Deteco e Identificao

dos Fungos de
Importncia Mdica

Mdulo VII
NDICE

1. Introduo ......................................................................................................................1
Fungos e infeco hospitalar ................................................................................................. 1
2. Coleta e transporte de amostras ....................................................................................4
Procedimentos para coleta de amostras.................................................................................. 4
3. Processamento de amostras ..........................................................................................6
Exame microscpico de amostras .......................................................................................... 6
Cultura de amostras biolgicas para isolamento de fungos ........................................................ 8
4. Identificao de fungos.................................................................................................12
Identificao de leveduras .................................................................................................. 12
Identificao de fungos filamentosos.................................................................................... 16
Identificao de fungos dimrficos ....................................................................................... 18
5. Descrio das principais micoses ..................................................................................20
6. Referncias bibliogrficas .............................................................................................24
GLOSSRIO

Artrsporo ou artrocondio = esporo formado pela desarticulao da hifa de fungos filamentosos ou

leveduras.
Blastosporo ou blastocondio = esporos formados por brotamento ou gemulao.
Bolor = fungo filamentoso, multicelular, constitudo de hifas.
Brotamento ou gemulao = reproduo com diviso de citoplasma atravs de estrangulamento.
Cenoctica = hifa desprovida de septos, o mesmo que hifa contnua.
Clamidsporo = estruturas de resistncia, constitudas de reserva nutritiva e membrana bastante
espessa, permitindo resistir aos fatores externos, semelhante aos esporos.
Condio = esporo assexuado externo.
Dimrfico = que apresenta duas formas: leveduriforme e filamentosa.
Esporngio = rgo de reproduo assexuada interna, geralmente em forma de vescula e contm
inmeros esporos denominados de esporangiosporos.
Hialino = que no tem cor, translcido, assumindo a cor do corante utilizado.
Hifa = reunio de clulas justapostas, formando estrutura tubular, filamentosa, que compe o corpo
vegetativo dos bolores e de alguns gneros de leveduras (por ex, Candida spp.).
Demcio ou demaciceo = fungos negros que tm pigmento melanide (acastanhado), na parede
celular.
Levedura = fungo em regra, unicelular que se reproduz geralmente por brotamento.
Tuberculado = com granulaes ou nodosidades.
1. INTRODUO

FUNGOS E INFECO HOSPITALAR

Fungos so seres dispersos no meio ambiente, em vegetais, ar atmosfrico, solo e gua e, embora
sejam estimados em 250 mil espcies, menos de 150 foram descritos como patgenos aos seres
humanos. Leveduras so fungos capazes de colonizar o homem e animais e, frente perda do
equilbrio parasita-hospedeiro, podem causar diversos quadros infecciosos com formas clnicas
localizadas ou disseminadas. De modo contrrio, fungos filamentosos, ou bolores, normalmente, no
fazem parte da microbiota animal e portanto o homem no um reservatrio importante para esse
grupo de fungos. As portas de entrada no hospedeiro so as vias areas superiores ou quebra na
barreira epidrmica aps traumatismos com objetos perfuro-cortantes.

Dentre as centenas de espcies descritas, leveduras do gnero Candida so os maiores agentes de

infeco hospitalar e representam um desafio para a sobrevida de pacientes com doenas graves e
aqueles em perodo ps-operatrio. Hospitais norte-americanos com sistema de vigilncia operante,
notificaram Candida como 6o patgeno nosocomial e a 4a causa mais comum de infeces de corrente
sangunea, adquiridas em hospitais.

A manifestao clnica mais comum nas candidases hospitalares febre. Candidemia pode ser
definida como a ocorrncia de 2, ou mais,culturas positivas para a mesma espcie de Candida,
provenientes de amostras diferentes, coletadas aps 72 h da admisso. Infeco invasiva por Candida
pode ser tambm considerada quando h isolamento de Candida a partir de stio normalmente, estril
associado a pelo menos, um outro sinal de infeco. A sensibilidade de hemocultura para Candida
baixa; aproximadamente, 50% dos pacientes com infeco invasiva por Candida podem ter culturas
negativas. Alm disso, se houver infeco bacteriana concomitante, pode diminuir a chance do
isolamento de Candida.

Os fatores reconhecidos de risco para infeco invasiva por Candida so:

Permanncia > 4 dias em UTI

Antibioticoterapia de largo espectro
Cirurgia abdominal
Cateterizao venosa central
Nutrio parenteral total
Imunodepresso
ndice APACHE II > 10
Ventilao mecnica > 48h
Neutropenia
Quimioterapia citotxica

Frente a estas condies recomenda-se monitorao com exames micolgicos sangue de amostras
biolgicas dos pacientes, tais como, sangue, escarro, pontas de catteres intravasculares, lquido
peritoneal e urina. Culturas positivas para leveduras podem significar apenas colonizao mas, podem
conduzir doena invasiva subsequente. Estudo prospectivo, em pacientes cirrgicos de UTI, mostrou
que 38% de 29 pacientes desenvolveram infeco aps colonizao. A colonizao pode ser
demonstrada por anlise de 3 ou mais amostras, coletadas do mesmo local ou de stios diferentes, do
mesmo paciente, em dias consecutivos.

Diferentes espcies de Candida podem causar quadros de fungemia, a saber: Candida glabrata
(Torulopsis glabrata), Candida tropicalis; Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida guilliemondii,
Candida lusitaniae, Candida lipolytica, Candida kefyr, Candida inconspicua, Candida norvergensis e
Candida catenulata. Um grupo europeu realizou na dcada de 90 um estudo multicntrico e, por
anlise univariada, concluiram ser C. glabrata, a espcie associada maior taxa de mortalidade e que
bito estava relacionado com maior idade e severidade da doena de base do paciente.

Mod VII - 1
O gnero Candida , sem dvida o mais importante mas, existem outras leveduras no ambiente
hospitalar, tanto em vegetais, ar atmosfrico e gua, quanto na pele e no trato gastrointestinal dos
pacientes e funcionrios, que podem causar quadros infecciosos. Os principais gneros so Pichia sp
(Hansenula sp), Rhodotorula sp e Trichosporon sp.

Fungos filamentosos presentes no meio ambiente hospitalar, tambm podem causar infeco em
pacientes suscetveis. O gnero Aspergillus sp (Aspergillus terreus, A. fumigatus, A. flavus e A. niger)
o mais citado na literatura como fungo oportunista, especialmente em pacientes transplantados de
medula ssea e neutropnicos. A inalao de esporos a via mais comum de transmisso e os surtos
de aspergilose so associados a reformas e construes, dentro e ao redor de hospitais. Doena
pulmonar e, mais raramente, sinusite, so as manifestaes de aspergilose. Outros gneros, tais
como Fusarium sp, Acremonium sp e Penicillium sp so capazes de causar formas localizadas ou
disseminadas de infeco hospitalar. Estes gneros que so dispersos pelo ar atmosfrico, pertencem
ao grupo dos hialohifomicetos, pois tm hifas hialinas e septadas. Outros grupos de fungos
filamentosos, como zigomicetos (Rhizopus sp, Mucor sp), caracterizados por hifas no-septadas
(cenocticas) e alguns feo-hifomicetos (fungos negros ou demcios) que tm hifas amarronzadas,
podem tambm ser agentes de infeco hospitalar.

GENERALIDADES SOBRE FUNGOS

Os fungos de interesse mdico, agentes de micoses, so de dois tipos morfolgicos: leveduras, que
so unicelulares e bolores ou fungos filamentosos, que so multicelulares (Fig.1). Existe um subgrupo
dentro dos filamentosos, chamados fungos dimrficos, que se apresentam sob ambas as formas,
dependendo principalmente da temperatura, mas sob influncia tambm do teor de CO2 e condies
nutricionais.

As leveduras tm como estrutura primria, clulas que se reproduzem por brotamento, nico ou
mltiplo, em geral, de forma arredondada. Estas clulas so esporos de origem assexual e se
denominam blastocondios. Alguns gneros de leveduras menos importantes em micologia mdica,
reproduzem-se por fisso.

Os fungos filamentosos possuem como elemento constituinte bsico a hifa, que pode ser septada ou
no septada (cenoctica). A partir da hifa formam-se esporos, para propagao das espcies. Na
grande maioria dos fungos, os esporos podem ser chamados de condios, pois nascem diretamente
delas ou sobre estruturas ligas a elas.

Esses conceitos fundamentais representam a base para a identificao de um fungo, pois a

classificao de filamentosos feita, em regra, pelas caractersticas morfolgicas, tanto macroscpicas
(cor, aspecto, textura da colnia, etc.), quanto microscpicas (forma e cor da hifa, presena ou no de
septos, tipo e arranjo de esporos, etc.), alm da velocidade de crescimento (lenta, moderada ou
rpida). A identificao de leveduras, ao contrrio, feita, principalmente, por caractersticas
fisiolgicas, desde que, a morfologia destes fungos no muito variada e no permite distino entre
espcies e, em regra, entre gneros.

Com o advento da terapia com antibiticos de largo espectro e o tratamento de pacientes com
doenas metablicas crnicas, neoplsicos e transplantados, em uso de agentes citotxicos e
imunossupressores, alm da AIDS, a diferena entre fungos contaminantes e patognicos
(classicamente os agentes de micoses superficiais, subcutneas e profundas), tornou-se pouco clara.
Agentes como Aspergillus, Candida, Cryptococcus e espcies de zigomicetos, considerados
antigamente, como contaminantes de laboratrio e, portanto, de pouca importncia clnica, so agora
conhecidos como causadores de enfermidades disseminadas, endocardites, infeces pulmonares,
ceratites entre outras, em pacientes imunodeprimidos. Portanto, estes fungos devem ser
considerados, alm dos patgenos clssicos, como por ex., Paracoccidiodes brasiliensis e Histoplasma
capsulatum, como possveis agentes de quadros infecciosos.

Neste mdulo, ser apresentada uma viso geral das principais infeces fngicas, de modo que, os
microbiologistas possam adquirir certa habilidade para identificar fungos isolados de amostras
biolgicas. Para um estudo mais completo sobre diagnstico de infeces fngicas, recomenda-se as
referncias citadas ao final do captulo.

Mod VII - 2
Estruturas microscpicas bsicas de fungos: a, b, c - filamentosos, d - leveduras

a Filamentosos

b Filamentosos

c Filamentosos

d Leveduras

Mod VII - 3
2. COLETA E TRANSPORTE DE AMOSTRAS

O tipo e a qualidade da amostra biolgica, submetida ao laboratrio de micologia, so fatores

importantes no sucesso do isolamento e identificao do verdadeiro agente etiolgico de infeces
fngicas.

A amostra deve ser submetida ao exame microscpico direto e cultura em meios para isolamento e
identificao acurada do agente etiolgico. Por isso, a assepsia na coleta e o volume da amostra so
fatores bsicos para o sucesso do diagnstico da infeco.

RECOMENDAES GERAIS DE COLETA E TRANSPORTE DE AMOSTRAS

Coletar a amostra biolgica com assepsia e coloc-la em recipiente estril e vedado, sempre em
quantidade suficiente (>2 ml ou 0,5 cm3) para permitir todos os procedimentos laboratoriais
necessrios.
Os swabs usados para coleta de material de ouvido, nasofaringe e orofaringe, secreo vaginal e
leses abertas, devem ser colocados em tubos contendo salina estril para o transporte, de modo
a evitar a dessecao da amostra.
Sempre que possvel, coletar amostras antes do incio da terapia especfica e, particularmente,
para leses cutneas de pele e unhas, orientar o paciente para evitar uso de medicao tpica por
4 a 5 dias antes da coleta de escamas.
A amostra deve ser identificada com nome do paciente , nmero de registro hospitalar (quando
for o caso), tipo de amostra e data da coleta.
A requisio mdica que acompanha a amostra, deve conter, sempre que possvel, as hipteses
diagnsticas que auxiliaro o micologista na escolha da colorao e do meio de cultura mais
adequado para o isolamento do agente etiolgico.
Em pacientes imunodeprimidos ou muito debilitados o estudo de um mesmo tipo de amostra
biolgica, coletada em 2 ou 3 dias consecutivos, importante para a interpretao correta de
resultados positivos para fungos considerados como saprfitas, ou seja, contaminantes do meio
ambiente, ou mesmo, constituinte da microbiota normal do paciente. Nestes pacientes, os fungos
saprfitas podem se tornar oportunistas e comportarem-se como patgenos.
Os materiais ditos contaminados, tais como urina, fezes, ps, secrees de feridas ou trato
respiratrio, devem ser enviados, sob gelo, ao laboratrio, o mais rpido possvel (<2 h).
Liquor e lquidos cavitrios devem ser mantidos temperatura ambiente e encaminhados com
urgncia ao laboratrio para processamento imediato.
Sangue e material de puno de medula ssea so os nicos materiais biolgicos que devem ser
semeados diretamente, em frascos contendo meio de cultura lquido ou bifsico (lquido sobre
slido), de modo a evitar coagulao e consequente diminuio da sensibilidade do exame.

PROCEDIMENTOS PARA COLETA DE AMOSTRAS

Recolher, de preferncia, a primeira expectorao da manh, aps gargarejo

Escarro
com gua limpa ou fervida, em frasco de boca larga, esterilizado. No deve
conter saliva.

Aspirar cerca de 5 a 10 ml de suco gstrico, atravs de sonda nasogstrica,

Aspirado gstrico
pela manh, em jejum.
Aspirado traqueal
Procedimento realizado por mdico treinado. O material colhido deve ser
e secreo obtida
colocado em recipiente estril.
por broncoscopia

Fazer assepsia rigorosa no local da puno e coletar cerca de 5 a 6 ml de

Sangue e aspirado
sangue venoso, que dever ser injetado diretamente, em frasco contendo meio
de medula ssea
de cultura (ver detalhes no prximo tem). A ltima gota de material deve ser
distendida em uma lmina de microscopia, para colorao de Giemsa.

Mod VII - 4
 Fazer assepsia rigorosa no local da puno. Coletar 2 ml ou mais, para exame
microscpico e cultura para fungos. Os tubos na rotina hospitalar, devem ser
usados na seguinte sequncia: 1 exame bioqumico, 2 exame de
Lquor
celularidade, 3 microbiolgico, reduzindo assim a possibilidade de isolamento
de contaminantes da pele. Entretanto, a coleta da amostra em tubos
especficos para cada um desses exames, aumenta a sensibilidade do exame
micolgico e, por isso, deve ser recomendada.
Tecido obtido por
Colher assepticamente, utilizando instrumentos estreis e colocar o material
bipsia, necrpsia
em recipiente estril, com salina. No adicionar nenhum liquido fixador.
e peas
operatrias
A amostra biolgica mais apropriada para o diagnstico de micose do trato
urinrio obtida por sondagem ou citoscopia. Quando no for possvel, e para
evitar contaminao com microrganismos presentes nas reas vizinhas, fazer
Urina
limpeza prvia da regio perineal com gua e sabo, desprezar o primeiro jato
de urina da manh, e colher 3 a 5 ml de urina em tubo de ensaio estril.
Colees de 24 horas, no tm valor para diagnstico micolgico.

Fazer lavagem prvia da regio anal com gua e sabo, coletar pores de
Fezes
fezes em recipiente estril com tampa ou swab anal, mergulhar o swab em
salina estril e enviar o tubo ao laboratrio.
Secreo ou pele
Colher material por curetagem da leso ou com swab estril. Mergulhar o
de conduto
swab umedecido em salina estril e enviar o tubo ao laboratrio.
auditivo externo

O melhor mtodo para recuperao de fungos, requer raspado de crnea,

Material de micose
aspirao de lquido intra-ocular ou bipsia. A coleta com auxlio de swab no
ocular
indicada em local de drenagem.
Leso de nariz
Coletar secreo, material necrtico ou tecido obtido por bipsia em recipiente
e
estril.
seios paranasais

Coletar com swab estril o material de leso de mucosa jugal, papilas linguais
Mucosa oral e
ou regio tonsilar. Mergulhar o swab umedecido em salina estril e enviar o
orofaringe
tubo ao laboratrio.

Com auxlio de espculo, coletar material da leso ou do fundo de saco vaginal

Secreo vaginal
com swab estril. Mergulhar o swab umedecido em salina estril e enviar o
tubo ao laboratrio.
Liqudos corporais
Fazer assepsia rigorosa no local da puno. Coletar cerca de 5 a 10mL de
(pleural, asctico,
lquido em tubo de ensaio estril.
pericrdico, sinovial)

Devem ser colhidos de preferncia, por aspirao de abscessos fechados, com

seringa e agulha estril. Se a leso for aberta, limpar o local, com gaze
Pus e material de
esterilizada embebida em salina estril, para eliminar os exsudatos superfciais
abscesso
que so altamente, contaminados com bactrias. A seguir, colher o material
com swab. Mergulhar o swab umedecido em salina estril e enviar o tubo
ao laboratrio.

Se possvel, descontaminar a pele com lcool 70% antes da coleta. Raspar com
lmina de bisturi as escamas cutneas da borda das leses . Pode-se utilizar
tambm, uma lmina de microscopia. Colocar o material entre duas lminas
Pele e pelos
limpas, de preferncia esterilizadas, vedando-se as bordas das lminas com fita
adesiva para evitar perda do material. Os pelos tonsurados, devem ser
retirados com pina estril e acondicionados entre lminas ou em potes, de
preferncia esterilizados.

Fazer limpeza prvia das unhas, escovando com gua e sabo. Cortar com
Unhas
tesoura e desprezar a parte descolada da unha e, com lmina de bisturi, raspar
as reas mais profundas e pulverulentas. Colocar este material entre lminas e
ved-las com fita adesiva.

Mod VII - 5
3. PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS

O sucesso na visualizao e isolamento do agente etiolgico depende, alm da coleta e transporte

adequados e volume suficiente da amostra, de seu processamento correto antes do exame micolgico.
As seguintes recomendaes devem ser cuidadosamente, seguidas para boa resoluo diagnstica:

Pelos, cabelos, escamas de unha e pele devem ser aliquotadas para exame microscpico e
cultura pois, para exame so clarificadas com soluo aquosa de KOH a 20% e, para cultura, no
podem sofrer nenhum tratamento prvio, sendo por isso, inoculadas diretamente na superfcie do
meio de cultura.
Lquor, secrees e fludos corporais (lquido pleural, asctico, sinovial, pericrdico, aspirado
transtraqueal, lavado gstrico e broncoalveolar [BAL]) devem ser concentrados por centrifugao
(1500 a 2000 rpm por 10 minutos). Os materiais coletados com swabs devem ser eluidos em
soluo salina e tambm devem ser centrifugados. O sedimento obtido o material adequado
para o exame microscpico e semeadura em meios de cultura.
Para urina, recomendvel que uma alquota (ala calibrada) seja semeada, por esgotamento,
sobre o meio de cultura distribudo em placa de Petri, para exame quantitativo, pela contagem de
unidades formadoras de colnias (UFC). A outra alquota deve ser centrifugada (1500 a 2000 rpm
por 10 minutos) e o sedimento ser utilizado para exame microscpico e nova semeadura em tubo
(cultura qualitativa).
Escarro pode ser digerido com enzima (v/v) N-acetil-L-cisteina (250 mg de enzima dissolvidas
em 1 L de soluo-tampo citrato ou soluo fisiolgica), que fluidifica e facilita a manipulao da
amostra e formao de sedimento aps centrifugao. Porm, no foi comprovado que esse
tratamento melhore a recuperao de fungos da amostra sendo, portanto, opcional. Pode-se
utilizar, como alternativa, para digesto da amostra, soluo de KOH 20%. A poro purulenta da
amostra prefervel e pores liqefeitas no so adequadas para isolamento do agente. A poro
da amostra tratada com KOH, porm, s pode ser usada para exame microscpico, pois a potassa
destri, aps algumas horas, as estruturas do fungo, inviabilizando seu isolamento em meio de
cultura. Neste caso, outra poro da amostra deve ser centrifugada e o sedimento usado para
cultura.
Tecidos obtidos por bipsia requerem fragmentao, com o auxlio de um bisturi estril ou
macerao (gnglio) com pistilo em almofariz; pode ser feito dentro de uma placa de Petri estril.
Esse procedimento visa aumentar a rea de superfcie e expor o microrganismo ligado ao tecido,
ao maior contato com o meio de cultura.
Sangue e aspirado de medula ssea no necessitam preparao, sendo que o exame
microscpico tem baixa sensibilidade e, portanto a cultura importante para identificao do
agente. Para cultura, as amostras so semeadas imediatamente, aps a coleta, em frascos
contendo meio de cultura. O meio pode ser bifsico (15 ml de gar inclinado sob 50 ml de caldo)
composto de infuso de crebro-corao (meio BHI) ou Sabouraud. Meios contendo saponina para
lise e posterior centrifugao da amostra so indicados. Na prtica, frascos para hemocultura
bacteriolgica (simples ou automatizada), proporcionam isolamento adequado de fungos, desde
que respeitado os perodos necessrios ao seu desenvolvimento. Para fungos dimrficos, de
crescimento lento (>15 d), muitos autores consideram o mtodo de lise-centrifugao o mais
sensvel. O sangue e medula ssea no devem ser coletados em seringas contendo EDTA, pois
esta substncia se combina com elementos da parede dos fungos, diminuindo a sensibilidade do
exame. Um dos procedimentos recomendados para a inoculao de 5 a 6 ml da amostra no
frasco com meio bifsico sendo, uma parte para 10 partes do meio liqudo, que deve ser ento,
incubado temperatura de 30C.

EXAME MICROSCPICO DE AMOSTRAS

A observao de um fungo na amostra biolgica tem grande valor diagnstico pois demonstra a
invaso do fungo no tecido e permite uma informao imediata ao mdico, a qual pode ser crucial
para determinar a terapia apropriada ao paciente. No entanto, se a quantidade da amostra biolgica
for insuficiente para o exame microscpico e cultura do material, a cultura, na maioria das amostras,
tem prioridade sobre o exame microscpico, desde que mtodo mais especfico e em muitos casos,
mais sensvel. O exame microscpico da amostra realizado por vrias tcnicas, dependendo do tipo
da amostra e suspeita clnica.

Mod VII - 6
EXAME MICROSCPICO DIRETO COM HIDRXIDO DE POTSSIO (KOH) A 20%

usado para exame de pelos, pele, unha, tecido obtido por bipsia, exsudatos espessos e outros
materiais densos. Colocar uma gota de KOH (aquoso a 20%) em uma lmina de microscopia e sobre
esta, uma poro da amostra a ser examinada. Cobrir a preparao com uma lamnula e, para
intensificar a clarificao, aquecer ligeiramente, sobre a chama de um bico de Bunsen, sem deixar
ferver a mistura. Examinar a preparao aps 20 minutos, em microscpio ptico comum,
inicialmente, com objetiva de 10x, seguida de 40x.

EXAME MICROSCPICO DIRETO COM TINTA NANQUIM (TINTA DA CHINA)

Utilizada em amostras de lquor, urina, secrees ou exsudatos, para visualizao de leveduras

capsuladas do gnero Cryptococcus, que se tornam mais evidentes contra o fundo negro
proporcionado pela tinta.

Colocar uma gota de tinta nanquim e uma gota do sedimento da amostra centrifugada, sobre uma
lmina. Cobrir a preparao com lamnula e observar ao microscpio ptico (objetivas de 10x e 40 x).
Nesta tcnica, um erro bastante frequente confundir linfcitos com clulas de leveduras. A
diferenciao feita pela refringncia da parede celular e das incluses no citoplasma das leveduras,
alm da presena de brotamentos.

Cryptococcus sp: leveduras em brotamento rodeadas de halo transparente (cpsula

polissacardica), sobre fundo negro formado pela tinta nanquim

Clulas em
Cpsula brotamento
Polissacardica

Incluses
citoplasmticas Tinta da China

EXAME MICROSCPICO COM COLORAO PELO MTODO DE GRAM

Todos os fungos so Gram- positivos, assim a utilizao da colorao no visa a diferenciao dos
microrganismos, mas possibilita discriminar elementos fngicos de artefatos existentes em urina,
secrees e fezes. A amostra espalhada de modo homogneo, em movimentos circulares, em uma
lmina de microscopia, fixada com calor e submetida colorao.

EXAME MICROSCPICO COM COLORAO PANTICA (GIEMSA, LEISHMAN OU WRIGHT)

Estas coloraes so usadas para pesquisa de Histoplasma capsulatum em diversas amostras

biolgicas: medula ssea, sangue, aspirados e secreo cutnea. Nestes casos, faz-se um esfregao
semelhante ao usado para colorao de Gram. Fixa-se com metanol e cora-se segundo o mtodo
escolhido. Podem ser usadas ainda, para corar imprints de tecidos obtidos por bipsia.

Abaixo esto esquematizados os principais aspectos morfolgicos observados ao exame microscpico

e os possveis agentes etiolgicos de acordo com a amostra biolgica.

Mod VII - 7
Interpretao de aspectos morfolgicos encontrados em exames microscpicos de
amostras biolgicas

Amostra biolgica Aspecto Morfolgico Interpretao

Pelos a. Hifas hialinas e/ou artrosporos (1) a. Dermatfitos

a. Hifas regulares, septadas, ramificadas, hialinas, a. Dermatfitos

Unhas, artrosporadas (1)
escamas de pele b. Leveduras e pseudohifas b. Candida spp

c. Grupo de leveduras e/ou pequenas hifas c. Malassezia sp

tortuosas, hialinas (1)
Lquor a. Levedura capsulada (2) a. CRYPTOCOCCUS SP
a. Hifas ramificadas, hialinas, septadas (3) a. Fungos filamentosos hialinos (5)
Secrees b. Levedura capsulada (2) b. CRYPTOCOCCUS SP
(trato respiratrio,
c. Levedura e pseudohifa (1,3) c. Candida spp
vaginal, nasal, oral,
naso-faringe) d. Leveduras globosas ou multiformes, de parede d. Paracoccidioides brasiliensis
espessa, incluses citoplasmticas, com
mltiplos brotamentos (1)

a. Hifas irregulares, largas, cenocticas (1,3) a. Zigomicetos

b. Hifas ramificadas, hialinas, septadas (1,3) b. Fungos filamentosos hialinos(5)
c. Hifas septadas de cor castanha ou marrom (1,3) c. Feohifomicetos (fungos demcios)
Tecidos, pus e d. Estruturas ovaladas, com ou sem septos, de cor d. Cromomicetos (agentes de
aspirados castanha (estruturas muriformes) (1) cromomicose)
(subcutneo, e. Levedura e pseudohifa (1,2) e. Candida spp
ganglionar,
cerebral, pulmonar, f. Levedura capsulada (2) f. CRYPTOCOCCUS SP
mucosa ou outro) g. Levedura globosa ou ovide, de parede espessa, g. Paracoccidioides brasiliensis
incluses citoplasmticas, com brotamento
nico ou mltiplos (1)
h. Leveduras pequenas, tipo charuto (achado h. Sporothrix schenckii
muito raro) (3)
i. Leveduras pequenas em macrfagos (4) i. Histoplasma capsulatum

Fludos oculares a. Fragmentos de hifas, hialinas, septadas (1,3) a. Fungos filamentosos hialinos (5)
b. Leveduras e pseudohifas (1,3) b. Candida spp

a. Fragmentos de hifas ramificadas, hialinas, a. Fungos filamentosos (5)

Sangue e septadas (3,4)
medula ssea b. Levedura capsulada (2) b. CRYPTOCOCCUS SP
c. Leveduras em brotamento (3,4) c. Leveduras (6)
d. Leveduras pequenas em macrfagos (4) d. Histoplasma capsulatum

(1) Exame microscpico com KOH

(2) Exame microscpico com tinta nanquim
(3) Exame microscpico com colorao de Gram
(4) Exame microscpico com colorao de Giemsa ou pantica
(5) So fungos saprfitas que podem se tornar oportunistas, por ex. Aspergillus, Fusarium, Acremonium, cuja
identificao s possvel pela cultura.
(6) No sangue, leveduras do genero Candida no formam pseudohifas e a identificao de gnero e espcie
possvel somente, aps isolamento em meio de cultura.

CULTURA DE AMOSTRAS BIOLGICAS PARA ISOLAMENTO DE FUNGOS

A amostra, aps o processamento, poder ser usada para isolamento do agente etiolgico. Para tanto,
dever ser semeada em movimentos de estrias (zig-zag) sobre a superfcie de meios slidos de
cultura, distribudos em alquotas de 12 a 20 ml, dentro de tubos de ensaio tamponados com tampo
hidrfilo.

Mod VII - 8
MEIOS DE CULTURA

Os meios de cultura utilizados para o isolamento primrio de fungos, a partir de amostras biolgicas,
podem ser adquiridos no comrcio, sob a forma desidratada, no precisando ser formulados no
laboratrio. Aps a hidratao, conforme instrues do fabricante, o meio deve ser distribudo, de
preferncia, em tubos e esterilizados por autoclavao.

Para gar, recomenda-se a solidificao com tubo inclinado, deixando espao de 3 cm do final do meio
at o tampo, para evitar contaminao via meio externo. Todos estes meios de cultura so
distribudos e esterilizados, de preferncia em tubos de ensaio pois, desta forma, h maior resistncia
desidratao e contaminao, alm de oferecer menor bio-risco na manipulao da cultura.

O armazenamento dos tubos, contendo meios de cultura, deve ser em saco plstico fechado, dentro
de armrios, temperatura ambiente. Desse modo, se houver uma contaminao durante o tempo de
armazenamento, as colnias de fungos contaminantes sero facilmente observadas, ao contrrio do
que ocorre, quando se armazena sob refrigerao. O controle de esterilidade deve ser feito por 7 dias,
temperatura ambiente, antes do uso de qualquer meio de cultura.

Para isolamento de fungos a partir de qualquer tipo de amostra, devem ser utilizados meios no
seletivos, que permitam crescimento de fungos patognicos e bolores de crescimento rpido (< de
7dias). Estes fungos, apesar de serem contaminantes de meio ambiente, podem ser agentes de
micoses em pacientes suscetveis, ou seja, so potencialmente, oportunistas. O isolamento desses
fungos, em meio de cultura est sendo, cada vez mais, importante para diagnstico laboratorial das
infeces ditas oportunsticas.

O meio bsico em laboratrio de micologia o gar Sabouraud dextrose (ASD), chamado

simplesmente, gar Sabouraud. Em regra, usa-se um antibitico para impedir o crescimento de
bactrias que poderiam prejudicar o isolamento de fungos. O cloranfenicol o mais indicado, pois
resiste autoclavao. Pode ser colocado tanto no ASD como em outros meios de cultura para fungos.

Meios ditos seletivos para fungos patognicos, contm cicloheximida que inibe parcialmente, ou
totalmente, fungos anemfilos. Estes meios so indicados para cultivo de materiais coletados de
leses com suspeita de dermatofitose, para aumentar a sensibilidade no isolamento de dermatfitos.
Mas, deve-se ressaltar que esta substncia poder inibir o isolamento de fungos oportunistas, como
Aspergillus sp, alm de Histoplasma capsulatum na fase leveduriforme e certas leveduras
patognicas dos gneros Candida e Cryptococcus.

Existem meios presuntivos que indicam presena de certos grupos de fungos ou determinados
gneros, como por ex., gar contendo compostos fenlicos para Cryptococcus sp (gar contendo
sementes de niger ou Guizzotia abssinica), ou gar especial para dermatfitos (Dermatophyte Test
Medium). Existem ainda, meios presuntivos, por reao enzimtica e colorimtrica, de espcies de
Candida spp (Candida Medium, ChromAgar, Biggy Agar, etc). So meios mais caros que ASD e alm
disso, sua maior aplicao no isolamento primrio de leveduras, a partir de amostras biolgicas
muito contaminadas, tais como: secreo vaginal, fezes e urina. A identificao, no entanto, feita
somente, aps anlise morfolgica e fisiolgica.

Para isolamento ou subcultivo de dermatfitos recomenda-se o gar batata, encontrado no comrcio,

sob forma desidratada, para aumentar a esporulao e facilitar a identificao do gnero e espcie do
fungo. Para fungos dimrficos, de crescimento lento (> 15 dias), recomenda-se o uso de meios
enriquecidos como o gar infuso de cerebro-corao (BHI) para obteno, em menor tempo, de
culturas melhor desenvolvidas. Pode ser acrescido de 5 a 10% de sangue de carneiro e de antibiticos
(de preferncia, cloranfenicol ou penicilina e estreptomicina).

O meio de cultura pode ser selecionado segundo: tipo de amostra e agente etiolgico, conforme a
suspeita clnica. De acordo com os aspectos observados ao exame microscpico da amostra, pode-se
ainda, redirecionar o procedimento para isolamento do agente. Recomenda-se sempre 2 tubos de
meio para semeadura da amostra biolgica, os quais devero ser incubados temperatura de 30C,
usada atualmente, para todos os tipos de amostras.

GAR SABOURAUD-DEXTROSE (ASD)

Dextrose ........................................................40 g
Peptona .........................................................10 g
gar ..............................................................15 g
gua destilada ..............................................1000 ml

Mod VII - 9
 Dissolver os componentes na gua destilada.
Acertar o ph em 5,6 .
Aquecer at a completa dissoluo.
Distribuir cerca de 10 ml por tubo.
Esterilizar em autoclave a 120C por 15 minutos.

GAR SABOURAUD-DEXTROSE COM CLORANFENICOL

Dissolver 100 mg de cloranfenicol em 10 ml de lcool 95C.

Adicionar em 1 litro de ASD antes da esterilizao.

GAR-SABOURAUD-DEXTROSE COM CLORANFENICOL E CICLOHEXIMIDA

(MEIOS COMERCIAIS MYCOSEL, MICOBIOTIC AGAR OU MEIO SELETIVO PARA FUNGOS)

Diluir separadamente 400 mg de cicloheximida (Actidione) em 10 ml de acetona.

Diluir 50 mg de cloranfenicol em 10 ml de lcool 95C.
Misturar as solues e adicionar em 1 litro de ASD antes da esterilizao.
pH= 7,0

BRAIN HEART INFUSION AGAR COM CLORANFENICOL (BHI)

Dissolver 50 mg de cloranfenicol em 10 ml de lcool 95C.

Adicionar em 1 litro de BHI desidratado antes da esterilizao.

PROCEDIMENTOS PARA CULTURA

Os materiais devidamente, processados devem ser semeados na superfcie dos meios de cultura, com
ala de nquel-cromo ou pipeta Pasteur, com movimentos em estrias em zig-zag, para permitir
separao de eventuais contaminantes da amostra. O material no deve ser colocado em
profundidade no gar, mas apenas aderido superfcie do meio.O ASD o meio mais utilizado, por
ser relativamente barato e permitir o crescimento de todos os fungos, com rarssimas excees.

A temperatura de incubao recomendada, para todas as amostras 30C, devido a possibilidade de

o agente etiolgico ser oportunista, e desse modo, crescer melhor a 30C do que a 37C, no primo
isolamento. Alm disso, pensando em Brasil, em que, as temperaturas so muito altas na regio norte
e nordeste, dificilmente alcanam 25C, a menos que se utiliza estufa BOD (body oxigen demand). A
temperatura de 30C verificada, mais facilmente, durante muitas horas do dia.

Hemoculturas fazem parte da rotina diagnstica para casos de infeco hospitalar e merecem
algumas recomendaes parte, para isolamento de fungos. Os frascos contendo meio bifsico e
sangue ou aspirado de medula ssea, devem ser submetidas agitao manual peridica, para
maior homogeneizao do oxignio na fase lquida do frasco. Exames macroscpicos dirios da
superfcie da fase slida so indicados para verificar aparecimento de colnias de: leveduras dos
gneros Candida sp, Cryptococcus sp e outros (24 h-7 dias), fungos filamentosos e Sporothrix
schenckii (2 a 15 d) e fungos dimrficos, como: Paracoccidioides brasiliensis, Histoplasma
capsulatum (15 a 30d). Qualquer colnia de fungo deve ser repicada em ASD, para posterior
identificao.

O crescimento de fungos, ao contrrio de bactrias, no resulta em turvao imediata do meio

lquido, de modo que, a anlise microscpica de uma gota do meio, abrevia o prazo de resultados
positivos. Recomenda-se a pesquisa microscpica do crescimento de fungos corando por Gram,
duas gotas do meio liquido, periodicamente, em cada um dos perodos acima citados. Alm do
exame microscpico da fase lquida, um procedimento que resulta em maior sensibilidade da
cultura, a realizao de repiques de 1 ml da fase lquida, para tubos contendo ASD ou BHI, em
dias alternados: 2, 10 e 30 dia.

Visto que a maioria dos laboratrios brasileiros no trabalha com o meio bifsico, pode-se inocular
a amostra, na mesma proporo de 10%, em frascos de hemocultura bacteriolgica e fazer a
leitura como anteriormente, descrito. Entretanto, sistemas automatizados para hemoculturas, que
acusam o crescimento de qualquer microrganismo em at 7 dias, no permitem identificar a
presena de fungos de crescimento mais lento. Nesses casos, a incubao por periodo de at 30
dias, com repiques do caldo em ASD. O procedimento para sangue e aspirado de medula ssea,
denominado lise-centrifugao, no muito difundido no Brasil, pelo custo de importao do
sistema. O material biolgico inoculado diretamente no frasco do sistema, que contem

Mod VII - 10
 saponina, que lisa as clulas liberando assim os microrganismos intracelulares. A seguir, deve-se
realizar centrifugao que direcionar os elementos fngicos para o fundo do tubo que j contem
o meio de cultura. O sobrenadante desprezado e, desta forma, a cultura foi realizada, evitando-
se subcultivos, que so necessrios quando se inocula o material em meios bifsicos ou lquidos. A
incubao feita a 37C por perodo de at 30 dias.

Abaixo esto os procedimentos recomendados para exame direto e cultura, visando obter melhor
rendimento no isolamento primrio de fungos, de acordo com tipo de amostra biolgica.

Procedimentos laboratoriais para exame direto e isolamento de fungos, segundo amostra

biolgica

AMOSTRA BIOLGICA PROCESSAMENTO EXAME MICROSCPICO MEIO DE CULTURA*

- Fluidificao (recomendada) - a fresco - ASD

Secreo respiratria - Centrifugao - KOH a 20% - BHI
- Uso do sedimento - Giemsa
- Tinta nanquim

Lquor - Centrifugao - Tinta nanquim - ASD

- Uso de sedimento - Gram

Urina** - Centrifugao - a fresco - ASD

- Uso de sedimento - Gram
Fludos corporais
(pleural, asctico, sinovial, - Centrifugao - KOH a 20% - ASD
pericrdico, gstrico, - Uso de sedimento - Giemsa - BHI
brnquico)

Pus e secrees de - Nenhum - KOH a 20% - ASD

abscessos - Giemsa - BHI
swab embebido em salina
(mucosa oral, nasal, - Centrifugao - Gram - ASD
vaginal, anal, olhos, - Uso de sedimento
conduto auditivo)
Pele, pelos e escamas - Nenhum - KOH a 20% - ASD

Tecidos e peas - Fragmentao ou - KOH a 20% - ASD e BHI

macerao - Giemsa
- Imprint em lmina - Tinta naquim

- Semeadura em meio de - Giemsa - BHI bifsico ou lquido

Sangue e medula ssea cultura - ASD bifsico ou lquido
- Esfregao ou distenso em
lmina
* Todos os meios slidos, para isolamento de fungos devem conter cloranfenicol.
** Para contagem de colnias (UFC/ml), semear 0,1 ml de urina em ASD distribudo em placa de Petri, antes de
centrifugar.

Mod VII - 11
4. IDENTIFICAO DE FUNGOS

O profissional de laboratrio deve tentar identificar todas as culturas positivas e emitir o resultado
mais acurado possvel. Muitas vezes, o exame microscpico da amostra suficiente para medidas de
controle da infeco, outras vezes somente o isolamento e identificao do fungo pode orientar a
conduta clnica. A identificao dos fungos, de modo ideal, deve contemplar o gnero e a espcie;
porm, muitas vezes, isso no possvel, pelo grau de dificuldade e complexidade do exame. Nestes
casos a identificao do grupo de fungos, suficiente para o diagnstico de micose, por ex.,
zigomicetos, feo-hifomicetos, dermatfitos, leveduras, etc.

O isolamento de um fungo em meio de cultura no significa, necessariamente, que ele o agente

etiolgico da infeco. A presena de fungos na microbiota (flora) de pacientes, por ex. Candida sp e
no meio ambiente, por ex. Aspergillus sp, pode resultar em cultura positiva. Isto explica o grande
nmero de culturas positivas para fungos, a partir de uma amostra biolgica. A relao entre o fungo
isolado em meio de cultura e sinais e sintomas, critrio clnico-epidemiolgico. No entanto, deve-se
sempre valorizar o isolamento de um fungo procedente de:

Qualquer amostra biolgica que mostrou resultado positivo ao exame microscpico

Micose cutnea
Fludos corporais normalmente estreis
Tecidos obtidos por bipsias ou peas operatrias
Urina, obtida por sondagem ou cistoscopia, independente da contagem de colnias
Raspado de crnea
Paciente imunodeprimido (transplantado ou com Aids)
Paciente em uso de antibiticos por longo tempo, internado em unidade de terapia intensiva ou
submetido a ventilao, cateterismo ou outras manipulao
Paciente de hemodilise ou debilitado que apresente algum sintoma ou sinal de doena infecciosa
independente do tipo de amostra clnica

Alm desses casos, tm importncia as culturas de fungos:

Dimrficos
Isolados mais de uma vez, do mesmo tipo de amostra biolgica, coletada em diferentes dias e
procedentes do mesmo paciente
Isolados de ponta de cateter (alimentao parenteral, infuses venosas, etc.)

IDENTIFICAO DE LEVEDURAS (Morfolgica e Bioqumica)

A morfologia das leveduras, ao contrrio do que ocorre com os bolores, no apresenta muita
diversidade e, portanto, nem sempre um parmetro suficiente para sua identificao. Em
determinadas situaes, no entanto, a identificao rpida, simples e presuntiva pode ser feita,
contribuindo para o diagnstico do quadro infeccioso. Desse modo, se a levedura apresenta hifas
hialinas e ramificadas, sugestivo do gnero Candida sps e se, alm disso, desenvolver clamidsporos
-clulas de reserva- ou tubos germinativos, em determinadas condies in vitro, identificada como
Candida albicans. Outros gneros, tais como, Cryptococcus, Rhodotorula, Geotrichum e Trichosporon,
tambm podem, na grande maioria das vezes, ser identificados apenas, por sua morfologia
caracterstica. O restante dos gneros e espcies, porm, necessita de provas bioqumicas para sua
identificao. No entanto, do ponto de vista clnico, nem sempre importante a identificao acurada
da levedura. Por outro lado, a identificao, pode ter interesse epidemiolgico. Para leveduras
relacionadas a episdios de infeco hospitalar, por ex., h grande preocupao no estudo das
espcies dos agentes, como marcador epidemiolgico temporal e espacial de infeces, como no caso
de espcies de Candida que tm menor sensibilidade a antifngicos azlicos.

Colnias de levedura obtidas de amostra biolgica, s devem ser identificadas, quando estiverem
puras, ou seja, sem contaminao bacteriana ou em mistura de espcies. Para tanto, deve ser
realizado o plaqueamento de cada colnia morfologicamente distinta e confirmada sua pureza, por
microscopia. De cada colnia deve ser feito um repique em ASD para sua identificao.

Mod VII - 12
As provas fisiolgicas mais comuns e mais simples para identificao de Candida albicans e Candida sp
so: tubo germinativo e filamentao em cultivo em lmina. No cultivo em lmina, avalia-se a
capacidade de produo de hifas hialinas ramificadas que podem se fragmentar em esporos,
denominados artrocondios. Estas hifas ocorrem nos gneros Geotrichum e Trichosporon. Caso a
levedura forme hifas hialinas ramificadas sem fragmentao, provavelmente pertence ao gnero
Candida e se houver formao de clamidsporos caracteristicos, Candida albicans.

A pesquisa de cpsula, caracterstica marcante do gnero Cryptococcus feita com uma gota de tinta
nanquim e uma alada da cultura. A cpsula, constituda de material polissacardico, aparece como um
halo claro ao redor dos blastocondios de Cryptococcus e contrastam com o fundo negro da lmina.

A prova de urease, disponvel em todo laboratrio de microbiologia muito utilizada em micologia. A

reao positiva para urease, junto com anlise morfolgica permite identificao presuntiva de
Cryptococcus sp. Leveduras do gnero Rhodotorula so tambm urease positiva mas, como em
regra, apresentam colnias com pigmento avermelhado ou salmo, so facilmente distinguidas de
Cryptococcus sp. Outros gneros incluindo Candida sp, produzem urease, mas tem outras
caractersticas para sua identificao.

O esquema abaixo prope um fluxo para identificao das principais leveduras de interesse mdico.
Se as provas no conduzirem identificao presuntiva do gnero, provas de assimilao de fontes de
carbono e nitrognio (auxanograma) e fermentao de carboidratos (zimograma) devem ser
realizadas e interpretadas segundo tabelas existentes na bibliografia recomendada ao final deste
captulo. Um exemplo simplificado a Tabela 1.

Esquema simplificado para identificao de alguns gneros de leveduras

Tubo Germinativo

Positivo Negativo Cultivo em lmina

Candida albicans

Hifas Somente blastocondios

Artrosporadas no-artrosporadas
+ blastocondios Prova da Urease

Candida albicans

com sem Positiva Negativa

blastocondios blastocondios

Trichosporon sp Geotrichum sp Associar cor da colnia

Laranja, Avermelhada, Salmo Branca Bege

Rhodotorula sp Associar pesquisa de cpsula

Positiva Negativa

Cryptococcus sp

Auxanograma e
Zimograma

Mod VII - 13
PROVA DO TUBO GERMINATIVO

A partir de uma alada da colnia isolada, fazer uma suspenso em tubo de ensaio contendo 0,5 ml de
soro humano (pode-se usar tambm soro estril de bovino, cavalo ou coelho). Incubar a 37C durante
perodo mximo de 3 horas. Este prazo importante porque, aps esse perodo, outras espcies de
Candida e de outros gneros, formam tambm tubo germinativo. Depositar ento, uma gota da
suspenso sobre lmina, cobrir com lamnula e examinar ao microscpio ptico. A presena de tubo
germinativo, na forma de pequeno filamento que brota do blastocondio, sem formar constrico com
a clula-me, permite a identificao presuntiva de Candida albicans.

Prova do tubo germinativo com blastocondios, tubo germinativo e pseudo-hifas de

Candida albicans

CULTIVO EM LMINA PARA PROVA DE FILAMENTAO E CLAMIDSPORO

Depositar 3 ml de gar-fub fundido, sobre uma lmina contida sobre um suporte dentro de uma
placa de Petri. O suporte para a lmina pode ser um basto de vidro, outra lmina ou apenas dois
palitos de madeira Aps solidificao do meio, semear a levedura, com auxlio de uma agulha em L,
fazendo 2 estrias paralelas. Recobrir as estrias com lamnula esterilizada. Fazer uma cmara mida,
acrescentando 2 ml de gua destilada estril na placa, ou embebendo um algodo estril, para evitar
dessecao do meio, durante o perodo de incubao da prova. Tampar a placa e aps 24h, 48h e
72h, examinar a preparao em microscpio tico. A presena de hifas hialinas, septadas e
ramificadas, caracterstica o gnero Candida e se houver formao de clamidsporos indica Candida
albicans. Formao exclusiva de artrsporos permite identificao de Geotrichum, mas quando so
formados tambm blastocondios trata-se de Trichosporon. O meio de gar fub ou farinha de milho
pode ser adquirido no comrcio (CornMeal agar) mas sua formulao simples , ressaltando-se que
de todos as maneiras, deve-se acrescentar a substncia tensoativa tween 80, para que a prova d
resultados confiveis. O meio tem a seguinte composio e preparo:

Meio gar Fub

Fub 20 g
gar 10 g
Tween 80 5 ml

Adicionar o fub em 250 ml de gua e ferver at borbulhar. Filtrar o fub em gaze dobrada em quatro.
Dissolver o gar em 250 ml de gua. Restaurar o volume da infuso de fub para 250 ml, com gua
quente, juntar as suspenses, ajustar o pH para 6,6 6,8 e adicionar o Tween 80. Distribuir volumes
de 5 ml em tubos e esterilizar em autoclave a 120C por 15 minutos.

Mod VII - 14
Cultivo em lmina para prova de filamentao e clamidsporo

Lmina Basto de vidro

Lamnula 3 estrias com inculo

da levedura

gar fub gua estril sobre

papel de filtro

PROVA DA UREASE

Semear uma alada da levedura na superficie do meio de urease (gar uria de Christensen).
Incubar temperatura de 37C.
A mudana da cor do meio para rosa bispo em 24 h, indica reao positiva.

PROVA DE ASSIMILAO DE FONTES DE CARBONO E NITROGNIO OU AUXANOGRAMA

Nessa prova so usados 2 meios, que podem ser adquiridos no comrcio, na forma desidratada (Yeast
Nitrogen Base e Yeast Carbon Base) ou formulados. A levedura semeada "pour plate",
homogeneizando-se 2 ml de uma suspenso das colnias, a cada meio fundido ou semeada na
superfcie de cada um dos meios, previamente, distribudos em 2 placas de Petri. So ento
adicionadas pequenas alquotas de diferentes carboidratos que servem de fonte de carbono, sobre a
superfcie do meio isento de carbono. Vrias substncias, incluindo lcoois, protenas e aminocidos
servem de fontes de nitrognio e so colocadas sobre a superfcie do meio isento de nitrognio. Aps
incubao temperatura ambiente ou 25C, por perodo de uma semana, a levedura ir assimilar e
crescer em volta de determinadas fontes, de acordo com o metabolismo caracterstico de sua espcie.
A leitura feita pelo halo de turvao resultante do crescimento e indica prova de assimilao positiva
para a respectiva fonte. Os resultados so comparados a tabelas existentes na bibliografia
recomendada e um exemplo simplificado consta na tabela abaixo.

Identificao das principais leveduras de interesse mdico

Cultivo
Levedura Tg em Ur Assimilao Fermentao
lmina
Hifa Ar Sa Ma La Ce Tr Ra X I NO3 Gl Sa Ma La Ra Tr

C. albicans + + - - + + - - + + + - - + - + - - V

C. tropicalis - + - - + + - V + + + - - + V + - - +

C. parapsilosis - + - - + + - V + + + - - + - - - - V

C. krusei - + - - - - - - - - - - - + - - - - -

C.guilliermondii - + - - + + - + + + + - - + + - - + V

C. glabrata - - - - - - - - + - - - - + - - - - +

C. neoformans - - - + + + - V + V + + - - - - - - -

Geotrichum - + + - - - - - - - + - - V - - - - -

Trichosporon - + + V + + + + V V + V - - - - - - -

Rhodotorula sp - - - + + V - V + + + - - - - - - - -

Saccharomyces - - - - + + - - V + - - - + + + - + V

Tg = tubo germinativo, Ar = artrsporo, Ur= urease, Sa = sacarose, Ma=maltose,La = lactose, Ce = celubiose, Tr

= trealose, Ra = rafinose, X = xilose, I = inositol,NO3 = nitrato, Gl = glicose, + = pos, - = neg, V= varivel

Mod VII - 15
FERMENTAO DE ACCARES OU ZIMOGRAMA

A capacidade de fermentar carboidratos, ao lado do auxanograma, ir completar o perfil bioqumico da

levedura permitindo, em regra, a identificao acurada de gnero e espcie (QUADRO 3). As
caractersticas morfolgicas so fundamentais para concluir a identificao, desde que diversas
espcies tm perfis bioqumicos idnticos, mas morfologias distintas. Para o zimograma,
diversas fontes de carboidratos so colocadas em tubos respectivos, contendo meio bsico lquido. A
levedura semeada em cada tubo e aps perodo de at 15 dias a 25C, a fermentao revelada
por formao de bolhas de gs, observadas dentro de tubos de Durhan, colocados previamente,
durante a preparao do meio bsico.

IDENTIFICAO DE FUNGOS FILAMENTOSOS

A identificao de fungos filamentosos tem, como fundamento, a observao da morfologia da colnia

e aspectos microscpicos. A anlise da colnia visa observar: cor, textura, superfcie, pigmento
difusvel no meio de cultura, entre outros, e pode ser feita no tubo de ensaio contendo a cultura
primria do fungo. Porm, o mais adequado a anlise a partir da colnia gigante, ou seja, uma
cultura feita no ponto central de uma camada de gar distribudo em placa de Petri. A velocidade de
crescimento, que pode ser rpida (< 7 dias), intermediria (8 a 14 dias) ou lenta (> 15 dias)
fundamental para identificao presuntiva do fungo.

A observao das estruturas microscpicas, tais como: hifa hialina ou demcia, septada ou cenoctica,
forma, disposio e formao dos esporos, so suficientes, em geral, para a identificao de fungos
filamentosos. Em alguns grupos porm, como os fungos demcios, pode ser necessrio tambm uso
de provas bioqumicas. A morfologia microscpica melhor visualizada com a tcnica de microcultivo
que preserva a disposio original dos esporos sobre as hifas e mantm ntegras certas estruturas
formadoras de esporos, por ex. esporngios que so rgos de reproduo de zigomicetos.

Os fungos filamentosos, patognicos ou contaminantes ambientais, potencialmente oportunistas,

formam um grupo muito extenso, impossvel de ser tratado neste Manual. Para identificao das
diversas espcies ou grupos existe bibliografia especializada de textos, manuais e atlas, indicados no
final deste captulo. Dentro do objetivo deste Manual sero ilustrados aspectos microscpicos de
alguns fungos de interesse em medicina (vide Figuras adiante).

TCNICA DE MICROCULTIVO PARA FUNGOS FILAMENTOSOS

Colocar sobre uma lmina esterilizada, contida em uma placa de Petri estril, um cubo de gar: ASD
ou gar batata. A lmina deve estar sobre um suporte, que pode ser formado por outra lmina, ou um
pequeno basto de vidro recurvado, ou ainda, dois palitos de fsforo. Semear o fungo, a partir de
repique recente, nos 4 lados do cubo de gar. Recobrir com uma lamnula esterilizada. Fazer uma
cmara mida, adicionando 1 a 2 ml de gua destilada estril no fundo da placa ou embeber um
pequeno chumao de algodo estril, para evitar a dessecao do meio de cultura, durante o
crescimento do fungo. Tampar a placa e deixar temperatura ambiente por 7 a 10 dias, at que se
observe desenvolvimento de hifas com ou sem pigmentao.

Aps esse perodo, inativar a esporulao, adicionando 1 ml de formol ao algodo e vedando a placa
com fita adesiva durante 24h-48h. O vapor de formaol, alm de inativar o fungo, ir auxiliar na
fixao das estruturas microscpicas. Retirar a lamnula com auxlio de uma pina, cuidadosamente,
uma vez que nela devero estar aderidas as hifas e esporos do fungo. Pingar uma gota de corante
azul de lactofenol-algodo (Cotton Blue) e montar sobre uma lmina. Desprezar o cubo de gar e,
em seu lugar, pingar outra gota de corante azul e recobrir com lamnula, para visualizar esporos e
hifas tambm aderidos lmina. Observar em microscpio tico com objetiva de 40 X, o tipo e cor da
hifa, forma disposio e formao de esporos.

O corante azul de lactofenol-azul algodo, utilizado na microscopia de culturas de fungos filamentosos,

formulado e preparado da seguinte forma:

Mod VII - 16
Azul de lactofenol-algodo
cido ltico 20g
Cristais de fenol 20g
Glicerina 20g
Azul algodo 0,05g
gua destilada 20g

Fundir os cristais de fenol em banho-maria e juntar

Esperar 24 h e filtrar

O azul algodo pode ser substitudo pelo azul de metileno.

Tcnica de microcultivo para anlise microscpica de fungos filamentosos

Lmina Basto de vidro

Lamnula 4 inculos de fungo nas

laterais do cubo

Cubo de gua estril sobre

gar papel de filtro

Fungos anemfilos de hifas hialinas e septadas (hialohifomicetos)

Mod VII - 17
 FUNGO ANEMFILO
DE HIFAS SEPTADAS E
MARRONS
(DEMCIO)

Cladosporium

FUNGO ANEMFILO DE
HIFAS HIALINAS E
CENOCTICAS
(ZIGOMICETO)

Dermatfitos agentes de micoses cutneas

Rhizopus

Dermatfitos agentes de micoses cutneas

IDENTIFICAO DE FUNGOS DIMRFICOS

Dimrficos so fungos filamentosos que podem, sob determinadas condies, assumir forma de
levedura, diminuindo a capacidade de filamentao e dividindo-se por brotamento, conferindo s
colnias aspecto cremoso. Esta fase leveduriforme ocorre sob temperatura acima de 30C, de
preferncia a 37C. So fungos de crescimento lento (>15 dias) no primo-isolamento (Histoplasma
capsulatum e Paracoccidioides brasiliensis ou moderado (8 a 14 dias), como Sporothrix
schenckii. A identificao feita pela comprovao do dimorfismo e pelo aspecto microscpico
caracterstico de cada fase.

Mod VII - 18
Paracoccidioides brasiliensis in vivo e in vitro (37C).

Histoplasma capsulatum (a) e Sporothrix schenckii (b) in vitro (25C).

a b

Mod VII - 19
5. DESCRIO DAS PRINCIPAIS MICOSES

As localizaes topogrficas mais frequentes, relacionadas aos agentes fngicos, sero apresentadas
de forma resumida.

Agentes etiolgicos e localizaes topogrficas

Derma- H. P. S. Aspergillus Candida C. Zigo-

tfitos capsulatum brasiliensis schenckii sp sp neoforman micetos

Trato X X X X X X
respiratrio

Sangue X X X X X X

Osso X X X X X

Medula ssea X

Pele e Unha X X

Pelo X

Crebro X X X X X X

Lquor X X X

Ouvidos X

Olhos X X

Fgado e Bao X X

Naso-faringe X X X X

Mucosas X X X

Tecido sub- X X X X X
cutneo e
gnglios

Trato urinrio X X X

Trato X X
gastrointestinal

DERMATOFITOSES (TINEAS)

So infeces fngicas limitadas s camadas superfciais queratinizadas da pele, pelos e unhas,

popularmente, conhecida como epinge ou frieira, dependendo da localizao das leses que so
extremamente pruriginosas. Em imunodeprimidos podem acometem tecidos subcutneos.

Agentes etiolgicos: Microsporum spp, Trichophyton spp e Epidermophyton floccosum

Ocorrncia: universal, acometendo indivduos de qualquer idade, sexo ou raa.
Fontes de infeco: contgio direto com animais, solo ou indivduo infectado.

Procedimento laboratorial:

Amostra: escamas de pele, unha e cabelos

Exame da amostra com KOH a 20%, revela hifas regulares, hialinas, septadas, refrigentes,
frequentemente artrosporadas.
Cultura: material deve ser semeado em ASD, com auxlio de uma ala em L, de forma a ficar em
perfeito contato com o meio de cultura. As colnias de dermatfitos geralmente, crescem a partir
do 10 dia de incubao temperatura ambiente e os fungos so identificados pela sua morfologia
macroscpica e microscpica. No Brasil, os dermatfitos mais freqentes so T. rubrum e M.
canis.

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PARACOCCIDIOIDOMICOSE

Doena granulomatosa, crnica que pode acometer pele, mucosas, linfonodos, sistema respiratrio,
trato gastrointestinal, adrenais, fgado, bao e SNC. Apresenta grande variabilidade de manifestaes
clnicas, desde formas localizadas at formas disseminadas de mau prognstico, na dependncia da
resposta imune do hospedeiro. Existe tambm a paracoccidioidomicose-infeco, em que o indivduo
no apresenta sinais e sintomas mas, demonstra por testes intradrmicos positivos, que entrou
anteriormente, em contato com o fungo. Apresenta muitas semelhanas com a tuberculose.

Agente etiolgico: Paracoccidioides brasiliensis

Ocorrncia: pases da Amrica Latina, principalmente Brasil.

Procedimento laboratorial:

Amostra: raspado de leso e mucosa, secreo do trato respiratrio, aspirado de linfonodos,

tecido obtido por bipsia.
Exame direto com KOH a 20% revela a presena da forma leveduriforme constituda de clulas
grandes (10m a 60 m), globosas, com parede celular dupla e refringente e com mltiplos
brotamentos, semelhana de roda de leme, orelhas de Mickey Mouse ou argolas
entrelaadas.
Cultura: fungo dimrfico de crescimento lento (> 15 dias). Culturas desenvolvidas a < 30C so
filamentosas, de cor branca, cotonosa, com sulcos centrais, composta de hifas hialinas finas,
septadas e fragmentadas em esporos multiformes. As colnias incubadas entre 30C a 35C so
de cor creme, pregueadas e enrugadas, cuja microscopia revela as formas caractersticas
leveduriformes que permitem a identificao do agente.

HISTOPLASMOSE

Doena que acomete primariamente o sistema retculoendotelial. A infeco pode ser localizada ou
generalizada. A histoplasmose primria afeta o sistema respiratrio e a histoplasmose progressiva
atinge fgado, bao, linfonodos, mucosas, mdula ssea, etc. Em indivduos hgidos, a infeco tem
bom prognstico porm atualmente, importante infeco oportunista associada Aids, nos quais
ocorre a forma grave e disseminada.

Agente etiolgico: Histoplasma capsulatum

Ocorrncia: distribuio universal, principalmente em pases de clima temperado.
Fontes de infeco: inalao de esporos presentes em aerossis formados por solos contaminados
com excretas de galinhas e morcgos.

Procedimento laboratorial:

Amostra: secreo do trato respiratrio, sangue, puno de mdula ssea, tecido obtido por
bipsia de mucosas e outros.
Exame microscpico direto, sem colorao, requer muita habilidade do tcnico. Recomenda-se
colorao por Giemsa, para melhor visualizao do agente em de cortes histolgicos, onde se
evidencia sob imerso, pequenas leveduras (2-5 m), intracelulares, dentro de clulas
mononucleares.
Cultura: fungo dimrfico de crescimento lento (15 a 30 dias) sendo que no primo-isolamento
mais fcil obter a forma filamentosa de cor branca, aspecto cotonoso e sulcado, temperatura <
30C. A confirmao do dimorfismo feita atravs de repique em meio rico (BHI) e incubao
entre 30C e 35C. A transformao da forma filamentosa ou miceliana fase leveduriforme,
vista com a formao de pequenas (2-5 m) leveduras em brotamento. A identificao porm,
feita pela micromorfologia da forma filamentosa, com a observao de esporos grande-
macrocondios- arredondados e com inmeras espculas ou granulaes na parede celular,
chamados hipnsporos ou esporos tuberculados.

ESPOROTRICOSE

Infeco crnica cuja forma clnica mais freqente em nosso meio a forma linfangtica nodular
ascendente. Atinge em geral, uma das extremidades sob forma de leso ulcerada no ponto de
inoculao e acomete a drenagem linftica regional com formao de gomas no trajeto. As formas
disseminadas so raras, em paciente imunocompetentes, mas frequentes em pacientes com Aids.

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Agente etiolgico: Sporothrix schenckii
Ocorrncia: doena de distribuio universal que acomete principalmente, trabalhadores rurais e
floristas.

Procedimento laboratorial:

Amostra: aspirado das leses gomosas ou tecido subcutneo.

Exame microscpico da amostra apresenta baixa sensibilidade mas, exame de cortes de tecido
corados, pode revelar leveduras em forma de charuto ou apenas formas ovaladas com diviso
em brotamento (blastocondios).
Cultura: fungo dimrfico que se desenvolve bem em ASD, entre 7 a 12 dias e cuja forma
filamentosa (< 30C) apresenta hifas hialinas finas e septadas com esporos disposto em arranjo
semelhante flor "margarida". A forma leveduriforme (> 30C), no caracterstica do gnero e
requer meios ricos acrescidos de sangue, cisteina e submetidos a tenso de CO2. O interesse na
obteno da fase leveduriforme para a diferenciar o agente da esporotricose, do gnero
Sporothricum, fungo filamentoso no-dimrfico e anemfilo de meio ambiente. A forma
filamentosa apresenta na microscopia a forma adequada para identificao do agente.

ASPERGILOSE

A aspergilose pode se apresentar em indivduos imunocompetentes, como leses localizadas em

unhas, ps, canal auditivo, olhos e forma bronco-pulmonar alrgica. Em pacientes
imunocomprometidos, tende forma disseminada ou cerebral, de alta letalidade, geralmente,
associada a neutropenia ou doenas debilitantes.

Agente etiolgico: Aspergillus fumigatus (o mais comumente isolado)

Ocorrncia: tem distribuio universal. crescente o nmero de relatos desta doena como infeco
secundria em pacientes em tratamento prolongado com antibitico e corticosterides, doenas
debilitantes como carcinoma, tuberculose, pacientes neutropnicos, e em leses de tecidos
subcutneos, da pele ou da crnea.

Procedimento laboratorial:

Amostra: secreo do trato respiratrio, material de bipsia e lavado brnquico.

O exame microscpico revela hifas septadas e hialinas, com 4 a 6 m de dimetro e que se
ramificam em ngulo de at 45.
Cultura: colnias de Aspergillus fumigatus, a espcie mais associada doena em humanos,
podem ser facilmente, isoladas em ASD, em at 7 dias (crescimento rpido) com
desenvolvimento, na superfcie do meio, de filamentos brancos-hifas - que se tornam verde a
verde-acinzentado, com a formao de esporos.

CRIPTOCOCOSE

A criptococose uma infeco subaguda ou crnica que envolve primariamente, os pulmes, com
tropismo pelo sistema nervoso central -meninges-, podendo atingir pele e outros tecidos.

Agente etiolgico: Cryptococcus neoformans

Ocorrncia: no homem, a distribuio da doena universal.

Procedimento laboratorial:

Amostra: lquor, secreo do trato respiratrio ou de leso de pele, aspirado de formao tumoral
subcutnea e tecidos obtidos por bipsia. O exame laboratorial dever incluir urina, de preferncia
aps massagem prosttica, para monitorar a presena do agente na prstata que constitui seu
rgo de reserva.
Exame obrigatoriamente, com tinta nanquim para observao de clulas capsuladas, com
dimetro varivel, entre 5 m a 20 m, que sugerem Cryptococcus sp.
Cultura: secreo do trato respiratrio, lquor e tecidos podem ser cultivados em ASD ou qualquer
outro meio, desde que no contenham cicloheximida que inibe Cryptococcus. O agente cresce
rpido (< 7 dias) entre 25C e 37C, sob forma de colnias mucides de colorao creme parda.
A identificao de gnero e espcie feita atravs de provas bioqumicas, como: teste da urease e
auxanograma.

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CANDIDASE

Candidiase uma doena com manifestaes clnicas variadas. As infeces aguda e crnica mostram
leses na boca, faringe, pele, unhas, sistema broncopulmonar, intestinal e perianal. Ocasionalmente,
endocardite, meningite, fungemia ou infeces em outras localizaes podem ser observadas.

Agentes etiolgicos: Candida albicans e outras espcies, que esto freqentemente, envolvidas em
casos de micoses oportunistas em pacientes debilitados. So os principais agentes etiolgicos de
Infeces hospitalares. As espcies de Candida podem ser isoladas de vrios locais do corpo humano,
como microbiota normal de cavidade oral, mucosa vagina, regio perianal e trato gastrointestinal.
Ocorrncia: - universal, incluindo as formas graves que ocorrem sob fatores predisponentes para
desenvolvimento da doena, tais como: desnutrio, obesidade, diabetes, gravidez, antibioticoterapia,
quimioterapia e uso de corticosterides, manipulao endovenosa inadequada, neoplasias e outras
doenas debilitantes.

Procedimento laboratorial:

Amostra: (depender da sintomatologia clnica) fragmentos de pele e unhas; raspados da mucosa

oral, vaginal ou anal; secreo do trato respiratrio, sangue, liquor, urina e fezes.
Exame de fragmentos de pele e unhas devem ser feitos com soluo de KOH 20%. Secreo do
trato respiratrio ou material de mucosa podem ser examinados pela colorao de Gram. A
levedura aparece como clulas arredondadas, com brotamentos com ou sem hifas. Pequenas
clulas podem ter dimetro de 2-6m, mas formas maiores so tambm observadas.
Cultura: o crescimento rpido (24-72h) entre 25C e 37C. O aparecimento ocorre em torno de
3 a 4 dias, com formao de colnias com colorao branca bege. A habilidade de formar tubo
germinativo e/ou clamidsporos na prova de cultivo em lmina, permite a identificao de
C.albicans. Para a identificao das outras espcies do gnero Candida deve-se, alm do cultivo
em lmina, procecer-se assimilao de fontes de carbono e nitrognio (auxanograma) e
fermentao de fontes de carbono (zimograma) .

ZIGOMICOSE

Infeco geralmente, subaguda de evoluo rpida que acomete indivduos debilitados,

transplantados, diabticos descompensados ou ainda com Aids. Pode acometer seios paranasais,
tecido subcutneo, pulmo e vasos sanguneos, causando embolia no SNC e trombose. A micose, em
indivduos imunodeficientes , em geral, fatal se o diagnstico no for rpido e o tratamento especfico
no for prontamente, estabelecido.

Agentes etiolgicos: fungos da classe dos Zigomicetos, compreendendo os gneros Mucor, Rhizopus
e Absidia, entre outros.
Ocorrncia: distribuio universal.

Procedimento laboratorial:

Amostra: secreo de sinus nasal ou tecidos obtidos por bipsia de seios paranasais ou leses
subcutneas.
Exame com KOH a 20%, revela hifas hialinas e largas (6-50m), cuja caracterstica principal a
ausncia de septos, que caracterizam as hifas cenocticas, desse grupo de fungos.
Cultura: fungos de crescimento rpido (< 72 h) a 25C em ASD, com hifas ereas abundantes. A
identificao feita pela microscopia da colnia que evidencia hifas cenocticas e esporos contidos
dentro de estruturas fechadas denominads esporngios.

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6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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