossa economia. Alm
disso, o ataque dos fungos no se restringe ao campo de produo, eles
atacam tambm os gros estocados causando sua destruio ou produzindo
toxinas carcinognicas potentes (micotoxinas) dentro destes gros.
Os fungos tm sido utilizados para os mais diferentes propsitos, desde
a antiguidade. O uso mais antigo deles tem sido como alimento, propriamente
dito, tendo sido utilizado mais tarde tambm na indstria alimentcia para a
produo de pes, queijos, cervejas e vinhos. O sabor e a textura de muitos
alimentos, como os queijos e o molho de soja, so dados pelos fungos usados
em sua fabricao. Posteriormente, foi descoberto o poder dos fungos na
produo de metablitos que poderiam ser teis, como a Penicilina.
Estudos em Biotecnologia e Engenharia gentica propiciaram a pro-
duo destes metablitos em larga escala. Hoje produtos fngicos usados
comercialmente incluem cidos orgnicos, etanol, alguns antibiticos (alm
da Penicilina), pigmentos, vitaminas, enzimas e pesticidas biolgicos. Alm
de se tornarem valiosos objetos de pesquisa, em particular, como modelos
eucariontes, uma vez que so facilmente manipulados em laboratrio, for-
necendo informaes importantes sobre a bioqumica, a gentica e a biolo-
gia molecular dos eucariontes.
3. Micologia Mdica
A Micologia mdica tem como principal objetivo estabelecer o diag-
nstico micolgico das infeces por fungos, que por sua vez se baseia em
correta coleta e processamento de espcimes clnicos. A observao das nor-
mas de preservao, e transporte adequados dos materiais clnicos at os locais
de processamento, como laboratrio de Microbiologia/Micologia tambm tem
enorme importncia para a obteno de resultados acurados.
3.1. Classificao das micoses

Didaticamente, podemos dividir as micoses em grupos, como demons-
trado a seguir:
3.1.1. Micoses superficiais e cutneas
As MICOSES SUPERFICIAIS so infeces causadas por

fungos que invadem as camadas mais superficiais da capa
crnea da pele ou a haste livre dos pelos. As leses se
manifestam como mancha pigmentar na pele, ndulo ou
pelos. A forma invasiva do fungo uma hifa, caracterstica
de cada micose.
A piedra negra uma micose causada pela Piedraia hortae. Esta micose
consiste em ndulos duros, de cor escura, localizados na haste dos pelos e
bastante aderentes a eles. Em parasitismo, o fungo se apresenta como um
emaranhado de hifas intimamente unidas. Essas hifas so de cor castanha e tm
parede e septos espessos. Os ndulos constituem, na verdade, um ascostroma,
pois em meio ao enovelado de hifas formam-se lculos ovalados contendo
oito ascsporos. J a piedra branca causada por leveduras do gnero
Trichosporon. Nesta infeco o fungo cresce sobre a haste dos pelos, forman-
do ndulos de hifas hialinas septadas e ramificadas, facilmente destacveis dos
Micologia | 409
pelos, que podem se desarticular, resultando em artrocondios retangulares que

se tornam esferides ou polidricos.
Leveduras do gnero Malassezia so os agentes da pitirase versicolor.
Esses fungos vivem normalmente sobre a pele do homem, na forma de levedura.
Usualmente podem filamentar e invadir as clulas queratinizadas das camadas
superficiais da pele, determinando a micose. A doena se manifesta como
manchas descamativas distribudas pelo trax, abdome e membros superiores.
Ao contrrio do que muitos pensam, a micose no adquirida na praia; o que
ocorre que quando o doente se bronzeia, os locais da pele onde o fungo
est em parasitismo no se queimam, permitindo que as leses possam ser
visualizadas com maior facilidade. O diagnstico definitivo se d somente pelo
exame direto atravs da observao de hifas curtas e curvas e elementos redon-
dos. A Malassezia no cresce nos meios de cultura habituais usados na rotina
porque necessita de suplemento lipdico para seu crescimento.
As MICOSES CUTNEAS se caracterizam por serem

causadas por fungos que invadem toda a espessura da
capa crnea da pele ou a parte queratinizada intrafolicular
dos pelos ou a lmina ungueal. Na pele, as leses se
manifestam como mancha inflamatria, nos pelos como
leso de tonsura e na unha por destruio da lmina
ungueal. O contgio feito atravs de animais, homens
ou de solo infectado.
As dermatofitoses constituem manifestaes clnicas muito variadas cau-

sadas por um grupo de fungos, denominados dermatfitos, que produzem
leses na pele, pelos ou unhas. Os fungos dermatfitos degradam queratina e
pertencem aos gneros Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton. H
reconhecidamente 27 espcies patognicas para o homem, dentre as quais 15
ocorrem no Brasil. Destas, as principais so: Trichophyton rubrum,
Epidermophyton floccosum, T. mentagrophytes, Microsporum canis, M.

gypseum e T. tonsurans.
As dermatofitoses podem ser classificadas nas seguintes modalidades
clnicas: dermatofitose ou tinha do couro cabeludo, da pele glabra, da
barba e da face, dos ps, das unhas e inguinal, dependendo da localizao
da leso no paciente. J nos cabelos, pela relao com os fungos, podem
ser diferenciados dois tipos de parasitismo: endotrix, onde os artrocondios
se localizam somente no interior do pelo, esse causado, por exemplo, por
T. tonsurans; e ectotrix, onde os artrocondios se dispem no interior e ao
redor do fio de cabelo. Podemos citar M. canis e T. mentagrophytes
como agentes deste tipo de parasitismo pilar.
Em cultivo, os dermatfitos, em sua maioria, produzem dois tipos de
condios: macrocondios e microcondios que, juntamente com a caracters-
tica macroscpica da colnia, vo permitir a identificao das diferentes
espcies dos dermatfitos. Os macrocondios so caractersticos dos se-
guintes gneros:
Microsporum So fusiformes, grandes, multisseptados de pare-
des rugosas.
Epidermophyton So clavados, robustos bi ou trisseptados com
paredes lisas e espessas.
Trichophyton Quando existentes so delicados, clavados,
multisseptados de paredes finas e lisas.
O quadro a seguir mostra as caractersticas macro e micromorfolgicas
que so observadas nas colnias dos principais fungos responsveis por
dermatofitoses.
Micologia | 411
Fungo dermatfito Macromorfologia Micromorfologia

Trichophyton rubrum Colnia branca, granular ou Microcondios em gota de
cotonosa, com pigmento lgrima dispostos ao longo
vermelho no verso da hifa e macrocondios,
que quando existem, so
comuns do gnero
T. mentagrophytes Colnia branca, granular ou Macrocondios do gnero,

cotonosa, com pigmento microcondios redondos
que vai do amarelo ao numerosos
marron no verso
T. tonsurans Colnia acastanhada com Microcondios numerosos e
pigmento vermelho- polimrficos, usualmente
ferruginoso no verso clavados ou alongados
Microsporum canis Colnia branca, penugenta Macrocondios fusiformes,

com pigmento amarelo multisseptados de paredes
alaranjado no verso rugosas e mais espessas que
a dos septos, poucos
microcondios
M. gypseum Colnia pulverulenta de cor Numerosos macrocondios
camura, com pigmento fusiformes, multissepados,
pardo no verso de paredes rugosas e finais
poucos microcondios
Epidermophyton flocosum Colnia membranosa de Macrocondios em grupos

cor verde-limo de trs ou mais na extremi-
dade de conidiforos,
microcondios inexistentes
A candidase micose causada por leveduras do gnero Candida, em

especial pela espcie C. albicans. Elas so hspedes normais do trato
gastrintestinal do homem e fazem parte da microbiota de determinadas regies
do tegumento cutneo. Porm a Candida pode invadir a camada crnea da
pele ou a lmina ungueal de hospedeiros normais. As leses tm localizao
peculiar: nas unhas das mos e nas reas intertriginosas da pele (regio inguinal,
espaos interdigitais das mos, regio submamria e axilar). Tambm possvel
ocorrerem leses nas unhas dos ps.
H ainda outras micoses de pele e de unha que no so causadas nem
por fungos dermatfitos nem por fungos do gnero Candida. Dentre esses
fungos destacam-se: Fusarium sp., Scytalidium dimidiatum, e S. hyalinum
que podem causar leses principalmente em unhas e em espaos interdigitais
dos ps. Em cultivo, S. dimidiatum se apresenta como colnia cotonosa,
branca no incio tornando-se cinza a negra em dez dias. Microscopicamente,
se compe de hifas demceas e hialinas, com artrocondios septados e no
septados. S. hyalinum considerado um mutante de S. dimidiatum incapaz
de sintetizar melanina e, com isso, as hifas e os condios so sempre hialinos.
As culturas de Fusarium sp. podem ser as mais variadas possveis, quanto
macroscopia. Esta depender da espcie que causa a leso. Porm, micros-
copicamente, o que caracteriza Fusarium sp. a presena de macrocondios
em forma de lua, bi ou trisseptados.
3.1.2 . Micoses subcutneas
As MICOSES SUBCUTNEAS se caracterizam por

resultar da inoculao de um fungo patognico por oca-
sio de um traumatismo, manifestando-se como tumefao
ou leso supurada da pele ou do tecido subcutneo,
produto da disseminao do fungo por contiguidade ou
por via linftica, porm limitada ao territrio aqum do
linfonodo regional.
A esporotricose tem como agente Sporothrix schenckii. Esse um

fungo dimrfico, logo, muda entre as formas miceliana e leveduriforme, de
acordo com a temperatura e as condies do ambiente onde se encontra.
Assim sendo, S. schenckii, em parasitismo nos tecidos apresenta-se como
Micologia | 413
elementos leveduriformes bem pequenos, com brotamento geralmente em

forma de charuto. Na natureza, em associao a vegetais e madeira, vive na
forma filamentosa. A transmisso clssica da esporotricose se d por traumatismo
causado por vegetais onde o fungo se encontra ou pela forma zooflica, ou
seja, atravs de leses provocadas por animais infectados por S. schenckii,
em especial gatos, como vm ocorrendo no estado do Rio de Janeiro, que
uma rea endmica de esporotricose. A leso inicial da esporotricose
uma ppula ou ndulo que surge no ponto da inoculao, usualmente loca-
lizado nos membros. Desse local o fungo pode propagar-se por contiguidade,
determinando uma leso circunscrita ou por via linftica, ocasionando o apa-
recimento de ndulos em nmero varivel sobre o trajeto de um linftico
superficial. O diagnstico definitivo se d com o isolamento em cultivo do
fungo em amostras de pus ou bipsia das leses. Testes de deteco de IgG
e IgM em amostras de soro podem auxiliar no diagnstico e no acompanha-
mento teraputico desta infeco.
A cromoblastomicose uma infeco que se caracteriza pelo aspecto
parasitrio de seus agentes: o corpo muriforme. Esses so elementos globosos,
com parede acastanhada espessa e septados em planos distintos. Podem ser
visualizados tambm elementos no septados e outros com apenas um septo,
porm o que caracteriza o corpo muriforme a presena de septos em planos
diferentes. As principais espcies que podem causar cromoblastomicose no ser
humano so Fonsecaea pedrosoi, F. compacta, Cladophialophora carrionii,
Phialophora verrucosa, e Rhinocladiella aquaspersa. No Brasil, normalmente,
os casos dessa micose so causados por F. pedrosoi, aps traumatismo com
matria orgnica vegetal.
Micetoma o nome coletivo de micoses produzidas por algumas esp-
cies de fungos ou de actinomicetos aerbios, os quais, nos tecidos, se organi-
zam em um agregado de hifas ou filamentos bacterianos, denominados gros.
Os agentes de micetoma possuem habitat na natureza associado a vegetais,
nutrindo-se de outros vegetais em decomposio ou como fitopatgenos.

O micetoma eumictico se distingue do actinomictico por ser: causado por
um fungo, enquanto o actinomictico causado por bactrias filamentosas.
Os gros, de tamanho e forma variados, podem ter colorao branco-amare-
lado, vermelha ou negra. O que caracteriza a cor de um gro somente o
fungo ou actinomiceto agente da doena. Por isso, a cor do gro obtido das
leses do paciente j fornece um indicativo de qual seja o agente do micetoma.
O quadro a seguir o relata alguns desses agentes, com o respectivo tipo e
colorao dos gros:
Fungos causadores de micetoma

Gro eumictico negro Gro eumictico branco
Madurella mycetomatis Acremonium sp.
M. grisea Pseudallescheria boydii (Scedosporium apiospermum)
Pyrenochaeta romeroi Neotestudina rosatii
Exophiala jeanselmei Aspergillus nidulans (Emerciella nidulans)
Actinomicetos causadores de micetoma
Gro actinomictico vermelho Gro actinomictico branco
Actinomadura pelletieri Actinomadura madurae
Nocardia brasiliensis
N. asteroides, N. caviae
Streptomyces somaliensis
H outras micoses subcutneas de interesse, como a lobomicose e a

entomoftoramicose. No entanto, a esporotricose, cromoblastomicose e
micetomas so as mais comuns no Brasil.
Micologia | 415
3.1.3. Micoses sistmicas e oportunsticas
As MICOSES SISTMICAS se caracterizam por serem

adquiridas por inalao de propgulos fngicos, sendo,
consequentemente a leso primria pulmonar, com ten-
dncia regresso espontnea. O fungo pode se disse-
minar pelo corpo atravs do sangue, originando leses
extrapulmonares nos indivduos. Os agentes de micoses
sistmicas raramente so implantados traumaticamente; quan-
do isso ocorre, determinam uma leso granulomatosa cir-
cunscrita, com ou sem linfangite regional, que regride
espontaneamente.
Ao invadir os tecidos, os fungos desencadeiam resposta imunolgica no

hospedeiro, que pode ser evidenciada por reao intradrmica, na qual se
verifica a resposta celular dada pelo hospedeiro, por reaes de
hipersensibilidade tardia e por provas de deteco de anticorpos em amostras
de soro (imunodifuso dupla e fixao do complemento), onde avaliada a
resposta humoral. Uma reao intradrmica positiva evidencia que o indivduo
j foi previamente sensibilizado pelo fungo e as provas sorolgicas indicam que
h anticorpos contra o fungo. Porm, as provas sorolgicas podem fornecer
resultados falso-positivo e falso-negativo, visto que podem ocorrer reaes
cruzadas com outros anticorpos na prova aplicada. As provas sorolgicas auxi-
liam no diagnstico de micoses sistmicas, mas o que realmente diagnostica a
doena o isolamento do fungo em cultivo ou sua observao no exame
micolgico direto dos materiais adequados para o exame, tendo as provas
imunolgicas valor diagnstico presuntivo. As provas imunolgicas so teis
para avaliaes epidemiolgicas, para avaliao prognstica e para a triagem de
pacientes. As reaes intradrmicas apresentam valor diagnstico baixo, uma
vez que no discriminam entre infeces passadas ou recentes. Porm so de
grande valor nos estudos epidemiolgicos.
As micoses sistmicas so a coccidioidomicose, a blastomicose, a

histoplasmose, e a paracoccidioidomicose. As duas primeiras no so co-
muns no Brasil, embora sejam relatados casos de coccidioidomicose no semi-
rido do Nordeste, em especial no Piau em caadores de tatus, que revolve-
ram o solo para desentocar a caa. H tambm a esporotricose sistmica,
que resultado da inalao de condios de S. schenckii os quais vo causar
infeco pulmonar que pode sistematizar-se. Este tipo de apresentao clni-
ca da esporotricose bastante raro. O aspecto macro e micromorfolgico
do fungo o mesmo do agente da esporotricose subcutnea.
A histoplasmose uma infeco sistmica, causada por Histoplasma
capsulatum var. capsulatum ou H. capsulatum var. duboisii. Enquanto o primei-
ro agente tem distribuio cosmopolita, o outro tem sua distribuio geogrfica
restrita ao continente africano. O cultivo de H. capsulatum temperatura
ambiente constitudo de colnia branca que, quando muito velha, assume
colorao camura. O crescimento do fungo bem lento. Microscopicamente
se observam hifas finas e delicadas e condios de dois tipos. Os macrocondios
esfricos e tuberculados so estruturas marcantes para a identificao do fungo.
Porm, a presena de microcondios esfricos necessria para a correta iden-
tificao do agente, pois h alguns fungos saprfitas, pertencentes ao gnero
Chrysosporium, que tambm produzem estruturas de propagao semelhan-
tes. Deve-se, para a correta identificao do agente da histoplasmose, realizar
a converso desse fungo para a fase leveduriforme em meios enriquecidos com
incubao a 37C. Todavia, a converso de H. capsulatum no facilmente
obtida e depende tambm das caractersticas fisiolgicas de cada isolado.
Quando convertidos fase leveduriforme observam-se colnias glabras, lisas,
branco-amarelada, e na microscopia notam-se leveduras ovais e unibrotantes.
A paracoccidioidomicose uma micose sistmica causada por
Paracoccidioides brasiliensis, caracterizada pela forma parasitria do seu agente:
clula leveduriforme mutibrotante com parede celular birrefringente. a micose
Micologia | 417
sistmica mais frequente na Amrica Latina. Afeta usualmente agricultores, que

mantm contato direto com a natureza, em principal com o solo. A micose
endmica no Brasil. As manifestaes clnicas da paracoccidioidomicose resul-
tam da inalao de elementos infectantes do fungo ou de uma reativao de
leso primria quiescente, ou seja, de uma leso adquirida h algum tempo,
muitas vezes mais de trinta anos, e que no tinha ainda se desenvolvido. O
fungo, alm de acometer o pulmo, dissemina-se para outras partes do corpo,
atingindo principalmente as mucosas do indivduo, sua pele e linfonodos. O
aspecto macroscpico da cultura de leveduras desse fungo tem colorao
creme-clara, consistncia cremosa e conseguido em meios especiais, como o
meio de Fava-Neto, com incubao a 37C. O cultivo a 25C d origem a
colnias de crescimento muito lento, filamentosas, algodoadas ou aveludadas,
compostos de uma trama de hifas sem condios.
As MICOSES OPORTUNSTICAS so causadas por

fungos termotolerantes (que crescem a uma temperatura de
37C), de baixa virulncia e que determinam doenas em
hospedeiros com graves deficincias do sistema
imunodefensivo. Esses fungos tm porta de entrada vari-
vel, usualmente provocam reao supurativa necrtica. Po-
dem acometer os mais variados rgos, produzindo qua-
dros polimrficos que se apresentam como manifestao
cutnea, subcutnea ou sistmica. Os fungos invadem os
tecidos como uma hifa.
A criptococose causada por leveduras do gnero Cryptococcus, das

quais destacam-se duas espcies: C. neoformans, que acomete principalmen-
te indivduos imunodeprimidos e C. gattii, que pode acometer indivduos
imunocompetentes. A micose de frequncia elevada nas grandes cidades,
onde so diagnosticadas suas formas clnicas mais graves. As formas subclnicas
ou as que se manifestam como infeco respiratria inespecfica devem ser
bastante frequentes. A doena endmica no Norte e no Nordeste do pas,

acometendo crianas, jovens e adultos, de ambos os sexos e todas as faixas
etrias, com ou sem depresso do sistema imunolgico. O fungo apresenta
tropismo pelo sistema nervoso central e o lquor do paciente pode simular
meningite viral, bacteriana e tambm tuberculose. As leveduras do gnero
Cryptococcus possuem uma caracterstica especial, que a presena de uma
cpsula polissacardica que envolve todo o fungo. Essa cpsula pode ser evi-
denciada em exames laboratoriais por contraste com tinta nanquim ou com a
colorao pelo Mucicarmin de Mayer. C. neoformans e C. gattii so capazes
de produzir a enzima extracelelular fenol oxidase, que extremamente til para
a identificao do agente da criptococose, pois esta enzima faz com que a
levedura se torne melanizada quando colocada em cultivo com compostos
fenlicos. Esta enzima e a cpsula polissacardica esto relacionadas com a
virulncia desse fungo ao organismo.
A aspergilose causada por membros do gnero Aspergillus que se
apresentam nos tecidos como hifas hialinas septadas e ramificadas
dicotomicamente, ou seja, num ngulo de 45. A micose se manifesta em
trs formas clnicas: a alrgica, de colonizao e a forma invasiva. Poucos
grupos de Aspergillus causam infeco no homem. Espcies de Aspergillus
dos grupos fumigatus, niger e flavus so os patgenos mais comuns, porm
tambm podem causar infeco fungos dos grupos nidulans, terreus, ustus e
restrictus. O aspecto microscpico do conidiforo permite a distino entre
as diferentes espcies.
A candidase oportunista tem incidncia mundial e resulta da invaso
por espcies de Candida dos tecidos de hospedeiros com endocrinopatias,
nos que recebem teraputicas imunodepressivas, nutrio parenteral e adminis-
trao prolongada de antibiticos ou esteroides, e ainda em pacientes com
complicaes aps grandes cirurgias. Nos tecidos, as espcies de Candida se
apresentam como hifas de aspecto peculiar, com exceo de C. glabrata (nun-
Micologia | 419
ca filamenta, sempre se apresenta na forma de levedura). O agente mais

comum C. albicans, espcie que faz parte da microbiota do tubo digestivo
do homem. Vive tambm em menor nmero na rvore brnquica e na cavidade
vaginal. Os microrganismos responsveis pela candidase so classificados em
sua forma anamrfica, usando provas fisiolgicas de assimilao e fermentao
de acares. medida que vm sendo descobertas as formas teleomrficas
das espcies de Candida, as caractersticas dos esporos demonstram que elas
pertencem a vrios gneros distintos.
3.2. Agentes antifngicos

O nmero de frmacos disponveis para o tratamento de infeces fngicas
sistmicas limitado. Nos ltimos anos, a anfotericina B e os azis principal-
mente cetoconazol, fluconazol e itraconazol tm sido os frmacos de primeira
escolha na terapia. Estas duas classes de medicamentos tm como alvo a membra-
na celular dos fungos. Os polienos ligam-se a uma poro esterol, basicamente
ergosterol, presente na membrana de fungos sensveis, formando poros ou ca-
nais. O resultado um aumento na permeabilidade da membrana que permite o
extravasamento de diversas molculas pequenas, levando morte celular. A
anfotericina B um antibitico fungicida de largo espectro e potente, mas seu
uso associado a efeitos adversos significantes, como nefrotoxicidade e febre
com calafrios, como reao aguda infuso intravenosa, j que a farmacocintica
deste frmaco no permite a administrao oral.
Os azis so compostos totalmente sintticos. O mecanismo de ao
destes frmacos baseia-se na inibio da esterol-14-a-desmetilase, um sistema
enzimtico microssomal dependente do citocromo P450, que prejudica a
sntese do ergosterol na membrana citoplasmtica e leva ao acmulo de 14- a-
metilesteris. Esses metil-esteris no possuem a mesma forma e propriedades
fsicas que o ergosterol e levam formao da membrana com propriedades
alteradas, que no desempenha as funes bsicas necessrias ao desenvolvi-
mento do fungo. Os azis causam menos reaes adversas que a

anfotericina B, mas so menos potentes que ela. Podem ter ao fungisttica
ou fungicida. O uso excessivo dos azis levou ao aparecimento de
resistncia em espcies suscetveis.
Um outro agente antifngico sistmico utilizado o pr-frmaco flucitosina.
Todos os fungos sensveis so capazes de desaminar a flucitosina em 5-
fluorouracila, um potente antimetablito; como resultado final, a sntese de
cido desoxirribonucleico dos fungos fica prejudicada. Embora as clulas dos
mamferos no convertam a flucitosina em fluorouracila, o que crucial para
ao seletiva do composto, alguns microrganismos da flora intestinal o fazem,
causando certa toxicidade aos humanos.
A atividade antimicrobiana de um composto pode ser quantificada
com base na determinao da concentrao mnima capaz de inibir o cresci-
mento de um dado microrganismo, um valor chamado CIM (Concentrao
Inibitria Mnima), ou MIC (Minimum Inhibitory Concentration) em
ingls. Este valor pode ser determinado atravs do mtodo das diluies
sucessivas ou do mtodo da difuso em gar, ou ainda atravs do uso de
tiras contendo um gradiente de concentrao de antibitico, conhecido
como E-teste.
Do ponto de vista microbiolgico e clnico, o conceito de sensibilidade
e resistncia aplicado para classificar o isolado como sensivel ou resistente.
No aspecto microbiolgico, uma cepa considerada resistente a um antifngico
quando a concentrao inibitria mnima mais elevada que a habitual do
antifngico frente a essa espcie.
Podemos observar trs diferentes tipos de resistncia aos agentes
antifngicos:
Intrnseca: dita quando nenhum membro de uma espcie sensvel
ao antifngico, ou seja, todos so insensveis.
Micologia | 421
Primria: ocorre quando dentro de uma espcie, normalmente sensvel

a determinado antifngico, encontra-se uma cepa com resistncia natural
a ele, sem necessidade de contato prvio com a droga.
Secundria: ocorre quando uma cepa, previamente sensvel, desen-
volve resistncia droga aps ter sido exposta a ela.
3.3. Diagnstico imunolgico das micoses pulmonares

As provas imunolgicas prestam valiosos auxlios no diagnstico de uma
infeco fngica. Os dados obtidos atravs de tais provas, devem ser
criteriosamente interpretados e correlacionados com os achados micolgicos,
evidncias clnicas e circunstncias epidemiolgicas.
Para segurana e facilidade na interpretao dos resultados, soros con-
troles positivos devem ser includos nas provas sorolgicas para deteco de
anticorpos em soro. Essas provas devem ser realizadas com uma bateria de
antgenos. No caso especfico das micoses pulmonares, essa bateria deve
incluir, no mnimo, antgenos de Paracoccidioides brasiliensis, Histoplasma
capsulatum, Aspergillus fumigatus e Coccidioides immitis.
Para melhor avaliao prognstica, as provas devem ser executadas com
amostras seriadas do soro colhido em diferentes perodos, possibilitando assim
a elaborao da curva sorolgica.
importante salientar que as provas imunolgicas tm

valor presuntivo no diagnstico das infeces fngicas,
sendo o exame de cultivo o padro-ouro para diagns-
tico definitivo das micoses.
3.4. Interpretao das provas imunolgicas
3.4.1. Paracoccidioidomicose
Pacientes portadores de paracoccidioidomicose ativa sem tratamento

apresentam positividade nas provas sorolgicas acima de 90%. Os ttulos da
reao de fixao de complemento so mais elevados nas formas graves e
agudas da doena, sofrendo quedas medida que ocorre melhora clnica. A
reao no tem muito valor diagnstico quando tomada como dado isolado.
A correlao com os dados clnicos, epidemiolgicos e resultados fornecidos
por outras tcnicas faz com que a importncia diagnstica aumente.
Na imunodifuso dupla de Ouchterlony pode ocorrer a formao de
vrias bandas de precipitao, sendo mais frequente a demonstrao de apenas
uma delas. A reao dotada de alta especificidade. Reaes cruzadas so
mnimas e podem ocorrer principalmente com soros de pacientes portadores
de histoplasmose.
A contraimunoeletroforese mais sensvel que a imunodifuso dupla e
permite que os resultados sejam conhecidos em tempo reduzido. Ao lado do
alto valor diagnstico, a reao permite tambm acompanhar a evoluo sorolgica
do paciente, atravs da titulao seriada de amostras do soro. O sorodiagnstico
especfico da paracoccidioidomicose pode ser obtido por intermdio da
imunoeletroforese, atravs da demonstrao do arco de precipitao corres-
pondente ao antgeno E2 ou gp43. O arco de precipitao correspondente
forma-se na regio catdica da lmina.
3.4.2. Histoplasmose
Anticorpos fixadores do complemento podem ser demonstrados na

maioria dos pacientes, j a partir da quarta semana aps a infeco. Preconiza-
se a utilizao dos antgenos obtidos da fase leveduriforme do Histoplasma
Micologia | 423
capsulatum bem como do antgeno obtido da sua fase filamentosa para aplica-
o no teste, uma vez que o antgeno leveduriforme apresenta uma maior
especificidade e o antgeno filamentoso maior sensibilidade. Os resultados
inespecficos esto geralmente relacionados aos ttulos de 1:8 e 1:32.
Consequentemente ttulos inferiores a 1:8 so considerados normais, e
entre 1:8 e 1:32 so considerados de valor presuntivo. Ttulos de 1:32
ou mais elevados so altamente sugestivos de histoplasmose em atividade.
Aps a cura clnica, os ttulos caem rapidamente e normalmente desapare-
cem aps nove meses. Reaes cruzadas podem ocorrer com soros de
portadores de paracoccidioidomicose.
Na imunodifuso dupla podem ser verificadas duas faixas de precipi-
tao de importncia diagnstica, denominadas bandas H e M. A faixa M
forma-se prxima do orifcio que recebe o antgeno e pode ser demonstra-
da com soros de pacientes com formas agudas ou crnicas de histoplasmose,
ou em indivduos sensveis a histoplasmina e que se submeteram a recente
teste intradrmico com o antgeno. A precipitina H demonstrada no soro
de pacientes com a doena ativa ou at dois anos aps recuperao clnica,
raramente ocorre na ausncia de M.
A contraimunoeletroforese tem praticamente o mesmo valor da
imunodifuso dupla, permitindo ainda a titulao dos anticorpos anti- H.
capsulatum.
A deteco de antgeno de H. capsulatum em espcimes de urina,
sangue e fluido crebroespinhal oferece um mtodo rpido para o diag-
nstico, para o monitoramento de terapia, assim como para a identificao
de recadas na histoplasmose disseminada. Resultados falso-positivos tm
sido observados somente em pacientes com blastomicose,
paracoccidioidomicose e infeco por Penicillium marneffei, e menos fre-
quentemente em pacientes com coccidioidomicose.
3.4.3. Aspergilose
Nos aspergilomas, os ttulos de anticorpos especficos demonstrados

pela reao de fixao de complemento esto geralmente elevados. As bandas
de precipitao reveladas pela imunodifuso dupla e contraimunoeletroforese
so geralmente mltiplas, podendo ser acima de dez. Aps a remoo cirrgi-
ca do aspergiloma ou tratamento adequado, estes anticorpos deixam de ser
detectados em pouco tempo.
Na aspergilose brnquica alrgica os ttulos de anticorpos especficos
so baixos, e na asma aspergilar raramente so demonstrados. Atravs de
provas cutneas com aspergilina, pode-se demonstrar reaes de
hipersensibilidade do tipo I e III na aspergilose brnquica alrgica, e do tipo I
na asma aspergilar.
Nas formas invasivas da doena raramente se demonstram anticorpos
atravs das provas usuais, necessitando-se o emprego de provas mais sensveis
tais como radioimunoensaios e imunoenzimticas.
Na imunodifuso dupla e contraimunoeletroforese, podem ocorrer rea-
es inespecficas devido protena C-reativa do soro do paciente. A elimina-
o de tal reao inespecfica se faz atravs da lavagem da lmina, em soluo
de citrato de sdio a 5% durante trinta minutos.
3.4.4. Criptococose
O imunodiagnstico da criptococose se baseia principalmente na de-

monstrao de antgeno solvel de C. neoformans ,
(GLUCORONOXILOMANANA) atravs da reao de soro ou lquor
com partculas de ltex sensibilizadas com gamaglobulina de coelho anti-
polissacride capsular. Interferncias, tais como fator reumatoide e efeito prozona
podem ser encontradas neste teste, e so facilmente eliminadas com tratamento
das amostras com pronase.
Micologia | 425
Os reagentes para demonstrao de antgeno solvel so encontrados

no comrcio, de procedncia norte-americana, na forma de KIT.
Anticorpos podem ser demonstrados na fase inicial e final da criptococose.
As provas mais utilizadas para tal propsito, so as reaes de imunofluorescncia
indireta e aglutinao de suspenso de clulas de C. neoformans, porm
apresentam baixo rendimento.
4. Meios de cultura e corantes
4.1. Meios de cultura

Os meios de cultura so preparaes que contm as fontes nutricionais
necessrias para o crescimento e multiplicao dos organismos.
O cultivo de microrganismos pode ter diferentes propsitos, mas em
todos eles o meio de cultura deve suprir as necessidades mnimas para que in
vitro se consiga um ambiente semelhante ao que se encontrava o organismo
na natureza.
Levando em considerao que os nutrientes so unidades estruturais e
fontes de energia para a construo e manuteno da estrutura e organizao
dos microrganismos, o meio de cultura deve cont-los para que viabilize o seu
crescimento.
So esses os principais constituintes do meio de cultura:
gua: sempre deve ser usada gua destilada para o preparo de meios
de cultura. A gua da torneira de constituio desconhecida, variando
especialmente em ons e em pH.
Fonte de carbono: necessria para a sntese de numerosos compos-
tos orgnicos que fazem parte do protoplasma. A glicose a principal
fonte de carbono utilizada pelos microrganismos.
Fonte de nitrognio: muitos componentes da clula, principalmente as

protenas, contm nitrognio.
Minerais: enxofre e fsforo.
Elementos de trao: so os minerais que so exigidos em quantidades
mnimas. Exemplos: potssio, magnsio, etc.
Fatores de crescimento: um fator de crescimento um componente
orgnico que a clula deve conter para crescer, mas incapaz de sinte-
tizar. Exemplos: aminocidos, purinas, etc.
Observao: Para o preparo do meio de cultura, as drogas usadas devem ser

de maior pureza. O pH, a temperatura e a aerao devem ser cuidadosamente
controlados. Sempre se deve observar o prazo de validade do produto.
Os meios de cultura podem ser classificados da seguinte forma:

Quanto ao estado fsico
Slido: contm gar (agente solidificante) na concentrao de 1,5g
a 3,0g por litro.
Semisslido: 0,1g a 1,1g de gar.
Lquidos (caldos): ausncia de gar.
Agentes solidificantes:
Gelatina: pode ser hidrolizada. mais utilizada hoje em provas
bioqumicas.
gar: uma substncia hidrocarbonada extrada de vrias espcies
de algas vermelhas, e imune ao desdobramento pela maioria dos
microrganismos.
Slica gel: usada quando se deseja cultivar microrganismos autotrficos.
Micologia | 427
Quanto composio qumica
Naturais ou Complexos: formados por substncias de composio

qumica no definida.
Sintticos: quando a composio qumica conhecida e seus com-

ponentes servem para suprir as fontes necessrias de carbono, nitro-
gnio, vitaminas, etc.
Quanto ao emprego
Meios de enriquecimento: so meios enriquecidos com determina-
dos nutrientes que favorecero o desenvolvimento de determinado
microrganismo, entre vrios outros.
Meio de manuteno: garante a viabilidade do microrganismo, por
longos perodos, de modo a torn-los disponveis em qualquer ex-
perimentao.
Meio diferencial: permite ao microrganismo produzir estruturas ou
reaes que podem ser usadas na sua diferenciao entre gneros ou
espcies.
Meio seletivo: permite o crescimento de um determinado grupo
ou gnero de microrganismo, em detrimento de outros.
Os meios de cultura devem ser preparados e esterilizados cuidadosa-

mente, de acordo com o protocolo a seguir:
a) Pesagem dos ingredientes
Se o meio preparado a partir de seus ingredientes bsicos,

suas massas corretas para o volume desejado devem ser pesadas
isoladamente.
Para meios desidratados, pesar a massa correspondente ao volume

desejado.
b) Dissoluo dos ingredientes

Nunca usar recipientes de cobre ou zinco para dissoluo dos
ingredientes do meio de cultura, usar preferencialmente o balo de
vidro, quimicamente limpo.
Adicionar ao recipiente contendo os ingredientes uma quantidade
de gua destilada, aproximadamente a metade do volume desejado,
agitando constantemente com basto de vidro, e evitando a forma-
o de bolhas; aquecer brandamente.
Usar gua destilada temperatura ambiente, no preparo de meios
lquidos.
Completar o volume do meio com a gua aps a formao de
suspenso homognea. Isso essencial, principalmente em meios
contendo agentes solidificantes.
O aquecimento para uma efetiva dissoluo dos ingredientes e
esterilizao do meio deve ser feito no menor tempo possvel. Os
meios que contm gar devem ser aquecidos at o seu ponto de
ebulio para uma completa dissoluo.
Resfriar os meios contendo gar temperatura aproximada de
50 C, reajustar o volume de gua destilada aquecida de 45 a
50 C, se houver perda significativa de gua durante o aquecimento.
c) Determinao e ajuste de pH
Determinar o pH de meios formulados antes de adicionar o gar.
Quando se tratar de meios formulados, se deve aferir 0,2 unida-

des de pH acima do desejado, haja visto que o pH abaixa aproxima-
Micologia | 429
damente este valor aps a autoclavao. Nos meios desidratados,

no necessrio o ajuste do pH, pois os meios j vm tamponados.
Determinar o pH atravs de um potencimetro ou por papel indi-

cador de pH.
Ajustar o pH com soluo de cido clordrico (HCl) 0,1N ou

soluo de hidrxido de sdio (NaOH) 0,1N.
d) Distribuio dos meios

Distribuir os meios em recipientes, quimicamente limpos e no caso de
meios que no suportem nova autoclavao, usar recipientes estreis.
Ao distribuir em frascos de Erlenmeyers ou bales de fundo chato,
evitar ultrapassar 50% do volume total do frasco.
A distribuio em placas deve ser de aproximadamente 15mL; 6ml
em tubos para meio inclinado, 5ml para camada alta e 6ml para
caldos em geral.
A distribuio nos tubos deve ser feita com pipetas;
Codificar os meios conforme padro ou conveno do laboratrio;
e) Esterilizao dos meios
Com algumas excees, esterilizar os meios em autoclave a 121 C

durante 15 minutos.
f) Preparo de gar inclinado em tubos
Ao retirar os tubos contendo meio slido da autoclave, inclin-los

apoiando-os num suporte de madeira, permanecendo os mesmos
com aproximadamente 1cm de meio na base. Deixar solidificar
temperatura ambiente.
g) Plaqueamento de meio de cultivo

Fundir o meio slido em banho-maria, resfri-lo em banho dgua,
de modo a evitar ou diminuir a umidade que se condensa na tampa
da placa de Petri, quando o gar se solidifica.
Flambar a boca do recipiente que contm o meio, antes de
distribu-lo na placa.
Prximo chama do bico de Bunsen, verter o meio, levantando
parte da tampa da placa de Petri estril, o suficiente para permitir a
introduo da boca do tubo ou outro recipiente que contm o
meio, sem tocar as bordas da placa. Pode-se usar uma pipeta para
a distribuio.
Fechar a placa, moviment-la levemente sobre a bancada para
permitir uma distribuio uniforme, e deixar solidificar temperatu-
ra ambiente.
h) Armazenamento e conservao dos meios de cultura:

Para perodos de tempo prolongados, recomenda-se guardar os
tubos e frascos de Erlenmeyers contendo meio em temperatura de
12 a 15 C. Os meios contendo gar no devem ser guardados
abaixo de 0 C para no alterar seu gel.
Geralmente possvel sua conservao durante um ou dois meses
temperatura ambiente em locais secos, limpos e abrigados da luz;
Identificar todos os tubos, placas ou frascos que contenham meios
de cultura.
Para que no haja perda de gua do meio para o ambiente, os
recipientes devem ser bem vedados. No caso de placas de Petri,
seus bordos podero ser lacrados com parafilme.
Micologia | 431
Lista de meios de cultura mais utilizados em laboratrio de Micologia
gar extrato de arroz (Rice extract agar)

Meio desidratado 15g
gar 30g
gua destilada 1000mL
Suspender o p na gua e deixar embeber o gar durante trinta

minutos, fundir, distribuir e esterilizar em autoclave por quinze
minutos a 121 C.
gar Sabouraud glicosado (Sabouraud glycose agar)

Dextrose 30g
Peptona 10g
gar 30g
Misturar todos os elementos em balo, deixar embeber o gar

por trinta minutos, levar autoclave e aquecer lentamente 120
C. Agitar e ajustar o pH para 6,5. Esterilizar por quinze minu-
tos a 121 C.
Batata dextrose gar (Potato dextrose agar BDA)

Meio desidratado 39g
gar 5g
Suspender em gua e deixar embeber o gar por quinze minutos.

Aquecer at a dissoluo completa. Esterilizar em autoclave por
quinze minutos a 121 C.
Mycosel (Mycobiotic) agar

Farinha de soja digerida 10 g
Dextrose 10 g
Cicloheximida 0,4 g
Cloranfenicol 0,05 g
Agar 15 g
gua destilada 1000 mL
Misturar os reagentes. Esquentar agitando frequentemente at

dissolver todos os ingredientes. Autoclavar a 118C por quinze
minutos. No aquecer de forma excessiva. Para o meio desidrata-
do seguir o mesmo procedimento sem adio do gar.
Czapeck dox gar (CZ)

Sacarose 30 g
Nitrato de sdio 3g
Fosfato di-potssico 1g
Sulfato de magnsio 0,5 g
Cloreto de potssio 0,5 g
Sulfato ferroso 0,01g
gar 30 g
Misturar e dissolver os reagentes. Juntar o gar e deixar embe-

ber durante trinta minutos. Ajustar o pH para 7,3 antes de
esterilizar. Fundir o gar e esterilizar em autoclave por quinze
minutos a 121 C. Para o meio desidratado, seguir o mesmo
procedimento sem adio do gar.
gar infuso de crebro e corao (Brain Heart Infusion agar BHI)

Infuso de 200g de crebro de bezerro 7,7 g
Infuso de 250g de corao de vaca 9,8 g
Proteose Peptona 10 g
Micologia | 433
Dextrose 2g
Cloreto de sdio 5g
Fosfato dissdico 2,5 g
gar 20 g
Misturar e dissolver os reagentes. Juntar o gar e deixar embe-

ber durante trinta minutos. Ajustar o pH para 7,4 antes de
esterilizar. Fundir o gar e esterilizar em autoclave por quinze
minutos a 121 C. Para o meio desidratado seguir o mesmo
procedimento sem adio do gar.
gar dextrose farinha de milho (Corn meal agar CMA)

Farinha de milho 40 g
Dextrose 20 g
gar 20 g
Colocar a farinha em Becker com gua e aquecer em banho-maria

a 60 C por uma hora. Em seguida, filtrar em gaze dobrada duas
vezes. Restabelecer o volume inicial com gua destilada. Transferir
para balo que j contenha o gar e a dextrose pesados. Esterili-
zar em autoclave a 121 C por vinte minutos. Para o meio
desidratado usar o mesmo procedimento usado no BDA, porm
esterilizar a 121 C por vinte minutos.
OBS: Quando este meio utilizado para Mucoracea, trocar a
dextrose por glicose.
Extrato de malte gar (Malt extract agar MEA)

Extrato de malte 30 g
gar 30 g
Usar o mesmo procedimento do meio BDA, e ajustar o pH para
7,0.
Sabouraud
Glicose 30 g
Peptona 10 g
gar 20 g
Usar o mesmo procedimento do meio Sabouraud glicosado.
Meio seletivo para fungos entomopatognicos

Farinha de aveia 10 g
gar 10 g
Sulfato de estreptomicina 0,50 g
Dodine 0,45 g
Penicilina G 0,20 g
Cristal violeta 2,5 mg
* Soluo estoque de cristal violeta: 0,1g de cristal violeta em

200 ml de gua destilada.
*Soluo estoque de antibiticos: 4g de penicilina G e 10 g de
sulfato de estreptomicina em 40 mL de gua destilada.
Mistura-se aveia e gar em 490 mL de gua destilada; agita-

se vigorosamente aquecendo at a fervura, adiciona-se Dodine
e 5 mL da soluo estoque de cristal violeta enquanto estiver
quente, e autoclava-se por vinte minutos. Quando estiver na
temperatura de 50 a 55 C, adicionam-se 2 mL de soluo
estoque de antibiticos; agita-se bem e distribui-se imediata-
mente o meio em placas de Petri.
Micologia | 435
Farinha de aveia gar (Oatmeal gar OM)

Farinha de aveia 60 g
gar 12,5 g
Bater a farinha no liquidificador com um pouco da gua por um

minuto. Depois adicionar o gar e a gua e homogeneizar. Esteri-
lizar em autoclave a 121C por vinte minutos.
OBS: No utilizar o frasco de Erlenmeyer na medida exata do
meio, pois durante a autoclavao, o meio ferve e pode molhar a
rolha ou transbordar.
Extrato de levedura-peptona-glicose-gar (Yeast extract-peptone-

glucose-agar PYGA)
Peptona 5g
Extrato de levedura 5g
Glicose 20 g
gar 13 g
Seguir os mesmos procedimentos usados para Sabouraud glicosado.
MP-5 (meio seletivo para fungos aquticos)

Peptona 1g
Maltose 4g
gar 20 g
Seguir os mesmos procedimentos usados para o Sabouraud

glicosado
Observao:Todos os meios utilizados no laboratrio de Micologia podem
ser acrescidos com antibiticos (cloranfenicol, estreptomicina, etc.) para evitar
o crescimento de outros microrganismos.
Meio de cultura Fava Netto (para antgeno de P. brasiliensis)

Proteose peptona n0 3 (Difco) 3g
Peptona 10 g
Extrato de carne 5g
Cloreto de sdio 5g
Extrato de levedura 5g
Dextrose 40 g
gar 18 g
gua destilada qsp 1000 mL
Fundir o meio em banho maria fervente. Ajustar o pH entre 7,2

e 7,4. Autoclavar a 1200C durante vinte minutos.
Meio de cultura - Smith-Asparagina ( para histoplasmina)

L-Asparagina 7g
Cloreto de amnio 7g
Fosfato monocido de potssio 1,31 g
Citrato de sdio 0,9 g
Sulfato de magnsio heptahidratado 1,5 g
Citrato frrico 0,3 g
Glicose 10 g
Glicerina 25 g
gua destilada qsp 1000 mL
Dissolver a asparagina em cerca de 300 mL de gua destilada

aquecida a 500C. Dissolver os sais separadamente em 25 mL de
gua destilada, sendo que o citrato frrico dever ser dissolvido
em gua quente. Misturar as solues dos sais com a soluo de
asparagina. Homogeneizar. Acrescentar a glicose e a glicerina.
Completar o volume com gua destilada. Homogeneizar. Distri-
buir o meio, pores de 200 mL, em bales de 500 mL.
Autoclavar a 1200C durante vinte minutos
Micologia | 437
Meio de Cultura Negroni (Filtrado de cultura de P. brasiliensis)

Dissolver 60 g de neopeptona em 120 mL de gua destilada
aquecida a 45C.
Colocar a soluo de neopeptona em tubos para dilise (mem-
branas de celofane) e dialisar contra gua destilada (cerca de 2
litros) durante cinco horas a 70C, e por uma noite em geladeira
a 4C.
Retirar o contedo do tubo de dilise e completar o volume
com gua destilada para 1.800 mL. Adicionar 36g de glicose,
0,18 g de tiamina e 0,36 g de asparagina.
Homogeneizar e acertar o pH, que deve ser entre 6.8 e 7.0;
Distribuir o meio, pores de 150 mL em frascos Erlenmeyer
ou bales de 300 mL de capacidade.
Autoclavar a 120C durante 15 minutos.
Observao: Todos os meios utilizados no laboratrio de Micologia podem

ser acrescidos com antibiticos (cloranfenicol, estreptomicina, etc), para evitar
o crescimento de outros microrganismos.
4.2. Corantes
A colorao um meio utilizado em laboratrios de Micologia com o
objetivo de visualizar estruturas vegetativas e reprodutivas dos fungos, as for-
mas de leveduras, e realizar testes de viabilidade. As solues utilizadas so:
a) Soluo de hidrxido de potssio KOH (soluo clarificante)

Concentraes:
40% - unhas (fneros).
30% - pelos e pele.
10% - pele tenra de criana.
6% - para exame de escarro.
5% - para estudo de Basiodiomycotina e outros fungos.
Frmula (para soluo 30%):

KOH em lentilhas 30 g
gua destilada 70 mL
Preparo:
Dissolver os dois ingredientes em movimentos giratrios, at a total
dissoluo dos componentes.
A soluo deve ficar transparente.
Armazenar em vidro escuro.
b) Lactofenol de Amann com azul de algodo

Usado para tornar mais distintas as estruturas hialinas dos fungos (corante
citoplasmtico)
Frmula:
cido fnico 20 g
cido ltico 20 g
Glicerina 40 g
gua destilada 20 mL
Azul de Poirrierblau 0,05 g
Preparo:
Misturar todos os componentes e dissolver pelo calor.
Depois adicionar 0,05g de azul de Poirrierblau.
Esperar 24 horas e filtrar.
Observao: Para estudar as estruturas de fungos demceos (negros) pode-se

utilizar Lactofenol de Amann sem adio de azul de algodo.
Micologia | 439
c) Acridine Orange
Corante vital usado para teste de viabilidade que distingue clulas vivas
e mortas, onde as clulas vivas adquirem colorao laranja, e as clulas
mortas, colorao verde.
Frmula:
Acridine orange 0,02 g
PBS pH 7,7 100 mL
Preparo:
Dissolver os dois ingredientes e agitar.
d) Verde janus B
Usado na diferenciao de clulas vivas e mortas. As clulas vivas per-
manecem incolor, enquanto as clulas mortas adquirem colorao azul.
Frmula:
Verde-janus B 0,05 g
Preparo:
Dissolver os dois ingredientes e agitar.
e) Reagente de Melzer
Usado para deteco de reao amiloide ou dextrinoide de esporos,
ascas e tecidos himeniais de Ascomycotina e Basidiomycotina, na qual
uma colorao azulada determina uma reao amiloide e uma marrom
determina uma reao dextrinoide.
Frmula:
Iodo 0,5 g
Potssio iodado 1,5 g
Hidrato de cloro 20 g
gua destilada 20 mL
Preparo:
Dissolver os ingredientes e agitar.
f) Floxina B
Usada para o estudo do citoplasma de Basiodiomycotina.
Frmula:
Floxina B 10 g
Glicerina 75 mL
Preparo:
Misturar todos os componentes e dissolver pelo calor.
g) Glicerina 10%
Preserva a colorao original do fungo estudado.
Frmula:
Glicerina 10 mL
gua 90 mL
Preparo:
Misturar os ingredientes com leve agitao.
Micologia | 441
5. Tcnicas micolgicas
5.1. Diluio seriada

A diluio seriada uma tcnica simples que pode ser usada para vrios
propsitos, como: separao de duas cepas fngicas que estejam misturadas
em um tubo ou placa (contaminao no tubo ou na placa), contagem de
colnias em amostras, isolamento de fungos de substratos lquidos (anlise de
gua, leite, etc) e de solo, alm da determinao da quantidade e qualidade
de um inculo para processos fermentativos ou inculos lquidos.
a) Preparo da amostra
Separao de duas cepas de fungos
Fazer uma raspagem com a ala em L na placa ou no tubo onde se
encontram as duas cepas a serem separadas no caso de separao de
duas cepas de fungos.
Este raspado deve ser colocado em um tubo com 10mL de soluo
salina a 0,85% e homogeneizar.
Isolamento de fungos de substratos lquidos

Colocar 2 mL da amostra lquida (gua, leite, etc) em um tubo com
10 mL de soluo salina a 0,85% e homogeneizar.
Isolamento de fungos de solo

Colocar 1g do solo a ser analisado em um tubo com 10 mL de
soluo salina a 0,85% e homogeneizar.
b) Diluio da amostra
Utilizando uma srie de dez tubos com 9 mL de salina, colocar no
primeiro tubo 1ml da suspenso homogeinizada do primeiro tubo (deve-
se usar uma pipeta para cada transferncia); homogeneizar e transferir
1mL para o segundo tubo; homogeneizar novamente e transferir 1mL

para o terceiro tubo. Repetir este procedimento at o ltimo tubo
c) Semeadura nos meios de cultura

Preparar uma placa de Petri com o meio de cultura escolhido para
cada tubo de diluio.
Todas as placas devem ser marcadas com as respectivas diluies.
Retirar 0,1mL ou 1mL ( escolha) de cada uma das diluies e
transferir para a placa de Petri com a pipeta (deve-se usar uma pipeta
para cada diluio) e espalhar na placa com o auxilio da ala de
Drigalski.
Incubar as placas por, no mnimo, sete dias na estufa a 250C.
Aps o perodo de incubao, observar as placas e fazer a contagem
das colnias ou no caso de separao das cepas fngicas, observar as
placas e retirar a colnia desejada com a ala em L.
d) Observao dos resultados Contagem

A contagem de colnias feita a partir da observao das placas e
contagem manual das colnias crescidas e quantificao da diluio origi-
nal, ou seja, quantos condios ou esporos haviam na sua suspenso
original. O nmero de condios presentes na suspenso original ser
igual ao nmero de colnias multiplicado pelo fator de diluio.
Ex: Se na diluio 10-4 obtivemos cinquenta colnias com inculo de
1mL, a concentrao original ser de 50 x 104 = 5 x 105 condios/mL.
Se na diluio 10-6 obtivermos 135 colnias com um inculo de 0,1ml,
a concentrao original ser de 135 x 106 x 10 = 135 x 107 =
1,35 x 109 condios/mL.
Observao: Para a contagem de condios ou esporos em uma soluo tambm

podemos usar a Cmara de Neubauer
Micologia | 443
5.2. Tcnicas de semeadura e microscopia
5.2.1.Semeadura de fungos
Inoculao em placas
As tcnicas usadas para inocular fungos em placas so fundamental-
mente efetuadas para obter culturas axnicas (culturas puras) e so bem desen-
volvidas, j que a identificao de fungos filamentosos baseia-se principalmente
nas caractersticas morfolgicas.
Procedimento:
Flambar a ala ao rubro e esfriar.
No caso de a amostra estar em tubo:
remover a tampa de rosca ou tampo de algodo do tubo

que contm a cepa, com o dedo mnimo da mo direita,
segurando o tubo com a mo esquerda;
flambar a boca do tubo, imediatamente antes e depois da

inoculao;
No caso de a amostra tambm estar em placa:
tomar a placa com a mo esquerda, de modo que a base da

placa fique segura e a tampa possa ser manipulada num movi-
mento de abrir e fechar, com os dedos polegar e indicador;
proceder a uma rpida flambagem na placa toda vez que esta

tenha que ser aberta;
manipular a placa na altura da chama do bico de Bunsen;

introduzir a ala ou agulha no tubo ou placa de Petri com amostra,

e retirar uma quantidade suficiente do inculo;
tomar uma placa, abrir conforme exposto anteriormente e inocular

no centro da placa ou conforme especificaes em trs pontos
eqidistantes.
Incubao das placas:
incubar as placas, invertidas em estufa ou temperatura

ambiente, para evitar que, durante a incubao, a gua de
condensao da superfcie do gar, provoque crescimento
confluente do organismo, impedindo a formao de colnias
isoladas.
obedecer aos requisitos fisiolgicos de crescimento do mi-

crorganismo, tais como temperatura ideal de incubao, ilumi-
nao, tempo de incubao, etc.
Inoculao em tubos ou frascos de Erlenmeyers
A inoculao em tubos ou frascos de Erlenmeyers pode ser feita em

meios slidos e lquidos. Apresentam inmeras finalidades de uso. Em todos
os casos, tomam-se medidas asspticas durante a inoculao.
a) Meio lquido para meio lquido
Quando a cultura estiver em meio lquido e se pretende repic-la para

um tubo contendo meio lquido, deve-se usar uma ala de platina ou
nquel-cromo em forma de gota, observando-se as condies de assepsia.
Micologia | 445
b) Meio lquido para meio slido
Tomar com uma ala em forma de gota um inculo da amostra em

meio lquido.
Introduzir a ala sobre a superfcie do gar inclinado, at a base do

mesmo.
Fazer estrias ou um esfregao em direo boca do tubo, sobre a

superfcie inclinada at da sua extenso. A superfcie inclinada do
gar deve ficar voltada para cima, com a mo do operador por baixo do
tubo, de modo que a superfcie inclinada possa ser vista sem obstculo.
c) Meio slido para meio lquido
Introduzir a agulha ou ala em forma de L estril no tubo que contm

a cultura em gar inclinado e tomar uma pequena quantidade do inculo.
Evite carrear pedaos ou fragmentos do meio com o inculo.
Imergir o inculo no meio lquido, agitar a agulha suavemente contra a

parede do tubo para ressuspender o inculo.
Homogeneizar o meio sob leve agitao.
d) Meio slido para meio slido
Tomar com uma agulha ou ala em forma de L o inculo no meio

slido.
Introduzir a agulha sobre a superfcie do gar inclinado, at a sua base.
Fazer estrias ou um esfregao em direo boca do tubo, sobre a

superfcie inclinada, at aproximadamente da sua extenso. O proce-
dimento o mesmo da inoculao de meio lquido para o meio slido.
Incubao dos tubos:
preferencialmente todos os tubos com meio slido

devem ficar em posio vertical em estantes ou outros
tipos de suporte.
6.2.2. Microscopia
Exame direto de um pedao da colnia
Com a ala de platina em forma de L ou agulha esterilizada, cortar um

pedao da colnia e coloc-lo sobre uma lmina. No se deve raspar a
superfcie da colnia, porque apenas os condios sero retirados. Desta forma,
em muitos casos possvel identificar o fungo.
Colocar uma gota do corante lactofenol de Amann com azul de
algodo ou outro corante desejado sobre o pedao da colnia. Se o fungo
for muito escuro, substituir o corante por uma soluo clarificante ou uma
gota de gua.
Cobrir a preparao com uma lamnula, comprimindo-a com o cabo
do bisturi ou do estilete. Examinar ao microscpio, com objetivas de 10X,
40X e 100X.
Tcnica de cultivo em lmina
Na maioria das vezes, necessrio obter preparaes onde as estruturas

do fungo so observadas por inteiro. Isto porque h muitos gneros cujos
esporos ou condios por si s no so caractersticos. Neste caso, as estruturas
responsveis pela formao e sustentao dos condios ou esporos necessitam
ser observadas por completo. Isto nem sempre possvel com a tcnica de
exame direto, havendo necessidade de se fazer o cultivo na prpria lmina.
Com isto, obtm-se os fungos com suas estruturas intactas.
Micologia | 447
Procedimento:
Vazar em placa de Petri uma camada fina do meio de cultura adequado

para cada gnero ou espcie de fungos a ser examinado.
Aps a solidificao do meio, com o auxlio de um bisturi, cortar
fragmentos de 0,5 cm2.
Montar uma placa de 15 cm de dimetro e cobrir o fundo com papel
de filtro e colocar sobre este um basto em forma de U, duas lminas
e duas lamnulas.
Aps a esterilizao, colocar o quadrado de meio sobre cada lmina;
Inocular nos quatro lados do quadrado do meio de cultura, fragmentos
miceliais e/ou esporos.
Colocar sobre o meio de cultura a lamnula.
Molhar o papel de filtro com gua destilada estril formando uma
cmara mida.
Deixar em temperatura ambiente, por aproximadamente uma semana
ou mais dependendo do fungo estudado.
Observar crescimento e esporulao.
Fixar pelo formol por 24 horas.
Montar lminas e lamnulas com corante e observar em microscpio
tico com objetivas de 10x, 40x e 100x.
Tcnica da fita adesiva
Esta tcnica d excelentes resultados quando o fungo est sendo cultiva-

do em placa de Petri. Na maioria das vezes, suas estruturas aparecero inteiras,
como no cultivo em lmina.
Procedimento:
Cortar um pedao de fita adesiva um pouco menor do que a lmina e

coloc-lo sobre a colnia, com a cola para baixo.
Comprimir com a ala de platina em forma de L para que o fungo cole

na fita.
Colar a fita sobre o corante na lmina.
Observar ao microscpio tico com objetivas de 10X, 40X e 100X.
Cultivo sob lamnula
O objetivo desta tcnica a observao das microestruturas vegetativas

e reprodutivas do fungo mais intactas.
Procedimento:
Inocular em uma placa de Petri, contendo 20 mL de meio de cultura

especfico para o gnero a ser identificado, fragmentos do fungo em trs
pontos equidistantes entre si, e sobre cada um destes colocar uma
lamnula de 24x32mm, previamente flambadas em bico de Bunsen.
Aps sete dias de crescimento, as lamnulas sobre os pontos de

inculo devem ser retiradas do interior da placa, com auxlio de uma
pina, previamente flambada. As lamnulas devem ser colocadas inverti-
das sobre lminas contendo uma gota de Lactofenol de Amann com
azul de algodo.
Observar ao microscpio ptico com objetivas de 10X, 40X e 100X.

Micologia | 449
Tcnicas para estudo de Ascomycotina
Procedimento:
O uso de um microscpio estereoscpico (lupa) indispensvel para

o exame do material.
Seces verticais no corpo frutfero do fungo estudado podero ser

feitas com auxlio de uma gilete ou bisturi.
A maioria das lminas para posterior observao ao microscpio ptico

montada normalmente em gua para medio dos ascosporos e obser-
vao de sua colorao, o reagente de Melzer s tambm devendo ser
usado para o estudo dos anis apicais das ascas.
O estudo destes fungos em meio de cultura tambm deve ser feito

para que se conhea o seu anamorfo. Isto poder ser feito atravs da
tcnica de isolamento de ascoporos (single ascospore isolation).
Tcnica para estudo de Basidiomycotina
O material montado em KOH a 5%.

O reagente de Melzers tambm usado para os esporos de fungos
Agaricceos.
Impresso de esporos:
Uma das mais importantes caractersticas que permite o agrupamento dos

gneros em sees a colorao dos basidisporos em massa, ou seja, a
impresso de esporos.
Procedimento:
Selecionar um corpo frutfero fresco e maduro e cortar sua haste junto

ao pleo.
Colocar o pleo sobre uma folha de papel de duas cores (preta e

branca) com as lminas ou poros para baixo.
Cobrir o pleo e o papel com papel encerado, cristalizador ou com

uma campnula. Se o corpo frutfero do fungo estiver em boas condi-
es, a impresso de seus esporos poder ser obtida em uma hora.
5.3. Coleta e isolamento de fungos ambientais

Observaes quanto ao complexo fungo-substrato so de grande valia
por ocasio de qualquer coleta. Deve-se notar que as estruturas mais visveis de
um fungo no representam, necessariamente, o seu todo. Alm disso, grande
parte de seus ciclos ou remanescentes estruturais podero estar perdidos no
interior do substrato. Desta forma, conclui-se que a amostra que se coleta de
um fungo, na verdade no passa de um momento do seu ciclo biolgico.
As partes mais evidentes, nos fungos, representam em geral, aquelas
que mais resistem ao manuseio e ao tratamento para secagem. As condies
ideais para o estudo dos fungos residem no isolamento dos organismos a partir
de diferentes substratos, e nos diversos ambientes em que os fungos ocorrem:
solo, ar, gua ou mesmo na vegetao.
Independente do espcime a ser coletado, alguns materiais gerais de-
vem ser providenciados para as coletas:
* altmetro * fsforo ou isqueiro
* jornal * caderneta de campo
* lupa de mo * lpis
* mochila ou cesta * mquina fotogrfica
* canivete ou esptula * papel indicador de pH
* faca afiada * saco plstico
* fita crepe * saco de papel
* fita mtrica ou trena
Micologia | 451
A. Solo
Considera-se o solo um mosaico de micro-habitats devido a sua grande
complexidade, longe de ser um simples amontoado de matria inorgnica sem
vida. Ao contrrio, o solo costuma ser rico em microbiota e mesofauna, o que
fora o pesquisador a usar tcnica ou substncias especiais quando pretende
isolar um grupo definido.
O mtodo de diluio o mais usado para se estudar a incidncia de
fungos em solos. O material, ao ser coletado, deve ser colocado em latas
esterilizadas ou em sacos plsticos. As amostras destinadas anlise devem ser
manipuladas com o auxlio de uma esptula ou colher, parcialmente esterilizadas
com algodo embebidos em lcool ou com auxlio de uma lamparina. De
preferncia, o perodo entre a coleta de material e as diluies, no deve
ultrapassar quatro horas.
Procedimento:
Tomam-se 10g de cada amostra de solo e coloca-se em frascos de

Erlenmeyer contendo 90 mL de soluo salina esterilizada. Agitar
vigorosamente (soluo 1:10 - mesmo princpio da diluio seriada
porm em maiores propores).
Desta suspenso, pipeta-se 1mL e adiciona-se a tubo contendo 9 mL
de soluo salina esterilizada, aps agitao (soluo 1:100).
Retira-se ento outro 1mL desta ltima soluo e coloca-se em um

novo tubo contendo tambm 9 mL de soluo salina esterilizada, sem-
pre aps agitao (soluo 1:1000).
Por fim, se necessrio, a mesma operao anterior pode ser repetida, e

uma alquota de 1 ou 0,1mL plaqueada em um meio de cultura apropriado.
Em geral, usa-se gar Sabouraud acrescido de antibitico (cloranfenicol,
estreptomicina ou penicilina).
Aps sete dias, faz-se o isolamento dos fungos, repicando-se as

colnias para tubos de ensaio contendo meio slido.
Aps o desenvolvimento das colnias, procede-se identificao

genrica-especfica dos fungos.
A coleta de substratos orgnicos, como folhas, frutos, razes e troncos

em diferentes estdios de decomposio tambm interessante. Estercos de
herbvoros devem ser coletados frescos, com uma esptula grande e acondici-
onados em sacos plsticos.
Importante lembrar que as regras de assepsia parcial e etiquetagem (local
de coleta, data, condies ambientais e substrato) so idnticas para qualquer
coleta, e devem receber ateno especial.
O mtodo da placa de solo consiste em se colocar, com uma esptula,
quantidades pequenas de solo em uma placa esterilizada, evitando os tor-
res de terra. Verter ento o meio de cultura com antibitico (sugere-se a
utilizao do meio de MARTIN, com rosa-bengala e sulfato de
streptomicina) e deixar solidificar.
Para o isolamento de fungos de substratos orgnicos pode-se utilizar o
mtodo de presso de folhas. Este consiste em se pressionar com uma pina
uma folha sobre a superfcie do meio de cultura com antibitico, retirando-a
em seguida. A placa, ento, deixada temperatura ambiente, observando-se
diariamente o crescimento das colnias.
Outra opo seria plaquear amostras de substratos (folhas, galhos, inse-
tos, etc), cortadas com bisturi em pequenos pedaos. Deposita-se de uma a
trs amostras equidistantes sobre o gar, umedecendo-as levemente com gua
esterilizada. Se a amostra for de insetos muito pequenos, coloc-los intactos.
Micologia | 453
B. Fungos macroscpicos
Existe uma variao muito grande de fungos macroscpicos, de con-

sistncia diferente. Alguns se decompem logo aps serem coletados,
outros so mais resistentes. De qualquer modo, cuidado e bomsenso tor-
nam-se necessrios para o sucesso de uma coleta. Os materiais comumente
usados so:
Cristalizador.
Folha de papel dupla face (branca/preta), para coleta de esporos.
Frascos de vidro escuros com fixador lcool a 5%.
Papel de filtro ou algodo.
No caso de o substrato ser esterco de herbvoros, preparar um cristalizador
contendo papel de filtro embebido em gua e glicerina (para no ressecar
rapidamente), antes de introduzi-lo no recipiente. Tampar, ento, deixando o
conjunto temperatura ambiente e ao abrigo do sol, porm com iluminao.
Impedir o ataque de inseto ou outros artrpodes e observar o crescimento
macroscpico dos fungos.
Nas coletas, deve-se retirar o material por inteiro com o auxlio de uma
faca ou esptula, cuidadosamente, para evitar quebra ou esfarelamento. Se
possvel, trazer parte do substrato junto. Aconselha-se no misturar materiais
diferentes em um mesmo saco a fim de evitar a mistura de esporos. Ao
transport-los para outro lugar, acomod-los na mochila ou cesta, protegendo-
as com folhas de jornal. Amostras delicadas podem ser coladas no fundo de
uma caixa de fsforos. Durante as coletas, anotaes sobre cor, textura e
tamanho do material coletado devem ser feitas, pois na maioria dos casos os
fungos tm suas caractersticas alteradas depois de secos.
C. Ar atmosfrico
O ar representa um repositrio natural, sob a forma de esporos, dos

mais diversos tipos e grupos de fungos. O isolamento depende do local, do
tempo de exposio e do substrato empregado. A coleta de ar pode ser
realizada de duas formas:
1. Com um amostrador de ar por impactao - Nestes amostradores

h um compartimento onde colocada uma placa de Petri com o
meio de cultura escolhido e quando o amostrador ligado, a placa
recebe todo o ar puxado em um volume determinado por dez minu-
tos. Ao trmino, essas placas so incubadas a 250C por sete dias.
As colnias so contadas e repicadas para tubo de ensaio e deve-se
ento proceder identificao dos fungos isolados.
2. Expondo as placas de Petri com meio de cultura escolhido, por

cinco, dez ou quinze minutos ao ar atmosfrico no ambiente selecio-
nado, incubando em seguida a 250C por sete dias. Repicar as
colnias para tubo de ensaio e proceder identificao dos fungos
isolados.
D. gua
Fungos aquticos
Em ambientes aquticos, encontramos tanto fungos zoospricos como
tetraradiados (no zoospricos). Os primeiros so realmente adaptados ao
ambiente aqutico, pois possuem esporos flagelados mveis. O segundo
grupo, sem flagelos, apresenta esporos de forma radiada, com trs ou qua-
tro braos partindo de um mesmo ponto, ou ainda sigmides ou ovalados.
Esta morfologia concede maior facilidade de flutuao, disperso e aderncia
ao substrato.
Micologia | 455
Os fungos aquticos podem tambm ser encontrados no solo, graas

formao de estruturas de resistncia que lhe permitem sobreviver at que
condies de umidade favorveis se estabeleam. Para observao destes fun-
gos, torna-se necessria a coleta de amostras de gua e solo, s quais adicio-
nam-se iscas especiais. Assim, o material para a iscagem :
cido clordrico a 1%.
Frasco de 100ml, de boca larga e tampa.
Hidrxido de potssio a 2%.
Hipoclorito de sdio a 10%.
Iscas como: asa de insetos, celofane, ecdise de cobra, exoesqueleto
de camaro, folha de gramnea descorada ou fervida, frutos (ma,
jabuticaba, etc), gro de plen do Pinus, gravetos e sementes (cnha-
mo, Crotalaria sp.).
Papel alumnio.
Papel encerado.
Saco de tela de nilon ou lata.
A iscagem pode ser realizada no campo ou no laboratrio. importante
salientar que a transparncia do material ir determinar sua eficincia como isca.
De preferncia, os frascos devem ser esterilizados. Para fins taxionmicos, este
requisito passa a ser obrigatrio.
No momento da coleta da gua, juntar ao pote gravetos ou folhas que
estiverem nas proximidades. Uma vez no laboratrio, transferir uma parte do
coletado para placas de Petri esterilizadas, adicionar as iscas e deixar tempe-
ratura ambiente. Com o desenvolvimento das colnias, entre 48 e 72 horas,
procede-se ao isolamento da cultura pura, utilizando o meio MP-5.
Aps o crescimento em meio slido, retirar um pequeno quadrado de
1x1cm da parte mais perifrica da colnia, colocando-o em uma placa esterili-
zada com gua destilada estril e duas a trs metades de sementes de cnha-
mo. Decorridas 48 horas, o material deve estar pronto para ser observado
diretamente ou montado em lmina.
Todos os substratos que portarem crescimento micelial devem ser sepa-
rados, lavados em gua destilada e recolocados em placas contendo novas
amostras do mesmo substrato com gua destilada esterilizada renovada. Em
lmina, pode-se observar os flagelos colocando-se uma a duas gotas de Karo
na montagem, a fim de diminuir a mobilidade dos zosporos.
Para as espcies que dificilmente ocorrem neste tipo de iscagem, reco-
menda-se a submerso de frutos, gravetos ou folhas dentro de latas perfuradas
ou bolsas de nilon. Estas devem ser amarradas com fio plstico e, de prefe-
rncia, protegidas da observao pblica. Aps duas ou trs semanas, este
material deve ser retirado e lavado em gua corrente por cerca de trinta minu-
tos, para a remoo de detritos, bactrias, protozorios e pequenos
invertebrados. Se os fungos estiverem presentes, pstulas esbranquiadas apa-
recero na epiderme do fruto, as quais devero ser observadas.
5.4. Preservao de fungos

Culturas microbianas so extremamente vulnerveis e podem se contami-
nar, mutar ou morrer. Muitas vezes, culturas so insubstituveis, e sua perda
pode ser muito grave. Outras vezes ela pode ser reisolada ou adquirida de
uma coleo de culturas. Em qualquer um dos casos, tempo, informao e
dinheiro so desperdiados, mas isto pode ser evitado ou minimizado com um
sistema eficiente de preservao de linhagens. Esta uma das funes mais
importantes de uma coleo de culturas. A preocupao central a preserva-
o de linhagens com suas caractersticas originais durante um longo perodo de
tempo. Novas espcies, mutantes, organismos portadores de plasmdeos e
linhagens produzidas por engenharia gentica devem ser preservadas, de forma
Micologia | 457
a manter as suas propriedades. Assim, essencial que colees de culturas

executem pesquisas no intuito de definir tcnicas de preservao apropriadas.
importante frisar que no existe nenhum mtodo universal para uma preserva-
o adequada a todos os microrganismos. Grupos taxonmicos de microrga-
nismos, e at linhagens dentro da mesma espcie, variam quanto a sua resposta
aos diferentes mtodos de preservao.
Mtodos de preservao
Estes mtodos tm como objetivo manter as culturas num estado vivel

sem mudana morfolgica, fisiolgica ou gentica. Para se obter um bom
resultado na aplicao de um mtodo de preservao, a cultura deve estar em
timas condies, deve-se respeitar as condies timas de crescimento, tem-
peratura, umidade, aerao, iluminao e meio de cultivo.
A. Repique
gar
O mtodo mais tradicional de preservao de culturas atravs da
transferncia peridica da cultura (repique) para um novo meio de cultivo
slido ou lquido. O intervalo entre cada transferncia varia com o microrganis-
mo, o meio de cultivo empregado e as condies ambientais.
A maioria dos fungos pode crescer em BDA ou EM, contudo, alguns
tm requerimentos especiais de crescimento. O perodo de tempo entre as
transferncias varia de fungo para fungo. Para alguns, a cada duas ou quatro
semanas, a maioria a cada dois a quatro meses, enquanto outros podem
sobreviver 12 meses sem transferncia. Trs condies devem ser determinadas
quando se usa este mtodo para preservao de microrganismos:
Meio adequado para manter as culturas.
Temperatura ideal de estocagem.
Frequncia entre as transferncias.
Preservao sob leo mineral

Muitas espcies de fungos podem ser preservadas por meses ou anos
atravs de um mtodo relativamente fcil e simples, que o de imerso em
leo mineral. O leo deve ser esterilizado por aquecimento em um forno
Pasteur a 170C por uma ou duas horas ou autoclavagem dupla por quinze
minutos a 121C.
Deixar crescer a cultura em meio apropriado. O repique pode ser feito
em gar inclinado ou no.
Aps um crescimento adequado, colocar assepticamente o leo mineral
estril sobre a superfcie da cultura a uma altura aproximada de 1 a 2cm
(quando a cultura estiver em gar inclinado, cobre-se completamente a super-
fcie). Isto impede a desidratao e reduz a atividade metablica, assim como a
velocidade de crescimento do microrganismo, devido reduo da tenso do
oxignio.
Guardar as culturas com leo mineral na posio vertical. Fazer testes de
viabilidade periodicamente para determinar se a cultura est deteriorando.
Blocos de gar em gua

O mtodo consiste em cultivar o microrganismo em uma placa de Petri
contendo um meio de gar apropriado. Aps o crescimento vigoroso o gar
cortado com uma lmina estril em blocos de aproximadamente 4 a 6 mm. No
caso de fungos, a partir do final do crescimento das colnias, um nmero
apropriado de cubos transferido assepticamente para tubos ou frascos con-
Micologia | 459
tendo 10 a 15 mL de gua destilada estril. Para reativao, basta retirar

assepticamente um dos cubos e deposit-los sobre um meio adequado, a sua
aplicao fica restrita a microrganismos que tenham grande aderncia ao gar,
como no caso de fungos filamentosos e algumas leveduras.
B. Secagem
Secagem em areia, solo e slica-gel

Tambm considerada como um bom mtodo de conservao de
microrganismos. Pode ser uma simples secagem de esporos ou secagem
sob vrias condies, como, por exemplo, em secador com ou sem vcuo.
Para tanto, emprega-se a seguinte linha de trabalho: Preparar o tubo
para estocagem (pode ser de tampa rosquivel ou frascos de penicilina),
enchendo-o at com gel (slica-gel purificada, sem indicador, 6-22
mesh), depois esterilizar no mnimo durante trs horas a 180C (calor
seco), e colocar em atmosfera seca para seguir em banho de gelo overnight.
Fazer uma suspenso de esporos em leite frio desnatado (5%). Derramar a
suspenso fria sobre a slica gelada e depois levar para um banho de gelo,
pelo menos durante quinze minutos.
Deixar os gis temperatura ambiente (25 a 30C) dentro de
dessecadores at que, com a agitao, os cristais sejam separados (cerca
de uma a duas semanas ou dois a trs dias para fungos de crescimento
rpido). Armazenar os tubos em dissecadores em sala fria ou recipientes
com slica em geladeira (4C), embora bons resultados possam ser obtidos
Armazenamento em solo estril

A preservao de fungos em solo estril, pode ser feita de duas maneiras:
pela inoculao de uma suspenso de esporos;
pela inoculao de esporos secos em solo seco ou em substrato

similar, com subseqente estocagem do material seco.
O mtodo de estocagem em solo empregado consiste em inocular 5g
de solo (20% de umidade e esterilizado pelo menos duas vezes a 121C
por quinze minutos) com 1mL de suspenso de esporos em gua, com
subsequente crescimento durante cerca de dez dias temperatura ambiente. O
armazenamento dever ser feito de preferncia em refrigerador a 5C.
C. Liofilizao (freeze-drying)
A liofilizao, ou freeze-drying um dos mtodos mais econmicos e
eficientes de preservao a longo prazo. O mtodo permite a produo de
grande nmero de liofilizado porque o uso de ampolas pequenas facilitam a
estocagem. Enquanto o procedimento da liofilizao relativamente simples, o
aspecto terico bastante complexo, pois a liofilizao envolve a remoo de
gua de uma suspenso de microrganismos congelados por sublimao sob
presso reduzida, isto , a gua evaporada sem passar pela fase lquida
(passagem do estado slido para o estado gasoso).
As clulas secas podem ser estocadas por longo perodo, se mantidas
longe de oxignio, umidade e luz. Elas podem a qualquer hora ser facilmente
re-hidratadas e ativadas.
A liofilizao pode ser realizada de vrias maneiras, pois vrios tipos de
aparelhos foram desenvolvidos para este fim.
No caso dos fungos, importante lembrar que o sucesso da liofilizao
varia entre linhagens de mesma espcie; em geral, aqueles que crescem e
Micologia | 461
esporulam bem em cultura sobrevivem ao processo, enquanto que isolados em

estado deteriorado ou debilitado no resistem liofilizao.
Requisitos bsicos para liofilizao

Meio de suspenso externo para congelamento (lcool metlico ou
etlico + gelo seco).
Gerador e mantenedor de vcuo (bomba).
Absorvente do vapor de gua (dissecante - condensador - lquido
refrigerante).
Parmetros de liofilizao
Tipo de clula; crescimento e idade da cultura; concentrao celular; meio de
suspenso (crioprotetores); velocidade de resfriamento; mtodo de seca-
gem; condio de estocagem; mtodo de constituio e mtodos de anlise
(medidas de viabilidade, injria, morte e outros parmetros).
Crioprotetores
Materiais proteicos, carboidratos; aminocidos; leite desnatado e
outros.
Meios de suspenso:
Leite desnatado 10%; leite desnatado 10% + inositol 5%.
Sacarose 7% + peptona 7%; inositol 5% em soro de sangue de
cavalo e outros.
Mtodo de liofilizao:
Pr-congelamento + vcuo (umidade residual 1% a 2%);
Centrifugao + vcuo
Secagem primria: umidade residual 5% a 10%.
Secagem secundria: umidade residual 1% a 2%.
Congelamento:
A preservao das caractersticas de microrganismos armazenados em um
freezer com faixa de temperatura de 0 a -20C produz resultados
diversos, sendo que seu sucesso depende da espcie de fungo.
Parmetro de congelamento:
Escolha do tipo de refrigerador, escolha de ampolas e frascos, agentes
crioprotetores, culturas e preparao de suspenso, velocidade de
resfriamento, estocagem e velocidade de descongelamento.
Pr-resfriamento para congelamento:

Freezer (velocidade de resfriamento, vr = 1C/min.).
Gelo seco (vr = 7C/min).
Fase vapor de nitrognio (vr = 18oC/min).
Congelamento direto:
Fase lquida de nitrognio (vr = 200 C).
D. Armazenamento em nitrognio lquido

Utiliza-se o nitrognio lquido para se conseguir temperaturas ultrabaixas.
Isso tem sido satisfatrio para grande nmero de clulas vivas.
O mtodo apresenta certas desvantagens: a aparelhagem requerida
mais cara que a usada para secagem ou congelamento; h necessidade de
condies bem controladas de congelamento e degelo, e ainda h o risco de
exploso de ampolas. Tambm um mtodo menos interessante que a seca-
gem, quando se usa o armazenamento para distribuio de culturas.
A estocagem a temperaturas ultrabaixas reduz as trocas fsicas e
qumicas e um bom mtodo para ser usado quando as culturas so de
difcil liofilizao.
Micologia | 463
Nos fungos, faz-se uma suspenso de esporos em glicerol 10% e

alquotas de 0,5mL so distribudas em ampolas de vidro-borosilicato ou
criotubos de 1mLe marcadas com o nmero da cultura usando tinta perma-
nente. As ampolas so seladas com maarico (quando criotubos, as tampas
so bem fechadas) e colocadas num banho com corante em refrigerador de 4
a 8C por trinta minutos para pr-resfriamento. Este procedimento permite
que o glicerol penetre e envolva o organismo. O corante indica qualquer falha
no selamento das ampolas ou criotubos, caso o contedo fique colorido.
Tal procedimento seguido pelo congelamento das ampolas a -35C
por quarenta a sessenta minutos, e as ampolas so ento colocadas no nitrog-
nio lquido e congeladas rapidamente a -196C. A reativao feita colocan-
do-se as ampolas rapidamente em banho de gua a 37C at os cristais de
gelo derreterem. As ampolas ento so abertas e o contedo dispensado em
meio de cultura adequado ao crescimento.
Para se fazer o controle da viabilidade e pureza das culturas congeladas,
a reativao deve ser feita aps trs a quatro dias de estocagem no nitrognio
lquido.
E. Mtodo do papel de filtro (preservao de fungos

entomopatognicos)
Procedimento:
Tiras de papel de filtro previamente esterilizadas (estufa 105C por
24h), so distribudas sobre o meio BDA (batata dextrose gar), em
placas de Petri, pouco antes de endurecer.
Culturas fngicas so transferidas para estas placas e incubadas por
oito dias (dependendo do isolado) a 28C.
As tiras de papel apresentando estruturas fngicas so retiradas das
placas e transferidas para placas de Petri, para ento serem mantidas em
dessecador contendo slica gel, onde devero permanecer por 48 horas
Aps este perodo de incubao, as tiras so acondicionadas em

saquinhos de papel-manteiga, previamente esterilizados, e armazenadas
em dessecador temperatura ambiente.
F. Mtodo da slica gel

Procedimento:
Preparar recipientes (vidrinhos com tampa ou tubos Eppendorfs)
parcialmente cheios com slica gel (6 a 22 meshs) sem indicador, seca e
esterilizada com calor seco (180C/90 min).
Cultivar os isolados em meio de cultura at a fase de esporulao.
Preparar suspenso de esporos em leite em p desnatado (10%),
esterilizado e esfriado a 4C.
Adicionar a suspenso de esporos slica, resfriada a 4C, sendo
0,5 mL da suspenso para 4 g de slica.
Incubar a 4C por trinta minutos.
Armazenar temperatura ambiente por duas semanas e depois vedar
as tampas.
Transferir para geladeira (4 C) para longo perodo de armazenamento.
6. Tcnicas utilizadas em Micologia mdica
O diagnstico laboratorial das infeces fngicas requer a coleta

de amostras apropriadas e procedimentos laboratoriais adequa-
dos, segundo indicao clnica do paciente. A qualidade da
amostra disponvel para anlise laboratorial de fundamental
importncia. Coleta, estocagem e processamento de espcimes
inadequados podem levar a um diagnstico errneo.
Dependendo da micose do paciente, uma srie de materiais podem ser

enviados ao laboratrio para exame, como relacionado no quadro a seguir.
Micologia | 465
Tipos de micose Tipos de material usualmente enviado

ao laboratrio para exame
Superficiais e cutneas Pele, pelos, unhas, exsudatos

Subcutneas Pus, tecidos (bipisas), exsudatos
Sistmicas e oportunistas Escarro, pus, tecidos (bipsias), exsudatos
lquor,materiais brnquicos, medula ssea,
sangue, urina
6.1. Coleta e processamento de espcimes clnicos
6.1.1. Pele
A. Coleta
Limpar com lcool etlico ou ter (Em alguns casos nenhuma antissepsia
pode ser feita). Se a leso for mida, limpar com gua destilada ou
soluo salina estril. Lmpada de Wood pode ser usada para orientar a
coleta e o diagnstico.
Raspar com lmina de bistur estril ou cureta dermatolgica a borda
das leses, evitar colher o material do centro da leso.
Colocar o material em placa de Petri entre duas lminas ou em
envelope (estreis).
B. Processamento
Exame microscpico direto - KOH 10% ou NaOH 4%.
Cultivo.
Meios Sabouraud-gar com cloranfenicol

Mycosel gar (contm cicloheximida e cloranfenicol)*
Semeadura Semear trs a cinco escamas de pele em cada tubo
Incubao Incubar temperatura ambiente
Observao Observar o crescimento de fungos por at trs semanas
Identificao Identificar os fungos isolados em geral pela morfologia
6.1.2. Pelos
A. Coleta
Com pina estril coletar o mximo de pelos afetados. A lmpada de
Wood pode ajudar na seleo.
Colocar em placa de Petri, entre duas lminas ou em envelope
(estreis).
Procurar sempre colher, por raspagem, amostra de pele onde se
implantam os pelos afetados, mesmo se tiverem aparncia sadia.
B. Processamento
realizado da mesma maneira que para amostras de pele.
6.1.3. Unhas
A. Coleta
Limpar com lcool etlico ou ter.
Raspar com lmina de bisturi estril ou com tesoura cirrgica de ponta
reta grande quantidade da parte lesada da unha. Desprezar as primeiras
raspagens. Excelente para exame e cultivo a parte da unha aparente-
mente so na borda da leso ungueal.
Raspar o material sob a unha, em caso de leso na parte proximal e
periungueal.
Micologia | 467
Colocar o material em placa de Petri, entre duas lminas ou envelope

(estreis).
B. Processamento
realizado da mesma maneira que para amostras de pele.
6.1.4. Escarro
A. Coleta
Quantidade: 5 a 10 mL so suficientes.
Coletar, de preferncia em jejum, o primeiro da manh, aps escovar
os dentes e bochechar com soluo antissptica.
Colher em recipiente estril.
Processar at duas horas aps a coleta.
B. Processamento
Fluidificao e concentrao de escarro:
Adicionar ao escarro 10 mL de soluo de citrato de sdio
0,10 mol/L e 0,10g de N-acetil L-cistena.
Agitar bastante, centrifugar e desprezar o sobrenadante.
Exame microscpico direto: KOH 10% ou NaOH 4%.
Cultivo:
Meios Sabouraud-gar com cloranfenicol e Mycosel gar
Semeadura Espalhar o material em pelo menos dois tubos de cada meio
Incubao Incubar temperatura ambiente e a 37C
Observao Observar o crescimento de fungos at quatro a seis semanas
Identificao Identificar os fungos isolados*
* Em geral realizada atravs de observao ao microscpio das colnias isoladas, em preparaes com
lactofenol-azul de algodo, cultivo em lminas, demonstrao de termotolerncia e demonstrao do
dimorfismo entre outras tcnicas.
7.1.5. Pus
A. Coleta
Colher assepticamente, de preferncia atravs de puno (nesse caso
o procedimento realizado por um mdico).
Colocar em recipiente estril ou processar imediatamente.
Processar o mais rpido possvel, caso o processamento no tenha
sido realizado no momento da coleta.
B. Processamento
Cultivo:
Semeadura Pelo menos dois tubos de cada, se houver material suficiente.
Caso contrrio, semear em quantos tubos forem possveis
Observao Observar o crescimento de fungos at quatro semanas
Identificao Identificar os fungos isolados
Observao: Caso se observe gros no pus, deve-se limpar a leso com salina
estril, cobri-la com gaze estril e, comprimir a regio ao redor da leso, a fim
de que os gros fiquem retidos na gaze. Se houver dificuldade de se obter
material, deixar a gaze sobre a leso do paciente at o dia seguinte. Obser-
vamos este material ao microscpio estereoscpico pescando os gros, com
auxilio de uma agulha ala de platina e, colocando-os em uma placa com
salina estril para lav-los.
Aps a lavagem, processar:
1. Exame direto: NaOH 4% ou KOH 10%.
2. Cultivo:
Micologia | 469
Gros actinomicticos Semear em Caldo Tioglicolato e Sabouraud sem

antibitico.
Gros eumicticos Semear em Sabouraud com cloranfenicol, observar de
trs a quatro semanas e identificar os isolados.
6.1.6. Aspirado de medula ssea
A. Coleta
O mdico deve coletar por puno.
Colocar em frasco estril com heparina. Evitar heparina de reuso, pois
esta deve ser rigorosamente estril. Nunca colher em frascos com EDTA,
pois esta substncia se combina com elementos da parede do fungo,
diminuindo a sensibilidade do exame.
Processar at duas horas aps a coleta.
B. Processamento
Exame direto geralmente no realizado. Mas se necessrio, corar
lminas com Giemsa ou Gram.
Cultivo:
Meios Sabouraud-gar com cloranfenicol

Mycosel gar
BHI gar (se possvel com sangue de carneiro 5%)
Observao Observar o crescimento de fungos at seis semanas
6.1.7. Tecidos (bipsia)
A. Coleta
O procedimento de coleta realizado pelo mdico
Colocar, preferencialmente em tubo estril, contendo 2 a 3 mL de
soro fisiolgico tambm estril. Na ausncia de frascos estreis com
salina, colocar entre duas gazes estreis umedecidas com soro fisiolgi-
co, acondicionando em recipiente estril para transporte.
Processar rapidamente, no mximo em duas a quatro horas.
B. Processamento
Pinando firmemente o tecido, cortar pequenos fragmentos e em
seguida macerar (em gral, homogeneizador ou com tesoura cirrgica
estril).
Cultivo:

Observao Observar o crescimento de fungos at quatro semanas
* Para isolar Zigomicetos (Mucor, Rhizopus, Absidia etc) usar o meio:
Po umedecido esterilizado em tubo ou placa. Acrescentar cloranfenicol na
concentrao de 300mg/l no processamento. Fragmento de tecido deve ser
cortado com bisturi em pequenos pedaos com cuidado, evitando a macerao.
6.1.8. Lquor
A. Coleta (sempre realizada por um mdico).
Quantidade ideal: 1,0 mL em tubo estril (s vezes vm menos
material).
Micologia | 471
Processar rapidamente;
Se for preciso conservar: guardar sob refrigerao (4C).
Observao: Cryptococcus tolera bem a refrigerao.
B. Processamento
Centrifugar o lquor;
Exame microscpio direto do sedimento com tinta nanquim
(OBRIGATRIO) e esfregaos corados com Gram e Giemsa
(caso necessrio).
Cultivo:
Meios Sabouraud-gar com cloranfenicol e BHI - NUNCA Mycosel

Semeadura Semear o sedimento em pelo menos dois tubos de cada meio
Observao Observar o crescimento de fungos at quatro a seis semanas
Identificao Identificar todos os fungos isolados
6.1.9. Exsudatos (Pleura, pericrdio, peritnio, articulaes, etc)
A. Coleta
Colher em tubo estril com heparina estril. O ideal j ter heparina
na seringa.
Processar rapidamente.
B. Processamento
Centrifugar e desprezar o sobrenadante.
Exame microscpico direto do sedimento com KOH 10% ou NaOH
4% e tinta nanquim.
Cultivo: realizado da mesma forma que escarro (item 6.1.4 deste
captulo)
6.1.10. Material brnquico (aspirado, escovado, lavado e outros)
A Colheita (sempre realizada pelo mdico do paciente)

Colher em frasco estril.
B. Processamento
Centrifugar e desprezar o sobrenadante. Realizar exame microscpico
do sedimento com KOH 10% e tinta nanquim. Cultivo do sedimento
damesma forma que para amostra de escarro.
6.1.11. Urina
A. Coleta
Quantidade 25 a 50 mL em frasco estril;
Recomendar:
Primeira urina da manh.
Cuidados de higiene local.
Desprezar o primeiro jato.
Processar no mximo em duas a quatro horas.
Conservar sob refrigerao (4C), excepcionalmente.
B. Processamento
Exame microscpico direto do sedimento com KOH 10% ou NaOH
4% e tinta nanquim.
Cultivo:

Semeadura Semear o sedimento em pelo menos dois tubos de cada meio
de cultura
Observao Observar o crescimento de fungos at seis semanas
Identificao Identificar os fungos isolados*
Micologia | 473
Nota: Para investigao da etiologia fngica, recomenda-se coleta de uma

amostra matinal diria, por trs dias consecutivos. * A ANVISA tambm
recomenda que seja realizada cultura quantitativa da urina para contagem de
unidades formadoras de colnia, atravs da semeadura da urina no centrifugada
em uma placa de Sabouraud gar com ala calibrada.
6.1.12 Sangue (para hemocultura)

A. Coleta
Fazer assepsia local com lcool iodado.
Quantidade: 4 a 5 mL de sangue (utilizando escalpe e seringa
descartvel).
Colocar diretamente em frasco de hemocultura contendo meio de
BHI lquido ou liquoid.
Manter o frasco (j inoculado) em temperatura ambiente, invertido
em estantes apropriadas.
Processar em 48 horas aps a colheita; dez dias aps a primeira
semeadura e dez dias aps a segunda semeadura.
Se forem utilizados frascos de sistemas automatizados, seguir instru-
es do fabricante.
B. Processamento
Exame direto em geral no realizado, se necessrio, corar lminas
pelo Gram ou Giemsa.
Cultivo:
Meios BHI gar com cloranfenicol
Semeadura Retirar o hemocultivo (com seringa descartvel) e inocular cerca
de 1 mL em cada tubo de cultura, espalhando o sangue por
toda superfcie do meio
Observao Observar as subculturas (tubos) por at seis semanas
Incubao Incubar temperatura ambiente e observar de quatro
a seis semanas
Identificao Identificar todos os fungos isolados
6.2. Coleta de sangue: separao, conservao e

estocagem do soro
Cerca de 10 mL de sangue devero ser colhidos atravs de puno
venosa, em tubo de ensaio estril sem adio de anticoagulantes. O soro
separado aps retrao do cogulo, segundo os preceitos tcnicos, a fim de
evitar hemlise. Adicionar ao soro, mertiolato na concentrao final de
1:10.000, a partir de soluo estoque 1:100.
Distribuir em alquotas de 1 mL em pequenos tubos e ensaio ou frascos,
identific-los corretamente e armazenar em congelador at o momento do uso
ou envio ao laboratrio de referncia.
6.3. Preparo e padronizao dos antgenos utilizados nas

provas sorolgicas e reaes intradrmicas
6.3.1. Polissacride de Paracoccidioides brasiliensis
O antgeno obtido a partir de clulas de Paracoccidioides

brasiliensis em sua fase leveduriforme, segundo tcnica de
FAVA NETTO, de natureza qumica quase que exclusi-
vamente polissacardica. O antgeno utilizado nas reaes
de fixao de complemento, precipitao em meio lquido
e nas provas intradrmicas de leitura tardia.
a) Preparar o meio de cultura - Fava Netto;
b) No preparo do antgeno, utilizar no mnimo trs amostras diferentes de

P. brasiliensis, que so mantidas em sua forma leveduriforme em estufa a
35C , no meio acima descrito e, com repiques a cada vinte dias.
c) Preparar suspenso em soluo fisiolgica estril das clulas

leveduriformes do fungo.
Micologia | 475
d) Com auxlio de pipeta estril, espalhar a suspenso sobre a superfcie

do meio de cultura contido em garrafas de Roux.
e) Incubar a 35C durante vinte dias.
f) Decorrido o prazo estipulado, colher as clulas do fungo, com auxlio

de esptula e fazer suspenso em soluo tampo Veronal, contida em
frascos apropriados para centrifugao.
g) Homogeneizar a suspenso com auxlio de basto de vidro e centrifugar

a 2.000 rpm durante dez minutos.
h) Desprezar o sobrenadante ( conveniente, antes, autoclavar o

sobrenadante, pois ele pode conter clulas viveis, ou adicionar formalina).
i) Fazer suspenso do sedimento em aproximadamente cinco volumes de

acetona. Homogeneizar a suspenso com auxlio de basto de vidro
(estril).
j) Centrifugar a 2.000 rpm durante dez minutos. Desprezar o

sobrenadante.
k) Repetir as operaes i e j por mais duas vezes.
l) Repetir as operaes i, j e k, com ter sulfrico.
m) Anotar o volume do sedimento e deix-lo em frasco aberto em

geladeira at o dia seguinte, quando as clulas estaro secas.
n) Fazer suspenso a 15% em soluo tampo veronal, levando em

considerao o volume das clulas anotado no item m.
o) Autoclavar a suspenso a 115C durante quinze minutos.

p) Centrifugar a 2.000 rpm, durante trinta minutos, tendo o cuidado

em manter condies de esterilidade.
q) Deixar o frasco em geladeira at o dia seguinte.
r) Repetir a operao p.
s) Separar cuidadosamente o sobrenadante e adicionar mertiolato na

concentrao final de 1:10.000.
t) Distribuir o antgeno em alquotas de 1 a 5ml, em frascos ou tubos

estreis. Identificar e datar.
u) Realizar controle de esterilidade.
v) A estabilidade do antgeno superior a dois anos, quando esto-

cado a 4C.
A padronizao do antgeno polissacardico para emprego na reao de

fixao de complemento se faz atravs da titulao desse antgeno ante o soro
de paciente portador de paracoccidioidomicose e, que reconhecidamente seja
positivo em tal reao diante do antgeno padro.
Nas reaes intradrmicas, o antgeno deve ser padronizado em pacien-
tes portadores de paracoccidioidomicose, ou em animais experimentalmente
infectados. Atravs da utilizao de antgeno padro, chega-se diluio tima
que dever ser utilizada para o novo antgeno. Fava Netto, atravs de sua
experincia pessoal, verificou que a diluio do antgeno a ser utilizado nas
provas intradrmicas corresponde a 1/10 daquela que representa a dose tima
de antgeno para fixar unidades de complemento 50% de hemlise, na prova
de fixao de complemento. Geralmente a diluio tima do antgeno para
utilizao nas reaes intradrmicas est em torno de 1:10.
Micologia | 477
6.3.2. Filtrado de cultura de Paracoccidioides brasiliensis
O antgeno obtido por essa tcnica, constitui-se em excelente reagente

para ser utilizado nas reaes de fixao do complemento e precipitao em
gel. Sua natureza qumica glicoproteica.
Preparar o meio de cultura - Negroni (item 4.1 deste captulo)

Inocular os frascos com pelo menos trs amostras diferentes de P.
brasiliensis, a partir de cultivos mantidos a 35C.
Incubar a 35C durante quatro semanas sob agitao constante.
Observao: Se no houver disponibilidade de manter os cultivos sob agita-
o constante, os mesmos podero ser mantidos estticos a 35C durante
12 semanas.
Decorrido o tempo de cultivo, adicionar mertiolato na concentrao
final de 1:10.000, agitar e incubar a 35C durante uma semana.
Realizar controle de esterilidade.
Filtrar as culturas em papel de filtro.
Colocar o filtrado em placas de Petri limpas e deixar em estufa a
37C, at que o volume seja reduzido a 1/20 do volume original, ou
utilizar polietilenoglicol (concentrando vinte vezes).
Centrifugar a 2.500 rpm por trinta minutos.
Distribuir o filtrado, que constitui o antgeno em alquotas de 1 a 5 mL
em frascos tipo penicilina, identificar, datar e estocar a 4C.
6.3.3. Filtrado de cultura de Histoplasma capsulatum

(HISTOPLASMINA)
Preparar o meio de cultura - Smith-Asparagina (item 4.1 deste captulo).

Semear de trs a cinco amostras diferentes de Histoplasma capsulatum
nos bales contendo o meio de cultura.
Deixar as culturas temperatura ambiente e no escuro, durante quatro

a seis semanas, sob agitao.
Decorrido o prazo estabelecido, adicionar mertiolato na concentrao
final de 1:10.000. Agitar para submergir os filamentos e deixar
temperatura ambiente durante uma semana.
Filtrar em papel de filtro.
Dependendo do emprego da histoplasmina, temos dois caminhos a
seguir:
Utilizao em reaes sorolgicas (Reaes de fixao de com-

plemento e precipitao em gel de gar)
Colocar o antgeno em placas de Petri limpas, deixar a 37C

at que o volume seja reduzido para 1/20 do volume original.
Centrifugar a 2.500 rpm durante trinta minutos.
Distribuir o antgeno em frascos tipo penicilina.
Identificar, datar e conservar a 4C.
Para padronizao nas provas sorolgicas, consultar o item

6.5 deste captulo.
Utilizao em provas intradrmicas
Aps filtrar em papel de filtro a histoplasmina filtrada em

membrana esterilizante (poro de 0,22 mm).
Distribuir em frascos tipo penicilina e estocar a 4C.

Micologia | 479
A histoplasmina a ser utilizada nas reaes intradrmicas

geralmente diluda a 1:1000, em soluo fisiolgica estril.
Devero ser realizadas provas em indivduos sensveis ao
antgeno, ou animais previamente sensibilizados, diante de
H. capsulatum, utilizando-se histoplasmina padro para fins
de comparao.
6.3.4. Filtrado de cultura de Aspergillus fumigatus
Cultivar A. fumigatus (mnimo de trs amostras diferentes) em

caldo Sabouraud por quatro semanas temperatura ambiente.
Decorrido o prazo estipulado, adicionar mertiolato na concentrao
final de 1:5.000. Agitar para submergir os filamentos.
Deixar as culturas temperatura ambiente durante uma semana.
Filtrar em papel de filtro.
Colocar o filtrado em placas de Petri limpas e deixar em estufa a

37C, at que o volume seja reduzido para 1/20 do volume origi-
nal, ou utilizar polietilenoglicol para concentrar.
Centrifugar a 2.500 rpm durante trinta minutos.
Distribuir o antgeno em alquotas de 1-5 mL, em frascos tipo

penicilina., Identificar, datar e conservar a 4C.
O filtrado de cultura de A. fumigatus utilizado nas reaes

de fixao de complemento e precipitao em gel de gar.
conveniente preparar pela mesma tcnica, filtrados de cultu-
ras de A. flavus, A. terreus e A. niger. Para a padronizao
do antgeno, consultar o item 6.5 deste captulo.
6.5. Tcnicas de padronizao dos antgenos utilizados nas

provas sorolgicas
a) Reao de fixao de complemento
Os antgenos utilizados nas reaes de fixao de complemento so

padronizados atravs da titulao cruzada perante soro positivo para o antgeno
em estudo. Utiliza-se, para tal propsito, antgeno padronizado com finalida-
des de controle da reao. A diluio tima do antgeno no dever demons-
trar atividade anticomplementar.
b) Imunodifuso dupla de Ouchterlony
So feitas diluies do antgeno (1:2, 1:4, 1:8 etc), as quais so

colocadas para difundir no gel, contra soro reconhecidamente positivo para o
antgeno em questo.
Decorrido o tempo necessrio para formao dos precipitados, proce-
de-se leitura da reao.
O ttulo do antgeno ser aquele correspondente sua mais alta diluio
que se d positividade ntida com o soro e o mesmo nmero de bandas de
precipitao, quando comparado ao antgeno padro.
6.6. Tcnica de imunodifuso radial dupla em gel de gar

(Ouchterlony)
REAGENTES
Reagente 1
gar noble ...............0,5 g
gua destilada..........100 mL (Estocar em erlermayer a 4 C)

Micologia | 481
Reagente 2
gar noble ...............1,0 g
Azida sdica .............0,1 g
PBS 7.2 ................100 mL
*Aquecer em banho-maria at o gar dissolver
* Colocar 3,5 mL em tubo de ensaio e estocar a 4 C
Reagente 3
PBS (Tampo fosfato 0,01 mol/L , NaCl 0,15 mol/L) pH 7.2-7.4
Soluo A: NaH2PO4 0,2 M (Fosfato de sdio monobsico)
Soluo B: Na2HPO4 0,2 M (Fosfato de sdio dibsico)
*Tampo fosfato 0,01mol/L
Adicionar 280 mL da soluo A a 720 mL da soluo B
PBS: 50 mL do tampo fosfato + 50 mL de NaCl 3 mol/L.

Completar para 1000 mL com gua destilada.
Reagente 4
Citrato de sdio 5 g ................100 mL de gua destilada

Reagente 5
SOLUO CORANTE
Coomassie brilliant blue ..............0,5 g
cido actico .........................10 mL
Etanol ...................................45 mL
gua destilada ........................45 mL
Reagente 6
SOLUO DESCORANTE
Metanol ...............................400 mL
cido actico .........................100 mL
gua destilada ........................500 mL
1 Etapa (filmagem das lminas):
Mergulhar as lminas de microscia, devidamente limpas, no reagente

1; com auxlio de uma pina, retir-las em seguida, deixando o
tempo suficiente para umedec-las.
Sec-las em estufa de aproximadamente 60C.
Aps a secagem, estoc-las em caixas para posterior utilizao.
2 Etapa:
Utilizando uma mesa nivelada, colocar a lmina previamente filma-

da com o reagente 1.
Micologia | 483
Colocar em banho-maria os tubos com 3,5 mL de gar (reagente

2) estocados, esperar liquifazer.
Verter sobre a lmina o reagente 2 liquefeito, deixando solidificar

por cinco minutos.
Coloc-las em cmara mida na geladeira.

Observao: Pode permanecer em geladeira na cmara mida at sete dias
(margem de segurana).
Aps dez minutos em geladeira, a lmina j pode ser perfurada

segundo esquema a seguir.
3 Etapa
Colocar o soro - 10 mL em cada orifcio - respeitando o esquema

acima. Nas extremidades superiores e inferiores adicionar soro pa-
dro. Nos poos 1, 2, 3 e 4, adicionar os soros a serem testados.
Aps a colocao dos soros, aguardar uma hora para adicionar os

antgenos nos orifcios centrais.
4 Etapa
Difuso em estufa a 37C ou temperatura ambiente, por 48

horas.
5 Etapa
Iniciar os banhos Colocar as lminas (aps 48 horas) em uma

cuba e verter sobre elas citrato de sdio 5 % (reagente 4) por duas
horas, com objetivo de retirar precipitados inespecficos.
Aps o banho de citrato Adicionar soluo salina 0,9 % por

48 horas, trocando vrias vezes.
6 Etapa
Usando o papel de filtro (umedec-lo previamente em gua desti-

lada), embrulhar as lminas e coloc-las em estufa de secagem a 60
C, at atingir completa secagem.
Mergulhar as lminas em gua destilada, e retirar o papel cuidado-

samente. Lavar em gua corrente para retirar resduos de papel de
filtro e sec-las em estufa.
7 etapa
Corar por dez minutos utilizando o reagente 5.
Colocar em cuba de colorao vrias lminas e verter o corante.

Aps dez minutos, retirar as lminas e estocar novamente o corante (
possvel reaproveit-lo). Periodicamente deve-se filtr-lo novamente.
8 Etapa
Aps o processo de colorao, retirar o excesso de corante com

soluo descorante (reagente 6) at que as linhas de precipitao
fiquem bem ntidas.
Observao: Se descorar muito ou totalmente pode corar novamente.
Micologia | 485
9 Etapa
Leitura: considera-se reao positiva (soro reagente) quando hou-

ver a presena de linhas de precipitao apresentando identidade
total com o soro padro. Exemplo:
6.7. Identificao de leveduras de importncia clnica

As leveduras so um grupo de fungos heterogneos que superficialmen-
te aparentam ser homogneas. A identificao desses fungos baseada nas
caractersticas morfofisiolgicas e bioqumicas. A morfologia primariamente
usada para estabelecer o gnero, entretanto, as provas bioqumicas (Teste de
reduo do nitrato e hidrolise da ureia), e de assimilao e fermentao de
acares so usadas para diferenciar vrias espcies.
6.7.1. Provas morfolgicas
Dentre as provas morfolgicas disponveis para identificar espcies do

gnero Candida temos a tcnica de Dalmau e o tubo germinativo.
A tcnica de Dalmau baseada no fato de que C. albicans, quando
cultivada em meio de cultura pobre em nutrientes, como o gar arroz ou gar
fub, produz uma estrutura de resistncia denominada clamidocondio. Dentre
todas as espcies do gnero Candida, somente C. albicans e C. dubliniensis
so capazes de formar clamidocondios, sendo que esta ltima forma
clamidocondios em cachos, apresentando trs ou mais clamidocondios por
hifa. Alm disso, esta uma espcie rara e altamente relacionada a C. albicans.
O teste do tubo germinativo baseia-se no fato de que C. albicans, quando

incubada a 37C por duas a trs horas, em soro bovino ou de coelho, forma,
a partir de suas leveduras, uma estrutura denominada tubo germinativo que
dar origem s hifas e pseudo-hifas caractersticas desta espcie.
Teste do tubo germinativo
Rotular os tubos testes com o nmero da amostra.
Usando uma pipeta, dispensar 0,5 mL de soro bovino ou de

coelho em cada tubo.
Com uma ala flambada, tocar levemente a colnia de levedura e

coloc-la no soro dentro do tubo.
Agitar para homogeneizar as clulas leveduriformes no soro. Incu-

bar os tubos a 37C por duas a trs horas.
Aps a incubao, colocar uma gota da suspenso numa lmina de

microscopia lisa e cortada e cobrir a preparao com uma lamnula.
Examinar ao microscpio para detectar a presena ou ausncia de

tubo germinativo nas clulas da levedura estudada.
Teste de Dalmau
Usar uma placa de Petri com corn meal gar adicionado de 1%

Tween 80.
Com um bisturi estril, fazer um sulco no meio de cultura, aproxi-

madamente 1 cm esquerda do meio da placa.
Com auxlio de uma ala de platina esterilizada, retirar uma peque-

na quantidade da cultura leveduriforme em estudo e semear no sul-
Micologia | 487
co. Fazer trs furos no meio de cultivo com a mesma ala direita do
sulco, formando um pequeno tringulo.
Colocar uma lamnula (24 mm x 24 mm) estril sobre o meio de

cultura, cobrindo o sulco e sobre os furos.
Incubar a temperatura ambiente por 72 horas.
Observar no microscpio ptico, em objetiva de 10X, a presen-

a ou ausncia de clamidocondios, diariamente at completar cin-
co dias.
6.7.2. Provas de assimilao
Para estudo de assimilao de fontes de carbono por leveduras podem

ser utilizados meios cromognicos, bem como kits comerciais de identificao.
Meio CHROMagar Candida
O meio cromognico CRHOMagar Cndida para diferenciao de

Candida albicans, C. krusei e C. tropicalis e outras espcies permite a identi-
ficao do microrganismo de acordo com a colorao que este apresenta no
meio semeado.
A interpretao dos resultados feita com base na cor e no aspecto
tpico das colnias, conforme apresenta a tabela a seguir:
Cor e aspecto tpico da colnia Microrganismo pr-identificado

Verde Candida albicans
Azul-metlico Candida tropicalis
Rosa, rugosa Candida krusei
Branco violeta Outras espcies
Galeria API 20C Aux
A galeria API 20 C AUX engloba vinte cpulas que contm substratos

desidratados para efetuar 19 testes de assimilao. As cpulas so inoculadas
com um meio mnimo semigelosado e as leveduras crescem apenas se forem
capazes de utilizar o substrato correspondente. A leitura dessas reaes faz-se
por comparao com os controles de crescimento (presena ou ausncia de
turvao) e a identificao possvel consultando o catlogo analtico ou um
sistema de identificao disponvel na internet (Api Web).
Mtodo Vitek YBC (Carto de Bioqumica para levedura)

O carto YBC contm 30 poos. Destes 30, 26 contm caldos
bioqumicos e quatro contm caldos de controle negativo. O carto necessi-
ta de 24 horas, e em alguns casos de 48 horas, de incubao a 30C em
uma estufa e, em seguida, de uma nica leitura depois de decorridas 24
horas, e em alguns casos de uma segunda leitura depois de 48 horas, no
leitor/incubadora VITEK para uma anlise dos dados. O carto baseia-se
nos mtodos bioqumicos estabelecidos de Wickerham e Burton. Estes tes-
tes incluem a assimilao de hidratos de carbono, hidrlise da ureia, resistn-
cia a ciclo-heximida e reduo de nitrato, que foram adaptados para serem
utilizados no sistema VITEK.
6.8. Testes de sensibilidade aos antifngicos

Entre os testes preconizados para detectar resistncia a antifgicos, ape-
nas alguns deles foram at agora suficientemante avaliados em estudos amplos e
bem conduzidos, a fim de comprovar boa reprodutibilidade intra e inter-
laboratorial, alm de correlao com a evoluo clinica dos pacientes. Os mais
conhecidos e difundidos so os do National Commitee for Clinical Laboratory
Standards (NCCLS), denominado, desde 2005, Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI), publicado a partir de 1985, sob a forma de
Micologia | 489
documento. No Brasil, a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA)

adquiriu os direitos autorais para a lngua portuguesa dos documentos CLSI/
NCCLSI M27- A3 e M38-A e tornou-os disponveis atravs do site: http:/
www.anvisa.gov.br
M27-A3. Mtodo de Referncia para Testes de Diluio em Cal-

do para a Determinao da Sensibilidade de Leveduras; Terapia
Antifngica Norma Aprovada - Terceira edio do NCCLS:D e s -
creve a metodologia de um teste de sensibilidade aos agentes
antimicrobianos das leveduras que causam infeces fngicas invasivas,
incluindo as espcies de Candida e Cryptococcus neoformans. O
M27-A3 o mtodo mais bem estudado e o documento pertinen-
te contm tcnicas de diluio em meio liquido, macrodiluio em
tubos de ensaios e microdiluio em placas de micro titulao, para
determinar a CIM. As leveduras so testadas ante as drogas
(anfotericina B, 5-fluorocitosina e azlicos, incluindo cetoconazol,
fluconazol, itraconazol, voriconazol, alm de posaconazol e
ravuconazol). O meio usado o RPMI-1640 lquido, inculo inici-
al de 1 a 5 x 106 cel/mL, ajustando em espectrofotmetro a 530
nm, incubao a 35 C. Utilizam-se cepas-controle ATCC em to-
dos os testes realizados.
M38-A. Mtodo de Referncia para Testes de Diluio em Caldo

para Determinao da Sensibilidade Terapia Antifngica de Fungos
Filamentosos; Norma Aprovada do NCCLS.
Descreve um mtodo para testar a sensibilidade dos fungos filamentosos

que causam infeces invasivas, incluindo espcies de Aspergillus,
espcies de Fusarium, Rhizopus arrhizus, Pseudallescheria boydii
(Scedosporium apiospermum) e Sporothrix schenckii, assim como
outros fungos patognicos oportunistas, aos agentes antifngicos. O
meio de cultura recomendado mesmo indicado no documento

M27-A2 e o inculo deve ser ajustado, com auxilio de
espectrofotmetro, para conter 0,4 x 104 a 5 x 104 UFC/mL.
Entretanto, a densidade ptica (DO) a 530 nm, requerida no en-
saio, depende do tamanho do condio ou esporangiosporos do
fungo em estudo. H necessidade de adio de Tween 20, como
agente surfactante, para preparar inculo de Aspergillus spp.
M44-A. esse mtodo descreve uma prova sensvel e prtica,

validada para teste de sensibilidade em Candida spp.; utilizando
discos impregnados com fluconazol ou com voriconazol. Este mto-
do ainda no foi validado para provas com outros gneros de leve-
duras e recentemente foi proposto um novo mtodo para uso com
fungos filamentosos. O documento inclui critrio de interpretao
para os dimetros de halos obtidos com discos de fluconazol e
valores esperados para cepas padro.
EUCAST. ensaio recomendado para avaliao da atividade antifngica

de substncias puras pela tcnica da microdiluio em caldo, pela
organizao europia Antifungal Susceptibility Testing Subcommit-tee
of the European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing (AFST-
EUCAST), baseado nos procedimentos da referncia CLSI M27-
A2, mas com algumas modificaes, a fim de se obter maior exatido
na determinao dos valores de CIM. Estudos tm confirmado que a
modificao do documento CLSI M27-A2, com a suplementao do
meio RPMI 1640 e com 2% de glicose no meio de cultura, tornou a
metodologia mais vantajosa. Isso se deu devido a reduo do tempo
de incubao necessrio (24 horas) para se obter um crescimento
suficiente para a determinao dos valores de CIM.
Micologia | 491
Sistemas comerciais: Existem vrios sistemas comerciais para realizar

testes de sensibilidade aos antifgicos, incluindo, entre outros, Asty,
Atb Fungus 3, Candifast, E-Test, Fungitest, Integral Systems Yest,
Mycototal E Sensitrite Yeast One. Apenas o E-Test, o Atb Fungus
3 e o Candifast tm distribuidores no Brasil.
Resumo do captulo
Os fungos so organismos que convivem conosco todos os dias. So
importantes, tanto do ponto de vista ecolgico, quanto econmico. A Micologia
a rea da Biologia destinada ao estudo dos fungos, que teve o seu grupo
reconhecido como um reino a partir da descrio de cinco reinos por Whittaker,
em 1969. Os organismos foram alocados em reinos com base na morfologia e
no modo de nutrio dos seres vivos, sendo criado, ento, o reino Fungi.
Todos os fungos conhecidos, com poucas excees, tm origem dos esporos
(reproduo sexuada) ou condios (reproduo assexuada), corpsculos que
podem ser comparados s sementes das plantas superiores, embora no sejam
morfologicamente semelhantes a estas. Na maioria dos casos, o sistema vegetativo
encontra-se no interior dos tecidos parasitados, no solo ou na matria orgnica
em decomposio. Com a formao dos esporos ou condios, necessrio
que estes tenham acesso livre ao ar, para assegurar sua disseminao. O ciclo
de vida dos fungos compreende duas fases. Uma somtica, caracterizada por
atividades alimentares, e outra reprodutiva, onde os fungos podem realizar
reproduo sexuada ou assexuada. Por causa da rigidez da parede celular, sua
nutrio por absoro de nutrientes solveis simples. Os fungos so consi-
derados seres cosmopolitas, pois esto presentes em qualquer parte do
planeta. A temperatura ideal para o crescimento dos fungos fica entre 0 a
350C, mas o timo para a maioria fica entre 20 a 300C, e a umidade ideal
fica em torno da saturao.
Os fungos so usados como alimento propriamente dito; na indstria
alimentcia, na produo de pes, queijos, cervejas e vinhos; na indstria
farmacutica e biotecnolgica, para a fabricao de antibiticos, cidos, pig-
mentos, enzimas, pesticidas biolgicos, entre outros usos.
Os fungos podem parasitar o homem e outros animais, causando

um grupo de doenas conhecidas como micoses.
Micologia | 493
As micoses podem ser classificadas em cinco grupos, de acordo

com suas manifestaes clnicas.
As micoses superficiais so infeces causadas por fungos que

invadem as camadas mais superficiais da capa crnea da pele ou a
haste livre dos pelos.
As micoses cutneas se caracterizam por serem causadas por fungos

que invadem toda a espessura da capa crnea da pele, a parte
queratinizada intrafolicular dos pelos ou a lmina ungueal.
As micoses subcutneas se caracterizam por resultar da inoculao

de um fungo patognico por ocasio de um traumatismo, em geral
cortes por plantas ou pela manipulao do solo, manifestando-se
como tumefao ou leso supurada da pele ou do tecido subcut-
neo, produto da disseminao do fungo por contiguidade ou por via
linftica.
As micoses sistmicas so caracterizadas por serem adquiridas atra-

vs de inalao de propgulos fngicos, causando, consequentemente
a leso primria pulmonar. Desta forma, o fungo pode se disseminar
pelo corpo atravs da corrente sangunea, originando leses
extrapulmonares nos pacientes.
As micoses oportunsticas so causadas por fungos termotolerantes

de baixa virulncia que determinam doenas em hospedeiros com
graves deficincias do sistema imunolgico.
O diagnstico das micoses realizado atravs da visualizao do

fungo nos espcimes clnicos (exame microscpico direto) e do seu
cultivo em meios adequados. Provas imunolgicas podem auxiliar no
diagnstico, fornecendo resultado presuntivo das infecces.
Questes
1) Cite as tcnicas mais importantes para o isolamento de fungos de solo e de ar.
2) Em que situaes podemos usar a tcnica de diluio seriada?
3) Paciente portador do HIV fazendo uso de corticosteroides e que teve
tuberculose pulmonar h trs anos apresenta imagens radiolgicas de trax
sugestivas de bola fngica. Foi colhida uma amostra de escarro, a qual foi
processada adequadamente. O exame microscpico direto apresentou hifas
septadas e hialinas, ramificadas dicotomicamente. No cultivo, houve cresci-
mento de uma colnia esverdeada, a qual, quando corada pelo lactofenol azul
de algodo, apresentou conidiforo com vescula alongada e filides distribu-
das a partir da metade da vescula, dando origem a longas cadeias de condios
globosos e equinulados. Com base nisso, responda:
a) Explique como deve ser realizado o processamento do espcime

clnico em questo, antes que sejam realizados o exame direto e o
cultivo do material.
b) Qual o agente etiolgico desta micose?
c) Que testes imunolgicos poderiam ser aplicados doena que o

paciente possui?
d) Uma pessoa saudvel, sem uso de medicamentos, poderia adqui-

rir esta infeco? Comente.
Micologia | 495
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Conceitos e Mtodos para a Formao de Tcni-

FUNDAO OSWALDO CRUZ

ESCOLA POLITCNICA DE SADE JOAQUIM VENNCIO

Vice-diretor de Pesquisa e Desenvolvimento Tecnolgico

Vice-diretora de Ensino e Informao

Vice-diretor de Gesto e Desenvolvimento Institucional

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Vice-diretora de Pesquisa, Desenvolvimento Tecnolgico e Inovao

Vice-diretora de Ensino, Informao e Comunicao

Vice-diretora de Servios de Referncia e Colees Cientficas

Vice-diretor de Desenvolvimento Institucional e Gesto

Conceitos e Mtodos para a Formao de Tcnicos

Copyright 2010 dos autores

Projeto Grfico e Editorao

290 p. : il. , tab. , graf.

1. Tcnicas e Procedimentos de Laboratrio.2. Pessoal de Laboratrio.

Aurea Maria Lage de Moraes

Flvia Coelho Ribeiro

Jos Carlos Couto Fernandez

Joseli Maria da Rocha Nogueira

Leila Abboud Dias Carneiro

Lucieny de Faria Souza Miguel

Maria Beatriz Siqueira Campos de Oliveira

Paulo R oberto Soares Stephens

R odrigo de Almeida P aes

Valmir Laurentino Silva

Vernica Leite de Holanda

O Chico Trombone costumava me dizer:

crolgio de cientista famoso. Cito textual: Joaquim Venncio conseguiu,

Tcnicos em Laboratrios de Sade, reunindo professores de vrias uni-

A coletnea de livros intitulada Conceitos e Mtodos para a Formao

so do melhor nvel intelectual e cientfico, com a titulao de mestres, douto-

Um sonho quase realizado

As alteraes pelas quais passa o mundo com a globalizao trazem

sou a divulgar conhecimentos, elaborando cursos, metodologias e tecnologias

O pontap inicial deste sonho s foi possvel pelo incondicional apoio

pode ser criada artificialmente, atravs das vacinas. Na ausncia de um sistema

2. rgos, tecidos e clulas

2.1. Clulas que participam do sistema imunitrio

interessam para o entendimento das aes do sistema imunitrio, de modo

Os eosinfilos parecem ser importantes, principalmente na resposta

Figura 1. Clulas que participam do sistema inunitrio

O progenitor linfoide comum d origem aos linfcitos. Os linfcitos so

adaptadas para detectar antgenos derivados de protenas estranhas ou

Figura 2. Estruturas bsicas do receptor de superfcie da clula B e do receptor T.

A maioria dos linfcitos virgens possui uma sobrevida muito curta,

Algumas das clulas-filhas retomam ao estado de repouso, tornando-se clu-

2.2. Os rgos linfoides e a rede linftica

celular, os dois tipos de linfcitos entram na corrente sangunea, migrando

vasos linfticos aferentes drenam o fluido dos tecidos e carregam antgenos

Figura 3. rgos, tecidos e clulas envolvidos na resposta imunitria.

2.3.Tecido linfoide associado mucosa

Tecidos linfoides associados ao intestino (GALT = gut-associated

2.4. Recirculao de linfcitos

Quando ocorre uma infeco tecidual, os antgenos so capturados por

T:: desenvolvimento, diversidade e ativao

clulas T CD4 ou CD8 ocorre na medula tmica, e as clulas T maduras so

3.1. Receptores de antgenos e molculas

associados s molculas MHC e no so restritas ao MHC. Alguns clones

3.2. Correceptores CD4 e CD8: Receptores envolvidos na

ce de forma especfica o complexo peptdeo-MHC na APC. Cerca de 65%

4. Natureza dos antgenos