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Odontologia 200
Odontologia 200
Centro Biomédico
Faculdade de Odontologia
Rio de Janeiro
2010
Bruno Rescala Conde de Medeiros
Rio de Janeiro
2010
Bruno Rescala Conde de Medeiros
Banca Examinadora:
_____________________________________________
Prof. Jonas Capelli Júnior
Faculdade de Odontologia da UERJ
_____________________________________________
Prof. Milton Uzeda
Departamento de Microbiologia Médica da UFRJ
_____________________________________________
Prof. Raphael Hirata Júnior
Faculdade de Ciências Médicas da UERJ
_____________________________________________
Prof. Ricardo Guimarães Fischer
Faculdade de Odontologia da UERJ
_____________________________________________
Prof. Ricardo Palmier Teles
Forsyth Institute
Rio de Janeiro
2010
DEDICATÓRIA
Aos meus pais Marilena e Livieto, pelo apoio incondicional que sempre me deram em
tudo na minha vida. Ao meu avô João (in memorium), minha avó Helena, minhas irmãs Luana
e Mariana, minha madrinha Marilena e minha tia Eliana, pelo carinho e incentivo.
À minha esposa Cris, pelo amor, incentivo, compreensão e ajuda constante durante
durante a elaboração deste trabalho, mas especialmente pelo incentivo, confiança e a amizade,
Aos meus amigos Fabiano, Fred, João Luís, Ida e Mazinho, pelo incentivo e
A todos os amigos da UERJ pela amizade compartilhada durante estes últimos anos.
RESUMO
RESCALA, Bruno. Perfil imunológico e microbiológico de pacientes com periodontites
crônica e agressiva. 2010. 47f. Tese (Doutorado em Odontologia) - Faculdade de
Odontologia, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2010.
O objetivo deste estudo foi determinar os níveis de interleucina-1β (IL-1 ), IL-2, IL-
4, IL-8, interferon-γ (IFN-) e a atividade de elastase no fluido gengival (FG) de pacientes
com periodontite crônica generalizada (PCG) e periodontite agressiva generalizada (PAgG), e
correlacionar com indivíduos de um grupo controle com gengivite apenas. Um objetivo
secundário foi analisar o perfil microbiológico subgengival destes indivíduos. Dados clínicos
transversais foram obtidos de 20 pacientes com PCG, 17 pacientes com PAgG e 10 indivíduos
com gengivite. Amostras de FG foram coletadas com tiras de papel e os níveis de: IL-1, IL-
2, IL-4, IL-8 e IFN- foram medidos, utilizando um imunoensaio do tipo multiplex
(Luminex). Atividade da elastase foi avaliada por um ensaio enzimático. Amostras de placa
subgengival foram analisadas através do checkerboard DNA-DNA hybridization. As
diferenças de significância entre os grupos para dados imunológicos e microbiológicos foram
realizadas utilizando o teste Kruskal-Wallis, ajustando para múltiplas comparações. As
médias dos parâmetros clínicos e os volumes de FG foram maiores nos pacientes com PCG e
PAgG comparados ao grupo gengivite. Níveis mais elevados de IL-1β e atividade de elastase
foram encontrados em sítios profundos quando comparado a sítios rasos em ambos os grupos
com periodontite (p <0,05). Os dados microbiológicos apresentaram níveis significativamente
mais elevados das espécies do complexo vermelho em pacientes com PCG e PAgG, quando
comparados aos indivíduos com gengivite (p <0,05). Não houve diferença estatisticamente
significante nos níveis de biomarcadores no FG e nos níveis de espécies bacterianas
subgengivais entre pacientes com PCG e pacientes com PAgG. Sendo assim, concluímos que
os dados do presente estudo não mostraram diferença estatisticamente significante nos
parâmetros imunológicos e microbiológicos medidos entre indivíduos com PCG e PAgG.
The goal of this study was to determine the gingival crevicular fluid (GCF) levels of
interleukin-1β (IL-1), IL-2, IL-4, IL-8 and interferon-γ (IFN-) and elastase activity from
patients with generalized chronic (GCP) and generalized aggressive periodontitis (GAgP) and
to compare with a control group with gingivitis subjects. A secondary aim was to analyze the
microbiological profile of these subjects. Cross-sectional clinical data were obtained from 20
GCP, 17 GAgP and 10 gingivitis subjects. GCF samples were collected with paper strips and
the levels of: IL-1, IL-2, IL-4, IL-8, and IFN- measured using a multiplexed bead
immunoassay (Luminex). Elastase activity was assessed by an enzymatic assay. Subgingival
plaque samples were analyzed using checkerboard DNA-DNA hybridization. Significance of
differences among groups for immunological and microbiological data was examined using
Kruskal-Wallis adjusting for multiple comparisons. Mean clinical parameters and GCF
volumes were higher in GCP and GAgP patients compared to controls. Higher levels of IL-1β
and higher elastase activity were found in deep sites compared to shallow sites in both
periodontitis groups (p<0.05). The microbiological data showed significantly higher levels of
the Red complex species in GCP and GAgP patients compared to controls (p<0.05). There
were no statistically significant differences in levels of GCF biomarkers and in levels of
subgingival bacterial species between GCP and GAgP subjects. In conclusion, there were no
statistically significant differences in the measured immunological and microbiological
parameters between GCP and GAgP subjects.
Abs - Absorbância
et al – e outros
FG – Fluido gengival
G – Gengivite
IG – Índice Gengival
INF-γ - Interferonγ
IL-2 – Interleucina 2
IL-4 – Interleucina 4
IL-8 – Interleucina-8
ml - Mililitro
mm – Milímetros
mM – Milimolar
ng – Nanograma
pg – Picograma
sr – Sítio raso
SS – Sangramento à sondagem
µl - Microlitro
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 13
1 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................ 15
1.1 Periodontite crônica e agressiva segundo a classificação da AAP de 1999....... 15
1.2 Fluido gengival como ferramenta de diagnóstico ............................................... 16
1.3 Achados imunológicos nas periodontites crônica e agressiva .......................... 17
1.4 Achados microbiológicos nas periodontites crônica e agressiva ...................... 20
2 PROPOSIÇÃO ...................................................................................................... 23
3 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................. 24
3.1 Seleção de pacientes e exame clínico .................................................................... 24
3.2 Coleta de fluido gengival ....................................................................................... 25
3.2.1 Quantificação dos mediadores pelo método Luminex ............................................ 25
3.2.2 Atividade de elastase ............................................................................................... 26
3.3 Coleta Microbiológica ........................................................................................... 27
3.3.1 Técnica de hibridização Checkerboard DNA-DNA ................................................ 27
3.4 Análise estatística .................................................................................................. 29
4 RESULTADOS....................................................................................................... 30
4.1 Parâmetros clínicos................................................................................................ 30
4.2 Resultados Imunológicos....................................................................................... 32
4.3 Resultados Microbiológicos................................................................................... 33
5 DISCUSSÃO........................................................................................................... 35
6 CONCLUSÕES...................................................................................................... 39
REFERÊNCIAS..................................................................................................... 40
ANEXO - Comitê de ética em pesquisa................................................................... 47
APÊNDICE A – Artigo submetido para o Journal of Periodontology -
Immunological and microbiological profiles of chronic and aggressive
periodontitis subjects................................................................................................ 48
13
INTRODUÇÃO
1 REVISÃO DA LITERATURA
destruição tecidual observada nestas duas condições clínicas (CHAMPAGNE et al., 2003;
MENG et al., 2007).
2 PROPOSIÇÃO
O objetivo do presente estudo foi comparar os níveis de IL-1 , IL-2, IL-4, IL-8, IFN-
e a atividade elastase no FG entre indivíduos com PCG e PAgG, e relacionar seus níveis com
indivíduos de um grupo controle com gengivite apenas. Um objetivo secundário, foi analisar o
perfil microbiológico subgengival destes indivíduos.
24
3 MATERIAIS E MÉTODOS
Nos grupos PCG e PAgG foram coletados 5 sítios profundos inflamados com PBS ≥ 5
mm e 5 sítios rasos inflamados com PBS ≤ 3 mm. No grupo gengivite, foram coletados 5
sítios rasos inflamados (gengivite) sendo PBS ≤ 3 mm. Sítios inflamados foram definidos
como sítios apresentando sinais clínicos de vermelhidão, inchaço e/ou sangramento à
sondagem.
As amostras foram agrupadas juntas (pool) por cada categoria de sítio em cada
paciente. Assim, o número final de amostras foi: 20 amostras para sítios rasos e 20 amostras
para sítios profundos no grupo PCG, 17 amostras para sítios rasos e 17 amostras para sítios
profundos no grupo PAgG e 10 amostra para sítios com gengivite no grupo gengivite.
Os sítios coletados foram isolados com rolos de algodão, secos com ar e a placa
supragengival foi cuidadosamente removida. Uma tira de papel absorvente padrão
(Periopaper, IDE Interstate, Amityville, NY) foi introduzida no sulco ou bolsa periodontal, até
certa resistência ser sentida e foi deixada em posição por 30 segundos. O volume do FG foi
imediatamente determinado através da utilização do medidor de FG previamente calibrado
(Periotron 8000, IDE Interstate, Amityville, NY). Para cada indivíduo, as tiras de cada
categoria de sítio foram agrupados em tubos Eppendorf contendo 0,5 ml de solução salina
tampão fosfato (PBS). Após eluição por 30 minutos em temperatura ambiente, as tiras foram
removidas e as amostras foram centrifugadas a 3000 g por 5 minutos. O sobrenadante foi
coletado e congelado a -20 ° C até análise.
O perfil microbiológico subgengival para cada indivíduo foi defenido como uma
amostra representativa da boca coletada da face mesial de cada dente de dois quadrantes
selecionados aleatoriamente. As amostras foram removidas de todos os indivíduos em todos
os três grupos clínicos. Depósitos de biofilme supragengival foram removidos previamente
com gaze estéril e as amostras de biofilme subgengival coletadas com curetas Gracey estéreis.
Para cada amostra, era utilizada uma extremidade estéril da cureta.
testadas com uma mistura controle contendo as espécies investigadas, em uma concentração
de 104 células bacterianas e tiveram sua concentração ajustada de tal modo que as
intensidades dos sinais de todas as sondas fossem semelhantes. Cada canaleta do “Miniblotter
45” foi preenchida com 130 l de uma determinada sonda, contida em uma solução de
hibridização (45% formamida, 5 X SSC, 1 X reagente de Denhardt, 20 mM de fosfato de
sódio (pH 6.5), 0,2 mg/ml de RNA de levedura, 10% de sulfato de dextrano, 1% caseína e 20
ng/ml de DNA). As sondas foram hibridizadas perpendicularmente às linhas contendo o DNA
bacteriano, propiciando um formato de xadrez com as linhas de DNA horizontais e as sondas
verticais. O aparato contendo as membranas foi colocado dentro de um saco plástico para
evitar sua desidratação. A hibridização das membranas com as sondas ocorreram a 42 oC,
durante 20 horas. As 40 cepas utilizadas para a confecção de sondas e padrões foram obtidas
da American Type Culture Collection (ATCC) e do Forsyth Institute (Boston, MA, USA).
Após hibridização com as sondas, as membranas foram removidas do “Miniblotter” e
lavadas por 5 minutos em temperatura ambiente, seguido de duas lavagens de 20 minutos
cada a 65oC em uma solução adstringente (0,1 X SSC, 0,1% SDS), a fim de remover sondas
que não hibridizaram completamente. Em seguida, as membranas foram imersas por 1 hora
em uma solução contendo 0,1M de ácido maleico, 3 M NaCl, 0,2 M NaOH, 0,3% Tween 20,
0,5% caseína, pH 8,0 e 30 minutos na mesma solução contendo o anticorpo anti-digoxigenina
conjugado à fosfatase alcalina (Boehringer Mannheim), em uma diluição de 1/25000. As
membranas foram, então, lavadas com uma solução de 0,1 M ácido maleico, 3 M NaCl, 0,2
M NaOH, 0,3% Tween 20, pH 8,0; 4 vezes por 10 minutos e uma vez por 5 minutos em 0,1 M
Tris HCl, 0,1 NaCl, 50 mM MgCl2, pH 9,5. Após as lavagens, as membranas foram incubadas
em uma solução contendo uma substância fluorescente (Atto – Phos) para futura leitura e
quantificação da reação em um scanner (Imagequant/Storm 840, USA). Os sinais
fluorescentes cpturados pelo “Storm” foram convertidos a contagens (níveis x 105) por
comparação com os valores dos padrões, usando regressão linear.
29
Os dados clínicos foram obtidos a partir de 6 sítios por dente para PBS, NIC e SS. Os
parâmetros clínicos médios foram determinados pela média de todos os sítios, de todos os
dentes, em cada indivíduo e depois comparados entre os indivíduos de cada grupo clínico
separadamente.
Os parâmetros clínicos médios para cada categoria de sítio foram calculados pela
média dos valores dos sítios coletados de cada indivíduo e, depois, comparados entre
indivíduos em cada categoria de sítio para cada grupo clínico separadamente.
Os níveis de cada mediador inflamatório foram medidos em amostras coletadas em
cada categoria de sítio a partir de cada indivíduo. O nível médio de cada biomarcador no FG
foi calculado pela média entre os indivíduos em cada categoria de sítio em cada grupo clínico
separadamente.
Os dados microbiológicos disponíveis foram as contagens de cada uma das 40
espécies testadas para até 14 amostras de placa subgengival por indivíduo. Os dados de cada
espécie foram expressos em contagens x 10 5 em cada sítio. Os dados microbiológicos foram
analisados como uma média, dentro de cada indivíduo e, depois, esta média comparada entre
indivíduos em cada grupo clínico separadamente.
A significância das diferenças entre os grupos foi calculada através do teste ANOVA
para os dados clínicos e o teste Kruskal-Wallis para dados imunológicos e microbiológicos.
Para os dados de FG e microbiológicos, o nível α foi ajustado para múltiplas comparações
usando a correção de Bonferroni para obter uma taxa final de erro tipo 1 de 5%
(SOCRANSKY et al., 1991). A diferença significativa entre os grupos para a porcentagem de
homens e percentual de fumantes foi testada pelo teste exato de Fisher. Para todos os tipos de
dados, diferenças de significância post-hoc entre pares de comparações foram determinadas
usando o procedimento da menor diferença significativa de Fisher (LSD – least significant
difference). Devido às diferenças de idade e no percentual de fumantes entre os grupos,
parâmetros clínicos médios, níveis dos biomarcadores no FG e a média dos dados
microbiológicos foram posteriormente analisados usando o teste não-paramétrico ANCOVA
ajustando para a idade e para o fumo. O procedimento LSD de Fisher foi repetido para os
valores ajustados por ANCOVA.
O nível de significância deste estudo foi considerado como 5% (p < 0,05).
30
4 RESULTADOS
Tabela1 – Valores médios (± DP) para parâmetros clínicos e demográficos nos indivíduos dos
grupos gengivite (G), periodontite crônica generalizada (PCG) e periodontite agressiva
generalizada (PAgG).
A Tabela 3 apresenta os valores médios (± DP) para PBS (mm), NIC (mm), SS
(porcentagem) e volume FG (μl) para cada categoria de sítio, enquanto a Tabela 4 mostra a
análise post-hoc correspondente. Os sítios profundos dos indivíduos com periodontite
apresentaram valores estatisticamente superiores para todos os parâmetros clínicos, quando
comparados aos sítios com gengivite dos indivíduos com gengivite. Os sítios rasos do grupo
com periodontite tiveram uma maior porcentagem de SS e volume de FG comparado aos
sítios com gengivite. Para o grupo PAgG, sítios rasos também apresentaram maiores valores
de PBS comparados aos sítios com gengivite. Quando os grupos PCG e PAgG foram
comparados, a única diferença estatística significante encontrada foi no volume de FG dos
sítios profundos. Esta diferença tornou-se sem significância depois do ajuste para a idade e
para o fumo.
Tabela 3 – Valores médios (± DP) para: profundidade de bolsa à sondagem (PBS), nível de
inserção clínico (NIC), porcentagem de sítios com sangramento à sondagem (SS) e volume
de fluido gengival (FG) para os sítios coletados, nas diferentes categorias de sítios. Os dados
foram comparados usando ANOVA e ANCOVA, ajustando para diferenças na idade e para o
fumo entre os grupos.
Quando sítios rasos e profundos foram comparados dentro de cada grupo com
periodontite, os sítios profundos apresentaram níveis estatisticamente superiores no FG de IL-
1, IL-2 e atividade de elastase, em comparação aos sítios rasos do grupo PAgG e para
elastase e IL-1β no grupo PCG. Quando os valores para os sítios rasos e profundos foram
comparados entre os indivíduos dos grupos PCG e PAgG, o grupo PAgG tinha níveis
significativamente maiores de IL- 1 nos sítios profundos. No entanto, quando os dois grupos
foram comparados usando ANCOVA ajustado para idade e fumo, as médias ajustadas não
apresentaram diferença estatisticamente significante.
33
comparado com o grupo PAgG, não houve diferença estatisticamente significativa para os
níveis de qualquer espécie. Três amostras de indivíduos com PAgG não puderam ser
analisadas por terem sido comprometidas durante o envio para o Instituto Forsyth em Boston.
Figura 1 - Contagens médias (x 105) das 40 espécies testadas de até 14 amostras de biofilme
subgengival de 10 pacientes com gengivite, 20 com periodontite crônica generalizada (PCG) e
14 com periodontite agressiva generalizada (PAgG). Contagens médias de cada espécie foram
calculados pela média dos dados de cada indivíduo, e em seguida, foi realizado uma média
entre indivíduos em cada grupo clínico separadamente. Significância das diferenças de cada
espécie entre os grupos clínicos foram realizados pelo teste de Kruskal-Wallis e ajustado para
40 comparações (SOCRANSKY et al., 1991): * p <0,05, ** p <0,01 e *** p <0,001. As
espécies foram ordenados e agrupados de acordo com os complexos descritos por Socransky et
al. 1998 (SOCRANSKY et al., 1998)
5 DISCUSSÃO
35
MOMBELLI, 2003). No entanto, os nossos achados não demonstraram esta relação, os níveis
de IL-8 apresentaram pouca variação entre os grupos e as categorias de sítios. No trabalho de
Jin et al (2000) os níveis totais de IL-8 também não apresentaram diferença significativas
entre as categorias de sítio no grupo periodontite.
Atividade da elastase foi maior em sítios rasos de pacientes com PAgG, quando
comparados aos sítios rasos dos indivíduos com gengivite. Houve também diferenças
estatisticamente significativas entre os sítios rasos e profundos em ambos os grupos de
periodontite, sugerindo um aumento na atividade de elastase associados com a severidade da
doença. Estudos anteriores do nosso grupo também mostraram níveis mais elevados de
elastase livre em pacientes com periodontite sem tratamento, quando comparados a indivíduos
controles com gengivite (FIGUEREDO; FISCHER; GUSTAFSSON, 2005). Foi visto que
neutrófilos periféricos de pacientes com periodontite crônica e agressiva encontraravam-se
hiper-responsivos após estimulação in vitro quando comparados a controles saudáveis
(FREDRIKSSON et al., 2003). Estes níveis aumentados de atividade elastase poderiam ser
explicados pelas diferenças na ativação local de neutrófilos por outros mediadores
inflamatórios, diferenças na quantidade e qualidade do biofilme adjacente ou a uma hiper-
reatividade dos neutrófilos, por si só.
Também encontramos níveis significativamente maiores de IL-2 em sítios profundos
quando comparados a sítios rasos dos indivíduos do grupo PAgG. Estes resultados estão de
acordo com estudos anteriores que mostraram níveis elevados deste mediador no FG em sítios
periodontais ativos e na "dentição terminal” de pacientes com periodontite (LEE et al., 1995;
SALVI et al., 1998). No entanto, uma limitação do presente estudo foi a baixa freqüência de
detecção deste mediador pró-inflamatório nas amostras de FG (57%), especialmente em sítios
rasos. Quantidades significativamentes maiores de IL-4 em sítios rasos de indivíduos do
grupo gengivite em comparação com os sítios rasos de ambos os grupos com periodontite
estão de acordo com dados relatados por outros autores em estudos anteriores (TSAI et al.,
2007; BASTOS et al., 2009). Giannopoulou et al.(2003) relataram uma relação inversa entre
níveis de IL-4 no FG e a condição periodontal; níveis de IL-4 estavam mais elevados no
grupo periodontalmente saudável, quando comparado ao grupo com periodontite. Salvi et al.
(1998) mostraram que baixos níveis de IL-4 no FG estavam associados com uma maior
deterioração periodontal em indivíduos com periodontite agressiva avançada. Estes dados
estão de acordo com o papel bem estabelecido de IL-4 como um potente regulador da função
dos macrófagos e inibidor da secreção de algumas citocinas pró-inflamatórias (TE VELDE et
al., 1990). Além disso, a IL-4 tem mostrado induzir a produção e secreção de colágeno
37
Os dados do presente estudo devem ser interpretados com cautela, uma vez que
envolveu uma amostra relativamente pequena e houve diferença estatisticamente significante
na idade e no fumo entre os 3 grupos clínicos, que tentamos compensar usando o teste
ANCOVA. A distinção clínica entre o PCG e PAgG também foi difícil em algumas situações.
Nós usamos as diretrizes estabelecidas pelo AAP (ARMITAGE, 1999), no entanto, já que não
há meios práticos de definir a taxa de perda de inserção, a idade foi utilizada como parâmetro
para ajudar no diagnóstico da periodontite agressiva. O desenho transversal do estudo também
dificulta a interpretação dos dados, visto que as diferenças imunológicas e microbiológicas
entre estas duas infecções periodontais podem ser de natureza temporal. Além disso, também
é possível que as diferenças nos mecanismos patológicos entre as duas condições periodontais
envolvendo mediadores imunológicos e espécies subgengivais não tenham sido medidas no
presente estudo.
6 CONCLUSÕES
39
REFERÊNCIAS
40
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ANEXO A
47
APÊNDICE A
48
Number of figures: 1
Number of tables: 6
microbiota.
Running title: Micro and imuno profiles of chronic and aggressive periodontitis.
Correspondance to:
Av. 28 de setembro, 157, Vila Isabel, Rio de Janeiro, RJ, Brasil, ZIP code: 20551-030
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