1.

Introdução

O ácido desoxirribonucléico (DNA) é constituído por duas fitas ou cadeias

polipeptídicas complementares, dispostas na forma de dupla-hélice. Sua
unidade básica são os nucleotídeos, estes são compostos por fosfato, um
açúcar (nesse caso uma desoxirribose) e por uma base nitrogenada, esta pode
ser adenina, guanina, citosina ou timina.

É no DNA, que a informação genética de um organismo é armazenada. Nos

seres eucariotos, ele se localiza no núcleo da célula. Dentre os seres
procariotos que o apresentam como material genético, encontram-se as
bactérias. Nestas o DNA, pode ser encontrado disperso em uma região de seu
citoplasma, denominada nucleóide. (Figura 1)

Figura 1: Representação de uma célula procariota onde é possível observar o nucleóide, em que o DNA
genômico está localizado.

A célula bacteriana pode apresentar um DNA extra cromossomial, chamado

plasmídeo. Ele confere uma certa vantagem seletiva às bactérias que o possui,
como resistência a certas drogas e antibióticos, e produção de fatores de
virulência como toxinas.

O plasmídeo pode se apresentar em vários estágios de compactação como

o circular, sua forma mais comum, o concatenado, onde cópias de DNA
plasmidial circular se encontram na forma de anéis agregados, e o supercoiled,
onde o DNA circular sofreu uma super enovelação. (Figura 2)

1
Figura 2: Representação dos níveis de compactação dos plasmídeos bacterianos: circular, concatenado e
supercoiled (superenovelado), respectivamente. (Equilibrium in DNA-molecule distribution. In: Nature
Reviews Molecular Cell Biology. Disponível em:
<http://www.nature.com/nrm/journal/v7/n8/box/nrm1982_BX2.html> Acesso em 19/11/2011)

A extração de DNA é um método rápido e fácil de torná-lo mais puro, onde,

as impurezas são eliminadas devido a utilização de vários compostos e
reagentes durante o processo. Ela nada mais é, do que um método de
purificação do DNA, para a então análise e quantificação deste pela
eletroforese.

A eletroforese é um processo de separação de moléculas em uma mistura

de acordo com seu tamanho e carga, sob influência de um campo elétrico.
Nesse processo é utilizado um gel, que essas moléculas irão atravessar de
acordo com seu tamanho, ou seja, quanto menor a partícula mais rapidamente
ela correrá pelo gel.

No caso da eletroforese de DNA, os tipos de gel mais utilizados são os de

poliacrilamida, que pode ser usado para mapeamentos gênicos e separa
fragmentos menores, de 5 a 500 pares de base; e o de agarose, que é o mais
comum, constituído de resíduos de D e L- galactose, separa fragmentos de 50
a 20000 pares de base.

2. Objetivos

Extrair DNA plasmidial, através dos métodos de lise alcalina e "boiling", e

DNA genômico, ambos bacterianos, para análise dos resultados utilizando a
eletroforese em gel de agarose.

3. Materiais

3.1 - Material por grupo

• Tubos tipo Falcon contendo cultura bacteriana de Escherichia coli, crescida in

vitro durante a noite.

• Tubos de microcentrífuga do tipo eppendorf;

2
• Pipetas automáticas (P20, P200 e P1000);

• Caixa de tips;

• Frasco de descarte contendo hipoclorito 1%.

3.2 - Equipamentos

• Microcentrífuga;

MARCA: Microcentrífuga Eppendorf®

MODELO: Centrifuge 5415C

• Microondas;

MARCA: Prodóscimo

• Fonte de eletroforese;

MARCA: Life Tecnologies

MODELO: 250

• Banho Maria;

MARCA: De Leo & Cia Ltda

•Balança;

MARCA: Marte ®

• Banho de gelo;

• Cuba de eletroforese;

• Forma de eletroforese;

• Pente de eletroforese;

• Tubo Falcon de 50 mL;

• Luva de amianto

• Proveta de 100 mL;

• Erlenmeyer de 250 mL;

• Espátula

3
• Capela de exaustão

MARCA: Engelab

• Estufa a 37°C

3.3 - Reagentes

• Tampão TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA);

• Proteinase K (10 mg/mL);

• Detergente SDS 10%;

• Clorofórmio;

• NaCl 3M;

• Isopropanol;

• Etanol 70%.

• Tampão de ressuspensão (Solução I) (25 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM EDTA

pH 8,0, glicose 50 mM);

• Solução II (NaOH 0,2M, SDS 1%);

• Solução III (60,0 mL de acetato de potássio 5M, 11,5 mL de ácido acético

glacial, 28,5 mL de água);

• Solução de ressuspensão STET (TrisCl 10 mM pH 8,0, NaCl 0,1M, EDTA 1

mM pH 8,0, Triton X-100 5% (v/v));

• Solução de lisozima (10 mg/mL);

• Fenol-clorofórmio, saturado em TrisHCl pH 8,0;

• Agarose;

• Tampão de amostra (Azul de bromofenol 0,25%, Xileno cianol 0,25%, Ficoll

30%, Tampão TE pH 8,0);

• Gel Red®;

• Tampão TAE (Tris-Acetato-EDTA).

4
 4. Procedimentos

4.1 - Extração de DNA genômico

Em dois tubos do tipo eppendorfs, que foram separados e devidamente

identificados , foi adicionado 1,5mL da cultura bacteriana E. coli – crescida por
16 horas, a 37°C, em meio LB, intensamente, sob vigorosa agitação de 250
rpm – e, em seguida, centrifugou-se a amostra por 3 minutos, à temperatura
ambiente, a 14000 rpm. Descartou-se o sobrenadante e o tubo foi mantido
invertido até que o “pellet” secasse ao máximo.

As células sedimentadas foram ressuspensas, com o auxílio da micropipeta

de 200μL, em 564μL de TE e, logo após, foram adicionadas 6μL de Proteinase
K e 30μL de SDS 10%. A mistura foi então encubada a 37°C por 1 hora.

Na capela, adicionou-se 600μL de Clorofórmio aos tubos, misturando as

fases, e centrifugando o eppendorf por 5 minutos a 14000 rpm em
microcentrífuga do tipo eppendorf.

A fase aquosa foi transferida para o outro tubo, e na capela, 1V de

Clorofórmio (24:1) foi adicionado ao mesmo, aproximadamente 200μL. As
fases foram misturadas e centrifugou-se o eppendorf por 5 minutos a 14000
rpm em microcentrífuga do tipo eppendorf.

Novamente, transferiu-se a fase aquosa para um novo tubo eppendorf,

previamente rotulado, adicionou-se 0,1V (20μL) de NaCl e depois 1V (200μL)
de Isopropanol. O tubo foi invertido várias vezes a fim de misturar as
substâncias, e em seguida, foi levado à microcentrífuga por 5 minutos a 14000
rpm.

O sobrenadante foi descartado e o eppendorf foi mantido invertido até que o

“pellet” secasse por completo e ressuspendeu-se o mesmo em 50μL de etanol
70%.

A amostra foi devidamente armazenada para posterior utilização em

eletroforese.

4.2 - Extração do DNA plasmidial por lise alcalina

No procedimento de extração de DNA plasmidial (método de lise alcalina) as

amostras de cultura bacteriana foram colocadas para crescimento a 37° C em
meio LB contendo agente seletivo. Feito isso, com a amostra já pronta, foram
transferidos 1,5mL da cultura bacteriana com o uso da micropipeta P1000 para
dois tubos do tipo eppendorf. Esses tubos foram submetidos a uma
centrifugação a 14000 rpm por 3 minutos. O sobrenadante foi descartado e
repetiu-se o processo desde o inicio. Transferiu-se mais 1,5ml da cultura

5
bacteriana aos mesmos eppendorf e foi descartado o sobrenadante ao fim da
centrifugação.

Feito isso as células foram ressuspendidas em 150µL de solução I (tampão

de ressuspenção) com auxílio da micropiteta P200. A solução foi então
incubada por 5 minutos à temperatura ambiente.

Seguidamente adicionou-se aos tubos 300µL de solução II (solução

alcalina), após sua adição os tubos foram homogeneizados por inversão até a
suspensão ficar clara. Feito isso 225µL de solução III foram adicionadas e a
amostra foi incubada em gelo por 10 minutos para posteriormente ser
centrifugada a 14000 rpm em temperatura ambiente por mais 10 minutos. Após
a centrifugação, os sobrenadantes foram transferidos para novos tubos
eppendorfs, descartando-se os precipitados ("pellet") no hipoclorito.

A esses novos tubos adicionou-se igual volume de clorofórmio (1V de

clorofórmio), realizando posteriormente a homogeneização e centrifugação por
3 minutos a 14.000rpm em temperatura ambiente, desses tubos.

Transferiu-se a fase aquosa para novos eppendorf ao qual foi adicionado 1V

de isopropanol. Os tubos foram incubados por 10 minutos no gelo e
posteriormente centrifugados a 14000 rpm durante 10 minutos, feito isso o
sobrenadante foi descartado cuidadosamente invertendo o conteúdo dos tubos
no hipoclorito.

Foi feito um spindown nas amostras e após isso elas foram lavadas com
200µL de etanol 70% gelado e foi centrifugada novamente por mais 5 minutos
a 14000 rpm em temperatura ambiente. Após isso, o sobrenadante foi
descartado e o “pellet” seco na estufa. Esse precipitado, por final, foi
ressuspenso em 20µL de TE.

A fim de realizar a técnica de eletroforese em gel de agarose do DNA

plasmidial obtido pelo método de lise alcalina, foi adicionado a este 2µL de gel
Red® e 3µL de tampão de amostra, com o auxilio de uma micropipeta, no seu
respectivo slot para visualização da sua corrida.

4.3 - Minipreparação de Plasmídeo (método do “boiling”)

Dois tubos do tipo eppendorf foram separados e devidamente identificados,

de tal forma que 1,5mL da cultura bacteriana de E. coli – crescida por 16 horas,
a 37°C, em meio LB, intensamente, sob vigorosa agitação de 250 rpm – foi
transferida para cada um destes e, em seguida, centrifugou-se por 3 minutos, à
temperatura ambiente, a 14000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o
eppendorf foi mantido invertido até que o “pellet” secasse ao máximo,
repetindo-se o processo de centrifugação e ressuspensão mais uma vez.

6
 Ao eppendorf foram adicionados 350µL de solução STET e 25µL de solução
de lizoenzima, misturando-se rapidamente para homogeneização, e colocou-se
o tubo em banho-maria a 100°C durante 60 segundos e depois foi centrifugado
por 10 minutos a 14.000 rpm. O sobrenadante foi, então, transferido para outro
tubo eppendorf ao qual foi adicionado igual volume de fenol-clorofórmio
saturado em Tris-HCl pH 8,0 e promovida homogeneização por inversão do
tubo. O tubo foi então centrifugado por 1 minuto a 14.000 rpm e a fase aquosa
foi transferida para outro tubo eppendorf.

Adicionou-se igual volume de clorofórmio ao tubo contendo a fase aquosa,

que foi então homogeneizado, centrifugado a 14.000 rpm por 1 minuto e teve
sua fase aquosa retirada. O DNA foi então precipitado adicionando 1/10 do
volume de NaCl 3M e então levado a centrífuga por 15 minutos a 14000 rpm, o
sobrenadante foi descartado e o “pellet” foi totalmente seco na estufa a 37°C
por 5 minutos.

O precipitado foi lavado com etanol 70% e centrifugado por 5 minutos a

14000 rpm, removeu-se o sobrenadante com auxílio de micropipeta e deixou-
se o “pellet” secar por 5 minutos . O precipitado foi então ressuspenso em 30µL
TE.

Para a realização da eletroforese, transferiu-se 10µL da amostra para um

novo tubo eppendorf previamente rotulado e adicionou-se ao mesmo 3µL de
Tampão de Amostra 6X e 2µL de gel Red®.

O tubo foi centrifugado rapidamente (“spin down”) e a amostra foi posta na

cuba para a visualização da corrida.

4.4 - Eletroforese Preparação do Gel

Para a preparação do gel de agarose 1% diluiu-se 20mL de TAE em um

cilindro graduado de 1000mL. Feito isso foram pesados 1,0g de agarose em
um erlenmeyer, e posteriormente foi adicionado 100mL do TAE diluído. Essa
solução foi levada ao microondas na potência 70% até que a agarose estivesse
completamente solubilizada, após isso espera-se a solução esfriar e a coloca
no suporte de gel, até sua secagem.

Após a secagem do gel, este é colocado na cuba de eletroforese, adiciona-

se solução de tampão TAE diluída até que a superfície do gel seja coberta e
com o auxílio do pente de eletroforese, marcam-se os ”slots".

Com tudo isso pronto, aplicam-se as amostras de DNA plasmidial e/ou

genômico nos "slots" com auxilio da micropipeta p20 utilizando as duas mãos
para uma maior precisão.

7
 Fecha-se o aparato da eletroforese e ajusta-se o mesmo para a voltagem e
corrente elétrica correta para a corrida das amostras. Feita a corrida (o tempo
varia de acordo com a voltagem), as amostras foram levadas ao
transiluminador UV para a visualização das bandas formadas.

5. Resultados

5.1 - Extração de DNA genômico

Após a corrida em gel de agarose, sob luz UV foi possível observar a

formação de bandas como mostrado a seguir:

Figura 3: Eletroforese do DNA genômico de E. coli. A formação de bandas no “slot” de número 3

representa a extração do grupo em questão.

Nessa extração, pôde-se observar bandas irregulares nos “slots” 2, 4 e 6.

Isso se deve aos erros que esses grupos cometeram ao longo da prática ou às
condições dos matérias utilizados pelos mesmos. O grupo 2 estava com o
eppendorf furado e portanto perdeu material. O grupo 4 não retirou
completamente o sal presente na amostra. O 6° grupo cometeu erro durante
uma pipetagem. Os "slots" dos grupos 1, 3 e 5 apresentaram bons resultados.

5.2 - Minipreparação de plasmídeo pelo método de lise alcalina

Após a corrida em gel de agarose, e visualização sob luz UV, foi possível
observar a formação de bandas como mostrado a seguir:

8
Figura 4: Eletroforese do DNA plasmidial de E. coli pelo método de lise alcalina. A formação de bandas no
“slot” de número 3 representa a extração do grupo em questão.

Observou-se nessa extração, um duplo resultado do grupo em questão. Isso

se deve porque em uma das etapas adicionou-se isopropanol antecipadamente
e foi obtido um precipitado de DNA com impurezas. No “slot” 4 não é possível
observar bandas regulares, o que se deve à uma possível ruptura do gel. Na
imagem não é possível visualizar o resultado do 6° grupo devido a um erro no
procedimento, em uma das etapas de transferência da fase aquosa para outro
tubo, uma parte da fase orgânica foi junto, contaminando assim a amostra. Os
demais resultados foram satisfatórios.

5.3 - Minipreparação de plasmídeo pelo método “boiling”

Assim como nos métodos anteriores houve corrida em gel de agarose e o

resultado foi visualizado sob luz UV, podendo ser observada a formação de
bandas de acordo com a imagem a seguir:

Figura 5: Eletroforese do DNA plasmidial de E. coli usando o método de “boiling”. A formação de bandas
no “slot” de número 3 representa a extração do grupo em questão.

9
 Nessa extração, pôde-se observar bandas irregulares no "slot" 4 devido ao
rompimento do gel de agarose e muito nítida no “slot” 5. Os demais resultados
foram muito satisfatórios e bastante homogêneos.

6. Discussão

Para obter uma adequada extração do DNA, seja este genômico ou

plasmidial, foi utilizada uma série de reagentes em cada etapa dos
procedimentos, tendo cada um deles um papel importante na extração.

A primeira prática realizada consistiu na extração do DNA genômico de uma

estirpe de Escherichia coli. Nesta, para a ressuspensão das células
sedimentadas foi utilizado o tampão TE, ao qual tem em sua composição: Tris
e EDTA. A função do Tris é de manter o pH constante, enquanto que a do
EDTA é de quelar os cátions divalentes, como o Mg2+. Quelar significa retirar
esses cátions divalentes de solução, não expondo então, esses íons ao meio
aquoso, fazendo com que eles fiquem ligados à molécula de EDTA e não a
outras moléculas, como as enzimas DNases e RNase, que utilizam esses
cátions como co-fatores.

A Proteinase K é uma serina protease cuja função é de clivar proteínas em

pequenas seqüências de nucleotídeos e de inativar a ação de nucleases que
poderiam degradar o DNA durante sua extração. A partir de sua adição, é
possível calcular sua concentração final:

1 µL = 10-3 mL
Cinicial = 10 mg/mL

Vinicial = 6 µL = 6 x 10-3 mL

Vfinal = 600 µL = 600 x 10-3 mL = volume de TE + volume de Proteinase K +

volume de SDS

Cinicial x Vinicial = Cfinal x Vfinal

10 x 6 x 10-3 = Cfinal x 600 x 10-3 mL

Cfinal = 0,1 mg/mL

O SDS é um detergente, cujo seu papel é de lisar a membrana fosfolipídica

da bactéria retirando os lipídeos junto a essa membrana, atuando assim em
conjunto com a Proteinase K. Porque após a ação do SDS, a serina protease
pode então degradar as proteínas que se encontravam dentro da membrana,
potencializando sua ação, tornando esta enzima mais ativa. A partir também da
sua adição, é possível calcular sua concentração final:

10
Cinicial = 10 %

Vinicial = 30 µL = 30 x 10-3 mL

Vfinal = 600 µL = 600 x 10-3 mL = volume de TE + volume de Proteinase K +

volume de SDS

Cinicial x Vinicial = Cfinal x Vfinal

10 x 30 x 10-3 = Cfinal x 600 x 10-3 mL

Cfinal = 0,5 %

A mistura foi incubada a 56°C, pois a esta temperatura, a ação das DNases
é desativada, sendo importante então para uma extração do DNA, pois sem
DNase, o DNA não é degradado. Nessa temperatura, contudo, as RNases
continuam funcionando.

O Fenol seqüestra as proteínas degradadas e aminoácidos hidrofóbicos,

interagindo com eles de forma hidrofóbica, e por ter polaridade diferente da
água forma um ambiente bifásico, onde a fase superior é formada por água e o
DNA, a fase interfásica é formada por restos celulares e a inferior, fenol e
proteínas.

A função do clorofórmio (CHCl3) é lavar o resto do fenol em solução, pois

este interfere na purificação do DNA. As centrifugações são realizadas com o
intuito de purificar mais ainda o DNA de forma eficiente.

O NaCl em solução se dissocia em íons sódio e íons cloreto. O DNA possui

carga negativa pelo seu grupamento fosfato. Desta forma, os íons sódio se
associam ao grupamento fosfato do DNA através de ligações iônicas,
diminuindo assim a repulsão entre as moléculas de DNA, favorecendo sua
agregação, ou seja, tornando-o mais apto à precipitação. Já o Isopropanol tem
a função de romper as pontes de hidrogênio formadas entre a água e o DNA,
tirando-o então de solução. Interage com o DNA, favorecendo também a
precipitação deste.

O etanol 70% também tem como função promover a precipitação do DNA, a

partir da retirada das moléculas de sua camada de solvatação, que faz com
que ele saia de solução e precipite. E além disto, promove a retirada de sal da
amostra, tornando-a mais pura. Porque o precipitado de DNA formado pelo íon
sódio não é solúvel em etanol, mas os outros elementos são.

A importância desta etapa está na formação do “pellet” formado pelo DNA e

os íons sódio, pois promove uma melhor análise da amostra de DNA, sem que
haja outros elementos interferindo.

11
 A segunda prática de extração de DNA foi a de DNA plasmidial pelo método
de lise alcalina, na qual a utilização dos reagentes consiste na obtenção de
amostras mais puras contendo DNA plasmidial com perda de DNA genômico.

A diferença entre a primeira extração de DNA e esta, está no começo do

procedimento, com a utilização de três soluções: solução 1, solução 2 e
solução 3.

A solução 1, denominada de tampão de ressuspensão, é formada por Tris-

HCl, glicose e EDTA. As funções do Tris e do EDTA aqui são as mesmas do
tampão utilizado na prática de extração de DNA genômico, são
respectivamente, manter o pH do meio e quelar os íons bivalentes que podem
atuar como co-fatores de DNases e RNases. A glicose é utilizada apenas para
manter o equilíbrio osmótico do meio preparando-o para a lise da bactéria.

A solução 2, denominada de solução de lise alcalina, é composta por NaOH

e SDS. A função do NaOH é de abrir poros na membrana da bactéria e de
manter o pH alto, ambas concedidas pela sua alta concentração. Com o pH
alto, o SDS atua de forma melhorada, lisando a membrana fosfolipídica da
bactéria pela sua ação detergente e também se associa às proteínas dessa
membrana lisando-as e aumentando a carga negativa do meio.

A solução formada é homogeneizada devagar a fim de evitar o rompimento

total da membrana e também para não desprender o DNA genômico associado
à membrana, caso contrário o este, poderia ser quebrado e não continuar mais
junto à membrana.

A solução 3, denominada de solução de precipitação, é formada por acetato

de potássio, ácido acético glacial e água. O acetato de potássio em solução
tem seus íons dissociados, sendo que seus cátions (íons potássio) se ligam ao
SDS associado a membrana formando um sal insolúvel, provendo então a
precipitação de DNA genômico, já que este se encontra associado a
membrana. O ácido acético glacial tem como função de trazer o pH à faixa do
neutro, pois este se encontrava básico pela adição de NaOH. Ao neutralizar o
meio, ocorre renaturação de DNA plasmidial em solução. A solução turva
formada é levada ao banho de gelo, isto é, a baixa temperatura para aumentar
a insolubilidade do sal formado.

Desta maneira, após a centrifugação, o sobrenadante formado só terá DNA

plasmidial, que será transferido para outro eppendorf para a continuidade da
extração. Vale ressaltar que a partir desta parte, o procedimento de extração
de DNA plasmidial utiliza os mesmos reagentes da extração de DNA genômico.

O fenol é usado também, assim como na extração de DNA genômico, para

criação de duas fases, sendo a fase superior aquosa formada por água e DNA
plasmidial e a inferior pelo fenol.

12
 Nesta parte, não utilizou-se NaCl, pois já tinha excesso de sal na amostra
pela adição anterior de acetato de potássio. Assim, apenas o Isopropanol foi
adicionado para a precipitação do DNA plasmidial, através da quebra das
pontes de hidrogênio entre este e a água. Os íons potássio também
promoveram a precipitação deste DNA, através da ligação com seu
grupamento fosfato.

O etanol 70% utilizado nesta prática possui as mesmas utilidades que na

prática anterior que é a de precipitar o DNA, a partir da retirada das moléculas
da camada de solvatação do DNA e de promover a retirada de sal na amostra,
fazendo com que esta se torne mais pura.

A etapa de adicionar RNase DNase free não foi feita, porque caso fosse
adicionada ocorria a retirada de RNA da solução, e assim não poderíamos
comparar sua velocidade de corrida com a do DNA.

A terceira e última prática realizada foi a de extração de DNA plasmidial pelo

método do “boiling” que assim como a extração de DNA plasmidial pelo método
de lise alcalina, tem como objetivo a extração de DNA plasmidial através da
perda de DNA genômico. Porém esta última prática de extração de DNA
plasmidial tem a vantagem de ser mais rápida e a desvantagem de ter uma pior
rentabilidade de DNA plasmidial na amostra.

A solução de ressuspensão STET é formada por Tris-Cl, EDTA, NaCl e

Triton X-100. O Tris e o EDTA são adicionados nesta solução pelas mesmas
funções descritas nas extrações anteriores, que são respectivamente, manter o
pH do meio e quelar os cátions bivalentes, como o Mg+2. O NaCl, por ser
adicionado em uma baixa concentração, promove o efeito denominado de
salting-in nas proteínas presentes no meio, isto significa que o sal aumenta a
solubilidade destas proteínas, a partir de uma maior interação entre suas
cadeias e a solução salina, impedindo, então, a precipitação das proteínas
juntamente com o DNA genômico, ao qual é precipitado pela ligação de íons
sódio ao grupamento fosfato. E o Triton X-100 é um detergente não iônico que
tem como objetivo promover a lise da membrana da bactéria, assim como o
SDS utilizado nas práticas anteriores. Porém este detergente é mais fraco que
o SDS.

A lisozima é uma enzima que degrada a parede celular bacteriana

hidrolisando as ligações glicosídicas β (1→4) presentes nesta parede,
liberando então os componentes citoplasmáticos desta bactéria. O
aquecimento feito posteriormente tem como objetivo intensificar a ação desta
enzima, este aquecimento também, é justificativa para uma obtenção menor
da amostra de DNA plasmidial, porque este método é muito prejudicial ao DNA,
já que existe uma grande diferença de temperatura promovida pela lisozima
(incubada no gelo) e ao aquecimento à 100°C.

13
 O fenol adicionado possui a mesma função vista anteriormente: de formar
um ambiente bifásico, onde a parte superior é formada por DNA plasmidial e a
inferior por fenol e por proteínas que interagem hidrofobicamente com o fenol.

O Clorofórmio possui a mesma função, lavar o resto do fenol em solução. A

adição do NaCl e do Isopropanol também desempenham o mesmo papel já
explicado anteriomente, assim como a do etanol 70%, que é o responsável
pela “limpeza” de prováveis resíduos na amostra de DNA plasmidial.

Ao final de todos os procedimentos de extração de DNA, seja este genômico

ou plasmidial, foi adicionado à amostra para a eletroforese, um tampão de
amostra composto de azul de bromofenol e glicerol, o primeiro é um corante e
permite a visualização do andamento da corrida eletroforética, indicando
quando o processo termina, e o segundo traz densidade à amostra, tornando-a
mais densa que o tampão de corrida e permitindo então, sua entrada nos slots
produzidos no gel. Além do tampão de amostra, foi adicionado o gel Red, um
corante que cora o DNA e o RNA e funciona como agente intercalante,
permitindo que este corante forme ligações de van der Walls com os pares de
bases do DNA.

O TAE, o tampão de corrida, tem como composição: Tris, EDTA e acetato. O

Tris tem o objetivo de regular o pH do meio,os íons acetato promovem a
passagem de corrente elétrica e o EDTA quela os cátions bivalentes.

Na visualização da corrida eletroforética de extração do DNA genômico, este

DNA corresponde à banda mais próxima ao slot, pois possui um maior peso
molecular demorando então, mais tempo para correr do pólo negativo para o
pólo positivo. A corrida ocorre desta forma devido à carga negativa gerada pelo
grupamento fosfato do DNA, que será então, atraído para o pólo positivo, na
cuba de eletroforese.

Também foi possível detectar outras bandas, sendo as mais próximas ao

slots, bandas com conformação mais relaxada e nas bandas centrais, uma
conformação de “super enovelamento”, ou DNA “supercoiled”. O DNA
“supercoiled” por estar mais compactado acaba correndo de forma mais rápida
pelo gel.

Nas bandas finais da corrida eletroforética, encontra-se o RNA, pois como

não houve adição de RNases, ele também participou da corrida. Estas bandas
se encontram no final, pois as moléculas de RNA são capazes de migrarem de
forma mais rápida por serem fitas mais simples e mais leves que as de DNA.

Na eletroforese da extração de DNA plasmidial, não foi possível ver a banda

de DNA genômico, mas foi possível a visualização de duas bandas distintas
mais próximas ao slot, principalmente na corrida do método “boiling”. As
bandas visualizadas são: a forma circular do DNA plasmidial e a conformação

14
"supercoiled”, a forma super enovelada deste plasmídeo circular. A forma linear
não é observada, pois o DNA não está clivado, devido a ausência de DNases.
Como na corrida anterior, no final, também foi possível observar bandas longas
contendo RNA, já que não havia RNases presentes em solução.

Em alguns grupos foi possível a visualização de algumas manchas acima do

DNA plasmidial circular, o que poderia significar a presença do DNA plasmidial
concatenado.

A uniformidade da corrida eletroforética na extração de DNA plasmidial pelo

método de lise alcalina resultou-se pela diminuição da voltagem, fazendo com
que a corrida ocorresse de forma mais lenta comparada às outras, permitindo
que as moléculas de DNA fossem melhor separadas.

7. Bibliografia

ALBERTS; JOHNSON; LEWIS; RAFF; ROBERTS; WALTER. Biologia

Molecular da Célula. 5.ed. Porto Alegre: Artmed, 2010.

15