UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS

CENTRO DE TECNOLOGIA - CTEC

ENGENHARIA QUÍMICA

Marília Inês Oliveira Belo

PREPARO E ESTERELIZAÇÃO DE MATERIAL, TÉCNICAS DE SEMEADURA E

ISOLAMENTO, CONTAGEM, CLASSIFICAÇÃO MORFOLÓGICA DE
MICRORGANISMOS E TESTES DE IDENTIFICAÇÃO MICROBIANA

Maceió – AL

2018

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 MARÍLIA INÊS OLIVEIRA BELO

PREPARO E ESTERELIZAÇÃO DE MATERIAL, TÉCNICAS DE SEMEADURA E

ISOLAMENTO, CONTAGEM, CLASSIFICAÇÃO MORFOLÓGICA DE
MICRORGANISMOS E TESTES DE IDENTIFICAÇÃO MICROBIANA

Relatório apresentado à disciplina

Laboratório de Engenharia Química II, do
curso de Engenharia Química da
Universidade Federal de Alagoas, como
requisito avaliativo para a mesma.

Orientador: Professor Dr. Jorge José de

Brito Silva

Maceió – AL

2018

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 RESUMO

A microbiologia é responsável pelo estudo de seres vivos microscópicos, seu

desenvolvimento e metabolismo, além de aplicações que venham a ter em diversas
áreas, como na indústria. Para que possam ser estudados apropriadamente, culturas
desses microrganismos precisam ser constantemente feitas em laboratório, além de
testes diversos para determinação de suas características. Este relatório descreve as
atividades de semeadura de culturas de microrganismos desconhecidos obtidos por
esfregaço sobre materiais diversos e os resultados dos testes microbiológicos
realizados.

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 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 5
2. OBJETIVOS ................................................................................................................................. 7
3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................................ 7
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ........................................................................................... 13
5. CONCLUSÕES .......................................................................................................................... 18
REFERÊNCIAS ............................................................................................................................... 19

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1. INTRODUÇÃO

A microbiologia é o ramo das ciências biológicas responsável pelo estudo,

caracterização dos microrganismos – como bactérias, fungos, protozoários e vírus –
e suas aplicações em diversas áreas. Benéficos ou não, podem ser encontrados em
qualquer lugar, vivendo sob as mais variadas condições, muitas das quais outros
seres vivos dificilmente conseguiriam sobreviver. Os microrganismos podem ser
agentes causadores de doenças, reguladores de funções vitais, responsáveis por
processos químicos de grande importância industrial e desempenhar outras tantas
atividades, sendo, por isso, tão valioso esse ramo da ciência (MADIGAN et al, 2016).

Um importante passo para a análise de microrganismos em laboratório é

conseguir desenvolver condições artificiais nas quais o seu crescimento seja possível.
Isto pode ser feito através do processo de semeadura em meios de cultura. De acordo
com TORTORA (2012), meio de cultura é o material nutriente preparado para permitir
o crescimento de microrganismos, o qual deve conter os nutrientes adequados,
quantidade suficiente de água, pH apropriado e nível conveniente de oxigênio. Além
disso, o meio deve ser estéril, ou seja, a princípio não pode conter qualquer
microrganismo vivo, garantindo que apenas aqueles que foram introduzidos
intencionalmente cresçam.

Figura 1: diferentes meios de cultura (sólidos, líquidos, em placas, tubos ou erlenmeyers).

Fonte: BORZANI et al, 2001.

Portanto, para o cultivo de um microrganismo que se deseja analisar, é

necessário recorrer a um meio de cultura estéril e adicionar a ele uma pequena
quantidade de material que contenha células vivas do microrganismo de estudo,

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chamando esse material de inóculo e, ao ato de transferi-lo ao meio de cultura,
inoculação. Neste ponto, é importante o uso de técnicas de assepsia, impedindo a
contaminação de instrumentos e meios de cultura durante o seu manuseio.

Também deve ser usada a técnica adequada para semeadura, de acordo com
o meio (sólido, líquido) (diferentes meios podem ser vistos na figura 1) e também do
inóculo. São várias: em estrias (figura 2), utilizada quando o inóculo na forma líquida
ou sólida contém diferentes microrganismos e deseja-se culturas bem separadas,
sendo o inóculo progressivamente espalhado; por espalhamento, para a contagem de
colônias a partir do espalhamento de um inóculo contido num pequeno volume sobre
a superfície de um meio de cultura sólido; pour-plate, uma técnica de semeadura por
derramamento na qual o inóculo é despejado em placa e, em seguida, derramado o
meio sólido estéril fundido, permitindo o crescimento do microrganismo em toda a
profundidade da placa; dentre outras técnicas. Feito isto, o meio é incubado por
determinado período, sob condições apropriadas de temperatura, oxigênio, etc. Nesta
etapa de incubação, ocorre a multiplicação do microrganismo, dando origem a uma
cultura (BORZANI et al, 2001).

Figura 2: inoculação por estriamento.

Fonte: TORTORA, FUNKE, CASE; 2012.

Com uma cultura devidamente incubada, pode-se proceder à análise dos

microrganismos, fazendo uso de diversos métodos de quantificação, como o de
diluição; contagem – quando as células são contadas em câmaras observadas ao
microscópio –; turbidimetria; contagem de microrganismos vivos; dentre tantos outros.
Além destes métodos de quantificação, microrganismos ainda podem ser identificados
por testes bioquímicos, como os de coloração de gram, que divide bactérias em dois
grupos (gram-positivas e gram-negativas) (BORZANI et al, 2001).

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2. OBJETIVOS

Preparar e esterilizar meios de cultura, utensílios e vidrarias para a cultivo de

culturas; observar o funcionamento da autoclave, embalagem dos materiais para
esterilização; empregar técnicas de cultivo e isolamento de microrganismos; observar,
quantificar e descrever as características das culturas visualizadas; conhecer provas
bioquímicas usadas na identificação de bactérias.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Materiais:
3.1.1. Preparo dos meios de cultura
• Balança, micro-ondas e autoclave;
• Becker, tubos de ensaio, placas de Petri, proveta e erlenmeyers;
• Espátulas e bastões de vidro;
• Papel alumínio, papel Kraft, barbante, algodão, gaze e caneta marcador de
texto;
• Substâncias necessárias para o preparo de meios Ágar Extrato de Levedura
(AYE), Ágar PCA (Plate Count Agar) e Ágar nutriente.

3.1.2. Semeadura e isolamento

• Alça de platina ou níquel-cromo e alça de Drigalski;
• Algodão, papel toalha, desinfetante e álcool 70%;
• Estufa bacteriológica, microondas, banho-maria, câmara de fluxo laminar e
maçarico;
• Meios de cultura preparados e esterilizados previamente;
• Pipetadores e ponteiras estéreis;
• Placas de Petri e tubos de ensaio contendo solução salina (NaCl 0,85%);
• Swaps e solução salina estéreis.

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 3.1.3. Contagem e classificação morfológica de microrganismos
• Alça de platina, pipeta Pasteur, lâminas e lamínulas;
• Álcool 70%, água destilada e solução salina (NaCl 0,85%);
• Maçarico;
• Microscópios ópticos e contador de colônias mecânico CP 602;
• Placas e tubos contendo material microbiano.

3.1.4. Testes bioquímicos de identificação microbiana

• Ágar com amido;
• Alça de platina, pipeta Pasteur, lâminas e lamínulas;
• Álcool 70%, água destilada e solução salina (NaCl 0,85%);
• Caldo de ureia;
• Maçarico;
• Meio citrato;
• Meio líquido de fermentação de açúcares;
• Meio SIM;
• Meio VM/VP;
• Microscópios ópticos e contador de colônias mecânico CP 602;
• Placas e tubos contendo material microbiano;
• Soluções de Gram.

3.2. Métodos:

3.2.1. Preparo dos meios de cultura

• Pesar as substâncias componentes dos meios de cultura num béquer (exceto
o ágar);
• Acrescentar a metade dos 100 mL de água destilada, medida com uma proveta;
• Dissolver os ingredientes em água, agitando continuamente com um bastão de
vidro, evitando a formação de espuma. Quando necessário, dissolver os
ingredientes do meio de cultura em forno de micro-ondas, até a ebulição,
agitando sempre, evitando o aquecimento desnecessário;

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• Quando preciso, adicionar ágar, vertendo a massa para o frasco com o meio
de cultura e levando-o até ebulição;
• Tampar os tubos com algodão ou tampão de algodão e gaze, protegendo-os
com papel de alumínio e papel kraft, bem como as placas e demais vidrarias
usadas, amarrando com barbante;
• Esterilizar em autoclave a 121°C (1 atmosfera de pressão) por 15 minutos.

3.2.2. Semeadura e isolamento

• Limpar a bancada com álcool 70%;
• Retirar os meios de cultura em banho-maria e colocar um pequeno volume nas
quatro placas de Petri, abrindo-as parcialmente e próximas da chama, de modo
a evitar qualquer contaminação;
• Realizar semeaduras de diferentes materiais com microrganismos por
espalhamento, estriamento e pour plate nos diferentes meios, utilizando alça
de platina quando necessário;
• Ao usar alça de platina: Aquecê-la até o rubor, esperar esfriar e usar para
transferência do material para as placas;
• Para a semeadura em placa por pour plate, semear a placa primeiro e, em
seguida, verter o meio de cultura líquido, aguardando a solidificação.

3.2.3. Contagem e classificação morfológica de microrganismos

• Colocar a placa de Petri sobre um contador mecânico CP 602, para a contagem
das colônias;
• Colocar a mesma placa num microscópio simples, para a identificação das
colônias;
• Sobre uma lâmina devidamente limpa e seca, colocar duas gotas de soro
fisiológico e reservá-la sobre um papel próximo ao maçarico;
• Flambar a alça de platina até o rubor e, depois de fria, transferir o material da
placa de Petri para a lâmina, dissolvendo-o bem no meio (soro fisiológico);
• Flambar até o rubor a alça de platina;
• Isolar o material com uma lamínula;
• Analisar detalhadamente o material em microscópio óptico.
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 3.2.4. Testes bioquímicos de identificação microbiana
• Preparo do esfregaço para análise de Gram:
o Suspender uma pequena porção da amostra bacteriana a ser corada em
uma gota de água ou solução salina 0,85%, sobre uma lâmina de
microscópio, espalhando a gota com uma alça bacteriológica flambada
ou um palito de madeira esterilizado;
o Deixar o material secar e, em seguida, fixá-lo com calor, flambando
rapidamente a lâmina na chama de um maçarico ou bico de Bunsen;
o A aplicação do corante primário é realizada cobrindo toda a sua
superfície da lâmina com o corante cristal violeta. Este corante em cima
da lâmina deve ficar em repouso por um minuto, sendo descartado o
excesso e enxaguando a lâmina com água;
o A aplicação do fixador é feita cobrindo toda a sua superfície da lâmina
com lugol, deixando em repouso por um minuto, descartando o excesso
do fixador e enxaguando a lâmina com água;
o A descoloração é realizada com a lâmina inclinada, despejando-se
algumas gotas de álcool-acetona 1:1 v:v (descolorizador) para remover
o complexo cristal violeta-lugol de células Gram-negativas. Este
procedimento não pode exceder a cinco segundos, pois o descolorizador
poderá remover o corante cristal violeta das células Gram-positivas. Em
seguida, enxaguar a lâmina com água para remover excesso de
solvente;
o O corante secundário é, então, aplicado, cobrindo-se toda a sua
superfície da lâmina com o corante safranina, deixando em repouso por
um minuto. Deixar secar;
o Examinar a amostra ao microscópio óptico. As bactérias Gram negativas
coram-se de vermelho (rosa) e as Gram positivas de violeta (roxo).
• Preparo do esfregaço para o teste do KOH:
o Com o auxílio de uma pipeta Pasteur, adicionar 2 gotas de uma solução
de KOH 3%;
o Com o auxílio de uma alça de platina, agregar a colônia em estudo
misturando-a com a solução de KOH na lâmina por 30 segundos;

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 o Durante a mistura, deve-se erguer a alça cerca de 1 a 2 cm da superfície
da lâmina, observando-se se há fios de material viscoso pendentes;
o Se a bactéria for verdadeiramente Gram negativa, o KOH irá romper sua
parede celular e liberar seu DNA, o que será observado como fios
viscosos, ou seja, a formação de fio;
o Se a bactéria for Gram positiva, não haverá formação de fios.
• Preparo do esfregaço para o teste da catalase:
o A prova da catalase serve para observar a capacidade que
determinados micro-organismos têm de desdobrar o peróxido de
hidrogênio em água e oxigênio livre (2 H2O2 2 H2O + O2);
o Colocar uma gota de peróxido de hidrogênio (água oxigenada) 3% sobre
uma lâmina;
o Com o auxílio de uma alça de platina, agregar a colônia em estudo na
gota de peróxido de hidrogênio;
o A presença imediata de bolhas, ou seja, a produção de efervescência,
indica a conversão do peróxido em água e oxigênio gasoso;
o O teste é negativo quando há ausência de bolhas ou efervescência. As
bactérias anaeróbias não produzem catalase.
• Inoculação para teste de hidrólise do amido: O material a ser analisado é
inoculado na placa por intermédio de uma alça estéril em pelo menos duas
estrias equidistantes para uma melhor visualização da leitura da prova. Então
a placa é incubada a 35°C por pelo menos 48 horas. Passado o período de
incubação, a superfície da placa é coberta com uma solução de iodo (pode-se
usar a mesma solução de Lugol utilizada para a coloração de gram, 3-4mL por
placa) para a revelação da prova.
• Inoculação para teste de utilização do citrato como única fonte de carbono: o
material a ser analisado é inoculado através de pequenas estrias na superfície
do ágar na placa ou no tubo invertido, utilizando-se uma alça de platina estéril.
O meio é então inoculado a 36° ± 1°C por 24 - 48 horas antes da leitura do
resultado. Deve-se observar que se o inóculo é abundante, os compostos
orgânicos pré-formados dentro das paredes celulares das bactérias, que
porventura morrerem durante o processo de incubação, poderão liberar

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 carbono e nitrogênio suficientes para produzir um resultado falso positivo,
falseando a prova.
• Inoculação para teste de degradação da ureia: Inocular o material a ser testado
no meio teste com o auxílio de uma agulha ou alça estéril. Incubá-lo a 35°C por
24 horas para posterior análise da mudança de cor.
• Teste VM/VP: Inocular o microrganismo a ser analisado em dois tubos de
ensaio contendo o meio de Clark Lubs por 24h a 35°C:
o Teste VM - Após o tempo de incubação da cultura, adicionar 0,2mL ou
5 gotas do indicador Vermelho de Metila pela parede do tubo (sem
agitar), que formará um anel acima da cultura. Positivo: coloração
vermelha. Negativo: coloração amarela ou acastanhada;
o Teste VP - Após a incubação da cultura, adicionar 0,6 mL de Barritt I (10
a 15 gotas) ao caldo. A seguir adicionar 0,2 mL de Barritt II (4 ou 5 gotas)
e agitar vigorosamente por aproximadamente 5 minutos. Depois de
decorrido pelo menos 15 minutos, verificar a coloração do caldo.
Positivo: coloração rósea, tijolo ou vermelha. Negativo: coloração
amarela ou acastanhada.
• Fermentações dos açúcares: Inocular 0,5 mL da cultura ou fermento nos tubos
contendo 3 mL do meio líquido de carboidrato a 2% com tubos de Durham
invertidos e observar em 48 horas a formação de gás no tubo de Durham ou
turvação do meio;
• Teste de produção de gás sulfídrico (H2S): Inocular o meio por punctura (com
uma agulha) e incuba-se em aerobiose por 24h a 35°C. O sulfeto de hidrogênio
produzido reage com o metal pesado do meio formando sulfetos que
apresentam coloração negra;
• Teste de motilidade: Inocular em linha reta, através da técnica da punctura
(com agulha), 2/3 do meio SIM. O microrganismo tem motilidade positiva
quando este se desloca do local da picada e turva o meio. Caso o
microrganismo só cresça no local da picada sem turvação do meio, este possui
motilidade negativa (imóvel).

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4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

O preparo dos meios de cultura Ágar Nutriente, Ágar Extrato de Levedura (AYE)
e Ágar PCA foi realizado, seguindo com a esterilização por autoclavagem para a
eliminação de possíveis contaminantes nos materiais e reagentes a serem utilizados,
devido à alta temperatura de operação e à pressão. A utilização de calor em ambiente
úmido provocou a destruição de microrganismos, resultando na desnaturação das
proteínas e na desestabilização da membrana citoplasmática.

Na etapa de semeadura dos meios, foram usadas cinco placas de Petri, com o
meio, a técnica de semeadura e a natureza do inóculo descritos na tabela 1:

Tabela 1: Descrição das culturas.

Identificação da Técnica de
Meio de cultura Material semeado
placa de Petri semeadura
1 AYE Pour plate Água
2 AYE Pour plate Cenoura
3 AYE Espalhamento Óculos
4 Ágar Nutriente Estriamento Cenoura
Moeda, cabelo,
5 PCA Estriamento
saliva, digital
Fonte: autor, 2018.

Para a contagem e classificação morfológica do microrganismo, foram

utilizadas as placas 1 a 4, observadas em contador de colônias mecânico, microscópio
simples e óptico. As figuras 3 a 6 mostram as imagens obtidas dessas observações,
para as placas 1 a 4, respectivamente. Na tabela 2, por sua vez, estão dispostas as
considerações sobre contagem e formato das colônias.

Tabela 2: Contagem e morfologia das culturas.

Identificação da
Contagem Formato
placa de Petri
1 79 colônias Circular de borda ondulada
2 141 colônias Circular de borda lobada

13
3 Não foi possível
Filamentoso
contar
4 35 colônias Circular de borda lobada
Fonte: autor, 2018.

Figura 3: Placa de Petri 1 (Água em AYE).

(a) Visualização no contador (b) Visualização no microscópio simples

(c) Visualização no microscópio óptico

Fonte: autor, 2018.

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 Figura 4: Placa de Petri 2 (Cenoura em AYE).

(a) Visualização no contador (b) Visualização no microscópio simples

(c) Visualização no microscópio óptico

Fonte: autor, 2018.

Figura 5: Placa de Petri 3 (Óculos em AYE).

(a) Visualização no contador (b) Visualização no microscópio simples

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 (c) Visualização no microscópio óptico

Fonte: autor, 2018.

Figura 6: Placa de Petri 4 (Cenoura em Ágar Nutriente).

(a) Visualização no contador (b) Visualização no microscópio simples

(c) Visualização no microscópio óptico

Fonte: autor, 2018.

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 Em relação aos testes, as tabelas 3 e 4 resumem seus resultados para KOH,
catalase, coloração de Gram, hidrólise do amido, citrato, ureia, VM/VP, nitrato, gás
sulfídrico e motilidade, sendo estes dois últimos feitos pelo teste SIM.

Tabela 3: Resultados dos testes de KOH, catalase e Gram.

Identificação da
KOH Catalase Gram
placa de Petri
1 Positivo Positivo Negativo
2 Negativo Positivo Negativo
3 Negativo Positivo Negativo
4 Negativo Positivo Negativo
Fonte: autor, 2018.

Tabela 4: Resultados dos testes de hidrólise do amido, citrato, ureia, VM, VP, gás sulfídrico e
motilidade.
Identificação
Gás
da placa de Amido Citrato Ureia VM VP Motilidade
sulfídrico
Petri
1 Pos. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg.
2 Pos. Pos. Pos. Pos. Neg. Neg. Neg.
3 Pos. Neg. Pos. Pos. Neg. Neg. Neg.
4 Pos. Pos. Pos. Neg. Pos. Pos. Pos.
Fonte: autor, 2018.

Em relação aos resultados do teste de KOH, quando confrontados com o teste

colorimétrico de Gram, indicam uma inconsistência, já que, quando o primeiro é
positivo, o segundo é, obrigatoriamente negativo. Assim, para as placas 2 a 4, a
incorreta identificação da positividade do teste KOH pode ter ocorrido, já que pode ser
difícil distinguir a viscosidade da mistura analisada.

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5. CONCLUSÕES

Os métodos de esterilização são eficazes na eliminação de microrganismos,

evitando assim infecções de materiais em laboratórios. O uso da estufa e
autoclavagem são os métodos de esterilização mais comumente utilizados. O
primeiro, por calor seco e que exige maior tempo de exposição para alcançar os
objetivos, enquanto que o segundo, por calor úmido, destrói os microrganismos por
coagulação e desnaturação irreversíveis de suas enzimas e proteínas estruturais.
Sobre os meios de cultura, estes propiciaram o desenvolvimento dos microrganismos
para análise, cujas características morfológicas e metabólicas puderam ser
mensuradas através de diversos testes microbiológicos e via observação em
microscópio.

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 REFERÊNCIAS

BORZANI, W.; SCHMIDELL, W.; LIMA, U. A ; AQUARONE, E. Biotecnologia

industrial – volume 1: fundamentos. Blucher. São Paulo, 2001.

MADIGAN, M. T. et al. Microbiologia de Brock. 14 ed. Artmed. Porto Alegre, 2016.

TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 10ª edição. Artmed.

Porto Alegre, 2012.

Universidade Federal de Alagoas. Notas de aula – Laboratório de Engenharia

Química 2. Maceió, 2015.

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